CHƯƠNG 1

SẮC KÝ
v 1903, Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet đã phát minh
ra kĩ thuật sắc kí khi ông đang nghiên cứu về chlorophyl.
v 1931, Vinterstin và Lederer tách carotin thô thành α-carotin và
β-carotin.
v 1938, Izmailov, Shraibr và Stahl phát triển phương pháp sắc kí
lớp mỏng.
v 1941, Martin và Synge phát minh phương pháp sắc ký phân bố
tách thành công các alcaloid.
v 1952, Martin và James lần đầu tiên dùng thiết bị sắc ký khí.
v 1960, sắc kí lỏng hiệu năng cao ra đời.
• Saéc kyù: Kyõ thuaät taùch caùc caáu töû ra khoûi hoãn hôïp
döïa treân aùi löïc khaùc nhau cuûa moãi caáu töû ñoái vôùi :

– Pha tónh (stationnary phase) coù taùc duïng giöõ hoùa

chaát

– Pha ñoäng (mobile phase) trong ñoù hoùa chaát hoøa

tan
• Söï taùch chieát ñöôïc thöïc hieän trong moät
coät goïi laø coät saéc kyù (chromatographic
column):
• Pha tónh:
• Raén xoáp, phim loûng treân chaát mang raén
hay treân vaùch coät
• Pha ñoäng:
- Khí (goïi laø saéc kyù khí)
- Loûng (goïi laø saéc kyù loûng)
Moâ hình taùch chieát 3 caáu töû baèng phöông phaùp
saéc kyù
• Saéc kyù khí:
• Töông taùc giöõa chaát phaân tích vaø pha tónh
• pha tónh A, B, C

• Saéc kyù loûng:

• pha tónh pha ñoäng

• A
Hỗn hợp chất tách khỏi
nhau thế nào ?

Flow

Pha tĩnh
Tại sao lại có sự khác nhau?

Mạnh Yếu
Do lực tương tác khác nhau
 Sắc ký đồ
(Chromatogrames)

Điều kiện để thu được sắc ký đồ:

- Đầu dò (Detector) được lắp đặt ở điểm cuối của cột
- Đầu dò tương thích với các chất cần phát hiện
Sắc ký đồ: Biểu diễn sự biến thiên của tín hiệu
ra theo thời gian hoặc theo thể tích tiêu hao của
pha động

Các peaks đối xứng (hoặc không đối xứng)

Phân tích định tính (qualitative) và định lượng (quantitative)
 Sắc ký đồ
(Chromatogrames)

• Vận tốc di chuyển tương đối (relative migration rates)

• Sự giãn peak (band broadening)

Sự phân giải (resolution)

 Thông số cơ bản:
Thöøa soá dung tích (capacity factor)
•Thời gian löu cuûa hoaù chất tR: thời gian hoaù chất tính từ luùc vaøo
coät ñeán luùc ra khoûi coät
•Trong pha đ ộng, tất cả chất đ ều di chuyển cuøng vận tốc bằng
vận tốc pha đ ộng : tất cả hoaù chất khoâng bò pha tónh giöõ ñeàu cuøng
ra khoûi coät cuøng thôøi ñieåm t0
•Thời gian hoaù chất bị giữ treân pha tĩnh laø tR-to= tR’
•tR’/to đ o khả năng pha tĩnh giöõ hoaù chất trong cột
tR
o t t’R
bôm maãu

chaát khoâng bò giöõ

 Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Thời gian lưu tR
(Retention time)

Tốc độ di chuyển trung

bình của chất tan
L
v
tR

Tốc độ di chuyển trung

bình pha động
L
u
to
 Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Hệ số phân bố K
Cân bằng phân bố của chất tan trong pha động và pha tĩnh
(Partition Ratios)
Amobile Astationary
cs
K
cM
Quan hệ giữa tốc độ di chuyển và hệ số phân bố

moles of solute in mobile phase

v  u
total moles of solute
VS và VM có thể xác định dựa theo
phương pháp chuẩn bị cột
cM VM 1
v  u  u
cM VM  cSVS 1  cSVS cM VM
1
v  u
1  KVS VM
 Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)
Hệ số khả năng
Thông số thực nghiệm quan trọng
(Capacity Factor)

Mô tả tốc độ di chuyển của chất tan trong cột

Đối với chất tan A, hệ số khả năng k’A:

K AVS 1
k A'   v  u
VM 1  k A'

L L 1 tR  tM
   k A' 
t R t M 1  k A' tM
 Vận tốc di chuyển của các chất tan
(Migration rates of solutes)

Tốc độ di chuyển tương đối: Hệ số chọn lọc 

(Selectivity Factor)

KB B là cấu tử bị giữ mạnh ở trên cột

 A là cấu tử bị hấp phụ yếu hơn trên cột  
KA 1

k t R B  t M
'
  B

k t R A  t M
'
A
 Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)

Sự giãn peaks (band Một phân tử chịu hàng ngàn lần chuyển từ pha động
broadenning) sang pha tĩnh

Cần trao đổi năng lượng giữa phân tử và môi

trường xung quanh

Thời gian lưu của một phân tử trong một pha

thường có sai lệch ngẫu nhiên so với các phân tử
cùng loại khác

Khoảng cách di chuyển thực tế trong cột có thể

khác nhau giữa các phân tử

Giãn đối xứng (symmetric spread) xung quanh một

giá trị chính

Dạng hình học của peak: phân bố Gaussian hoặc

đường cong sai số chuẩn (normal error curves)
 Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
ĐỊNH LƯỢNG HIỆU QUẢ CỦA CỘT SẮC KÝ

N = L/H
Chiều cao tương đương của đĩa (H) Số đĩa lý thuyết (N)
(Plate height) (Number of theoritical plates)

Độ lệch chuẩn () 2

t 
Variance (2) N  16 R 
W 
tR = (t’)R + to

2
H
L W
 Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)

Variance thời gian của peak: 2 
L tR
Với L/tR: Vận tốc thẳng trung bình (average linear velocity) của chất phân tich

Xác định  từ thực nghiệm:

2 Vẽ 2 tiếp tuyến từ các điểm uốn
Diện tích tam giác = 96% diện tích peak
(sai lệch 2) và W= 4

LW

4t R

LW 2
H
2 16t R2
 tR 
N  16 
W  N = L/H
 Hiệu quả của cột sắc ký
(Efficiency of chromatographic colunms)
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỘT SẮC KÝ

üTốc độ dòng của pha động: Hminimum (Hiệu quả cao nhất) xuất hiện ở vùng
tốc độ thấp (0,1 – 0,2 m.s-1: LC và 1-2 m.s-1: GC)
üKích thước hạt của pha tĩnh đối với cột nhồi (column packings)
üChiều dày mỏng hơn của lớp cố định (immobilized film) khi pha tĩnh là
chất lỏng hấp thụ trên chất rắn (liquid adsorbed on a solide)
üTăng nhiệt độ sẽ làm giảm sự giãn peak đối với tất cả các trường hợp

üGiảm độ nhớt của pha động

 Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Độ phân giải của cột (Rs) cung cấp các giá trị định lượng đặc trưng cho khả năng
tách của hai chất cần phân tích

2Z 2t R B  t R A 
Rs  
WA  WB WA  WB
RS = 0,75 độ phân giải và phân tách
peak kém
RS = 1 Vùng A chứa khoảng 4% B và
vùng B chứa khoảng 4% (overlap =
4%)
RS = 1,5 phân tách peak gần tuyệt đối
(overlap = 0,3%)

Tăng độ phân giải:

Tăng chiều dài cột >< thời gian
 Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Ảnh hưởng của các hệ số khả năng và chọn lọc đến độ phân giải

Xét độ phân giải của hai chất A và B:

 Số lượng đĩa (number of plates), N

 Hệ số khả năng (capacity factor), k’B Rs
 Hệ số chon lọc (selectivity factor), 

N    1  k B' 
Rs    
Số đĩa cần thiết (chiều cao cột sắc ký để 4    1  k B' 
đạt được một độ phân giải cho trước

2 2
   1 k '

N  16 Rs2    ' B

  1  kB 
 Độ phân giải của cột (Rs)
(Column resolution)
Ảnh hưởng của độ phân giải đến thời gian lưu

Mục đích của một quá trình phân tích sắc ký

 Độ phân giải cao Xác định thời gian lưu tR

 Thời gian lưu nhỏ nhất đối với cấu tử khó tách (tR)B

t R B 
2
s
 
2

16 R H    1  k ' 2
B 
u   1 k  
' 2
B

u: Tốc độ tuyến tính của pha động

 Tóm tắt các công thức
Chiều cao đĩa (plate height) và số đĩa (number of
plates)

N = L/H
1
v  u
1  KVS VM

Hệ số khả năng (capacity factor)

Độ phân giải của cột (column resolution)

tR  tM
k A' 
tM

Hệ số chọn lọc (selectivity factor)

KB

KA
 Áp dụng
Số liệu ban đầu:
(tR)A=16.4 phút, (tR)B=17.63 phút, (tR)M=1.3 phút, chiều dài cột: L=30 cm
Độ rộng của peak tại đường nền: WA=1.11 phút và WB=1.21 phút
Tính toán: Rs, N, H, Chiều dài của cột để bảo đảm Rs=1.5 và (tR)B tương ứng.

Giải:

Rs= 2(17.63 – 16.4)/(1.11+1.21) = 1.06

N = 16(16.4/1.11)2 = 3493 và N = 16(17.63/1.21)2 = 3397

   1  k B 
'
N
Rs    
 N = (3493+3397)/2= 3445 4    1  k B
'


H = L/N = 30/3445 = 8.710- 3 cm t R B 

16 Rs2 H
2
   1 kB
 
 '

2

u    1  k B'  
2

Do k’B và  không thay đổi khi tăng chiều cao của cột, ta có:
Rs 1 N1 1.06 3445
    N 2  6.9  10 3
 R s 2 N2 1 .5 N2
L  N  H  6.9  10 3  8.7  10 3  60 cm t R 1 Rs 12 17.63 1.06 2
    t R 2  35 phut
t R 2 Rs 22 t R 2 1.5 2
 Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng
phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức
chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha
tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời
điểm cân bằng .
K’ = ( tR - t0)/ t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém .
Nếu K’ lớn thì Peak bị dãn. Trong thực tế K’
từ 1- 5 là tối ưu .
 Độ chọn lọc  :
Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống
sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác
nhau thì mới có khả năng tách ,mức độ tách biểu
thị ở Độ chọn lọc  .
 = K’B / K’A Với: K’B > K’A
với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng
 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức
sau :
N = 5,54 ( tR / W0,5)2
W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak .
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến
5500 là vừa đủ .
• Temperature
Program: 60°C
Isothermal
• Head Pressure:
12 psi
• Split Ratio: 1/50
SAÉC KYÙ KHÍ
GC-2010 với Autosampler AOC-5000 thuộc loại Combi-Pal
• Tuỳ thuộc bản chất pha tĩnh chia thành hai loại
sắc ký khí:
- Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography -
GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp
trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
- Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography
- GLC): Pha tĩnh là 1 chất lỏng không bay hơi.
Cấu tạo và hoạt động của máy sắc
ký
1.Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình
chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2
từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…).

Bình chứa áp suất cao (pressurized tank)

- Dụng cụ điều chỉnh áp suất (pressure
regulator)
- Điều khiển lưu lượng dòng khí (Flow
controller)
- N2: chi phí thấp, an toàn
- H2: chi phí thấp, nguy cơ
cháy nổ
- He: thông thường, đắt

38
2. Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích
3. Bộ phận tiêm mẫu
+ Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân
tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi.
Khi đưa mẫu vào cột,
có thể sử dụng chế độ chia dòng (split)
và không chia dòng (splitless).
+ Có 2 cách đưa mẫu vào cột:
- bằng tiêm mẫu thủ công
- tiêm mẫu tự động
(Autosamper – có hoặc không có bộ phận
hóa hơi - headspace).

39
 COÄT SAÉC KYÙ KHÍ
COÄT NHOÀI

Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được

nhồi vào
trong cột, cột có đường kính 2-4mm và chiều
dài 2-3m.
COÄT MAO QUAÛN
•  Kích côõ coät:

• - Daøi thoâng thöôøng : 12, 25, 30, 50, 60, 100m

• - Ñöôøng kính trong: 0,1; 0,18; 0,22; 0,25;

0,32; 0,53mm

• - Beà daøy phim: 0,12; 0,2; 0,25; 0,4; 1; 2; 5m

Pha tĩnh
DETECTOR Sắc ký khí
 ÑAÀU DOØ DAÃN NHIEÄT
• Tín hieäu döïa treân söï thay ñoåi ñoä daãn nhieät
cuûa khí mang khi coù hoaù chaát hieän dieän trong
khí mang
 ÑAÀU DOØ ION HOAÙ NGOÏN LÖÛA FID
1. Tín hieäu döïa treân ion sinh ra
(CHO+) khi hoaù chaát bò ñoát
chaùy döôùi taùc duïng ngoïn löûa
taïo ra bôûi söï ñoát chaùy hidro.
Ion sinh ra taïo doøng ñieän
ñöôïc khueách ñaïi vaø bieán ñoåi
thaønh peak saéc kyù.
2. Döôùi taùc duïng ngoïn löûa, coù
söï taïo thaønh caùc goác CHn* ,
OH*, O2* ôû bieân ngoïn löûa,
phaûn öùng sinh ra CHO+ :
C* + OH* CHO+ + e_
3. Ñoä nhaïy cao với chaát höõu cô
coù nhieàu CH
 ÑAÀU DOØ COÄNG KEÁT ÑIEÄN TÖÛ ECD
• Nguyeân taéc vaän haønh :
• 1. Moät nguoàn phoùng xaï, 63 Ni
phoùng thích ñieän tö ûß
• Caùc ñieän töû ß ion hoaù khí mang
N2 taïo ra ñieän töû coù naêng löôïng
thaáp (ñieän töû nhieät):
• N2 + ß N2+ + e-
• Do ñoù coù söï sinh ra moät doøng
ñieän goïi laø doøng ñieän neàn
• 2. Khi coù theâm hoaù chaát coù chöùa
nhöõng nguyeân töû coù ñoä aâm ñieän
lôùn nhö F, Cl, Br, I, O, NO2,
CN… , caùc phaân töû hoaù chaát naøy
baét bôùt ñieän töû, laøm cho doøng
ñieän giaûm, daãn ñeán söï taïo thaønh
peak saéc kyù ñaëc tröng cho hoaù
• ÑAÀU DOØ ION HOAÙ NHIEÄT NPD
.
1 Ñaëc tröng cho caùc hôïp chaát coù N,P
2. Caáu truùc gaàn gioáng ñaàu doø FID, coù theâm moät vieân laø
muoái Rb, Cs ( silicat, bromua…) noái vaøo ñieän cöïc aâm
3. Vieân muoái Rb (giaû sử silicat) ñöôïc ñoát noùng ( 800oC)
vaø coù söï taïo thaønh caùc Rb*
 DETECTOR FPD
• Nguyeân taéc :
• Trong ngoïn löûa khoâng khí- hidro giaøu hidro, hôïp chaát coù P hay S phoùng thích
böùc xaï xanh luïc hay xanh lô, caùc böùc xaï naày sau khi qua kính loïc ñöôïc ño
baèng moät teá baøo quang nhaân (photomultiplier)
 Ưu nhược điểm của sắc ký khí
• Ưu điểm:
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
- Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)
• Nhược điểm:
Phương pháp này ít chọn lọc do không loại trừ
hết được ảnh hưởng của nền mẫu
 Ứng dụng
• Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến
vài trăm °C
• Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và
hỗn hợp
• Được ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử
trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau
• Thiết bị đơn giản và rẻ
• Nhanh chóng
• Dễ dàng kết nối với phổ khối
58
ỨNG DỤNG CỦA SẮC
KÝ KHÍ TRONG LỌC
DẦU VÀ HÓA DẦU
A. REFINING
PHÂN TÍCH KHÍ
Lấy mẫu
CHƯNG CẤT MÔ PHỎNG
PHÂN TÍCH LOẠI
HYDROCARBON
PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT
NITROGEN VÀ SULFUR
B. PETROLEUM CHEMICAL
1. OLEFINS
1.1. ETHYLENE
1.2. PROPYLENE
1.3. BUTADIENE
2. AROMATICS
 Xác định n-paraffin
• Mẫu dầu thô, phân đoạn dầu mỏ từ các mỏ dầu
đang khai thác ở Việt Nam
• Máy sắc ký (GC): HP 6890 plus
- Cột sắc ký HT-5 dài 25m, đường kính trong
0,32mm, lớp chất hấp phụ dầy 0,1 micromet.
- Detector ion hoá ngọn lửa (FID), nhiệt độ
350oC.
- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 315oC.
- Nhiệt độ lò: tăng dần từ To đầu đến 415oC, giữ
đẳng nhiệt ở 415oC đến kết thúc.
- Lượng mẫu: 1 microlit.
Phổ sắc ký toàn phần phân tích một mẫu dầu Miocen mỏ Bạch Hổ
theo hai phương pháp, thời gian phân tích bằng nhau (112 phút)