5/14/2022

Nội dung môn học

• Chương 1: Đại cương về phân tích hóa lý
thực phẩm (4,0,8).
• Chương 2: Các phương pháp phân tích hóa
lý (8,0,16).
• Chương 3: Phân tích một số chỉ tiêu trong
thực phẩm (18,0,36).

Chương 2: Các phương pháp phân

tích hóa lý
• Phương pháp điện thế
• Phương pháp quang học
– Phương pháp khúc xạ kế
– Phương pháp UV-VIS
– Phương pháp AAS
• Phương pháp sắc kí

1
 5/14/2022

Phổ hấp thu phân tử UV-VIS

1. Phổ điện từ trường
2. Cơ sở phổ hấp thu phân tử UV-VIS (Định luật
Lambert – Beer)
3. Thiết bị quang phổ UV-VIS
4. Ứng dụng
5. Phương pháp đường chuẩn

Phổ điện từ trường

2
 5/14/2022

Vùng ánh sáng khả kiến

Tính chất của ánh sáng

• Photons: có đồng thời 2 tính chất sóng và hạt

 E is the energy of the photon in joules

 h is Planck's constant (6.624 x 10-34 joule seconds)
  is the frequency of the radiation
 Nhớ:  = c/λ

3
 5/14/2022

Sự hấp thu và phát xạ của bức xạ điện từ

Higher energy

Absorption Emission E = h

Lower energy

• Sự hấp thu: là quá trình vật chất nhận năng lượng của ánh
sáng và chuyển lên trạng thái năng lượng cao hơn.
• Sự phát xạ: là quá trình vật chất chuyển từ trạng thái năng
lượng cao về trạng thái năng lượng thấp, đồng thời phát ra
năng lượng bức xạ (photon)

PHỔ HẤP THU PHÂN TỬ

• Đường biểu diễn độ

hấp thu A, hoặc ε
vào độ dài sóng
(bước sóng ʎ) của
chất phân tích gọi là
phổ hấp thu phân tử.
(Mối quan hệ giữa
độ hấp thu và bước
sóng)
• Phổ hấp thu phân tử
có dạng PHỔ ĐÁM!
8

4
 5/14/2022

PHƯƠNG PHÁP PHỔ HẤP THU PHÂN TỬ

• Phương pháp phổ tử ngoại – khả kiến (UV–

Vis: Ultraviolet-Visible) => Phương pháp trắc
quang.
• UV (200-350 nm) – Vis (350-700 nm)
• Nguyên tắc: dựa trên khả năng hấp thu ánh
sáng (bức xạ) của một hợp chất (khả năng này
phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của chính hợp
chất đó!).

Quan sát hình sau

Io
λmax I, λmax

5
 5/14/2022

Định luật Lambert-Beer

• Độ truyền qua

• Độ hấp thu

Định luật Lambert-Beer

• Mối quan hệ giữa độ hấp thu, A với nồng độ, C và
chiều dài, l
A = ε.l.C
• Phát biểu định luật Lambert Beer: Trong dd đồng
nhất và đẳng hướng thì độ hấp thu quang học tỷ
lệ với nồng độ dd và bề dày (chieu dai) dd
• Cơ sở định lượng bằng pp phổ hấp thu!

6
 5/14/2022

• B1: C chuẩn chất màu Y = 10 ppm

• Đo Ac = 0.5
=> A= elC= xC => x = A/C = 0.5/10 = 0.05
• B2: Mẫu thực phẩm (có chứa chất Y) nhưng C
= ???
• Đo, As = 0.8
• Hỏi: Nồng độ C của Y trong mẫu = ??
=> A=elC = xC => C = A/x = 0.8/0.05 = 16 ppm

A = LC

Co Nồng độ

Mối liên hệ giữa A và C

14

7
 5/14/2022

Nguyên nhân gây sai lệch định luật

Sai lệch dụng cụ đo: độ đơn sắc của bức xạ điện từ

và các ảnh hưởng khác của các thiết bị đo độ hấp
thu
Sai lệch hóa học: những biến đổi hóa học của chất
phân tích khi pha loãng dd, sự phân ly của chất
phân tích, ảnh hưởng của pH, nhiệt độ…

MÁY QUANG PHỔ UV-VIS

Máy quang phổ UV-Vis, Jasco V-750

16

8
 5/14/2022

Sơ đồ cấu tạo của thiết bị quang phổ UV-Vis cơ bản.

17

18

9
 5/14/2022

1. Nguồn sáng (nguồn bức xạ)

• Vai trò: Cung cấp nguồn bức xạ thích hợp cho
quá trình đo.
• Bức xạ được cung cấp bởi nguồn sáng thường
là chùm bức xạ đa sắc, nó bao trùm một
khoảng rộng của phổ.

19

Đèn Tungsten
• Là nguồn sáng dùng phổ biến trong các máy
quang phổ.
• Cung cấp bức xạ từ 330 – 900 nm (bức xạ vùng
khả kiến).
• Cấu tạo: Đèn có dây tóc làm bằng dây kim loại
Tungsten đặt trong bóng thủy tinh chứa đầy khí
trơ (Neon or Argon).
• Hoạt động: Với U=6 v và cường độ rất lớn, dây
tóc Tungsten bị nung đỏ đưa các khí trơ lên
trạng thái kích thích và phát bức xạ.
• Thời gian hoạt động của đèn khoảng 1200 giờ.
20

10
 5/14/2022

Đèn Hydro/Deuterium
• Là nguồn sáng cung cấp bức xạ tử ngoại
liên tục từ 200 – 450 nm.
• Cấu tạo: dây tóc Tungsten và anode được
đặt đối diện trong hộp kim loại Niken. Vỏ
đèn làm bằng vật liệu như thạch anh. Bên
trong chứa đầy khí D2.
• Hoạt động: hồ quang được tạo ra từ dây
tóc và anode sẽ kích thích các phân tử D2,
khi các phân tử D2 trở về trạng thái cơ bản
sẽ phát ra bức xạ (tử ngoại).
• Thời gian hoạt động khoảng 500 giờ.

21

2. Bộ đơn sắc
• Vai trò: tách chùm bức xạ đa sắc thành các tia
đơn sắc.
• Có hai loại thích bị phổ biến là lăng kính và
cách tử.
White Light

Gratings

22

11
 5/14/2022

3. Buồng đo (bộ phận chứa mẫu)

• Buồng đo là khoang tối, bên trong đặt bộ phận
chứa mẫu – cuvette.
• Cuvette có thể làm bằng nhựa, thủy tinh hay
thạch anh. Chiều dài thường là 1 cm (chiều dài l
trong định luật Lambert-Beer).
• Cuvette thủy tinh chỉ dùng trong vùng Vis, còn
cuvette thạch anh dùng trong vùng UV và Vis.

23

• Sử dụng cuvette đúng kĩ thuật:

• Đặt cuvette vào khe đo sao cho mặt
sáng của cuvette HỨNG đường
truyền tia sáng/.
24

12
 5/14/2022

4. Bộ phận detector
• Vai trò: Ghi nhận và biến đổi tín hiệu quang
thành tín hiệu điện.
• Cường độ dòng điện thu được tỉ lệ với lượng
bức xạ tới bề mặt catot của tế bào quang điện,
ống nhân quang hoặc mảng diod.

25

Đầu dò mảng diod

(Diode Array Detectors)

26

13
 5/14/2022

4. Bộ phận xử lý tín hiệu và điều khiển

• Vai trò: ghi nhận và xử lý số liệu. Giao diện
giữa người sử dụng và thiết bị.

27

Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ 1 chùm tia

• I0 chỉ được đo tại thời điểm ban đầu của quá trình đo.
28

14
 5/14/2022

Sơ đồ cấu tạo của máy quang phổ 2 chùm tia

I0

• I0 được đo đồng thời trong suốt quá trình đo/. 29

ỨNG DỤNG
CỦA PP PHỔ HẤP THU PHÂN TỬ
• Nhiều lĩnh vực: thực phẩm, dược, môi trường…
• Trong thực phẩm:
– Protein, glucid…
– Thành phần khoáng đa lượng và vi lượng
– Vitamin
– Chất tạo màu, chất bảo quản
• Là detector quan trọng và phổ biến khi kết hợp với
phương pháp sắc kí.
30

15
 5/14/2022

PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG

PHÁP PHỔ UV-VIS

• Nguyên tắc và cơ sở định lượng của phương pháp.

• Phương pháp so sánh
• Phương pháp so sánh thêm chuẩn
• Phương pháp đường chuẩn
• Phương pháp đường thêm chuẩn
• Phương pháp vi sai
• Phương pháp chuẩn độ trắc quang

31

Cơ sở định lượng
• Dựa vào khoảng tuyến tính của định luật Lambert-
Beer. (là khoảng nồng độ mà mối quan hệ giữa độ
hấp thu và nồng độ là tuyến tính với nhau).
• Khi chiếu 1 chùm tia đơn sắc (ʎmax) đi qua một dung
dịch đồng nhất và đẳng hướng thì cường độ hấp thu A
tỉ lệ thuận với nồng độ của phân tử hấp thu trong
dung dịch.

A = ε.l.C

32

16
 5/14/2022

Nguyên tắc định lượng

• Chất phân tích X được xử lý để tách ra khỏi nền mẫu (Bước
xử lý mẫu). Vd:
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn của chất X (điểm chuẩn hoặc
đường chuẩn). Nồng độ chất chuẩn nằm trong khoảng tuyến
tính của định luật Lambert-Beer.
• Thực hiện phản ứng tạo màu cho chất X (nếu có). Phản ứng
tạo màu này thực hiện tương tự giữa chuẩn và mẫu. Vd:
• Xác định bước sóng tại đó có độ hấp thu cực đại (bước sóng
hấp thu cực đại - ʎmax).
• Đo quang (độ hấp thu) của mẫu và chuẩn theo qui trình tối ưu
của phép đo.
• Tính toán kết quả. Suy ra hàm lượng chất X có trong mẫu. /.
33

Cách xác định ʎmax trong thực hành

• Chuẩn bị 1
dung dịch màu
của chất phân
tích X (thông
thường là bình λmax
chuẩn có nồng
độ lớn nhất).

34

17
 5/14/2022

Phương pháp so sánh với 1 chuẩn

• Pha dung dịch có nồng độ Cc. Thực hiện lên
màu và đo quang được Ac.
• Pha dung dịch mẫu có nồng độ Cx (chưa biết).
Thực hiện lên màu và đo quang được Ax.
• Tính kết quả:

35

Ví dụ
• Để xác định Pb trong mẫu thực phẩm, ta tiến
hành cân 5g mẫu, hòa tan thành dd, sau đó tiến
hành tạo phức với thuốc thử dithizon, phức Pb-
dithizon tan trong CH3Cl. Chiết phức bằng
CH3Cl, dd sau khi chiết được định mức thành
25ml. Dd chuẩn được chuẩn bị tương tự như
dd mẫu, chứa 10µgPb/25ml. Độ hấp thu (tại
λmax =545nm) của chuẩn và mẫu là
Ac=0.320, As=0.225. Tính hàm lượng Pb
(mg/kg)?
36

18
 5/14/2022

Phương pháp so sánh với 2 chuẩn

• Chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn có nồng độ sao
cho C1 < Cx < C2.
• Thực hiện lên màu của 2 dung dịch chuẩn và
dung dịch mẫu.
• Đo quang của 3 dung dịch trên: A1 < Ax < A2
• Tính kết quả:

37

Ví dụ
• Để xác định Pb trong mẫu thực phẩm, ta tiến hành
cân 5g mẫu, hòa tan thành dd, sau đó tiến hành
tạo phức với thuốc thử dithizon, phức Pb-dithizon
tan trong CH3Cl. Chiết phức bằng CH3Cl, dd sau
khi chiết được định mức thành 25ml. Thực hiện 2
dd chuẩn tương tự như mẫu, 1 dd chứa
6.25µg/25ml và 1 dd chứa 12.5µg/25ml. Độ hấp
thu (tại λmax=545nm) của dd mẫu và 2 dd chuẩn
lần lượt là: As = 0.225; Ac1= 0.160 và
Ac2=0.323. Tính hàm lượng Pb (mg/kg)?

38

19
 5/14/2022

Nhận xét về phương pháp so sánh

• Nồng độ của dung dịch mẫu và dung dịch
chuẩn phải nằm trong khoảng tuyến tính của
định luật Lambert-Beer.
• Đơn giản.
• Thuận lợi khi số lượng mẫu ít. (*Khi lượng
mẫu nhiều thì nên sử dụng pp đường chuẩn).
• Để kết quả chính xác thì nồng độ chất chuẩn
càng gần với nồng độ mẫu càng tốt.

39

Phương pháp thêm chuẩn

• Thêm vào dd cần xác định (Cx, chưa biết) một
lượng chất chuẩn có nồng độ đã biết (Cc).
• Độ hấp thu quang của dd mẫu được so sánh
với chính dd đó nhưng có thêm 1 lượng chất
chuẩn có nồng độ xác định.
• Có 2 kỹ thuật chính:
– PP so sánh thêm chuẩn
– PP đường thêm chuẩn

40

20
 5/14/2022

Phương pháp thêm chuẩn thích hợp:

– Không biết thành phần nền của mẫu
– Mẫu rất phức tạp
– Loại bỏ được ảnh hưởng nền
– Xác định được hàm lượng nhỏ

41

Phương pháp so sánh thêm chuẩn

• Chuẩn bị 3 bđm có V bằng nhau. Lấy 2 V như
nhau của dd mẫu vào 2 bđm (b1 và b2).
• B1: dd mẫu có nồng độ Cx, thực hiện lên màu, đo
quang Ax.
• B2: thêm 1 lượng chính xác dd chuẩn biết trước
nồng độ Cc (bình này có nồng độ Cx+c), thực hiện
lên màu, đo quang Ax+c.
• B3: nước cất, thực hiện lên màu. DD này dùng
làm dd so sánh. (Lưu ý: B3 này còn có thể dùng
chính dd mẫu làm dd so sánh, không thêm bất cứ
thuốc thử lên màu nào!)
42

21
 5/14/2022

• Tính kết quả:

• Vì Cx tính được theo công thức trên là nồng

độ X trong bđm V ml. Tức là mẫu đã bị pha
loãng so với ban đầu, do đó nếu gọi Co, Vo là
nồng độ và thể tích ban đầu thì:

43

Ví dụ
• Lấy 20 ml dd mẫu có chứa Fe, thực hiện phản
ứng lên màu với thuốc thử 1,10-phenaltroline,
và định mức thành 50 ml. Đo A tại 510 nm
được 0.225.
• Lấy 20 ml mẫu khác thêm 4 ml dd Fe chuẩn 10
mg/L, thực hiện phản ứng lên màu tương tự và
định mức thành 50 ml. Đo A được 0.358.
• Tính nồng độ Fe của dd mẫu.

44

22
 5/14/2022

Phương pháp đường thêm chuẩn

• Chuẩn bị 4 dung dịch mẫu (4 bình) có nồng độ
mẫu là Cx.
• Lần lượt thêm dung dịch chuẩn vào các bình với
nồng độ tăng dần.
• Thực hiện phản ứng lên màu.
• Chuẩn bị dd mẫu trắng (blank):
• Đo độ hấp thu quang.
• Xây dựng đường phụ thuộc A theo C, thu được
phương trình hồi qui y=ax+b => Cx cần tìm/.

45

STT Bình 0 Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4

Thể tích 0 Vx Vx Vx Vx
mẫu, ml
Thể tích 0 0 V1 V2=2.V V3=3.V
chuẩn, 1 1
ml
Thuốc x x x x x
thử
Định mức đến vạch mức bằng nước cất!
ABS 0 Ax Ax+1 Ax+2 Ax+3
C 0 Cx=? C1 C2 C3
*Không vẽ điểm 0:0 trong phương pháp đường thêm chuẩn
46

23
 5/14/2022

Dd cần
Dd chuẩn
xác định
Cc
Cx

Vc
Vx
Cx Cx + ∆C2

Cx + ∆C1 Cx + ∆C3

47

Đồ thị đường thêm chuẩn

48

24
 5/14/2022

Ví dụ
• Xác định Fe trong mẫu nước sông bằng pp
thêm chuẩn như sau: Rút 20 ml mẫu cho vào 5
bđm 50 ml. Sau đó thêm 1 lượng chất chuẩn có
nồng độ lần lượt 0.1,0.2,0.3,0.4 ppm vào bình
số 2,3,4,5. Thêm các thuốc thử và định mức
lên 50 ml. Sau đó tiến hành đo quang A:
STT 1 2 3 4 5
C ppm
A 0.056 0.130 0.224 0.303 0.371

49

Phương pháp đường chuẩn

• Là kỹ thuật định lượng phổ biến nhất!
• Dùng 1 đường chuẩn để tính toán nhiều mẫu.
• Nhược điểm: gây sai số khi nền mẫu quá phức
tạp, hoặc khi hàm lượng chất phân tích trong
mẫu thấp.
- Ưu điểm: Thuận lợi để phân tích hàng loạt mẫu
của cùng một chất trong một loại đối tượng mẫu
=> Nhanh chóng!

50

25
 5/14/2022

Qui trình:
• Chuẩn bị từ 5- 6 dd chuẩn có nồng độ tăng dần,
nằm trong khoảng tuyến tính của định luật
Lambert-Beer.
• Thực hiện phản ứng lên màu.
• Đo độ hấp thu quang A.
• Xây dựng đường chuẩn y=ax+b (A=aC+b), là
phương trình hồi qui của đường phụ thuộc giữa
A=y và C=x.
• Đối với mẫu: Lấy V ml mẫu cho vào bđm, thực
hiện phản ứng lên màu => Đo độ hấp thu Ax.
• Áp vào phương trình đường chuẩn thu được Cx.

51

STT Bình 0 Bình Bình Bình Bình Bình Bình

1 2 3 4 5 X
Thể tích chuẩn, ml (A 0 V1 V2 V3 V4 V5 0
ppm)
Thể tích mẫu, ml 0 0 0 0 0 0 V
Thuốc thử x x x x x x x
Định mức tới vạch mức bằng nước cất!
ABS 0 A1 A2 A3 A4 A5 Ax
C 0 C1 C2 C3 C4 C5 Cx

*Thông thường, khi xây dựng đường chuẩn thì cần vẽ điểm 0:0!
52

26
 5/14/2022

Phương pháp dãy chuẩn

1 2 3 4 5

53

54

27
 5/14/2022

Ví dụ
• Xác định Fe trong thịt bò: Cân 1 g mẫu hòa tan trong hỗn hợp acid mạnh. Sau
đó cho toàn bộ vào bình 100 ml và định mức bằng nước. Rút 25 ml mẫu cho
vào bđm 50 ml, thêm các thuốc thử cần thiết, sau đó đi đo quang A = 0.245.
• Chuẩn bị 1 dãy chuẩn Fe(II) trong bđm 50 ml và thực hiện lên màu tương tự
STT
như mẫu và đo quang1 A thu được
2 dãy chuẩn
3 như sau:4 5
V ml (10ppm) 0 1 2 3 4
C (ppm) 0 0.2 0.4 0.6 0.8
A 0 0.074 0.153 0.247 0.315

1. Tính các giá trị ? Co*Vo = C1*V1 => 10 ppm * 1 ml = C1 ml * 50 ml => C1

2. Tính C trong bđm 50 ml (bình đem đi đo A) : A = 0.4015*C – 0.0028. Biết A
= 0.245 => C = 0.61 mg/L (ppm)?
3. 3. Tính C trong bđm 100 ml. C = 0.61 * (50/25) = 1.22 mg/L
4. 4. Tính khối lương Fe có trong bđm 100 ml:? 0.122 mg
5. Tính hàm lượng Fe có trong mẫu thịt bò? 122 mg/kg? C = 0.122 mg/1g = 0.122
mg/g = 122 mg/kg 55

28
 5/14/2022

Hướng dẫn sử dụng Casio lập ptđc

58

29
 5/14/2022

Hướng dẫn sử dụng excel lập ptđc

59

Bài tập
• Câu 1: Trong pp phổ UV-Vis, vùng khả kiến có
bước sóng là:
• Câu 2: Trong pp phổ UV-Vis, vùng tử ngoại có
bước sóng là:
• Câu 3: Trong nước, anline (C6H5NH2) có λmax
280 nm, ε=1430 l/mol.cm. Tính khối lượng
aniline cần thiết để pha 100 ml dd aniline
có độ truyền suốt 30% (biết l = 1cm)

30
 5/14/2022

• Câu 4: Viết ptđc có dữ liệu như bảng dưới:

• Câu 5: Tính nồng độ của các bình trong bảng

Bdm 50 ml 1 2 3 4 5
V ml (10ppm) 1 2 3 4 5

Định mức thành 50 ml

C, ppm

61

VD1: 15 mg mẫu của một hợp chất cần phân tích A có trọng
lượng phân tử 384.63 được hòa tan trong nước và pha loãng
đến vạch trong bình định mức 50 mL. Lấy 2 mL dung dịch
này cho vào bình định mức 100 mL và pha lõang đến vạch.
1. Nồng độ của dung dịch (mol/L) trong bình định mức 50
mL ?
2. Nồng độ của dung dịch (mol/L) trong bình định mức 100
mL ?
3. Dung dịch trong bình định mức 100 mL được cho vào
cuvet 5.0 cm và đo độ hấp thu tại bước sóng 496 nm là
0.634. Tính hệ số hấp thu phân tử tại bước sóng này.

62

31
 5/14/2022

VD2: Để xác định nồng độ chất A trong một mẫu phân tích,
nhân viên phân tích thực hiện như sau: Lấy 25 mL mẫu cần
xác định cho vào bình định mức 50 mL (thực hiện p/ư lên
màu) và đo được độ hấp thu tại bước sóng 496 nm là 0.463.
Tính nồng độ chất A (ppm) trong mẫu cần xác định biết dãy
chuẩn trong bình định mức 50 mL như sau:

Bình định mức Thế tích chất A Độ hấp thu tại

50 mL nồng độ 1 ppm bước sóng 496
(mL) nm

1 0.2 0.232
2 0.4 0.487
3 0.6 0.688
4 0.8 0.939
5 1.0 1.165 63

32