Phương pháp sắc ký

(Chromatography)

Chromatography
 Phương pháp sắc ký

• Lịch sử của phương pháp sắc ký

• Phương pháp sắc ký là gì
• Phân loại các phương pháp sắc ký
• Các thông số cơ bản của phương pháp sắc ký
• Ứng dụng

Chromatography
 Lịch sử phương pháp sắc ký
- 1872 - 1919 Nhà thực vật học người Nga Mikhail
Tswett dùng cột nhồi với CaCO3 (pha tĩnh—
stationary phase) và petroleum ether (pha động—
mobile phase) tách (separate) các chất màu
(colored pigments) từ dịch chiết lá cây (plant
extracts)
- 1941 Martin và Singe xây dựng lý thuyết tách
bằng sắc ký (chromatographic separations)
(Nobel Prize năm 1952)
- Ngày nay, sắc ký là một trong những phương pháp
tách quan trọng và được ứng dụng rộng rãi nhất

Chromatography
 Phương pháp sắc ký là gì?

– Chromatography is a physical method of

separation in which the components to be
separated are distributed between two phases,
one of which is stationary (stationary phase),
while the other (the mobile phase) moves in a
definite directions

Chromatography
 Phân loại các phương pháp sắc ký
• PP sắc ký được phân loại theo nhiều cách: :
– (1) theo trạng thái vật lý của pha động và pha
tĩnh (the physical state of the mobile phase and
stationary phase)
– (2) theo phương pháp tiếp xúc giữa pha động và
pha tĩnh
– (3) theo cơ chế tách

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (1) Theo tính chất vật lý của pha động và
pha tĩnh:
– Pha động (mobile phase) thường là lỏng (liquid)
hoặc khí (gas), pha tĩnh (stationary phase)
thường là rắn (solid) hoặc lỏng (liquid) phủ trên
bề mặt chất rắn mang.
– Gọi tên phương pháp sắc ký theo tính chất vật lý
của pha động và pha khí (ví dụ: gas–liquid
chromatography (pha động khí, pha tĩnh lỏng)
– Gọi tên phương pháp sắc ký theo pha động:
liquid chromatography (LC) (sắc ký lỏng, pha
động lỏng), gas chromatography (GC) (sắc ký khí,
pha động khí).

Chromatography
 Sắc ký khí (GC)

Chromatography
 Sắc ký khí (Gas Chromatography)

– Pha động (Mobile Phase)

– Cột phân tích (Chromatographic Columns)
– Pha tĩnh (Stationary Phases)
– Bơm mẫu (Sample Introduction)
– Nhiệt độ (Temperature Control)
– Đầu dò (Detectors for Gas Chromatography)
– Ứng dụng định lượng (Quantitative Applications)

Chromatography
 GC
Sơ đồ thiết bị

Schematic diagram for a typical gas chromatograph

Chromatography
 GC
Sơ đồ thiết bị

Chromatography
 Cột sắc ký (GC Column)

Chromatography
 GC Column

Chromatography
 GC column

Chromatography
 Pha tĩnh (Stationary Phase)
• Cột nhồi (Packed columns)
• Cột mao phản (Capillary columns)
– Wall-coated open-tubular (WCOT)
• wall-coated open tubular consist of a capillary tube whose
walls are coated with liquid stationary phase.
– Support coated open-tubular (SCOT)
• support coated open tubular consist of a capillary lined
with a thin layer of support material such as diatomaceous
earth, onto which the stationary phase has been adsorbed.
– Porous layer open-tubular (PLOT)
• porous layer open tubular columns in which a thin layer of
adsorbent is affixed to the inner walls of the capillary.

Chromatography
 Pha tĩnh

Chromatography
 Pha tĩnh

Glass
surface

An example of a trimethylsilyl deactivating group.

Chromatography
 GC column

Chromatography 17
Sắc ký đồ (chromatogram)
• GC

Typical gas chromatogram of complex mixture using a capillary column

Chromatography
 Sắc ký khí

- Phân tích khí (All gases)

- Most nonionized organic molecules, solid or liquid,
containing up to about 25 carbons

Chromatography
 Sắc ký lỏng (High-Performance Liquid
Chromatography)
– Pha động (Mobile Phases)
– Cột phân tích (HPLC Columns)
– Pha tĩnh (Stationary Phases)
– Bơm mẫu (Sample Introduction)
– Đầu dò (Detectors for HPLC)
– Ứng dụng định lượng (Quantitative Applications)

Chromatography
 Sắc ký lỏng

Chromatography
 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng

Schematic diagram of a high-performance

liquid chromatograph
Chromatography
 Cột phân tích (HPLC column)

Chromatography
 HPLC silica Bonded Phases

Cyano
SAX
Amino

Methyl Hexyl C8 C8

Butyl
Phenyl C18
C18

SCX
Chromatography 24
 Sắc ký đồ (HPLC chromatogram)

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (2) Phân loại dựa trên phương pháp tiếp
xúc giữa pha động và pha tĩnh
– Sắc ký cột (Column chromatography):
• The stationary phase is placed in a narrow column
through which the mobile phase moves under the
influence of gravity or pressure
• The stationary phase is either a solid or a thin, liquid
film coating on a solid particulate packing material or
the column’s walls.
– Sắc ký phẳng (Planar chromatography):
• The stationary phase coats a flat glass, metal, or
plastic plate and is placed in a developing chamber.
• A reservoir containing the mobile phase is placed in
contact with the stationary phase, and the mobile
phase moves by capillary action.

Chromatography
 Sắc ký giấy (Paper Chromatography)

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (3) Dựa trên cơ chế tách
– Sắc ký hấp phụ (Adsorption chromatography):
• solutes separate based on their ability to adsorb to a
solid stationary phase.
– Sắc ký phân bố (Partition chromatography):
• A thin liquid film coating a solid support serves as the
stationary phase.
• Separation is based on a difference in the equilibrium
partitioning of solutes between the liquid stationary
phase and the mobile phase.

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (3) Dựa trên cơ chế tách
– Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange
chromatography): Stationary phases consisting of a
solid support with covalently attached anionic (e.g.,
SO3–) or cationic (e.g., –N(CH3)3+) functional groups.
Ionic solutes are attracted to the stationary phase
by electrostatic forces.
– Sắc ký rây phân tử (Size-exclusion
chromatography): Porous gels are used as stationary
phases. Separation is due to differences in the size
of the solutes. Large solutes are unable to
penetrate into the porous stationary phase and so
quickly pass through the column. Smaller solutes
enter into the porous stationary phase, increasing
the time spent on the column.
Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
– Not all separation methods require a stationary
phase.
• Sắc ký điện di (Electrophoretic separation): charged
solutes migrate under the influence of an applied
potential field. Differences in the mobility of the ions
account for their separation.

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký (3)
a) Sắc ký hấp phụ
(Adsorption
chromatography)

b) Sắc ký phân bố
(Partition
chromatography)

c) Sắc ký trao đổi ion

(Ion-exchange
chromatogIonraphy)

d) Sắc ký rây
phân tử (Size-
exclusion
chromatography)

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

Progress of a
column
chromatographic
separation
showing the
separation of
two solute
bands.

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký
– Sắc ký đồ (chromatogram)
• Biểu diễn tín hiệu của detector theo thời gian lưu (A
plot of the detector’s signal as function of elution
time or volume).
– Thời gian lưu (retention time)
• The time a solute takes to move from the point of
injection to the detector (tr).
– Thể tích lưu (retention volume)
• The volume of mobile phase needed to move a solute
from its point of injection to the detector (Vr).
Dividing the retention volume by the mobile phase’s
flow rate, u, gives the retention time.
– Bề rộng peak (baseline width)
• The width of a solute’s chromatographic band
measured at the baseline (w).
Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

– void time (tm)

• Thời gian cho chất không bị lưu giữ di chuyển từ vị trí
bơm mẫu tới đầu dò (The time required for unretained
solutes to move from the point of injection to the
detector.
– void volume
• The volume of mobile phase needed to move an
unretained solute from the point of injection to the
detector.

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

tr : thời gian lưu

(retention time)
tm : void time

W : bề rộng chân
peak (baseline
width)

Chromatography
 Độ phân giải (Resolution)

Độ phân giải (Resolution –

R) biểu diễn khả năng tách
của cột phân tích giữa 2
peak sắc ký.

Độ phân giải – Ví dụ
Chromatography
 Độ phân giải – Ví dụ

Trong phân tích tinh dầu chanh bằng phương pháp

sắc ký, peak limonene có thời gian lưu 8.36 phút
với bề rộng chân peak 0.96 phút và peak g-
Terpinene có thời gian lưu 9.54 phút với bề rộng
chân peak 0.64 phút. Tính độ phân giải giữa 2
peak.

Chromatography
 Hệ số chứa k’ (capacity factor)

– Hệ số chứa k’ (capacity factor)

• Biểu diễn khả năng lưu giữ chất phân tích bởi pha tĩnh (A
measure of how strongly a solute is retained by the
stationary phase).

– Thời gian lưu biểu kiến (adjusted retention time)

• The difference between a solute’s retention time and
column’s void time (tr’).

Chromatography
 Hệ số chứa (capacity factor)

– Phân tích butyric acid bằng phương pháp sắc ký,

thời gian lưu của acid này là 7.63 phút, tM = 0.31
phút. Tính hệ số chứa của cấu tử.

Chromatography
 Độ chọn lọc của cột
(Column Selectivity)
– Hệ số chọn lọc (α) (selectivity factor)
• The ratio of capacity factors for two solutes showing
the column’s selectivity for one of the solutes.

Chromatography
 Hệ số chọn lọc – Ví dụ
– Phân tích hỗn hợp acid bằng phương pháp sắc ký,
thời gian lưu của butyric acid là 7.63 phút và thời
gian lưu của isobutyric acid là 5.98 phút, tM = 0.31
phút. Tính hệ số chọn lọc giữa isobutyric acid và
butyric acid.

butyric

isobutyric

Chromatography
 Hiệu năng của cột phân tích (Column
Efficiency)

– Số đĩa lý thuyết (theoretical plate)

– Chiều cao đĩa lý thuyết của cột (the
height of a theoretical plate)

With N: theoretical plates

L: the column length

H: the height of a theoretical plate

Chromatography
 Hiệu năng của cột phân tích
– Số đĩa lý thuyết (The number of theoretical
plates)
• Số đĩa lý thuyết phụ thuộc tính chất của cột và chất
phân tích
• Số đĩa lý thuyết khác nhau với các chất phân tích

tr: thời gian lưu (the

retention time)
W: bề rộng chân peak
(the width of the
chromatographic peak)
W1/2: bề rộng chân peak tại phân
nửa chiều cao peak (the width of
the chromatographic peak at half
Chromatography
its height)
 Số đĩa lý thuyết
Ví dụ
– Sắc ký đồ cho biết peak Dieldrin (thuốc trừ sâu
họ Clo) có thời gian lưu của là 8.68 phút (bề rộng
chân peak W = 0.29 phút). Tính số đĩa lý thuyết
N của cột. Chiều dài cột là 2 mét. Tính chiều cao
đĩa lý thuyết H của cột.

Chromatography
 Nonideal Behavior
– Peak không đối xứng (fronting)
• A tail at the beginning of a chromatographic peak,
usually due to injecting too much sample (a).
– Peak không đối xứng (Tailing) (peak kéo đuôi)
• A tail at the end of a chromatographic peak, usually
due to the presence of highly active sites in the
stationary phase (b).

Chromatography
 Tối ưu hiệu quả tách (Optimizing
Chromatographic Separations)

NB: the number of kB’, (the effect of

theoretical plates α : the influence of solute B’s capacity
(the effect of column selectivity factor)
column efficiency)

(1) (2) (3)

Chromatography
 Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
• Tăng k’B (khi k’B nhỏ)
– Tăng k’B từ 1 lên 10, hiệu quả tách tăng 82%, từ
1 lên 15, hiệu quả tách tăng 87.5%.
– Tăng k’, chất phân tích nằm lâu hơn trong cột,
thời gian phân tích tăng, chí phí tăng, peak dễ
giãn rộng.

Chromatography
 • Tăng k’B
– Sắc ký khí: giảm nhiệt độ cột phân tích
• At a lower temperature a solute’s vapor pressure
decreases (it spends more time in the stationary
phase). Therefore, its capacity factor increases.

Chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí (Temperature

programming in gas chromatography)
The process of changing the column’s temperature to
enhance the separation of both early and late eluting
solute accomplished.

Chromatography
 GC
Chương trình nhiệt độ
(A typical temperature program)
(c)

(b)

(a)

(a) = nhiệt độ ban đầu và thời gian (initial temperature and time)
(b) = ramp (˚C/min)
(c) = nhiệt độ cuối và thời gian (final hold time and temperature

Some GCs will allow for far more complex temperature programming
Chromatography
 Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
• Tăng k’B
– Sắc ký lỏng: giảm độ mạnh của dung môi (By
decreasing the solvent strength in liquid
chromatography)
• When the mobile phase has a low solvent strength,
solutes spend proportionally more time in the
stationary phase, thereby increasing their capacity
factors.
Chương trình gradient dung môi trong sắc ký lỏng (Gradient
elution in liquid chromatography)
The process of changing the mobile phase’s solvent
strength to enhance the separation of both early and late
eluting solutes.
Chromatography
Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
Ví dụ

Chromatography
 Thay đổi hệ số chọn lọc (column
selectivity) tăng hiệu quả tách
(Optimize Resolution) (2)
– a (hệ số chọn lọc).
• when a is nearly 1, it usually is not possible to improve
resolution by adjusting k’B or N.
• changing a from 1.1 to 1.5 improves resolution by
267%.
– Trong GC, thay đổi a bằng cách thay đổi pha
tĩnh
– Trong LC, thay đổi a bằng cách thay đổi thành
phần pha động

Chromatography
Thay đổi hệ số chọn lọc tăng hiệu quả
tách (2)
Ví dụ

Sự thay đổi thời gian lưu theo pH pha động

Chromatography
Thay đổi hệ số chọn lọc tăng hiệu quả
tách (2)
Ví dụ

Sự thay đổi của hệ số chọn lọc theo pH pha động

Chromatography
 Thay đổi hiệu năng cột (Column
Efficiency) tăng hiệu quả tách
(Optimize Resolution) (1)
– Tăng chiều dài cột (L) (tăng thời gian lưu)
– Giảm chiều cao đĩa lý thuyết (Decrease the
height of a theoretical plate)
• Các thông số thực nghiệm ảnh hưởng bề rộng peak
• Chiều cao đĩa lý thuyết H phụ thuộc 3 thành phần: (1)
multiple paths, (2) khuyếch tán dọc (longitudinal
diffusion), (3) chuyển khối trong pha tĩnh (mass
transfer in the stationary phase) và chuyển khối
trong pha động (mass transfer in the mobile phase).

Chromatography
Hiệu quả tách
Phương trình van Deeter (The van Deemter
Equation)
• Chiều cao đĩa lý thuyết H phụ thuộc:
– (1) Multiple Paths
Longitudinal dispersion term
– (2) Longitudinal Diffusion
– (3) Mass Transfer Mass transfer
term
B 
H  A 
C u
u A, B and C are
Multiple path term constants for
a given system
u: vận tốc trung bình của khí mang hay pha động (the average
linear velocity of the carrier gas in cm/s (or the liquid
mobile-phase velocity for liquid chromatography))
Chromatography
 Multiple Paths

Molecules passing through a stationary phase that differ in

path and length

Hp  2dp A term

Where Hp= contribution to theoretical plate

 = constant associated with consistency of packing
dp= average diameter of packing material
Open tubular column Hp=0
Chromatography
 Longitudinal Diffusion

2Dm B term
Hd 

u
Where Dm = the solute’s diffusion coefficient in the mobile phase
= constant relating to column packing
m = mobile phase velocity
B

decreases by increasing the flow rate
Chromatography
u
 Mass Transfer
Diffusion of the
solute between
the mobile and
stationary phase
interface

Where df =thickness of stationary phase

qk 'd 2f dc= the columns’ diameter

Hs  2
(1 k ') Ds
u dp= average diameter of packing material
Ds= solutes diffusion coefficient in stationary phase
Dm= solutes diffusion coefficient in mobile phase
C term q = constant related to packing material
2 2 k’ = capacity factor
fn ( d p ,d c )
Hm 
Chromatography Dm
u
the exact form of Hm is unknown
 Gas Chromatography Effiency – The van
Deemter Equation
• The net height of a theoretical plate is a
summation of three terms:
– Multiple Paths (Eddy diffusion)
Longitudinal dispersion term
– Longitudinal Diffusion
– Mass Transfer
B  Mass transfer
H  A 
C u term

Multiple path term

u
A, B and C are constants
for a given system
H: The height of a theoretical plate
u: the average linear velocity of the carrier gas in cm/s (or the liquid
mobile-phase velocity for liquid chromatography)
Chromatography
 Đường cong Van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Đường cong van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Đường cong van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Định lượng trong sắc ký lỏng
Ví dụ
– Phân tích PAH fluoranthene trong một mẫu đất
bằng phương pháp HPLC. Mẫu (2.013-g) + 20.00 mL
methylene chloride (dung môi chiết). Fluoranthene
được chiết vào pha dung môi, sau đó dịch chiết
được bay hơi còn 1-mL và được hòa tan thành 10 mL
với acetonitrile. Bơm 5 mL mẫu vào thiết bị HPLC,
tín hiệu là 0.217. Bơm 5 mL dung dịch chuẩn
fluoranthene 20.0 ppm, tính hiệu là 0.258. Tính
nồng độ ppm fluoranthene trong mẫu ban đầu

Chromatography
 Định lượng trong sắc ký khí
Ví dụ

Peak area ratio

(EtOH/PrOH)
0.24945
0.619154
1.1918
1.86534
2.39374
1.17868

The blood alcohol concentration is 0.142% (wt/vol)

Chromatography