Phương pháp sắc ký

(Chromatography)

Chromatography
 Phương pháp sắc ký

• Lịch sử của phương pháp sắc ký

• Phương pháp sắc ký là gì
• Phân loại các phương pháp sắc ký
• Các thông số cơ bản của phương pháp sắc ký
• Ứng dụng

Chromatography
 Lịch sử sắc ký
1903 (1872 – 1919) Nhà thực vật học người Nga
Mikhail Tswett trình bày thí nghiệm về sắc ký

1941 Martin và Singe xây dựng lý thuyết tách

bằng sắc ký (Nobel Prize năm 1952)

Ngày nay, sắc ký là một trong những phương pháp

tách quan trọng và được ứng dụng rộng rãi nhất

Chromatography
 Lịch sử phương pháp sắc ký
Mikhail Tswett
(1872-1919) Chromatography
Pha động:
ete dầu hỏa

Pigments Dịch
(chrophylls) chiết lá
cây
(carotenoids)

Pha tĩnh
(CaCO3)

Chromatography
 Nguồn: Internet

Chlorophyll
Carotenoid
Chromatography
 Lịch sử phương pháp sắc ký

C
A
B

Nguồn: Internet

Chromatography
 Phân loại phương pháp sắc ký
Pha động: Dung môi: đắt tiền, độc hại
(Non-polar) Nước? Pha động (mobile
phase phase): chất lỏng
Cấu tử: A, B, C (liquid)
Pha tĩnh
Dịch chiết (stationary phase):
lá cây (Polar chất rắn (solid)
compounds)
Sắc ký lỏng (liquid
chromatography)
Non-polar? A
Cấu tử - pha tĩnh :
Pha tĩnh
B polar like polar
(Polar C A: phân cực nhất
phase)
C: ít phân cực nhất

Pha động (Non-polar), pha tĩnh (Polar) Sắc ký cột

Chromatography Sắc ký pha thường (Normal phase)
 Nguồn: Internet
(A) bề mặt silica (B) bề mặt silica
(polar) – C8 (non-polar)
Chromatography
 Phân loại phương pháp sắc ký
Pha động: Hỗn hợp nước và dung môi
(Polar) (Độ phân cực, độ mạnh rửa giải)
Pha động (mobile
Cấu tử: A’, B’, C’
phase): liquid
Pha tĩnh
Cấu tử (stationary phase):
(Non solid
Polar)
Sắc ký lỏng (liquid
chromatography)
A’ Cấu tử - pha tĩnh :
non-polar like non-
Pha tĩnh
B’
polar
(Non C’ C’: phân cực nhất
Polar)
A’: không phân cực
nhất
Pha động (Polar), pha tĩnh (Non-Polar) Sắc ký cột
Chromatography Sắc ký pha đảo (Reversed phase)
 Sắc ký là gì?

Sắc ký là phương pháp vật lý, tách các cấu tử dựa

trên khả năng phân bố của các cấu tử giữa pha
tĩnh và pha động

Chromatography
 Phân loại phương pháp sắc ký
• Tính chất vật lý của pha động
– Sắc ký lỏng (pha thuận, pha đảo,…)
– Sắc ký khí
• Kiểu tương tác giữa pha tĩnh và pha động
– Sắc ký cột
– Sắc ký phẳng (bản mỏng, giấy)
• Cơ chế tách (sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, trao
đổi ion, rây phân tử)
• Mục đích
– Sắc ký phân tích
– Sắc ký điều chế
Chromatography
 Phân loại các phương pháp sắc ký
• PP sắc ký được phân loại theo nhiều cách: :
– (1) theo trạng thái vật lý của pha động và pha
tĩnh
– (2) theo phương pháp tiếp xúc giữa pha động và
pha tĩnh
– (3) theo cơ chế tách

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (1) Theo tính chất vật lý của pha động và
pha tĩnh:
– Pha động (mobile phase) thường là lỏng (liquid)
hoặc khí (gas), pha tĩnh (stationary phase)
thường là rắn (solid) hoặc lỏng (liquid) phủ trên
bề mặt chất rắn mang.
– Gọi tên phương pháp sắc ký theo tính chất vật lý
của pha động và pha khí (ví dụ: gas–liquid
chromatography (pha động khí, pha tĩnh lỏng)
– Gọi tên phương pháp sắc ký theo pha động:
liquid chromatography (LC) (sắc ký lỏng, pha
động lỏng), gas chromatography (GC) (sắc ký khí,
pha động khí).

Chromatography
 Sắc ký khí (GC)

Chromatography
 Sắc ký khí (Gas Chromatography)

– Pha động (Mobile Phase)

– Cột phân tích (Chromatographic Columns)
– Pha tĩnh (Stationary Phases)
– Bơm mẫu (Sample Introduction)
– Nhiệt độ (Temperature Control)
– Đầu dò (Detectors for Gas Chromatography)
– Ứng dụng định lượng (Quantitative Applications)

Chromatography
 GC
Sơ đồ thiết bị

Schematic diagram for a typical gas chromatograph

Chromatography
 GC
Sơ đồ thiết bị

Chromatography
 Cột sắc ký (GC Column)

Chromatography
 GC Column

Chromatography
 GC column

Chromatography
 Pha tĩnh (Stationary Phase)
• Cột nhồi (Packed columns)
• Cột mao phản (Capillary columns)
– Wall-coated open-tubular (WCOT)
Cột mao quản, thành cột phủ lớp pha tĩnh lỏng
– Support coated open-tubular (SCOT)
Cột mao quản, pha tĩnh lỏng phủ trên bề mặt
chất mang gắn trên thành cột
– Porous layer open-tubular (PLOT)
Cột mao quản, thành cột phủ lớp pha tĩnh rắn

Chromatography
 Pha tĩnh

Chromatography
 Pha tĩnh

Glass
surface

An example of a trimethylsilyl deactivating group.

Chromatography
 GC column

Chromatography 24
Sắc ký đồ (chromatogram)
• GC

Typical gas chromatogram of complex mixture using a capillary column

Chromatography
 Sắc ký khí

- Phân tích khí (All gases)

- Phân tích các hợp chất hữu cơ

Chromatography
 Sắc ký lỏng (High-Performance Liquid
Chromatography)
– Pha động (Mobile Phases)
– Cột phân tích (HPLC Columns)
– Pha tĩnh (Stationary Phases)
– Bơm mẫu (Sample Introduction)
– Đầu dò (Detectors for HPLC)
– Ứng dụng định lượng (Quantitative Applications)

Chromatography
 Sắc ký lỏng

Chromatography
 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng

Schematic diagram of a high-performance

liquid chromatograph
Chromatography
 Cột phân tích (HPLC column)

Chromatography
 HPLC silica Bonded Phases

Cyano
SAX
Amino

Methyl Hexyl C8 C8

Butyl
Phenyl C18
C18

SCX
Chromatography 31
 Sắc ký đồ (HPLC chromatogram)

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (2) Phân loại dựa trên phương pháp tiếp
xúc giữa pha động và pha tĩnh
– Sắc ký cột (Column chromatography)
– Sắc ký phẳng (Planar chromatography)
• Sắc ký giấy
• Sắc ký bản mỏng

Chromatography
 Sắc ký giấy (Paper Chromatography)

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (3) Dựa trên cơ chế tách
– Sắc ký hấp phụ (Adsorption chromatography):
• Pha tĩnh rắn
• Tách dựa trên khả năng hấp phụ khác nhau của các
chất tan trên pha tĩnh rắn.
– Sắc ký phân bố (Partition chromatography):
• Pha tĩnh lỏng
• Tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các
chất tan giữa pha tĩnh lỏng và pha động.

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
• (3) Dựa trên cơ chế tách
– Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange
chromatography):
• Pha tĩnh rắn có các nhóm chức trao đổi ion (cation, –SO3–
hay anion,–N(CH3)3+)
• Chất tan (ion) tương tác pha tĩnh dựa trên lực tĩnh điện
khác nhau (electrostatic forces)
– Sắc ký rây phân tử (Size-exclusion
chromatography):
• Pha tĩnh là porous gel
• Tách dựa trên kích thước của chất tan

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký
– Sắc ký điện di (Electrophoretic separation):
Tách không cần pha tĩnh
• Chất tan mang điện tích (charged solutes) di chuyển
(migrate) dưới tác dụng của nguồn điện ngoài
• Tách dựa trên tính di động (mobility) khác nhau của
chất tan.

Chromatography
 Phân loại các pp sắc ký (3)
a) Sắc ký hấp phụ
(Adsorption
chromatography)

b) Sắc ký phân bố
(Partition
chromatography)

c) Sắc ký trao đổi ion

(Ion-exchange
chromatogIonraphy)

d) Sắc ký rây
phân tử (Size-
exclusion
chromatography)

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

Progress of a
column
chromatographic
separation
showing the
separation of
two solute
bands.

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký
– Sắc ký đồ (chromatogram)
Biểu diễn tín hiệu của detector theo thời gian
lưu
– Thời gian lưu (retention time)
Thời gian chất tan đi từ đầu (injector) đến
detector (tr).
– Bề rộng peak (baseline width)
Bề rộng peak sắc ký đo tại đường nền (w).

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

– void time (tm)

Thời gian cho chất không bị lưu giữ di chuyển
từ vị trí bơm mẫu tới đầu dò (The time
required for unretained solutes to move from
the point of injection to the detector.

Chromatography
 Các thông số cơ bản của pp sắc ký

tr : thời gian lưu

(retention time)
tm : void time

W : bề rộng chân
peak (baseline
width)

Chromatography
 Độ phân giải (Resolution)

Độ phân giải (Resolution –

R) biểu diễn khả năng tách
của cột phân tích giữa 2
peak sắc ký.

Độ phân giải – Ví dụ
Chromatography
 Độ phân giải – Ví dụ

Trong phân tích tinh dầu chanh bằng phương pháp

sắc ký, peak limonene có thời gian lưu 8.36 phút
với bề rộng chân peak 0.96 phút và peak g-
Terpinene có thời gian lưu 9.54 phút với bề rộng
chân peak 0.64 phút. Tính độ phân giải giữa 2
peak.

Chromatography
 Hệ số phân bố K
– Hệ số phân bố
• Biểu diễn khả năng lưu giữ chất phân tích
bởi pha tĩnh

K = Cs/CM

K hệ số phân bố
Cs: Nồng độ cấu tử trong pha tĩnh
CM: Nồng độ cấu tử trong pha động

Chromatography
 Hệ số chứa k’ (capacity factor)

– Hệ số chứa k’ (capacity factor)

• Biểu diễn khả năng lưu giữ chất phân tích bởi pha tĩnh (A
measure of how strongly a solute is retained by the
stationary phase).

– Thời gian lưu biểu kiến (adjusted retention time)

• The difference between a solute’s retention time and
column’s void time (tr’).

Chromatography
 Hệ số chứa (capacity factor)

– Phân tích butyric acid bằng phương pháp sắc ký,

thời gian lưu của acid này là 7.63 phút, tM = 0.31
phút. Tính hệ số chứa của cấu tử.

Chromatography
 Độ chọn lọc của cột
(Column Selectivity)
– Hệ số chọn lọc (α) (selectivity factor)
• The ratio of capacity factors for two solutes showing
the column’s selectivity for one of the solutes.

Chromatography
 Hệ số chọn lọc – Ví dụ
– Phân tích hỗn hợp acid bằng phương pháp sắc ký,
thời gian lưu của butyric acid là 7.63 phút và thời
gian lưu của isobutyric acid là 5.98 phút, tM = 0.31
phút. Tính hệ số chọn lọc giữa isobutyric acid và
butyric acid.

butyric

isobutyric

Chromatography
 Hiệu năng của cột phân tích (Column
Efficiency)

– Số đĩa lý thuyết (theoretical plate)

– Chiều cao đĩa lý thuyết của cột (the
height of a theoretical plate)

With N: theoretical plates

L: the column length

H: the height of a theoretical plate

Chromatography
 Hiệu năng của cột phân tích
– Số đĩa lý thuyết (The number of theoretical
plates)
• Số đĩa lý thuyết phụ thuộc tính chất của cột và chất
phân tích
• Số đĩa lý thuyết khác nhau với các chất phân tích

tr: thời gian lưu (the

retention time)
W: bề rộng chân peak
(the width of the
chromatographic peak)
W1/2: bề rộng chân peak tại phân
nửa chiều cao peak (the width of
the chromatographic peak at half
Chromatography
its height)
 Số đĩa lý thuyết
Ví dụ
– Sắc ký đồ cho biết peak Dieldrin (thuốc trừ sâu
họ Clo) có thời gian lưu của là 8.68 phút (bề rộng
chân peak W = 0.29 phút). Tính số đĩa lý thuyết
N của cột. Chiều dài cột là 2 mét. Tính chiều cao
đĩa lý thuyết H của cột.

Chromatography
 Nonideal Behavior
– Peak không đối xứng (fronting)
• A tail at the beginning of a chromatographic peak,
usually due to injecting too much sample (a).
– Peak không đối xứng (Tailing) (peak kéo đuôi)
• A tail at the end of a chromatographic peak, usually
due to the presence of highly active sites in the
stationary phase (b).

Chromatography
 Tối ưu hiệu quả tách (Optimizing
Chromatographic Separations)

NB: the number of kB’, (the effect of

theoretical plates α : the influence of solute B’s capacity
(the effect of column selectivity factor)
column efficiency)

(1) (2) (3)

Chromatography
 Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
• Tăng k’B (khi k’B nhỏ)
– Tăng k’B từ 1 lên 10, hiệu quả tách tăng 82%, từ
1 lên 15, hiệu quả tách tăng 87.5%.
– Tăng k’, chất phân tích nằm lâu hơn trong cột,
thời gian phân tích tăng, chí phí tăng, peak dễ
giãn rộng.

Chromatography
 • Tăng k’B
– Sắc ký khí: giảm nhiệt độ cột phân tích
• At a lower temperature a solute’s vapor pressure
decreases (it spends more time in the stationary
phase). Therefore, its capacity factor increases.

Chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí (Temperature

programming in gas chromatography)
The process of changing the column’s temperature to
enhance the separation of both early and late eluting
solute accomplished.

Chromatography
 GC
Chương trình nhiệt độ
(A typical temperature program)
(c)

(b)

(a)

(a) = nhiệt độ ban đầu và thời gian (initial temperature and time)
(b) = ramp (˚C/min)
(c) = nhiệt độ cuối và thời gian (final hold time and temperature

Some GCs will allow for far more complex temperature programming
Chromatography
 Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
• Tăng k’B
– Sắc ký lỏng: giảm độ mạnh của dung môi (By
decreasing the solvent strength in liquid
chromatography)
• When the mobile phase has a low solvent strength,
solutes spend proportionally more time in the
stationary phase, thereby increasing their capacity
factors.
Chương trình gradient dung môi trong sắc ký lỏng (Gradient
elution in liquid chromatography)
The process of changing the mobile phase’s solvent
strength to enhance the separation of both early and late
eluting solutes.
Chromatography
Thay đổi kB’ (Capacity Factor) tăng
hiệu quả tách (Optimize Resolution) (3)
Ví dụ

Chromatography
 Thay đổi hệ số chọn lọc (column
selectivity) tăng hiệu quả tách
(Optimize Resolution) (2)
– a (hệ số chọn lọc).
• when a is nearly 1, it usually is not possible to improve
resolution by adjusting k’B or N.
• changing a from 1.1 to 1.5 improves resolution by
267%.
– Trong GC, thay đổi a bằng cách thay đổi pha
tĩnh
– Trong LC, thay đổi a bằng cách thay đổi thành
phần pha động

Chromatography
Thay đổi hệ số chọn lọc tăng hiệu quả
tách (2)
Ví dụ

Sự thay đổi thời gian lưu theo pH pha động

Chromatography
Thay đổi hệ số chọn lọc tăng hiệu quả
tách (2)
Ví dụ

Sự thay đổi của hệ số chọn lọc theo pH pha động

Chromatography
 Thay đổi hiệu năng cột (Column
Efficiency) tăng hiệu quả tách
(Optimize Resolution) (1)
– Tăng chiều dài cột (L) (tăng thời gian lưu)
– Giảm chiều cao đĩa lý thuyết (Decrease the
height of a theoretical plate)
• Các thông số thực nghiệm ảnh hưởng bề rộng peak
• Chiều cao đĩa lý thuyết H phụ thuộc 3 thành phần: (1)
multiple paths, (2) khuyếch tán dọc (longitudinal
diffusion), (3) chuyển khối trong pha tĩnh (mass
transfer in the stationary phase) và chuyển khối
trong pha động (mass transfer in the mobile phase).

Chromatography
Hiệu quả tách
Phương trình van Deeter (The van Deemter
Equation)
• Chiều cao đĩa lý thuyết H phụ thuộc:
– (1) Multiple Paths
Longitudinal dispersion term
– (2) Longitudinal Diffusion
– (3) Mass Transfer Mass transfer
term
B 
H  A 
C u
u A, B and C are
Multiple path term constants for
a given system
u: vận tốc trung bình của khí mang hay pha động (the average
linear velocity of the carrier gas in cm/s (or the liquid
mobile-phase velocity for liquid chromatography))
Chromatography
 Multiple Paths

Molecules passing through a stationary phase that differ in

path and length

Hp  2dp A term

Where Hp= contribution to theoretical plate

 = constant associated with consistency of packing
dp= average diameter of packing material
Open tubular column Hp=0
Chromatography
 Longitudinal Diffusion

2Dm B term
Hd 

u
Where Dm = the solute’s diffusion coefficient in the mobile phase
= constant relating to column packing
m = mobile phase velocity
B

decreases by increasing the flow rate
Chromatography
u
 Mass Transfer
Diffusion of the
solute between
the mobile and
stationary phase
interface

Where df =thickness of stationary phase

qk 'd 2f dc= the columns’ diameter

Hs  2
(1 k ') Ds
u dp= average diameter of packing material
Ds= solutes diffusion coefficient in stationary phase
Dm= solutes diffusion coefficient in mobile phase
C term q = constant related to packing material
2 2 k’ = capacity factor
fn ( d p ,d c )
Hm 
Chromatography Dm
u
the exact form of Hm is unknown
 Gas Chromatography Effiency – The van
Deemter Equation
• The net height of a theoretical plate is a
summation of three terms:
– Multiple Paths (Eddy diffusion)
Longitudinal dispersion term
– Longitudinal Diffusion
– Mass Transfer
B  Mass transfer
H  A 
C u term

Multiple path term

u
A, B and C are constants
for a given system
H: The height of a theoretical plate
u: the average linear velocity of the carrier gas in cm/s (or the liquid
mobile-phase velocity for liquid chromatography)
Chromatography
 Đường cong Van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Đường cong van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Đường cong van Deemter
Ví dụ

Chromatography
 Định lượng trong sắc ký lỏng
Ví dụ
– Phân tích PAH fluoranthene trong một mẫu đất
bằng phương pháp HPLC. Mẫu (2.013-g) + 20.00 mL
methylene chloride (dung môi chiết). Fluoranthene
được chiết vào pha dung môi, sau đó dịch chiết
được bay hơi còn 1-mL và được hòa tan thành 10 mL
với acetonitrile. Bơm 25 µL mẫu vào thiết bị HPLC,
tín hiệu là 0.217. Bơm 25 µL dung dịch chuẩn
fluoranthene 20.0 ppm, tính hiệu là 0.258. Tính
nồng độ ppm fluoranthene trong mẫu ban đầu.

Chromatography
 Định lượng trong sắc ký khí
Ví dụ

Peak area ratio

(EtOH/PrOH)
0.24945
0.619154
1.1918
1.86534
2.39374
1.71868

The blood alcohol concentration is 0.142% (wt/vol)

Chromatography