SẮC KÝ: ĐẠI CƯƠNG và CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Chromatography: generality and theoretical basis

12/ 2023
1
Dành cho lớp Cao đẳng Dược
 SẮC KÝ: ĐẠI CƯƠNG và CƠ SỞ LÝ THUYẾT
MỤC TIÊU

1/- Nêu được nguyên lý tách của sắc ký

2/- Trình bày cách phân loại kỹ thuật sắc ký
3/- Nêu các đại lượng đặc trưng cho các kỹ thuật sắc ký
4/- Nêu ứng dụng của kỹ thuật sắc ký trong ngành Dược

2
 SẮC KÝ: ĐẠI CƯƠNG và CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Nội dung

1.LỊCH SỬ CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

2. NGUYÊN LÝ TÁCH
3. QÚA TRÌNH TÁCH SẮC KÝ
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.1. THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIƯ PHA TĨNH
4.2. THEO CƠ CHẾ TÁCH SẮC KÝ
4.3. THEO PHƯƠNG CÁCH CHO PHA ĐộNG CHẠY QUA PHA TĨNH
4.4. THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.1. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ LỚP MỎNG, GiẤY
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG
CAO (HPLC)
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.1. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
1. LỊCH SỬ CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

4
2. NGUYÊN LÝ TÁCH
Sắc ký: qui trình trong đó các chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển
khác nhau về động lực học của các chất này trong một hệ thống 2 hay nhiều pha.
 Một trong các pha này chuyển động một cách liên tục theo một hướng nhất định và
trong pha này các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau là do có sự khác nhau giữa
chúng về sự phân bố, sự hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan và áp suất
hơi. Các chất riêng biệt được tách ra có thể được xác định bằng các pp phân tích.
mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động
Pha động có thể một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho
là đi qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó.
Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn.
Các chất tan là sẽ di chuyển qua pha tĩnh theo pha động với tốc độ khác nhau tùy
thành phần của thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh – pha động và chất tan.
mẫu phân tích Các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượng

5
3. QÚA TRÌNH TÁCH SẮC KÝ
Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai
đoạn chính:
3.1/-Đưa hỗn hợp Ví dụ: đưa các sắc tố lên đầu cột calci
lên pha tĩnh cacbonat.
Các chất được giữ trên pha tĩnh.
3.2/-Cho pha động Ví dụ: dung môi ete dầu hỏa qua cột. Giai
chạy qua pha tĩnh đoạn này gọi là khai triển sắc ký.
- Nếu các chất được tách trên pha tĩnh
(sắc ký khai triển) có thể lấy từng phần
pha tĩnh có mang chất được tách (phân
đoạn bột trên cột, vệt trên bản mỏng)
đem chiết lấy chất.
-Nếu các chất được tách ra ngoài pha
tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng lấy
các phân đoạn dịch rửa giải có chất được Sự tách SK và SK đồ
tách.
3.3/-Phát hiện các Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các
chất chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho
dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát
hiện gọi là detector đặt sau cột.
6
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

4.1/- Theo phương cách lưu giữ pha tĩnh Sắc ký trên cột
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký giấy
4.2/- Theo cơ chế tách sắc ký Sắc ký hấp phụ
Sắc ký phân bố
Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký rây phân tử
Sắc ký ái lực
4.3/- Theo phương cách pha động chảy qua pha tĩnh Sắc ký khai triển
Sắc ký rửa giải
4.4/- Theo bản chất vật lý các pha Sắc ký lỏng – lỏng
Sắc ký lỏng – rắn
Sắc ký khí – lỏng
Sắc ký khí – rắn

7
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.1. THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIƯ PHA TĨNH

- Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography, CC)

- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)
- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography,
HPLC)
- Sắc ký lỏng siêu áp (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)

8
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.2. THEO CƠ CHẾ TÁCH SẮC KÝ

4.2.1/- Sắc ký hấp phụ (Adsorption

Chromatography):
Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự phân tách các chất tan là
do sự cân bằng hấp phụ trên bề mặt của chất tan
giữa các tiểu phân chất rắn của pha tĩnh với pha động
(đó là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn).
Đây là kiểu sắc ký cổ nhất
4.2.2. Sắc ký phân bố (Partition
Chromatography):
Là kỹ thuật sắc ký trong đó chất tan được tách
riêng ra là do sự cân bằng về sự phân bố của
chất tan giữa pha tĩnh lỏng (chất lỏng này được
bao trên bề mặt một chất rắn trơ, không tham gia
vào quá trình sắc ký gọi là chất mang (support))
và pha động có thể là lỏng hay khí. Đây là kiểu
sắc ký phổ biến nhất.
Chất phân tích hòa tan trong pha tĩnh lỏng
bao trên bề mặt chất mang rắn 9
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.2. THEO CƠ CHẾ TÁCH SẮC KÝ
4.2.3. Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange
Chromatography):
Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự phân tách các chất tan là
do lực hút tĩnh điện giữa các phân tử chất tan mang điện
tích trái dấu với các nhóm cation [-N(CH3)3]+ hay anion
(-SO3)- liên kết cộng hóa trị với các tiểu phân của pha
tĩnh (thường gọi là nhựa trao đổi ion).
4.2.4. Sắc ký loại trừ phân tử (Sắc ký rây phân tử,
Size-exclusion Chromatography):
Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự tách riêng chất tan dựa
vào kích thước khác nhau của phân tử chất tan khi đi
qua lỗ trống của các gel. Các phân tử có kích thước nhỏ
bị giữ lại trong các lỗ trống của gel nên chuyển động
chậm hơn còn các phân tử có kích thước lớn hơn không
bị giữ lại nên chuyển động nhanh hơn khi đi qua cột.
Trong kiểu sắc ký này không có bất kỳ một tương tác
nào giữa chất tan và pha tĩnh giống như trong các kiểu
sắc ký thông thường.
10
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.2. THEO CƠ CHẾ TÁCH SẮC KÝ
4.2.5. Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography):
Ví dụ:
phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh là một kháng thể của một protein. Khi
cho hỗn hợp gồm hàng ngàn protein qua cột, chỉ có một protein phản ứng với
kháng thể được giữ lại trên cột, còn các protein còn lại được rửa khỏi cột.
Protein bị giữ lại trên cột sẽ được tách ra khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH
hay nồng độ ion trong pha động
Đây là một kiểu sắc ký mới và có tính chọn lọc cao, dựa vào tương tác đặc hiệu
giữa một loại phân tử chất tan với một phân tử thứ hai liên kết cộng hóa trị với
pha tĩnh.

11
CƠ CHẾ HẤP PHỤ
dung
Dung moâi
môi

A và B
dung môi
bị hấp phụ chiếm chỗ
trên pha tĩnh

A B

A bị phản hấp phụ ra trước B

(A : kém phân cực hơn B) 12
CƠ CHẾ PHÂN BỐ

CHCl3 CHCl3 CHCl3

20 04 0.8

100 80 20 16 04 3.2

CHCl3 CHCl3
alkaloid base
(k = 1/4)
80 16
13
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION
Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả và hiện đại để tách các ion dựa
vào các nhựa trao đổi ion (pha tĩnh). Nhựa trao đổi ion (ionit) là những hợp chất
cao phân tử, thể rắn, không tan trong nước và có chứa nhóm chức có khả năng
trao đổi.
Gồm 2 loại:
Nhựa trao đổi cation (cationit): Có 2 loại:
Cationit acid mạnh có nhóm acid sulfonic -SO3-H+.
Cationit acid yếu có nhóm acid cacboxylic -COO-H+.

Nhựa trao đổi anion (anionit): Có 2 loại:

Anionit base mạnh có nhóm amin bậc 4 -N(CH3)3+OH-.
Anionit base yếu có nhóm amin bậc 1 -NH3+OH-.

14
CƠ CHẾ RÂY PHÂN TỬ
Cơ chế rây phân tử ngược với cơ chế rây cơ học. Ở đây pha tĩnh là hệ thống gel
có đặc điểm là các lỗ xốp có kích thước cỡ phân tử. Chất tan trong pha động đi
qua chất gel này bằng kỹ thuật thẩm thấu.
Các phân tử lớn không thẩm thấu được vào các lỗ xốp của pha tĩnh, chúng được
rửa giải bằng một thể tích dung môi bằng với thể tích của pha động.
Những phân tử nhỏ ở trong hay ở ngoài gel đòi hỏi một lượng chất rửa giải nhiều
hơn.

15
CƠ CHẾ ÁI LỰC

16
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.3. THEO PHƯƠNG CÁCH CHO PHA ĐộNG CHẠY QUA PHA TĨNH

Sắc ký khai triển pha động đưa các thành phần trong mẫu di chuyển và tách
(Development ngay trên pha tĩnh. Sắc ký đồ nằm trên pha tĩnh. Sắc ký khai
chromatography) triển thường thực hiện trên mặt phẳng.
Sắc ký rửa giải pha động đưa các thành phần trong mẫu di chuyển lần lượt
(Elution ra ngoài pha tĩnh. Sắc ký đồ nằm ngoài pha tĩnh. Sắc ký rửa
chromatography) giải thường thực hiện trên cột.

17
Sắc ký khai triển Sắc ký rửa giải
4. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
4.4. THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA
Tên kỹ thuật Pha tĩnh Loại cân bằng
- Sắc ký lỏng (liquid - Chất lỏng được hấp - Phân bố giữa hai pha lỏng
chromatography): phụ trên 1 chất rắn - Phân bố giữa pha lỏng và
- pha động là chất lỏng (chất mang) bề mặt pha liên kết
- Pha liên kết - Hấp phụ
- Chất rắn

- Sắc ký khí (gas
chromatography, GC):
- pha động là chất khí
- Sắc ký lỏng siêu tới
hạn (supercritical fluid
chromatography, SFC):
- pha động là chất lỏng
siêu tới hạn
- Chất lỏng được hấp - Phân bố giữa pha khí và
phụ trên chất rắn pha lỏng
- Pha liên kết - Phân bố giữa pha khí và
- Chất rắn pha liên kết
- Hấp phụ
- Pha liên kết - Phân bố giữa pha lỏng siêu
tới hạn và pha liên kết
18
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ

Xét sự tách hai chất A và B trên cột (Hình 1). Khởi

đầu, tại thời điểm t0, cho hỗn hợp hai chất A, B
lên đầu cột, ở đó A và B tự phân bố vào hai pha
(một cách khác nhau). Thêm một ít dung môi
mới vào cột, phần dung môi mới sẽ đẩy dung
môi có hòa tan A, B xuống phần cột bên dưới.
Tiếp tục thêm dung môi mới, A và B sẽ bị kéo dần
xuống và ở thời điểm t1 đã tách khỏi nhau tuy
chưa hoàn toàn. Tại thời điểm t2, hai dải A và B
tách riêng khỏi nhau ở trên cột: ta có sắc ký đồ
ngay trên cột (hình cột ứng với t2).
Hình 1.

Nếu tiếp tục thêm dung môi mới, tới thời điểm t3 dải chất A ra khỏi cột, gặp
detector và cho ta tín hiệu dưới dạng một đỉnh hay một pic. Ta thu được một sắc
ký đồ gồm 2 pic riêng biệt ứng với 2 chất A và B. Vị trí của pic trên trục thời gian
là cơ sở để định tính chất tương ứng và diện tích đỉnh hay chiều cao đỉnh là đặc
trưng định lượng của chất. 19
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ

Ảnh hưởng của tốc độ di chuyển của chất tan và sự mở rộng dải đối với sự tách
sắc ký:
Ở hình 2 vẽ mô tả nồng độ chất tan tại các dải A và B trên cột ở hình 1 tại thời
điểm t1 và t2. trục tung chỉ nồng độ và trục hoành chỉ quảng đường chất tan
di chuyển trên cột.

Hình 1. - ở thời điểm t1, hai dải A và B còn

xen phủ nhau một phần.
Tại t2, chúng đã tách khỏi nhau (ở
phần dưới cột). Nếu cột có độ dài
cần thiết sẽ có thể tách riêng các
chất trên đó.
Nhận xét khác: theo thời gian,
trong quá trình di chuyển, các dải
bị mở rộng làm ảnh hưởng đến
Hình 2: Nồng độ chất tan
việc tách hai dải cạnh nhau.
tại các dải A và B trên cột ở
hình 1 tại thời điểm t1 và t2 20
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ

Trên hình 3 ở sắc ký đồ (a) hai pic xen phủ

nhau. Để tách riêng 2 pic, có thể thay đổi tốc
độ di chuyển chất tan (tăng tốc độ của chất
thứ nhất, giảm tốc độ của chất thứ hai) bằng
cách thay đổi điều kiện sắc ký: xem sắc ký
đồ (b).
- có thể giảm sự mở rộng dải (giảm sự giãn pic):
xem sắc ký đồ (c).
Như vậy để có thể tách sắc ký được tốt, cần
quan tâm đến tốc độ di chuyển của các chất
Hình 3: Tách hai chất xen phủ.
tan và hiện tượng giãn pic.

Từ hình 3, hai chất khi qua cột sắc ký nếu không được tách tốt sẽ cho hai pic xen
phủ nhau trên sắc ký đồ (a).
Để hai chất được tách hoàn toàn khỏi nhau :
Hai pic phải cách xa nhau nghĩa là hai chất phải có tốc độ di chuyển khác nhau
rõ rệt (hay bị lưu giữ mạnh yếu khác nhau rõ rệt trên cột): sắc ký đồ (b).
Hai pic phải gọn (hẹp và cân đối) nghĩa là không có sự giãn pic (hay sự mở rộng
21
dải): sắc ký đồ (c).
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.1. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ LỚP MỎNG, GiẤY

Vị trí các vết trên dR v

sắc ký đồ có thể Rf  
xác định nhờ chỉ dM V0  0  Rf  1 Đường
số Rf dung
(Retardation môi
factor)
- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm tại điểm xuất
phát dM
- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của dung môi
- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách dR
- dM: khoảng di chuyển được của dung môi
- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách
x
1 2
- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

22
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.1. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ LỚP MỎNG, GiẤY
-Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
Các -Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường chạy sắc ký,
yếu tố lượng chất chấm
ảnh -Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng Hiện tượng “bờ”
hưởng
đến Rf -Thành phần và độ tinh khiết của pha động
-Phương pháp khai triển sắc ký
F
-Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký (hiện
tượng “bờ”) X
-Ảnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành phần hỗn A
hợp cần tách
-Độ ẩm, nhiệt độ và pH…
OX O x x x

R f ( X ) OF OX
- Sử dụng chất đối chiếu Rs ( X )    Sắc ký đồ
R f ( A) OA OA
Sắc ký đối chứng
OF
- Hai chất giống nhau lần lượt phải có Rf và Rs bằng nhau.
-Hai chất phải có cùng lượng chấm như nhau và được triển khai trong cùng
23 điều
kiện sắc ký
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)

5.2.1.Tốc độ di Tốc độ di chuyển của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ
chuyển của một số phân bố của nó giữa hai pha hoặc bởi các đại lượng về sự
chất: lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu).
5.2.2. Thời gian Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần thiết để một chất di
lưu tR (phút) chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic
trên sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của
pic).
tM (hoặc to)= (thời gian chết) thời gian lưu của một
chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi,
tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển
của nó càng nhỏ.
tR2
tR1

t0 W 2.1/2
W 1.1/2
24
W1 W2
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)

5.2.3. Thời t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)

gian lưu hiệu hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh
chỉnh t’R (thời gian lưu, thể tích lưu).
Nếu trên trục hoành của sắc ký đồ sử dụng đơn vị đo là thể tích
dung môi thì có các đại lượng tương tự: thể tích lưu VR và
thể tích lưu hiệu chỉnh V'R, thể tích chết của cột VM còn gọi
là thể tích rỗng Vo chính là thể tích dung môi từ nơi tiêm trong
cột đến detector. chatV'R = VR - VM (hay V'R = VM – Vo)
> Nois di for
trans plasting
5.2.4. Hệ số CS và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.
phân bố K L~ Khi nồng độ chất tan không cao quá thì K là một hằng số chỉ
horg de trans platichphụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ.
5.2.3. Thời gianVới lưumột
hiệuchất, nếut’KR lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh
chỉnh
và sẽ di chuyển chậm, nếu K nhỏ chất sẽ di chuyển nhanh.
tR2
tR1 tR2
tR1
CS
K
t0 W 2.1/ CM t0 W 2.1/
W 1.1/2 W 1.1/2 2
2
25
W1 W2
W1 W2
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.5. Hệ số dung lượng K’ (capacity factor)

Hệ số dung lượng k' là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô tả
tốc độ di chuyển của một chất. Q C V V
k ' s
 S S
 K S

QM C M VM VM

QS, QM là lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động
VS, VM là thể tích pha tĩnh và pha động.

"punches
có thể định nghĩa k' theo một cách khác: t'R t R  t M
k'  
tM tM
<===> tR = tM(1+k') f

Khác với K, k' không những phụ thuộc vào bản chất các pha, bản chất chất tan,
nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của cột.

Với một chất k' càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp.
Để tách một hỗn hợp các chất, người ta thường chọn cột, pha động, các điều kiện
phân tích khác sao cho k' của chất nằm trong khoảng từ 1 đến 8.
Nếu k' > 8 thì thời gian phân tích quá dài.
nếu k' < 1 pic sẽ xuất hiện quá sớm dễ lẩn với pic các tạp chất và dung môi.26
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.6. Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

Được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc (selectivity factor).

k'B 7 /'*
alpha = k 'B t 'R , B
  .

k ' A t 'R , A
Theo qui ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy a luôn luôn lớn hơn 1.
Để tách riêng hai chất, cần có a > 1, thường dùng a trong khoảng 1,05 đến
2,0. a càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau quá lớn với thời gian phân tích
sẽ kéo dài.

27
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.7. Hình dạng pic – Sự bất đối xứng của pic

Khi quan sát các pic trên sắc ký đồ, chúng có dạng tương tự như đường cong
phân bố chuẩn Gaussian thu được khi vẽ đường cong phụ thuộc giữa kết quả
các thí nghiệm lặp và tần số xuất hiện các kết quả đó.

Dạng pic sắc ký có tính đối xứng như phân bố Gaussian là dạng lý tưởng. Trong
thực tế thường bị giãn ra và gần như đối xứng. Để đánh giá tính bất đối của
pic người ta dùng hệ số bất đối (Asymmetry Factor).

BC: nửa chiều rộng phía

sau của pic, đo ở 1/20
chiều cao của pic.
AC: nửa chiều rộng phía
trước của pic, đo ở 1/20
BC
AF  chiều cao của pic.
AC
Một cột sắc ký còn hiệu
lực sẽ có AF trong 28
Tính bất đối của pic. khoảng 0,8 - 1,2 Sok can)
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.8. Hiệu lực của cột (Column efficiency) - Số đĩa lý thuyết và Chiều cao đĩa LT

Sự giãn pic: (Peak spreading)- lý thuyết đĩa

Sự giãn pic hay sự mở rộng dải là một hiện tượng đặc
biệt quan trọng trong sắc ký và được nghiên cứu qua lý
thuyết đĩa và lý thuyết động học.
Sự giãn pic là kết quả di chuyển nhanh chậm khác nhau
của các phân tử của cùng một chất trong khi đi qua cột
sắc ký. Các pic ra muộn bao giờ cũng tù hơn. Một cột sắc Hình minh họa
ký tốt (hiệu lực cao) sẽ cho các pic nhọn (ít bị giãn). cho sự giãn pic.

Năm 1941 Martin và Synge đã dùng phương pháp này để mô tả quá trình sắc ký.
Theo hai ông, cột sắc ký có thể phân ra thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau được
gọi là đĩa lý thuyết (Theoretical Plates)
.

29
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.8. Hiệu lực của cột (Column efficiency) - Số đĩa lý thuyết và Chiều cao đĩa LT

Lý thuyết đĩa
Phương pháp đĩa lý thuyết đã được dùng đầu
tiên để giải thích quá trình chưng cất.

Ở mỗi đĩa sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức

thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động.
Khi một phần mới pha động đưa vào đĩa sẽ
làm dịch chuyển cân bằng và một phần chất
tan theo pha động sang đĩa tiếp theo.

Ở đĩa này cân bằng mới được thiết lập và chất

tan lại theo pha động sang tiếp đĩa sau nữa.
Nhờ thiết lập quá trình cân bằng ở các đĩa nối
tiếp nhau như thế, chất tan sẽ được phân bố
trong một số đĩa và trong số đĩa này các đĩa ở
giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận
ở hai bên. 30
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.8. Hiệu lực của cột (Column efficiency) - Số đĩa lý thuyết và Chiều cao đĩa LT

Hiệu lực của cột = hiệu suất tách của cột, được biểu thị bởi hai thông số: số đĩa
lý thuyết N (Neff) và chiều cao đĩa lý thuyết H.

Số đĩa lý thuyết (Theoretical Chiều cao đĩa lý thuyết (HETP):

Plates) N eff càng lớn, hiệu lực (High Equivalent to a
cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp, Theoretical Plates) cột có hiệu
không giãn rộng). lực cao (H nhỏ, N lớn) thì WB
nhỏ (độ doãng peak nhỏ).
2
t 
2
 t 
2 L
N eff
t
 16 r

 N eff 
L
 16 R   5,54 R  H
H  WB  W1 / 2
N eff
 Wt   
on who
stinly thayetwho
>
-

chien cao
(
N eff : số đĩa lý thuyết của cột. ~ lon
HETP: chiều cao của đĩa lý thuyết. 1
-> chien car

WB: chiều rộng của peak ở đáy peak.

W1/2: chiều rộng peak đo ở nửa chiều cao
peak.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, chiều cao 31
hier
o
của đĩa lý thuyết thường là 0.03mm – 1mm. Wie in chien eco - on side
5. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ
5.2. ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG CHO SẮC KÝ KHÍ (GC), LỎNG HiỆU NĂNG CAO (HPLC)
5.2.9. Độ phân giải (hay hệ số tách của cột) (Resolution)

là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. Độ phân giải Rs được tính
như sau: T
R

Agian kin
-
2(t R ) B  (t R ) A 
Rs  WB

WA  WB
↳ chien da dig W

Rs = 0,75: hai peak không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
Rs = 1,0 : hai peak tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
Rs = 1,5 : hai peak tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%).

Hình minh họa sự tách hai chất A và

B ở 3 độ phân giải khác nhau
32
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.1. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT

Sắc ký được xem là một kỹ thuật phân tích rất có hiệu quả để tách và định lượng
các hợp chất có cấu trúc hóa học gần nhau trong một hỗn hợp. Vì vậy nó được
dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc sinh vật.

sắc ký rửa giải sắc ký khai triển

Sắc ký đồ cho biết thời gian lưu (trong sắc ký rửa giải) hoặc vị trí trên pha tĩnh
(trong sắc ký khai triển) của chất phân tích cùng với điều kiện sắc ký (pha
động, pha tĩnh, nhiệt độ,...) là những thông tin định tính giúp khẳng định sự có
mặt của chất phân tích trong mẫu.
Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó
33
khăn.
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.1. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT

Sắc ký thường được dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang
phổ. Mặt khác định tính bằng sắc ký không cho kết quả dương tính chắc
chắn. Do vậy, để định tính các chất trong hỗn hợp người ta kết hợp sắc ký – phổ
IR, UV hoặc sắc ký – phổ khối.

Sắc ký giúp khẳng định đúng kết quả âm tính – tức là xác nhận một chất
không có mặt trong hỗn hợp.
Vì vậy sắc ký thường được dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu. Trên sắc ký đồ
không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi tiến hành sắc
ký trong cùng điều kiện. 34
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ

'Eco
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
tay
·

Phương pháp đo chiều cao Phương pháp đo diện tích.

Phương pháp đo chiều cao của pic cho kết quả tốt hơn phương pháp
đo diện tích nếu pic hẹp.
Khi pic tù hay lệch phương thì sử dụng phương pháp đo diện tích

35
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
6.2.1. Phương pháp xây dựng đường chuẩn (ngoại chuẩn).

Absolute Calibration Curve Method (External Standard Method)

36
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ chan wi plar chit'ain cink la als so
6.2. ĐỊNH LƯỢNG >
-
pie gan no
6.2.2. Phương pháp sử dụng chuẩn nội. (Internal Standard Method)

Chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch
chuẩn đối chiếu.
Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân
tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Hai yêu cầu đối với chất chuẩn nội:
-Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác (Rs > 1,25).

E - Pic của chất chuẩn nội có thời gian lưu phải gần với pic của chất phân tích.
Phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy nhất (sai số khoảng 0,5 – 1,0%).
Sai số do tiêm mẫu đã được loại bỏ.

Nồng độ của mẫu phân tích

khoảng 100 ppm
(nồng độ của chuẩn nội trong
mẫu phân tích) × 0.7 / 1.2 = 58
ppm
Nồng độ của chất A: 58 PPM
37
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
6.2.2. Phương pháp sử dụng chuẩn nội. (Internal Standard Method)

ví dụ chọn chuẩn nội

38
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
PP chink sai whit
6.2. ĐỊNH LƯỢNG >
-

6.2.2. Phương pháp sử dụng chuẩn nội. (Internal Standard Method)

Đường cong chuẩn độ đối với phương pháp sử dụng nội chuẩn
Tính yếu tố hiệu chỉnh Fx Nếu yếu tố hiệu chỉnh Fx
là hằng số trong vùng
nồng độ nghiên cứu, thì
nồng độ Cs của một mẫu
mà trong đó đã thêm chất
chuẩn nội được tính:

Ss
Cs   Cis  Fx
Sis

S is  C x
Fx 
Nếu gọi Cx là nồng độ của dung dịch chuẩn S x  Cis
Cis là nồng độ của dung dịch chất chuẩn nội
Sx là độ lớn của pic chuẩn (chất chuẩn ngoại) 39
Sis là độ lớn của pic chuẩn nội
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
6.2.3. Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Phương pháp qui về phần trăm diện tích peak: (Percentage Peak Area Method )

Nồng độ của chất A: 1000/4500 = 22.2 %

% X: giá trị % của cấu tử Hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác định
X trong hỗn hợp X, Y, Z
Ax, Ay, Az: diện tích
bằng tỷ số (tính theo %) của diện tích pic của chất đó và
peak của cấu tử X, Y, Z. tổng diện tích các pic có mặt trong mẫu (trừ pic của dung
Trong sắc ký lỏng hiệu môi, thuốc thử, và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới
năng cao, công thức này
chỉ đúng khi sự đáp ứng hạn phát hiện).
của bộ phận phát hiện Ngày nay các hệ thống sắc ký đều có phần mềm xử lý số
trên các cấu tử X, Y, Z là
như nhau. liệu đi kèm. Vì vậy việc tính toán, trình bày kết quả trở nên
dễ dàng hơn (digital data). 40
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
6.2.3. Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Phương pháp qui về phần trăm diện tích peak có hiệu chỉnh:
(Corrected Percentage Peak Area Method )

Phương pháp diện tích pic phần trăm đã hiệu chỉnh là phương pháp diện tích pic
phần trăm có bù cho độ nhạy tương đối của từng thành phần.
Ưu điểm: Thực hiện phân tích định lượng bằng phương pháp phần trăm diện
tích pic nhưng có bù cho độ nhạy thành phần tương đối.
Nhược điểm: Yêu cầu mẫu chuẩn chứa tất cả các thành phần ở nồng độ đã
biết.
•Ghi chú Tất cả các thành phần mẫu phải được phát hiện.

Nồng độ của chất

A: 500/2417 = 20.7 %41
6. ỨNG DUNG CỦA SẮC KÝ
6.2. ĐỊNH LƯỢNG
6.2.4. Phương pháp thêm chuẩn
(Standard Addition Method)

được sử dụng để phân tích các mẫu có nồng độ nhỏ hoặc nồng độ phân
tích bị ảnh hưởng bởi nồng độ của các thành phần khác trong mẫu,
ví dụ: phân tích thành phần mùi và phân tích không gian đầu (head space).
Ưu điểm: Các thành phần khác trong mẫu (chất nền) có thể giảm thiểu ảnh
hưởng (hiệu ứng chất nền) do sự thay đổi thành phần mẫu khi được đưa vào
máy sắc ký khí.
Nhược điểm: Cần phải làm thêm nhiều nồng độ để thêm thành phần phân tích
vào mẫu chưa biết nên không thể sử dụng cho các mẫu hiếm.

Nồng độ (ppm) của chất A trong

http://zimmer.csufre
mẫu chưa biết được thể hiện
sno.edu/~davidz/Che bằng giá trị tuyệt đối tại giao
m106/StdAddn/StdA điểm với trục hoành (lượng thêm
ddn.html vào). Nồng độ thành phần A là
50 PPM 42
Ưu điểm: đơn giản, có khả năng tách các chất trong hỗn hợp phức tạp
Phương pháp sắc ký phát triển rất nhanh.
Với ngành Dược, phương pháp sắc ký được áp dụng trong công tác
43
nghiên cứu, phân tích và kiểm nghiệm thuốc.
44