TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.

HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC


Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh

BÀI GIẢNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SẮC KÝ
(Tài liệu lưu hành nội bộ)

Tp. Hồ Chí Minh – 2019

 MỤC LỤC CHƯƠNG 1

Trang
CHƯƠNG 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ .............................................................1
1.1. KHÁI NIỆM VỀ SẮC KÝ .................................................................................1
1.1.1. Khái niệm ......................................................................................................1
1.1.2. Phân loại sắc ký .............................................................................................1
1.1.3. Sắc ký rửa giải trên cột ..................................................................................2
1.2 CÁC TƯƠNG TÁC TRONG QUÁ TRÌNH SẮC KÝ .....................................3
1.2.1. Lực phân tán (Dispersion force) ....................................................................3
1.2.2. Lực phân cực .................................................................................................4
1.2.3. Lực ion ...........................................................................................................4
1.3. CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CHO QUÁ TRÌNH RỬA GIẢI ...............5
1.3.1. Thời gian lưu tR (Retention time) .................................................................5
1.3.2. Hệ số phân bố K và hệ số dung lượng k’ ......................................................6
1.3.3. Hệ số chọn lọc  (Selectivity factor) ............................................................7
1.4. LÝ THUYẾT SẮC KÝ .......................................................................................8
1.4.1. Lý thuyết đĩa ..................................................................................................8
1.4.2. Lý thuyết động học - Phương trình Van Deemter .........................................9
1.5. ĐỘ PHÂN GIẢI RS ..........................................................................................13
1.5.1. Khái niệm ....................................................................................................13
1.5.2 Phương trình Purnell: Rs = f (n; ; k‘) .........................................................14
1.5.3. Các biện pháp tăng độ phân giải .................................................................14
1.6. HỆ SỐ KHÔNG ĐỐI XỨNG ..........................................................................15
BÀI TẬP CHƯƠNG 1 .................................................................................................18
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

CHƯƠNG 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ

1.1. KHÁI NIỆM VỀ SẮC KÝ

Sắc ký (Chromatography) là kỹ thuật TÁCH được ứng dụng trong nhiều ngành
khoa học và hiện nay đóng vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu lý thuyết cũng như
ứng dụng của khoa học và công nghệ. Đặc biệt trong lĩnh vực hóa phân tích.
1.1.1. Khái niệm
Tất cả các loại hình sắc ký đều có nguyên tắc tách giống nhau: Mẫu phân tích
được hòa tan trong một pha động (mobile phase). Pha này có thể là một chất khí hoặc
chất lỏng cho qua pha tĩnh (stationary phase) một cách liên tục và không hòa lẫn với nó.
Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của
mẫu sẽ di chuyển qua pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha
tĩnh – pha động – chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần mẫu sẽ tách
riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng. Trên cơ sở nguyên
lý này có thể phân loại các kỹ thuật sắc ký theo nhiều cách khác nhau
1.1.2. Phân loại sắc ký
1.1.2.1. Phân loại theo cách lưu giữ pha tĩnh
- Sắc ký cột (column chromatography): Pha tĩnh được giữ trong ống nhỏ; pha
động đi qua nhờ áp suất hay trọng lực.
- Sắc ký phẳng (planar chromatography): Pha tĩnh được cố định trên một mặt
phẳng (giấy, bản mỏng), pha động di chuyển qua mặt đó nhờ mao dẫn hoặc tác động của
trọng lực.
1.1.2.2. Phân loại theo bản chất vật lý của pha động
- Sắc ký khí: Pha động là chất khí thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa
vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký. Pha
động không tương tác với chất phân tích mà chỉ làm chức năng vận chuyển chất phân
tích qua cột.
- Sắc ký lỏng: Pha động là chất lỏng, Sắc ký lỏng có thể chia thành hai nhóm:
Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC: High
Performance Liquid chromatography)
Trong HPLC tùy thuộc bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách,
có thể có các loại sắc ký: Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC). Sắc ký pha
thuận (Normal phase: NP-HPLC). Sắc ký pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC), Sắc ký
trao đổi ion (Ion exchange IE-HPLC), Sắc ký ghép cặp ion (IP-HPLC); Sắc ký loại cỡ
Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 1
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

(Size exclusion chromatography SEC-HPLC)

1.1.3. Sắc ký rửa giải trên cột
Hình 1.1. mô tả sơ đồ di chuyển của hai chất A & B trên cột sắc ký. Quá trình
rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục pha động qua cột. Mẫu phân tích hòa
tan trong pha động được đưa vào đầu cột (ứng với thời gian t0). Khi thêm pha động vào
cột, pha động sẽ hòa tan mẫu và di chuyển theo cột. Trong quá trình di chuyển có sự
phân bố mẫu giữa hai pha. Thêm liên tục pha động sẽ đưa A và B di chuyển tiếp theo
cột nhưng với tốc độ khác nhau. Sự khác nhau về tốc độ đã phân hai thành phần trong
hỗn hợp thành hai vùng khác nhau dọc theo chiều dài cột (ứng với thời gian t2 trên hình
vẽ). A di chuyển nhanh vì A tương tác với pha tĩnh yếu hơn, còn B bị pha tĩnh giữ mạnh
hơn nên di chuyển theo pha động chậm hơn.

Hình 1.1. (a) Sơ đồ tách hai chất A và B từ hỗn hợp bằng sắc ký rửa giải; (b) Sắc ký
đồ

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 2
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Quá trình tách hoàn toàn khi thêm đủ lượng pha động vào cột để tách riêng biệt
thành hai dải ở cuối cột và ra ngoài ứng với thời gian t3 và t4 trên hình.
Nếu ở cuối cột có đầu dò (detector) phát hiện sự có mặt và nồng độ trong pha
động của A và B (thường qua tín hiệu) , tín hiệu trên được vẽ theo thời gian hoặc thể
tích pha động qua cột, ta sẽ có đồ thị với một số pic (peak) sắc ký. Đây là sắc ký đồ
(chromatogram), được dùng cho phân tích định tính và định lượng.
1.2 CÁC TƯƠNG TÁC TRONG QUÁ TRÌNH SẮC KÝ
Trong quá trình sắc ký các chất tách khỏi nhau do lực tương tác khác nhau với
pha tĩnh và pha động. Trong sắc ký khí, pha động là khí mang (khí trơ) không có tương
tác với chất phân tích, chỉ có tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh. Trong sắc ký
lỏng, có tương tác giữa chất tan và pha tĩnh, chất tan và pha động, pha tĩnh và pha động.
Bản chất của tương tác là tương tác tĩnh điện. Có thể phân thành ba loại tương tác.
1.2.1. Lực phân tán (Dispersion force)
Là lực tương tác giữa các hợp chất không phân
cực như là HC mạch thẳng hoặc nhân thơm.
Phân tử không mang điện tích, nhưng phân bố
điện tích giữa electron và nhân không phải luôn
luôn đối xứng. Ở một thời điểm nào đó chuyển
động của các electron bên trong phân tử làm
xuất hiện tức thời moment lưỡng cực nhỏ.
Lưỡng cực tức thời của một trong các phân tử
đó có hướng xác định ở thời điểm đó sẽ gây ra
một lưỡng cực trở lại ở phân tử bên cạnh, do đó
có thể dẫn đến một trường đồng bộ trong tòan
thể.
Lực phân tán tăng theo kích thước phân tử,
Hình 1.2. Tương tác khuếch tán
phân tử càng lớn lực phân tán càng lớn. Điều này
giải thích tại sao CH4 là khí, còn hecxan C6H14 là lỏng ở nhiệt độ thường, cũng như phân
tử càng lớn nhiệt độ sôi càng cao do tương tác khuếc tán giữa các phân tử càng mạnh

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 3
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

1.2.2. Lực phân cực

Lực phân cực là lực tương tác giữa hai chất
bị phân cực. Đầu dương của phân tử chất này hút
đầu âm của phân tử chất kia nên tương tác này còn
được gọi là tương tác lưỡng cực – lưỡng cực. Các
hợp chất phân cực thông thường như alcohols,
esters, Amines, nitrile
Lực phân cực cũng xuất hiện trong trường hợp
một phân tử là lưỡng cực, còn phân tử kia không
phân cực. Dưới tác dụng của phân tử phân cực,
phân tử không phân cực sẽ trở nên phân cực. Tương
tác này được gọi là tương tác lưỡng cực cảm ứng.
Hình 1.3. Tương tác lưỡng cực và Ví dụ poly ethylenglycol HO-CH2 – CH2 – OH là
lưỡng cựccảm ứng chất phân cực, nếu có benzen vào thì có tương tác
lưỡng cực – lưỡng cực cảm ứng.
Phân tử hữu cơ ngoài tương tác lưỡng cực – lưỡng cực còn có lực phân tán.
Hình trên cho thấy hai phân tử tương tác và hút nhau bởi lực phân tán và lực lưỡng cực
tự các cực thường xuyên và cực cảm ứng.
1.2.3. Lực ion
Lực tương tác giữa hai tiểu phân mang điện tích trái dấu nhau.
Trong thực tế thường xảy ra với chất hữu cơ khi cho chất hoạt động bề mặt
sodium dodecyl sulfonate. Đây là chất có một đầu mang điện tích ưa nước( hydrophilic))
và một đầu mạch HC dài kỵ nước (hydrophobic)

Hình 1.4. Sodium dodecyl sulfonate.

Phần mang điện tích và ưa nước tương tác với đầu mang điện tích của phần tử
chất tan theo lực tương tác ion-ion. Phần mạch HC dài không ưa nước tương tác với pha
tĩnh không phân cực theo lực phân tán.
* Quy tắc cơ bản trong sắc ký: “Những chất giống nhau thì có ái lực với nhau”
Chất hữu cơ thường có hai tính chất : độ phân cực (háo nước) và háo dầu (kỵ
nước: hydrophobic). Những chất hữu cơ chỉ có H và C trong mạch thí tính háo dầu cao,

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 4
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

còn những chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH; -NH2 …) thì có tính háo nước.
Ví dụ: Xét ba hợp chất sau: CH3COOH (1); CH3–CH2–COOH (2);
CH3–CH2–CH2–COOH (3).
 Cả ba chất đều có nhóm –COOH, cùng với sự tăng mạch C, độ phân cực
giảm dần và tính háo dầu tăng dần.
Lưu ý rằng tương tác trong sắc ký là hỗn hợp nhiều tương tác, ít khi chỉ có một
tương tác thuần túy.
1.3. CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CHO QUÁ TRÌNH RỬA GIẢI
1.3.1. Thời gian lưu tR (Retention time)
Khi tiêm mẫu vào cột sắc ký, chất tan sẽ di chuyển dọc theo cột và sẽ có thời
gian lưu giữ nhất định trong cột sắc ký . Hình 1.5. là một sắc ký đồ trục tung là thời gian,
trục tung là tín hiệu của detector
Thời gian lưu tR: Thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến
detector ứng với nồng độ cực đại.
Thời gian lưu chết t0: Thời gian mà chất không bị lưu giữ đi qua cột. Tốc độ di
chuyển của chất không lưu giữ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha
động
Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’ = tR – t0
Vận tốc trung bình của chất phân tích (Linear velocity) v = L/tR
(L là chiều dài cột). Đơn vị của tốc độ dòng cm/s
Vận tốc trung bình của các phân tử pha động ͞u = L/tM

Hình 1.5. Sắc ký đồ (Chromatogram)

Nếu trục hoành của sắc ký đồ là đơn vị thể tích pha động thay cho thời gian, ta
có thể tích lưu VR, thể tích chết V0 của cột. Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ = VR – V0.
Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 5
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Mối liên quan giữa thể tích và thời gian khi pha động qua cột: V=Ft
F: lưu lượng hay còn gọi là tốc độ dòng (Flow rate). Đơn vị là mL/phút..
Mỗi chất sẽ có thời gian lưu cố định trong một điều kiện sắc ký. Cho nên thời
gian lưu là đại lượng để định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: Bản chất của pha tĩnh; Bản chất, thành
phần, tốc độ của pha động; Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan. Trong một số
trường hợp, thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tích, nếu tR quá nhỏ thì quá trình tách các chất không hoàn
toàn, thậm chí các peak sẽ chập lên nhau, còn nếu tR lớn các peak sẽ tách hoàn toàn
nhưng peak sẽ bị bành rộng ra, độ lặp lại cũa peak rất kém, cũng như thời gian và hóa
chất tiêu tốn cho phân tích tăng lên. Do đó, phải chọn tR thích hợp bằng cách thay đổi
các yếu tố vừa nêu.
1.3.2. Hệ số phân bố K và hệ số dung lượng k’
1.3.2.1. Hệ số phân bố K (Partition Coefficient)
Biểu thị sự khác biệt khi chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động
𝐶𝑠
𝐾= (1.1)
𝐶𝑀

Trong đó, CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol
chất tan trong pha động.
Lực tương tác của chất phân tích trong hai pha sẽ quyết định giá trị K. Trị số K
càng lớn, chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp
có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách các chất càng dễ dàng.
Theo phương trình (1.1): nếu hệ số K giữ không đổi trên một khoảng nồng độ
thì nồng độ Cs tỷ lệ thuận với CM trong pha động. Đây là sắc ký tuyến tính. Chúng ta
khảo sát chủ yếu loại hình sắc ký này.
1.3.2.2. Hệ số dung lượng k’ (Capacity/retention factor)
Đối với mỗi chất phân tích, hệ số dung lượng cho biết khả năng lưu giữ của
cột, đồng thời sự phân bố của chất phân tích trên pha tĩnh và pha động. Do đó hệ số
lưu giữ k’sẽ bằng lượng chất phân tích bị lưu giữ ở pha tĩnh chia cho lượng chất chia
cho lượng chất phân tích trong pha động
𝐶𝑠 . 𝑉𝑆 𝑉𝑆
𝑘′ = =𝐾×
𝐶𝑀 . 𝑉𝑀 𝑉𝑀
* Mối liện hệ giữa k’ và tR
Tốc độ di chuyển của pha động dọc theo cột là u, tốc độ di chuyển của chất phân

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 6
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

tích X là uX sẽ được xác định bởi tỷ lệ R của chất phân tích có mặt trong pha động ở bất
kỳ thời điểm nào.
ux = R  u
Ví dụ nếu ở một thời điểm nào R=0,5 có nghĩa là có một nữa phân tử X ở trong
pha động và một nữa ở trong pha tĩnh. Vì vậy tốc độ chất phân tích chỉ nhanh bằng ½
tốc độ pha động.
Một chất phân tích phải có mặt trong pha tĩnh, pha động. Vì thế nếu phần có
mặt trong pha động là R thì phần có mặt trong pha tĩnh là 1−R. Theo định nghĩa thì:
1−𝑅 1
𝑘′ =  𝑅=
𝑅 1+𝑘 ′

Thời gian lưu ( tR ) bằng khoảng cách (chiều dài cột L) chia cho tốc độ di
chuyển của chất phân tích uX
𝐿
𝑡𝑅 =
𝑢𝑥
Tương tự:
𝐿 𝑢 𝑡𝑜 𝑡𝑅 −𝑡0
𝑡𝑜 =  𝑡𝑅 = 𝑡𝑜 = = 𝑡0 (1 + 𝑘 ′ )  𝑘 ′ =
𝑢 𝑢𝑥 𝑅 𝑡0

- Khác với hệ số phân bố K, k’ phụ thuộc không chỉ bản chất của chất phân tích
mà còn phụ thuộc tỷ lệ VS/VM
- Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, khó xác định chính xác
thời gian tR, các chất khó tách ra khỏi nhau. Nếu k’ quá lớn (k: 20 – 30), thời gian rửa
giải quá dài, peak bị bành rộng. Thường chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 – 5
1.3.3. Hệ số chọn lọc  (Selectivity factor)
Đánh giá khả năng tách của hai chất A và B. Hai chất A và B càng dễ tách khi
hệ số phân bố của chúng khác nhau nhiều.
𝐾𝐵 𝑘′𝐵 (𝑡𝑅 )𝐵 − 𝑡0
∝= = =
𝐾𝐴 𝑘′𝐴 (𝑡𝑅 )𝐴 − 𝑡0
Theo quy ước KB > KA nên  luôn luôn lớn hơn 1
Để tách riêng hai chất A và B cần >1. Thường chọn  dao động trong khoảng
1.05 – 2. Nếu  quá lớn thời gian phân tích sẽ dài.

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 7
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

1.4. LÝ THUYẾT SẮC KÝ

Sắc ký là quá trình phức tạp, có sự tương tác
giữa ba thành phần: chất phân tích (PT). Pha tĩnh
(SP), pha động (MP). Có nhiều công trình khoa học
đưa ra lý thuyết mô tả quá trình sắc ký. Bài giảng này
chỉ giới thiệu một cách định tính hai nội dung: Lý
thuyết đĩa và lý thuyết động học
Hình 1.6. Tương tác giữa 3
thành phần trong sắc ký lỏng
1.4.1. Lý thuyết đĩa
Năm 1941 Martin và Synge đã mô tả quá trình sắc ký như sau: Cột tách được
hình dung như là cột chưng cất. Cột sắc ký có thể phân ra nhiều lớp mỏng xếp sát nhau
được gọi là đĩa lý thuyết. Ở mỗi đĩa diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan
giữa pha tĩnh và pha động. Khi một phần mới pha động đưa vào đĩa sẽ làm dịch chuyển
cân bằng và một phần chất tan theo pha động đi vào đĩa tiếp theo. Ở đĩa này cân bằng
mới được thiết lập và chất tan theo pha động sang tiếp đĩa sau nữa. Nhờ thiết lập quá
trình cân bằng ở các đĩa nối tiếp nhau như thế, chất tan sẽ được phân bố trong một số
đĩa và trong số đĩa này các đĩa ở giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận hai bên.
Số đĩa lý thuyết tưởng tượng sẽ là: N=L/H ( L : chiều dài cột; H: chiều cao đĩa
lý thuyết)
Số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H được dùng để đo hiệu lực của
cột sắc ký. N mô tả mối liên quan giữa cột và độ hẹp của các peak và được gọi là hiệu
năng cột (column efficiency) và được xác định theo công thức
𝑡𝑅
𝑁 = 16 × ( )2
𝑊
Ví dụ: Độ rộng W của peak A ở hình 1.7 = 4.00 – 3.85 =0.15 phút và tR =3.93
phút.
 N=16 . (3.93/0.15)2 = 10.980.
Giá trị N có thể khác nhau đối với mẫu khác nhau, điều kiện tách và cột khác
nhau. Giá trị của N càng lớn , peak thu được ở sắc ký đồ càng hẹp và tách càng tốt.

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 8
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Hình 1.7. Sắc ký đồ và W1/2

Độ rộng peak có thể đo bằng W1/2 (chiều rộng pic ứng với nữa chiều cao peak )
sẽ cho kết quả tin cậy hơn. Lúc này N được tính như sau
𝑡𝑅 2
𝑁 = 5.54 × ( )
𝑊1/2
Lý thuyết đĩa đề cập đến hai thông số đặc trưng cho quá trình rửa giải. Tuy nhiên
lý thuyết đĩa chưa xem xét đến các yếu tố trong và ngoài cột ảnh hưởng đến pic sắc ký,
làm bành rộng pic. Lý thuyết động học bổ sung cho những nhược điểm của lý thuyết đĩa
1.4.2. Lý thuyết động học - Phương trình Van Deemter
Van Deemter – Kỹ sư Hóa người Hà Lan đã thiết lập phương trình mô tả sự phụ
thuộc của chiều cao đĩa H theo 3 yếu tố động học
B
H=A +
+ Cu
u
Trong đó A, B, C là hằng số ; u : vận tốc pha động (cm/s)
1.4.2.1. Khuếch tán xoáy (A)
Hằng số A liên quan đên khuếch tán xoáy
(Eddy diffusion) của chất tan di chuyển theo pha
động qua cột. Quãng đường di chuyển theo pha
động của chất tan qua cột không hoàn toàn như nhau.
Vì pha động phải đi qua các kẻ hở của cột nhồi. Điều
này làm pic giản rộng do di chuyển theo nhiều
đường khác nhau. Thực tế tốc độ pha động thay đổi
từ điểm này đến điểm khác, phụ thuộc nhiều yếu tố:

Hình 1.8 Khuếch tán xoáy

- Khoảng cách đến bề mặt hạt nhồi trong cột,
độ đồng đều của hạt (hình dáng và kích thước hạt)

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 9
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

- Hiệu ứng thành cột: Ngay trong một ống rỗng, dòng chảy qua ống do hiệu ứng
thành ống có vận tốc khác nhau: Ở thành ống vận tốc rất bé, gần bằng không. Ở trung
tâm ống, vận tốc cực đại. Trong trường hợp cột sắc ký nhồi đầy hạt, tính chất của dòng
chảy càng phức tạp hơn, phụ thuộc vào tính chất của pha động, đặc điểm kỹ thuật của
cột sắc ký (đặc điểm hạt, mật độ nhồi cột, đường kính trong của cột). Người ta nhận thấy
thay đổi tốc độ dòng tác động không đáng kể đến khuếch tán xoáy của chất tan. Cho nên
số hạng thứ nhất không có đại lượng u.

Hình 1.9 Hiệu ứng di chuyển bằng nhiều quãng đường lên sự bành rộng peak.
Hình dạng dải chất phân tích ban đầu là hình chữ nhật. Khi dải này di chuyển
dọc theo cột, những phân tử chất tan riêng biệt sẽ di chuyển theo những con đường khác
nhau, ba đường đi này được vẽ theo 3 đường đi có màu khác nhau (chiều dài thực sự
của 3 đường này được biểu thị bằng 3 mũi tên thẳng ở dưới hình . Hầu hết chất phân
tích di chuyển theo đường đi có chiều dài tương tự như đường màu xanh. Một số ít khác
di chuyển theo đường dài hơn (đỏ) hoặc ngắn hơn (lục). Hình dạng dải chất phân tích ở
cuối cột bị bành rộng và có hình Gause
1.4.2.2. Khuếch tán dọc (B/u)
Số hạng thứ hai liên quan đến
khuếch tán dọc (longitudinal
diffussion) theo cột của chất tan
trong pha động. Còn được gọi là
khuếch tán trục (axial diffussion).
Các phân tử chất tan sẽ khuếch tán
từ vùng có nồng độ cao sang vùng
có nồng độ thấp hơn. Kiểu khuếch
Hình 1.10. Khuếch tán dọc làm dải bành rộng ra
Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 10
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

tán này có thể có thể cùng hướng và ngược hướng với pha động . Trong cột sắc ký, các
phân tử chất tan sẽ khuếch tán ra khỏi dải ở cả hai phía: Phía trước và phía sau dải, cho
nên dải sẽ mở rộng ra. Nếu thời gian trong cột càng lâu sự khuếch tán dọc theo cột càng
mạnh . Cho nên tốc độ pha động càng tăng, thời gian lưu của chất tan trong cột càng
ngắn và hiệu ứng khuếch tán dọc càng giảm: Khuếch tán dọc tỷ lệ nghịch với tốc độ pha
động u.

Hình 1.11 Ảnh hưởng của khuếch tán dọc lên sự bành rộng dải chất phân tích. Mũi
tên đỏ chỉ hướng mà pha động di chuyển
1.4.2.3. Quá trình chuyển khối (mass transfer)
Chất tan di chuyển trong pha động, trong pha tĩnh và cả ở mặt phân cách hai pha
với tốc độ khác nhau. Sự phân bố chất tan trong dòng chảy qua cột sắc ký không thể
đạt cân bằng thực vì quá trình chuyển khối giữa hai pha không diễn ra tức thời. Nếu tốc
độ dòng càng lớn thì cân bằng càng khó vì phân tử chất tan trong pha động càng cón ít
cơ hội chuyển vào pha tĩnh mà lướt nhanh lên phía trước dải, trong khi đó một số phân
tử chất tan trong pha tĩnh đi vào pha động càng chậm nên nằm lại phía sau dải. Kết quả
dải mở rộng về hai phía. Rõ ràng trong trường hợp này hiệu ứng mở rộng pic sắc ký liên
quan đến động học của quá trình hấp và giải hấp chất tan, tăng tỷ lệ thuận với tốc độ
dòng : ta có đại lượng liên quan đến quá trình chuyển khối là C.u

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 11
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Hình 1.12 Ảnh hưởng của quá trình chuyển khối lên sự bành rộng dải.
(a) Hình dạng Gause với cân bằng lý tưởng của chất phân tích trong pha động và pha
tĩnh. (b, c) Nếu để dải chất tan di chuyển một đoạn nhỏ dọc theo cột, cân bằng giữa
hai pha bị phá vỡ. Mũi tên đỏ biểu thị sự di chuyển chất phân tích từ pha động vào
pha tĩnh (Cái được gọi là sự chuyển khối), (d) Một khi cân bằng được tái thiết lập, dãi
chất phân tích bị bành rộng ra.

Đường cong tổng hợp 3 tác động trên đến chiều cao H có dạng một hyperbol.

Hình 1.13. Đường cong Van Deemter

Khi tốc độ dòng u còn bé, chiều cao H giảm theo chiều tăng u, H giảm đạt cực
tiểu và sau đó tăng dần theo tốc độ dòng. Vì hiệu lực cột đạt tối ưu khi H cực tiểu, nên
tốc độ dòng để cho hiệu lực cột tối ưu sẽ ứng với cực tiểu của đường cong.
Để xác định cực tiểu lấy vi phân phương trình theo u
𝑑𝐻 −𝐵
= 2 + 𝐶
𝑑𝑢 𝑢
𝐵
 𝑢=√  𝐻𝑚𝑖𝑛 = 𝐴 + 2√𝐵𝐶
𝐶

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 12
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Dựa vào thuyết động học, có cơ sở tối ưu hóa quá trình sắc ký rửa giải: xác định
tốc độ dòng tối ưu để có hiệu lực cột cực đại.
Trong sắc ký lỏng chỉ dùng cột dài 25 – 30 cm . Nếu cột dài phải dùng áp suất
rất cao mới duy trì tốc độ dòng. Ngược lại trong sắc ký khí có thể dùng cột dài đến 100m.
Vì vậy hiệu cực cột sắc ký khí cao hơn săc ký lỏng .
1.5. ĐỘ PHÂN GIẢI RS
1.5.1. Khái niệm
Rs đặc trưng cho khả năng tách hai cấu tử A và B ra khỏi nhau trong cùng điều
kiện sắc ký. Rs = Hiệu số thời gian lưu của hai peak / Độ rộng trung bình của hai peak
gần nhau
2(𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴 )
𝑅𝑆 =
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵
Trong đó
(tR)B: thời gian lưu của cấu tử B được lưu giữ mạnh hơn
(tR)A: thời gian lưu của cấu tử A được lưu giữ kém hơn
WA: Bề rộng mũi của cấu tử A tại đường nền (bề rộng đáy của A)
WB: Bề rộng mũi của cấu tử B tại đường nền (bề rộng đáy của B)

Hình 1.14. Hai peak phân giải

Hình 1.15 minh họa khả năng tách 2 peak được cải tiến cùng vớí tăng RS. Nếu
diện tích của 2 peak là như nhau thì Rs =1.5 thì hai peak chỉ chập nhau khoảng 0.13%
và xem như là tách hoàn toàn

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 13
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Hính 1.15. Ba ví dụ minh họa tương quan giữa Rs và khả năng tách của hỗn hợp
hai chất. peak màu xanh và đỏ là đồ thị rửa giải của hai chất. Peak sắc ký - tổng
của hai đồ thị là đường màu đen.
1.5.2 Phương trình Purnell: Rs = f (n; ; k‘)
Việc lựa chọn điều kiện sắc ký để có Rs phù hợp sẽ thuận lợi nếu xác định ảnh
hưởng của các thông số đặc trưng như k’, , N . Giả định là 2 chất A và B được rửa giải
liên tiếp và liền kề nhau. Do đó có thể xem như WA =WB,
(𝑡𝑅 )𝐵− (𝑡𝑅 )𝐴
Công thức tính Rs có thể viết lại là 𝑅𝑠 =
𝑊

(𝑡𝑅 )𝐵− (𝑡𝑅 )𝐴 √𝑁

Thay W được tính theo số đĩa lý thuyết N có 𝑅𝑠 = ×
(𝑡𝑅 )𝐵 4

𝑘′𝐵− 𝑘′𝐴 √𝑁
Thay hệ số k’ tính theo thời gian lưu vào có 𝑅𝑠 = ×
1+ 𝑘′𝐵 4

Thay  theo hệ số dung lương k’ vào, ta có:

√𝑁 𝛼 − 1 𝑘′𝐵
𝑅𝑠 = × ×
4 𝛼 1 + 𝑘′𝐵
Phương trình trên là phương trình Purnell, mô tả sự phụ thuộc của Rs vào số đĩa
lý thuyết N, Hệ số dung lượng k’, hệ số chọn lọc . Để tăng độ phân giải Rs có thể thay
đổi các thông số trên
1.5.3. Các biện pháp tăng độ phân giải
a. Tăng số đĩa N.
- Dùng cột dài hơn sẽ tăng N, nhưng thời gian phân tích dài hơn, pic bành
rộng hơn
- Giảm chiều cao H bằng cách giảm tốc độ pha động, giảm kích thước hạt
(thay cột khác)

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 14
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

b. Tăng hệ số dung lượng k’:

Tăng k’B là hệ số dung lượng của chất ra chậm hơn (chất có k’ lớn hơn). Tuy
nhiên khi tăng k’ sẽ tăng thời gian phân tích. Thông thường trị số k’ nên dao động trong
khoảng 1 - 5
c. Tăng hệ số chọn lọc 
- Thay đổi thành phần pha động (pH, tăng hoặc giảm thành phân dung môi
hữu cơ, hoặc thay đổi dung môi pha động có độ phân cực cao hơn hoặc thấp hơn đối với
sắc ký lỏng
- Thay đổi pha tĩnh (thay cột)
-Thay đổi nhiệt độ cột : nhiệt độ tăng , vận tốc trao đổi chất tăng lên  số
đĩa lý thuyết tăng lên. Tuy nhiên yếu tố nhiệt độ cột không quan trọng lắm trong sắc ký
lỏng mà rất quan trọng trong sắc ký khí
1.6. HỆ SỐ KHÔNG ĐỐI XỨNG
Khi hệ số phân bố K=Cs /CM là hằng số với tất cả các nồng độ chất phấn tích, ta
có sắc ký tuyến tính và peak rửa giải của chất có hình Gause đối xứng. Nếu K không là
hằng số, peak rửa giải sẽ có dạng không đối xứng như hình 1.16
Peak tailing xảy ra khi một số tâm hoạt tính trên pha tĩnh lưu giữ mạnh hơn
những tâm khác. Peak fronting thường xảy ra khi cột bị overload mẫu (lượng mẫu quá
lớn )
Để đo mức độ tailing hay fronting của peak sắc ký, người ta dùng hệ số tailing
(hệ số kéo đuôi) TF hoặc hệ số không đối xứng As
Có thể biểu diễn mức độ không đối xứng của peak sắc ký theo hai cách như hình
1.17
- Hệ số không đối xứng As = Nửa chiều rộng phía sau của peak chia cho nửa
chiều rộng phía trước peak (tại điểm 1/10 chiều cao peak)
- Hệ số kéo đuôi peak TF= Độ rộng peak chia cho 2 lần nữa chiều rộng phía
trước của peak (tại điểm 1/20 chiều cao peak) .
Hai peak có TF=As=1.0 sẽ tách tốt. Khi hệ số tailing tăng, tất nhiên khả năng
tách sẽ giảm rất nhiều (Hình 1.19)

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 15
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Hình 1.16. Peak sắc ký không đối xứng: (a) peak tailing (peak kéo đuôi) và (b) peak
fronting (peak đổ đầu).
Peak sắc ký màu xanh ở cả hình (a) và hình (b) là peak không đối xứng và đường
màu đỏ nét rời thể hiện dạng peak Gause lý tưởng. Phần chèn vào thể hiện mối tương
quan giữa nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh [S]s, và nồng độ chất phân tích trong
pha động [S]m. Đường nét rời thể hiện K là hằng số. Đường màu xanh liền thể hiện K
giảm hoặc tăng khi tổng nồng độ chất phân tích tăng.

Hình 1.17. Cách tính TF Và As

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 16
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

Hình 1.18. Mối liên quan giữa As và TF

Hình 1.19. Khi hệ số tailing tăng, khả năng tách giảm

Hình 1.20. Peak đổ đầu

Nếu TF <1 ta có hiện tượng peak đổ đầu (fronting). Và cũng ảnh hưởng lên quá
trình tách tương tự như hiện tượng kéo đuôi (Hình 1.20)
Thông thường TF<2 cho tất cả các peak trong sắc ký đồ là chấp nhận được
Nếu hệ số tailing TF≥2. Phải giải quyết vấn đề ngay. Các nguyên nhân có thể:
- Cột hư
- Cột bị nhiễm bẩn
- Cột bị quá tải (Mẫu chứa lượng chất phân tích quá lớn)
- Dung môi hòa tan mẫu quá mạnh
- Bành rộng peak ở ngoài cột,
- Tương tác silanol
- Đệm không đủ hoặc không phù hợp
- Sử dụng nhiệt độ cột quá cao so với pha động quá lạnh

Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 17
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

BÀI TẬP CHƯƠNG 1

1.1. Phân tích sắc ký cho mẫu tinh dầu chanh, kết quả cho thấy có: một peak của
limonene (hidrocacbon lỏng chưa bão hòa, có mùi chanh, có trong tinh dầu chanh và
bạc hà) có thời gian lưu là 8,36 phút, với độ rộng đáy là 0,96 phút; và một peak γ-
terpinene rửa giải ở 9,54 phút với đường nền 0,64 phút. Tính độ phân giải giữa hai peak.
1.2. Sắc ký đồ sau đây thể hiện sự tách của một hỗn hợp có hai thành phần. Có tR = 8,5
phút. Độ rộng đáy 2 peak đều bằng 12 phút. Tính độ phân giải Rs

1.3. Phân tích sắc ký của mẫu có chứa hợp chất acid butyric, peak rửa giải có tR =7,63
phút. Thời gian chết (tM) là 0,31 phút. Tính hệ số lưu giữ k’
1.4. Sắc ký đồ sau đây thể hiện sự tách 2 chất. Biết tM =1,02 phút; tR1 = 5,31 phút; tR2 =
6,8 phút. Hãy tính hệ số lưu giữ k’ của hai chất trên. Tính hệ số chọn lọc của hai chất.

1.5. Phân tích sắc ký của mẫu có chứa chất acid butyric và isobutyric acid, peak rửa giải
của acid butyric có tR =7,63 phút. Thời gian chết là 0,31 phút. Peak rửa giải của acid
isobutyric có tR là 5,98 phút. Tính hệ số chọn lọc của acid butyric và acid isobutyric.
1.6. Tiến hành sắc ký với thuốc trừ sâu Dieldrin (thuốc trừ sâu cực độc có công thức
C12H10OCl6 hiện nay đã cấm dùng) thu được peak có thời gian lưu là 8,68 phút và độ
rộng đáy là 0,29 phút. Hãy tính số đĩa lý thuyết. Biết cột dài 2m. Hãy tính chiều cao của
một đĩa lý thuyết.
1.7. Áp dụng nguyên tắc những chất giống nhau thì dễ tan trong nhau. Hãy xác định chất
nào dễ tan hơn trong dung môi tương ứng của các cặp chất sau, và giải thích cho từng
Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 18
Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký Khoa CNHH-HUFI

trường hợp:
a. Naphthalene và 1-naphthol trong benzene
b. Benzophenone và diphenylmethane trong propanone
c. Methanol và butan 1-ol trong nước
1.8. Trong sắc ký pha thuận, một chất phân tích có tR = 29,1 phút, trong khi đó một chất
không lưu giữ có tR =1,05 phút. Tính k’
1.9. a. Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với từng chất khi tách A và
B bằng HPLC có các dữ liệu sau, cột dài 250 mm
Chất Thời gian lưu (phút) Độ rộng chân peak
A 5,2 0,6
B 8,4 0,8
b. Tại sao các chất A, B lại có số đĩa lý thuyết khác nhau?
1.10 Phân tích một hỗn hợp A,B.C,D bằng sắc ký lỏng với chiều dài cột 25,7 cm; tốc
độ dòng 0,313ml/phút; VM =1,37 mL; Vs = 0,164 mL. Kết quả như bảng sau:
Chất Không lưu giữ A B C D
Thời gian lưu (phút) 3,1 5,4 13,3 14,1 21,6
Độ rộng chân peak 0,41 1,07 1,16 1,72
Hãy tính:
a. Số đĩa lý thuyết cho mỗi peak
b. Số đĩa lý thuyết trung bình
c. Chiều cao đĩa lý thuyết của cột
d. Hệ số lưu giữ và hệ số phân bố của từng chất
e. Đối với hai chất B và C:
- Tính hệ số Rs; hệ số chọn lọc α
- Chiều dài cần thiết của cột để có độ phân giải 1,5
- Thời gian cần thiết để tách B và C với độ phân giải 1,5
1.11. Hai chất A và B có thời gian lưu tương ứng 16,40 và 17,63 phút. Cột có chiều dài
30,0 cm. Chất không lưu giữ qua cột mất 1,30 phút. Bề rộng chân peak của A và B là
1,11 phút và 1,21 phút. Tính:
a. Độ phân giải của cột
b. Số đĩa lý thuyết trung bình của cột
c. Chiều cao peak
d. Chiều dài của cột cần có để đạt được độ phân giải là 1,5
e. Thời gian yêu cầu để rửa giải chất B trên cột dài hơn
Phan Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa, Lê Thị Ngọc Hạnh Trang 19