5/14/2022

NỘI DUNG

• Cơ sở lý thuyết
• Phân loại các phương pháp sắc kí
• Quá trình sắc kí cơ bản và sắc kí đồ
• Các thông số đặc trưng của pp sắc kí
• Ứng dụng của pp sắc kí
• Các phương pháp sắc kí CỔ ĐIỂN
• PP sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• PP sắc kí khí (GC)

CƠ SỞ LÝ THUYẾT
 Sắc kí là phương pháp tách các chất
 Dựa trên 2 quá trình
– Hấp phụ
– Giải hấp phụ
 Xảy ra liên tục giữa 2 pha không trộn lẫn
– Pha tĩnh (cột sắc kí): chất rắn hoặc lỏng
– Pha động: là chất lỏng (LC) hoặc chất kí (GC)
Trong pttp sắc kí được ứng dụng rộng rãi để
định lượng các hợp chất, đặc biệt là hàm lượng
nhỏ.

1
 5/14/2022

Lịch sử ra đời

• Hỗn hợp các chất tách ra

khỏi nhau khi đi qua cột!

Năm 1906 - Mikhail

SemenovichTswett (1872-1919)
đã thí nghiệm tách chất bằng cột
sắc ký lần đầu tiên.

2
 5/14/2022

PHÂN LOẠI
Cách 1: Dựa trên cấu tạo pha tĩnh
– Sắc kí cột
– Sắc kí phẳng

Cách 2: Dựa trên tính chất pha động

– Sắc kí lỏng (LC)
– Sắc kí khí (GC)

Cách 3: Dựa trên bản chất tương tác giữa chất phân tích
với pha tĩnh
– Sắc kí phân bố
– Sắc kí hấp phụ
– Sắc kí trao đổi ion
– Sắc kí gel

QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÍ

• Quá trình tách (separation) là quá trình cơ bản
trong pp sắc kí (chromatography).
• Nhờ vào việc tách riêng từng chất ra khỏi nền
mẫu ban đầu mà việc định tính và định lượng trở
nên dễ dàng hơn rất nhiều.
• Cơ chế: do sự khác biệt về ái lực của chất phân
tích (các chất khác nhau có ái lực khác nhau!) với
hai pha không trộn lẫn, mà các chất này tách
nhau ra khi chúng di chuyển dưới tác dụng của
pha động (pha di chuyển) đi qua pha tĩnh (pha
đứng yên).

3
 5/14/2022

SẮC KÍ ĐỒ (Chromatogram)
• Là đồ thị biễu diễn mối
Cường độ tín hiệu

quan hệ giữa tín hiệu –

nồng độ - thời gian.
– Định tính: dựa vào thời gian
lưu tR
– Định lượng: dựa vào diện
Thời gian lưu tích hay chiều cao peak
• Peak sắc kí: thời gian lưu và
cường độ tín hiệu (diện tích
hay chiều cao).
• Mỗi 1 peak tương ứng với 1
chất => phân tích đồng thời
nhiều chất trong 1 lần phân
tích mẫu.

4
 5/14/2022

CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG TRONG SẮC KÍ

• Thời gian lưu tR.

• Hệ số phân bố K.
• Hệ số chọn lọc α.
• Hệ số dung lượng k’.
• Số đĩa lý thuyết N.
• Chiều cao đĩa lý thuyết H.
• Độ phân giải Rs.
• Phương trình Van Deemter

Thời gian lưu - tR

• Là thời gian chất phân
tích đi ra khỏi cột, có
tính đến tương tác với
pha tĩnh.
• Thời gian lưu chết tM:
là thời gian chất phân
tích đi ra khỏi cột khi
không có tương tác
với cột.
Là thông số quan trọng và đặc trưng cho từng • Thời gian lưu thực t’R
chất phân tích trong điều kiện xác định.
Dùng để định tính (một phần!). = tR - tM

5
 5/14/2022

Thời gian lưu - tR

Thời gian lưu của chất được quyết định bởi:
- Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, loại xốp,…)
- Pha động (loại khí, thành phần, tốc độ,…)
- Bản chất và cấu trúc chất PT
- Nhiệt độ cột trong quá trình chạy SK.

Hệ số phân bố K
• Là đại lượng đặc trưng cho cân bằng động của
chất phân tích giữa 2 pha: tĩnh và động
K = CS/CM
– CS và CM: là nồng độ chất trong pha tĩnh và pha
động.
– K càng lớn chất giữ lại càng lâu trên cột

6
 5/14/2022

Hệ số phân bố K
K phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất PT, nhóm
chức, nhóm thế,..
- Bản chất, loại và cấu trúc SP
- Bản chất, thành phần và tốc độ MP
- Nhiệt độ cột tách

Hệ số chọn lọc - 
 = Hệ số tách của hai chất

t’A và t’B: thời gian lưu thực của chất A và B

k‘A, k’B: hệ số chứa của chất A và B
Với 2 chất kề nhau:
 = 1: không có sự tách sắc ký của 2 chất
  1: có sự tách sắc ký của 2 chất
14

7
 5/14/2022

Hệ số dung lượng k’ (K’)

• Đại lượng đăc trưng
cho sự di chuyển của
chất phân tích trên
cột.
k'=K’=KAVS/VM
• Cách xác định:
k'=(tR-tO)/tO

8
 5/14/2022

Số đĩa lý thuyết N
- Số đĩa lý thuyết (N): biểu thị
số lớp chất di chuyển trong
cột.
N = 16(tR/wb)2 = 5.545(tR/w0.5)2
tR : thời gian lưu tòan phần
wb và w0.5 là độ rộng peak đo
tại chân đường nền và tại
nửa chiều cao peak
Số đĩa lý thuyết thực (hiệu dụng) N’:
N’ = 16(t’R/wb)2 = 5.545(t’R/w0.5)2

- Chiều cao đĩa lý thuyết: bề dày của lớp chất

mẫu trong cột tách
h = L/N
Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng:
H = L/N’
L : chiều dài cột tách (mm)
H, h: mm

9
 5/14/2022

Độ phân giải Rs
• Là đại lượng cho phép
đánh giá hai chất có thể
tách ra khỏi nhau không.
WA, WB; độ rộng đáy của peak
sắc ký hai chất A và B
t'RA, t’RB: thời gian lưu của hai
chất A và B
• .

Độ phân giải Rs
• Muốn tăng độ phân giải Rs => tăng α, N, k’ (k)

10
 5/14/2022

Hiện tượng kéo đuôi, đầu của peak sắc kí

Ưu điểm của PP sắc ký

 Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

 Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
 Độ nhạy cao (ppm-ppb)
 Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL)
 PT nhanh

22

11
 5/14/2022

ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÍ

• Phổ biến trong các mẫu thực phẩm như: dư

lượng thuốc trừ sâu, kháng sinh, độc chất…ở hàm
lượng vết đến siêu vết.
• Định tính: dựa vào thời gian lưu.
• Thử độ tinh khiết: không có peak ứng với các tạp
chất.
• Định lượng: dựa vào mối quan hệ giữa diện tích
(chiều cao) peak với hàm lượng của chất phân
tích. Thường sử dụng kĩ thuật đường chuẩn.

SẮC KÍ CỘT CỔ ĐIỂN

• Pha động: dung môi hữu
cơ . Chảy qua cột dưới tác
dụng của trọng lực/. (áp
thấp)
• Pha tĩnh: hạt nhồi vào
trong cột.
• Quá trình tách: chất phân
tích được đưa vào đầu cột,
cho dung môi từ từ chảy
qua cột dưới tác dụng của
trong lực. Do sự khác biệt
giữa các chất với pha tĩnh
Dựa trên màu sắc (quan sát bằng mắt) và pha động khác nhau mà
các chất này tách ra khỏi
hoặc ghi nhận tín hiệu bằng các nhau khi đi qua cột.
detector tiến hành thu nhận các phân
đoạn khác nhau (các chất khác nhau) =>
sắc kí điều chế.

12
 5/14/2022

SẮC KÍ BẢN MỎNG

• Pha động: chất lỏng.
• Pha tĩnh: chất rắn or chất
lỏng gắn trên bản mỏng.
• Quá trình tách: chất phân
tích được chấm vào vạch
cuối bản mỏng, làm bay hơi
dung môi. Đưa bản mỏng +
chất phân tích vào bình chứa
dung môi. Dung môi + chất
phân tích di chuyển lên do
Rf = a/b lực mao dẫn.
Rf: 0-1 • Tùy thuộc vào ái lực của chất
phân tích với pha tĩnh và pha
Giá trị Rf trong khoảng động mà quãng đường di
chuyển khác nhau trong 1
0.25 – 0.35 khoảng thời gian xác định =>
cơ sở định tính.

SẮC KÍ GIẤY
• Tương tự sắc kí bản
mỏng!
• Pha tĩnh là giấy
cellulose (chất rắn).

13
 5/14/2022

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

High Performance Liquid Chromatography

High Pressure Liquid Chromatography
• Quá trình tách thực hiện trên cột, nhồi các hạt có kích
thước bé cỡ µm (5µm, 3µm). => cần áp lực cao để
đẩy dung môi đi qua cột. Hiệu quả tách rất cao.
• Pha động (dung môi): chất lỏng, có vai trò đẩy chất
phân tích ra khỏi cột.
• Pha tĩnh (cột): chất rắn hoặc chất lỏng, lưu giữ và
tách chất phân tích.

THIẾT BỊ HPLC

1. Dung môi (pha động) 4. Cột sắc kí (pha tĩnh)

2. Bơm cao áp 5. Detector
3. Bộ tiêm mẫu 6. Hệ thống ghi đó, xử lý tín hiệu

14
 5/14/2022

THIẾT BỊ HPLC (tt)

1. Dung môi (pha động): có vai trò đẩy chất phân
tích ra khỏi cột. Nước và dung môi hữu cơ.
2. Bơm cao áp: bơm dung môi đi qua cột.
3. Bộ tiêm mẫu: đưa mẫu chất phân tích vào cột.
4. Cột sắc kí (pha tĩnh): tách hỗn hợp thành các cấu
tử riêng lẻ. *là trái tim của hệ sắc kí*
5. Detector: ghi nhận các chất khi đi ra khỏi cột
theo thời gian. Tín hiệu ghi nhận (cường độ) tỉ lệ
với hàm lượng chất phân tích => cơ sở định
lượng.
6. Bộ phân thu nhận và xử lý tín hiệu:

LC Instrumentation
 The Agilent 1100, a typical modern LC system

Solvent reservoirs

Solvent degasser

Pump

Autosampler

Column oven

DAD

15
 5/14/2022

SẮC KÍ KHÍ - GC

• Thường sử dụng phân tích các hợp chất dễ

bay hơi và bền nhiệt.
• Pha động (khí mang): các khí trơ như N2, Ar,
He. Đẩy chất phân tích đi ra khỏi cột.
• Pha tĩnh (cột): chất rắn, hoặc lỏng. Lưu giữ và
tách chất phân tích.

THIẾT BỊ GC

1. Pha động (khí mang) 4. Pha tĩnh (cột)

2. Buồng tiêm mẫu 5. Detector
3. Lò cột 6. Bộ phân ghi nhận và
xử lý tín hiệu

16
 5/14/2022

THIẾT BỊ GC (tt)
1. Khí mang (pha động): là các chất khí trơ như N2, Ar,
He…đẩy chất phân tích ra khỏi cột. Pha động không có
tương tác với chất phân tích.
2. Buồng tiêm mẫu: là nơi mẫu được đưa vào, hóa hơi, và
lôi cuốn theo dòng khí mang vào cột.
3. Lò cột: dùng điều khiển nhiệt độ cột tách.
Trong GC, quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về ái
lực giữa các chất với pha tĩnh, và nhiệt độ bay hơi của chất
phân tích khi chúng di chuyển liên tục dọc theo cột sắc kí.
Chương trình nhiệt: nâng cao hiệu quả tách. Thường dùng
chương trình gradient nhiệt cho các mẫu phức tạp.

THIẾT BỊ GC (tt)
4. Cột sắc kí (pha tĩnh): tách chất phân tích. Có 2
loại cột nhồi và cột mao quản.
5. Detector: ghi nhận chất phân tích ra khỏi cột
theo thời gian. Cường độ tín hiệu (diện tích peak
hay chiều cao) tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích
=> cơ sở định lượng.
Các loại detector phổ biến: ion hóa ngọn lửa FID;
Cộng kết điện tử ECD; khối phổ MS.
6. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu: phần mềm
và máy vi tính.

17
 5/14/2022

Câu hỏi
1. Vẽ và mô tả cấu tạo thiết bị HPLC và GC
2. So sánh HPLC với GC
3. Khi sử dụng dung môi và đệm pH cần lưu ý
gì?
4. Vì sao nối cột bảo vệ vào cột phân tích?
5. Vì sao cần duy trì dòng ổn định từ bơm?
6. Tác hại của chất rắn và khí hòa tan trong pha
động và biện pháp loại trừ.

18
 5/14/2022

Bài tập nộp trên E-classroom

• Q: Hãy vẽ sơ đồ cấu tạo, nêu công dụng của
từng bộ phận trong thiết bị HPLC và GC
• Thời gian 20 phút, từ 7h5-7h25’
• Làm ra giấy, chụp hình và
• Nộp ngay trên EC.

19