CHƯƠNG 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH

10.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP TÁCH SẮC KÝ

10.1.1 Đại cương về phương pháp sắc ký
Lịch sử phát triển của phương pháp
Có nhiều tài liệu công bố về lịch sử phát triển của phương pháp, tuy nhiên mốc
thời gian được nhiều người thừa nhận là 1903 nhà thực vật học người Nga Michael
Txvet đã lần đầu tiên công bố tách được các chlorophyl từ lá cây với hệ sắc ký gồm pha
tĩnh là chất hấp phụ CaCO3, pha động là ete dầu hỏa.
Năm 1941 Tiselius phát triển các kỹ thuất tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp
phân tích tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải. Cũng trong năm này, 1941
Martin, A. J. P. và Synge, R.L.M. đã trình bày lý thuyết sắc ký lỏng-lỏng (sắc ký phân
bố). Do có công đóng góp các tác giả đã nhận giải Nobel 1952
Vào những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng
cao hiệu quả của phương pháp; các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến, từ
đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể như tách
được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố Đất hiếm), các
ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu….Ngày nay trong sắc ký lỏng chất nhồi
được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5-1,7µm, có khả năng chịu áp suất và
nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả (Ultra Performance Liquid
Chromatography - UPLC) có thể tách nhanh các hợp chất khó trong thời gian vài chục
giây. Gần đây, phương pháp siêu tới hạn (Supercritical fluid Chromatography -SFC) và
điện di mao quản ra đời để phù hợp với đa dạng các chất phân tích, đặc biệt các chất có
khối lượng phân tử lớn như protein, enzym trong các mẫu sinh học làm tăng khả năng
của sắc ký.
Thí nghiệm của Txvet và khái niệm về hệ sắc ký
Năm 1903 Txvet là một nhà thực vật học ngươic Nga, có một thí nghiệm vô cùng
độc đáo và tìm ra một phương pháp tách mới mang tên chromatography mà ta vẫn gọi
là sắc ký.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách hoà tan diệp lục trong ete dầu hỏa, sau đó
nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3. Tiếp theo, cho liên tục ete dầu hỏa tinh
khiết đi qua; sau một thời gian nhất định diệp lục đã tách thành các giải riêng biệt. Sau
này, người ta biết được đó là các a-chlorophyl, b - chlorophyl, a- xantophyl, b-
xantophyl.
Khi các chất phân tích được nạp vào chất nhồi CaCO3 còn gọi là pha tĩnh, lúc
đầu các cấu tử phân bố ở đầu cột một cách bất kỳ, xen kẽ. Ái lực của từng cấu tử với
pha tĩnh là khác nhau. Các chất có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ có thời gian
lưu lại pha tĩnh lâu hơn, ngược lại, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn, lưu lại pha
tĩnh ít hơn hay có thời gian trong pha động nhiều hơn.
Mặt khác, do dung môi được bơm vào cột liên tục, khi các chất ở pha động chúng
di chuyển cùng pha động, ngược lại khi các chất ở pha tĩnh, chúng không di chuyển. Vì
vậy các chất có sự chênh lệch về thời gian ở pha tĩnh cũng như pha động, sẽ dẫn đến
khác nhau về tốc độ di chuyển, từ đó các chất tách khỏi nhau. Đó là cơ sở của phương
pháp tách sắc ký. Hình 10.1a mô tả quá trình tách 2 chất ở các thời điểm khác nhau,
trong đó cột 1 là thời điểm ban đầu, mới nạp chất váo cột, 2 chất chưa tách. Các cột 2,
3 là các thời điểm sau đó, các chất dần tách khỏi nhau và đến cột thứ 4 thì 2 chất đã tách
hoàn toàn. Hình 10.1b là sắc đồ tương ứng của các cột tách.
Người ta thường nạp chất phân tích vào cột có khối lượng khoảng một vài phần
trăm dung lượng hấp thu cuả cột để đảm bảo cho cân bằng phân bố chất tan xảy ra nhanh
hơn.

Hình 10.1 : Quá trình tách sắc ký với 2 chất

Trong trường hợp các chất có tính chất rất giống nhau, lực liên kết của các chất
với pha tĩnh không khác nhau nhiều, điều đó dẫn đến thời gian ở pha tĩnh cũng như pha
động rất giống nhau, tốc độ di chuyển gần giống nhau. Để các chất có quãng đường di
chuyển khác nhau đáng kể, quá trình hấp thu và giải hấp thu phải thực hiện nhiều lần
hay nói cách khác là chiều dài của cột phải đủ lớn. Khi đó, thời gian di chuyển càng
lớn, sự khác biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn.
 Gọi là một hệ sắc ký khi chức năng tách của cột đã được thực hiện qua các thành
phần của hệ. Khi ta đưa chất phân tích vào hệ sắc ký, trước hết chất phân tích phải tan
được trong pha động. Từ pha động chất phân tích chuyển sang pha tĩnh và sau đó chất
phân tích lại lại chuyển về pha động. Quá trình đó được lặp đi lặp lại hàng ngàn, thậm
chí hàng triệu lần. Pha tĩnh đứng yên, pha động di chuyển qua pha tĩnh, và các chất phân
tích phân bố giữa hai pha. Các chất có ái lực khác nhau với pha tĩnh cũng như pha động
nên di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau. Vì vậy hệ sắc ký phải gồm: chất
phân tích, pha tĩnh và pha động. Tất nhiên để đưa được mẫu vào hệ, cho pha động chạy,
ghi nhận sự di chuyển của các chất là vấn đề kỹ thuật thực nghiệm, vấn đề thiết bị.
chúng ta sẽ xét ở phần sau.
Từ thí nghiệm trên, có thể đưa ra định nghĩa về sắc ký như sau:" Sắc ký là quá
trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha
thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển
qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha
tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau".
10.1.2 Phân loại các phương pháp sắc ký
Có hai kiểu phân loại các phương pháp sắc ký; thứ nhất là phân loại theo hệ
pha. Các phương pháp sắc ký không kể hoạt động theo cơ chế nào nhưng hệ sắc ký
gồm pha tĩnh rắn hoặc lỏng tiếp xúc với pha động cũng lỏng hoặc rắn.
Đối với kiểu phân loại này có sắc ký Khí- Rắn; Sắc ký Khí -Lỏng, sắc ký
Lỏng-Lỏng; Lỏng -Rắn…

Hình 10.2 Phân loại các phương pháp sắc ký theo hệ pha
Thứ hai là phân loại theo cơ chế, các phương pháp sắc ký có 4 loại với 4 cơ chế;
đó là: Sắc ký hấp phụ; Sắc ký phân bố (L-L hoặc L-R), Sắc ký trao đổi ion và Sắc ký
rây phân tử. Đối với các hệ sắc ký với các chất phân tích cũng như pha tĩnh phức tạp
(thí dụ silicagel biến tính), cơ chế tách có thể gồm nhiều loại trong liên kết giữa các
chất.
Nhìn vào sơ đồ phân loại trong hình 10.2 chúng ta thấy sắc ký lỏng rất đa dạng,
trong phân tích, sắc ký lỏng hiệu năng cao –HPLC gồm nhiều phương pháp khác nhau,
trong đó sắc ký HPLC lỏng rắn gồm rất nhiều phương pháp. Đó là sắc ký lỏng pha đảo,
sắc ký lỏng pha thường, sắc ký trao đổi ion v.v. Phương pháp HPLC pha đảo (reversed
phase high performance liquid chromatography) được sử dụng nhiều nhất, ta sẽ xét các
phương pháp này ở phần sau.
10.1.3 Các lực liên kết trong hệ sắc ký
a) Lực liên kết ion
Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion, đó là các phân tử có khả
năng phân ly tạo thành các ion tạo nên các trung tâm hoạt động ion. Chúng tham gia
liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là
liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch, pha tĩnh cần có các trung
tâm cation trên bề mặt, và ngược lại, để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch,
pha tĩnh cần có các trung tâm anion.
Cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng tham
gia tương tác với chất phân tích và pha tĩnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch
tạo thành các cation và anion. Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta
có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng.
Các phương pháp tách sắc ký thường gặp có tham gia của các liên kết ion gọi là
sắc ký ion, sắc ký cặp ion.
b) Lực phân cực
Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử
trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực. Chúng có thể là các lưỡng cực điện cố
định, cũng có thể là những lưỡng cực điện do cảm ứng. Chúng tham gia liên kết với các
phân tử phân cực khác bằng lực liên kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi
khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ. Tuy nhiên, sự chênh lệch này
là yếu tố rất quan trọng để độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia
chúng trong các phép tách sắc ký.
Thí dụ: các chất Cresol (o-. m-, p-, cresol) chỉ khác nhau về vị trí của nhóm CH3- trong
phân tử. Chính nhờ sự khác nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử
của các cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên
kết phân cực với pha tĩnh khác nhau, là nguyên nhân chênh lệch về thời gian lưu trong
quá trình sắc ký.
c) Lực phân tán (lực Van-de-van)
 Lực này có bản chất tĩnh điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới
phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực cảm ứng hay cố định. Tương tác
phân tán điển hình là giữa các mạch hydrocacbon, nó là tương tác phân tử.
Thí dụ: n-heptan là chất lỏng chứ không phải khí vì sự tương tác giữa các phân
tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các
hydrocacbon người ta có thể dùng hydrocacbon khác làm pha tĩnh.
d) Lực tương tác đặc biệt
Lực tương tác đặc biệt là lực tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.
Sự hình thành liên kết giữa các nguyên tử hydro và các nguyên tử có độ âm điện cao
như O, N, F...tạo thành liên kết hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là
"đám mây electron" chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện cao. Như vậy các nguyên
tử của nguyên tố có độ âm điện càng cao, liên kết hydro càng bền chặt. Người ta nhận
thấy năng lượng liên kết giảm theo dãy sau đây:
F--H--F > O--H--O > N--H--N > C--H--C .
Như vậy lực tương tác của các phân tử trong hệ sắc ký gồm : lực ion, lực phân
cực, lực phân tán và lực tương tác đặc biệt. Các lực này đối với các chất khác nhau có
giá trị khác nhau và quyết định đối với quá trình tách sắc ký.
Cũng lưu ý rằng bề mặt pha tĩnh không hoàn toàn đồng nhất, nó có thể có nhiều
loại nhóm chức khác nhau. Mỗi nhà máy có quy trình sản xuất riêng, kết qủa là thành
phần và số lượng các nhóm chức trên bề mặt pha tĩnh có khác nhau. Thí dụ với sắc ký
pha đảo, bề mặt của pha tĩnh là các nhóm ODS - otadecylsilan. Đây là kết quả của
phản ứng giữa nhóm Silanol - OH và Clorosilan hữu cơ. Tuy nhiên không phải tất cả
cả các nhóm silanol đều được thay bằng các nhóm ODS cho nên bên cạnh nhóm ODS
còn có cả nhóm -OH chưa thay thế, là nhóm phân cực và ngoài ra còn các tạp chất
kim loại. Như vậy là tương tác giữa pha tĩnh và phân tử chất phân tích có thể bao gồm
các lực tương tác ion, phân cực, lực phân tán, tương tác đặc biệt ở các mức độ khác
nhau.
10.1.4 Một số đại lượng cơ bản trong sắc ký
Hệ số phân bố
Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động và pha tĩnh, sẽ phân bố giữa hai pha theo
tỷ số nồng độ nhất định, như vậy, nó có hệ số phân bố riêng, nói một cách khác cân
bằng phân bố được thiết lập, có phương trình;
AS ⇌ Am (10.1)
Hệ số phân bố được định nghĩa là tỷ số của nồng độ chất phân tích giữa hai pha
 [ AS ]
KD = (10.2)
[ Am ]
Trong đó [A]S - Nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh
[A]m - Nồng độ chất phân tích trong pha động
Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của chất trong hệ sắc ký.
Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động.
Gọi fA là phần thời gian của chất A ở pha động
Số milimol A trong pha động [A]m . Vm
fA = = (10.3)
Số milimol A trong toàn cột [A]m . Vm + [A]s . Vs
Biến đổi phương trình 1.5 (chia phân số cho [A]m.Vm) ta có:
1
fA = (10.4)
VS
1+K DA
Vm
VS 1
Đặt k A/ = K DA , ta có f A = (10.5)
Vm 1+k 'A
trong đó kA' được gọi là hệ số lưu. Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động, uA
là:
u
uA = u. fA hay u A =
(1 + k A/ )
u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức 10.6 và 10.7 ta có nhận xét:
khi KDA hoặc kA’ càng lớn, thời gian chất phân tích ở trong pha động càng ít, nói một
cách khác là chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược lại khi kA' càng nhỏ, chất phân
tích di chuyển càng nhanh.
Thời gian lưu tR và thời gian lưu hiệu chỉnh tR'
Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic
đạt giá trị cực đại.
L L(1+k 'A )
t RA = =
uA u
L/u = tm là thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột, còn gọi là thời gian chết.
Vs
tRA = tm (1+ KDA. ) = tm (1 + k’ ) (10.6)
Vm
Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R là thời gian lưu không tính tới thời gian chết
t 'R V/
t'RA = tRA - tm = tm.k' . Þ k'= = R (10.7)
tm Vm
Thể tích lưu VR và thể tích lưu hiệu chỉnh VR'
 Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơm mẫu
vào cột tới khi pic đạt giá trị cực đại.
Gọi F là tốc độ chảy của pha động, ml/ phút
Thể tích lưu VR được tính theo công thức:
VRA= tRA.F ; Vm = tm . F; thay vào (10.8) ta có
VRA = Vm (1+ k'A) (10.8)
Thể tích lưu hiệu chỉnh V'R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột.
V'RA = VR - Vm
= Vm.k'A = KDA.VS (10.9)
Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa
giải để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh.
V’RA/ Vs = KDA = Vg
Hệ số tách
Hệ số tách a là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc
ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỷ số của hệ số phân bố của 2 chất;
một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn.
Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là a ¹ 1
a = KDA / KDB = k'A / k'B ¹1 (10.10)
Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải
khác nhau. Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t'RA / t'RB cũng chính là tỷ số
của hệ số phân bố
K DA k 'A t 'RA VRA
'
Vậy có thể tóm tắt là : α= = ' = ' = '
K DB k B t RB VRB

Đĩa lý thuyết
a) Khái niệm đĩa lí thuyết
Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập. Theo quan
niệm của Martin và Synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy
nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tượng
pic sắc ký không cân đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng
đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha
tĩnh và ngược lại, các tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ chúng ta sẽ đề cập ở phần sau.
b) Sắc đồ và tính số đĩa lý thuyết
Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu
đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thểt là độ dẫn điện, hoặc tần số xung điện…
liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu vào thời gian. Các tín hiệu
này được gọi là "pic"sắc ký. Định lượng các chất phân tích dựa vào diện tích píc sắc ký
là chính xác nhất. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký hiện đại đều được trang bị phần
mềm để tính diện tích của píc một cách tự động.
Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân bằng phân
bố chất phân tích tại để được đáp ứng.
Gọi N là số đĩa lí thuyết, s là độ lệch chuẩn; s ~ N . Đối với cột sắc ký n càng
lớn pic càng hẹp; thời gian lưu tỉ lệ với số đĩa lí thuyết n, tR ~ n, nên ta có thể viết:
tR N
= hay N = ( tR / s)2 (10.11)
σ N
Mặt khác w = 4s hay s = w / 4
Số đĩa lí thuyết n có thể viết lại là:
2 2
æt ö æ t ö
N=16 ç R ÷ =5,54 ç R ÷ (10.12)
èwø è w1/2 ø

Hình 10.3 Xác định số đĩa lý thuyết từ sắc đồ một cấu tử

Trong sắc ký lỏng cột nhồi, số đĩa lý thuyết được tính tương đối dựa vào chiều
dài cột và chiều cao đĩa lý thuyết, H~ 2-3dp
Thí dụ 10.1: Tính số đĩa lí thuyết, N của cột sắc ký và chiều cao đĩa lí thuyết, H biết
thời gian lưu tRA = 280s, tRB = 300s, độ rộng pic wA = 14s, wB =15s, thời gian chết,
tm=10s. Cột có chiều dài L = 3,2 m.

Đối với pic A : N = 16 æç

280 ö 2
Giải : ÷ = 6400
è 14 ø

Đối với pic B : N = 16 æç

300 ö 2
÷ = 6400
è 15 ø
Số đĩa lí thuyết của cột đối với cả hai chất là 6400.
H = 320 / 6400 = 0,05 (cm).
Độ phân giải
 Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép tách sắc
ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân
giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, tRA, tRB, và độ rộng píc
WA,WB.
2(t RB -t RA )
Độ phân giải R được định nghĩa: R= (10.13)
WA +WB
trong để : tRB - tRA = DtR là sự chấnh lệch thời gian lưu (cũng có thể dùng thể
tích lưu VRA- VRB) của 2 cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều
rộng píc, đo bằng giây hoặc ml nói lên khả năng tách của cột.
Khi R=1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95% nghĩa là còn 2,5% cũa
A ở trong B , 2,5% B ở trong A. Khi R= 1,5 thì hai cấu tử A và B để tách khỏi nhau đạt
99,8 % có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại.
Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lí thuyết tăng:
tR µ N , chiều rộng pic tỷ lệ với N
N
Rµ hay R µ L
N
Thí dụ khi tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải mới R' sẽ là: R' = 2R
Cách làm tăng độ phân giải
a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột:
Có 4 biện pháp gồm: tăng chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ
hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh, giảm đường kính cột.
b) Dựa trên thay đổi vận hành cột
Vận hành cột ở điều kiện tối ưu sẽ thu được hiệu quả tách cao nhất gồm: tối ưu
hoá tốc độ pha động (tỷ lệ dung môi, pH, thêm phụ gia …), giảm lượng mẫu, giảm nhiệt
độ cột (GC), thay đổi thành phần pha động (LC).
Thí dụ 10.2: a) Tính độ phân giải R của phép sắc ký biết rằng thời gian lưu và chiều
rộng pic giống thí dụ 10.1. b) Cũng với các dữ kiện giống như ở thí dụ 10.1, thay đổi
chiều dài của cột từ 320cm lên 400cm. Tính độ phân giải?
Giải: a) R = 2(300 - 280)/(15 +14) = 1,3793.
Phép sắc ký mới tách được cấu tử A và B nhưng chưa đạt độ phân giải đường nền.
b) tRA = 280(400/320) = 350 s
tRB = 300(400/320) = 375 s
N = 16(tR/w)2 = 6400.(400/320) = 8000.
16(350) 2
WA = = 15,65 s
8000
 16(375) 2 (375 - 350)
WB = = 16,77 s ; R = = 1,54
8000 (15,65 + 16,77) / 2
Kết quả này cho độ phân giải tốt hơn, phép tách sắc ký đạt độ phân giải đường đáy.
Một cách đơn giản hơn cũng có thể xác định được độ phân giải mới:
Do R tỷ lệ với (L)1/2 ta có biểu thức
R2 L2 R2 400
= hay = ; R2 = 1,54
R1 L1 1,3793 320

10.1.5 Ứng dụng của phương pháp

Phương pháp sắc ký có khả năng tách riêng rẽ các chất, từ đó kết quả phân tích
định lượng rõ ràng hơn. Sắc ký tham gia vào phân tích hầu hết các mẫu phức tạp trong
hầu hết các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục vụ
đời sóng như chữa bệnh, điều tra hình sự. Ngoài ra sắc ký còn là công cụ đắc lực phục
vụ cho nghiên cứu khoa học. Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, phương pháp góp phần
tách và định lượng các dinh dưỡng trong sản phẩm; phân tích các độc tố, như thuốc bảo
vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống …
Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân
tích các thuốc kháng sinh. Phân tích các dược phẩm, dược liệu …
Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác động của
môi trường tới đời sống con người. Thí dụ tách và định lượng hàm lượng các chất độc
hại trong không khí
10.1.6 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter
Theo thuyết này, yếu tố tốc độ của pha động có vai trò cực kỳ quan trọng đối với
hiệu quả tách sắc ký. Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa là hệ số khuyếch
tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều bởi tốc độ pha
động. Ngoài ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột..., cũng ảnh hưởng rất nhiều tới
sự dãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng của píc thu được trong sắc đồ.
Các tác giả đưa ra đại lượng đặc trưng cho độ giãn rộng của vùng chất phân tích là chiều
cao đĩa lý thuyết, H. Chiều cao đĩa lý thuyết được cấu thành do 3 yếu tố H1, H2, H3 là 3
đại lượng độ giãn rộng thành phần.
H = H 1 + H2 + H3 (10.14)
H1 Là đại lượng khuyếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng đều của hạt
nhồi, đường kính hạt nhồi, khả năng nạp cột, được viết:
H1 = 2 ldp
trong đó l là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt, nó có giá trị =1,5; dp là đường kính hạt
nhồi
 H2 Là đại lượng khuyếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuyếch
tán của chất phân tích về hai ðầu của cột, phụ thuộc vào tốc ðộ của pha ðộng, hệ số
khuyếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu
diễn bằng phương trình: H2 = B/ u
Trong đó B = 2 g Dm là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuyếch tán của chất phân
tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của
chất phân tích không quá khúc khuỷu, g =1; Dm là hệ số khuyếch tán của chất phân tích
trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là:
H2 = 2 g Dm / u
H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc nhiều
vào tốc độ hấp thu và giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và pha động, vì
vậy H3 có thể viết:
H3 = (CS + Cm) u
trong đó CS là hệ số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha tĩnh phụ
thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ, khi tốc độ dòng, F ³ 1ml/phút, CS » 0.
CS = K. df2 / DS ;
Trong đó K là hệ số, DS là hệ số khuyếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh,
df2 - là chiều dày pha tĩnh
Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha
động, phụ thuộc vào pha động.
C m = b dp 2 / D m
Trong đó b là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1, Dm là hệ số khuyếch tán của
chất phân tích trong pha động.
Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:
H =2 ldp + 2 g Dm / u +(K. df2 / DS + b dp2 / Dm) u
Phương trình trên (1.43) thường được viết tắt là
H = A + B/u + Cu (10.15)
Trong thực tế có thể tính gần đúng H » 3-4 dp
Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm của phương trình Van Deemter, ta
có: H’ = -B/ u2 + C. Tại cực tiểu, H’ = 0
hay -B/u2 + C = 0 Þ u2t.ư = B/C Þ
ut.ư = ( B/C )1/2
Þ Hmin = A + 2. (B/C )1/2

H
 Cu

B/u
Hmin

A
utư u, cm/s

Hình 10.4 Đường cong Van Deemter

Đối với cột mao quản, A trong phương trình Van Deemter bằng zero, Golay đã đề nghị
phương trình:
2D m 1 f(k).r 2 .u 2 g(k).d f2 .u
H= + + = B/u + (Cs+Cm)u (10.16)
u 24 D m 3 DS
Trong đó, r là bán kính cột mao quản, f(k), g(k) là các hằng số.
Biểu diễn mối quan hệ trên bằng đồ thị ta có giản đồ trên hình 1
Thí dụ 10.3: Một phép phân tích sắc ký khí dùng cột mao quản dài 30 m, chạy một chất
chuẩn ở vận tốc khác nhau cho các số liệu dưới đây:
Vận tốc , u (cm/s) số đĩa( n )
0,5 50000
1,0 50000
Xác định các thông số B, C và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó, cho A = 0.
Giải: Chiều cao của đĩa lý thuyết ở cả 2 vận tốc trên là:
H=3000/50000= 0,06 cm
Ta có hệ phương trình:
B
0,06 = + 0,5 C
0,5
0,06 = B + C
Þ B = 0,02 ; C = 0,04
B
Þ utư = = 0,707 cm/s; Hmin = 2 B.C = 0,0566 cm
C

10.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH SẮC KÝ

10.2.1 Phương pháp sắc ký khí
 Phương pháp sử dụng pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng còn pha động là khí
mang nên gọi là ký khí. Phương pháp này phù hợp với các chất dễ bay hơi, đặc biệt là
các mẫu môi trường, thí dụ các hydrocacbon thơm đa vòng, thuốc trừ sâu v.v. Sự phân
bố của các chất giữa pha tĩnh và pha động là khí tương tự như trong sắc ký lỏng đã phân
tích ở trên.
Pha tĩnh trong sắc ký khí
Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký khí có hai loại là rắn và lỏng.
Pha tĩnh rắn gồm các chất có diện tích bề mặt lớn, có khả năng hấp phụ được các chất
phân tích dễ bay hơi. Đó là oxit nhôm, silicagel, than... Pha tĩnh rắn được áp dụng ít,
đặc biệt là phân tích vết, không phù hợp với các detector hiện đại.
Pha tĩnh lỏng là các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn, đáp ứng những 3 yêu
cầu chính sau:
+ Lực tương tác giữa pha tĩnh với chất phân tích có khả năng tăng độ chọn lọc của
phép tách sắc ký, nghĩa là liên kết mạnh với chất này nhưng yếu với chất kia và do vậy
làm chênh lệch về hệ số phân bố, tăng hệ số tách.
+ Ít bay hơi, không phân huỷ ở nhiệt độ làm việc của cột.
+ Không có những phản ứng bất thuận nghịch giữa chất phân tích và pha tĩnh.
Để chọn pha tĩnh lỏng trước hết một quy tắc vẫn được áp dụng là “quy tắc tương
tự” - Các chất tương tự nhau sẽ hoà tan vào nhau, tuy nhiên cũng phải lựa chọn sao cho
chất phân tích có hệ số phân bố vừa phải. Ở đây có thể thông qua độ phân cực của chất
phân tích và pha tĩnh. Một cách đánh giá độ phân cực theo hệ thức Rohrschneider.
Một số chất thường sử dụng làm pha tĩnh:
Các hydrocacbon Với hydrocacbon không phân cực, pha tĩnh không phân cực, hoặc
phân cực thấp sẽ có tác dụng hấp thu tốt. Squalane là một loại dầu, có công thức phân
tử C30, thường được sử dụng làm pha tĩnh và được xem như pha tĩnh có độ phân cực
thấp nhất. Công thức cấu tạo của Squalane như sau:

Các este: Đây là các chất hữu cơ có khối lượng phân tử khoảng 200-300, độ phân cực
thấp. Đó là các phtalat: Diphenylphtalat, o.C6H4(COOC2H5)2, nhiệt độ làm việc 100-
1600C
Các ankol: Đối với các chất phân tích có độ phân cực cao thì pha tĩnh là các ankol phù
hợp hơpn. Đây là các chất phân cực do các nhóm hidroxyl có độ phân cực cao nên các
pha tĩnh này ưa nước. Sử dụng rộng rãi nhất là polyetylenglycol, có cấu trúc: HO(-CH2-
CH2-O)n-CH2-CH2-OH, nhiệt độ làm việc tới ~ 2500C, nó có tên thương mại
Carbowax® 20M, phân tử lượng trung bình 20000.
Các polyme silicon: Các polyme silicon được sử dụng rộng rãi nhất làm pha tĩnh do tính
đa dạng của các nhóm chức. Tuỳ theo độ phân cực của các nhóm chức mà người ta chế
tạo được các pha tĩnh có độ phân cực khác nhau để phù hợp với chất phân tích.

Loại được sử dụng rộng rãi nhất là Dimetylpolysiloxan có nhiệt độ làm việc 325
- 3500C. Nó có tên thương mại là OV-1 hoặc DB-1. Tuy nhiên các nhóm chức -CH3 có
thể thay thế bằng rất nhiều nhóm chức khác từ độ phân cực thấp đến cao, thí dụ phenyl,
-Cl, -F hoặc-CN v.v. Với 5% diphenyl và 95% dimetylsiloxane, tên thương mại là DB-
5 hoặc HP-5; silicon có 35% diphenyl 65% dimethyl gọi là DB-35 hoặc HP-35... Trên
đây là cấu trúc phân tử một số pha tĩnh.
Bảng 10.1 thống kê một vài loại cột có độ phân cực khác nhau của hãng HP:
Bảng 10.1 Một vài loại cột sắc ký khí trên thị trường
Loại cột Đặc tính Đối tượng Thành phần Loại tương tự
kỹ thuật Phân tích pha tĩnh
HP 1 60-325oC Amin, hidrocacbon, 100% dimetyl- DB-1, SE-30
PCBs, phenols, sulfur siloxane SPB-1, OV-1
o
HP-5 60-325 C Alkaloids, các 5% diphenyl + 95% DB-5, SE-54
halogen, h/c thơm dimetyl-siloxane SBP-5, OV-5
o
HP-35 40-340 C Amin, thuốc BVTV 35% diphenyl +65% DB-35, SPB-35
Dược phẩm dimethyl-siloxane SPB608, AT35
o
HP-210 45-250 C Aldehyd, cơ-clo, 50%triflopropyl + DB 210
Cơ-photpho, BVTV 50% dimethylsiloxane Rtx-200
 HP- 20-280oC Ancol, h/c oxygen 6%cyanolopropyl- DB 1301,
1301 Thuốc BVTV, aroclor phenyl + DB624
94% dimethylsiloxane Rtx-1301
HP-20M 40-250oC Ancol, h/c thơm, dung Polyethylene Glycol BP-20,
môi (PEG) Carbowax 20M
Sau khi chế tạo được pha tĩnh lỏng, người ta đưa chúng lên bề mặt của chất mang
là các vật liệu vô cơ bền với nhiệt và hoá chất như: đất lưỡng nguyên, silicagen hoặc
silicagen silan hoá, trong đó silicagen được sử dụng rộng rãi nhất.
Detector được sử dụng nhiều nhất trong sắc ký khí là ion hóa ngọn lửa
(ionization flame detedtor- FID).

Hình 10.5 Thiết bị sắc ký khí

a- Sơ đồ chức năng máy sắc ký khí
b- Sơ đồ nguyên lý detector FID
Nguyên lý làm việc của detector là chất phân tích sau khi tách, đi vào detector
bị ion hóa trong ngọn lửa có nhiệt độ khoảng 2000OC. Các ion di chuyển về phía các
điện cực trái dấu đặt gần ngọn lửa, làm xuất hiện dòng điện là tín hiệu phân tích cần đo.
Có thể tóm tắt hoạt động của máy sắc ký khí như sau: Khí mang được bơm đi
qua cột liên tục trong khi cột được duy trì ở một nhiệt độ nhất định; Khi bơm mẫu vào
cột qua đầu cột, các chất trong mẫu được tách khỏi nhau trong cột. Các chất đã được
tách lần lượt đi vào detector, chuyển thành tín hiệu điện và bộ phận xử lý tín hiệu đánh
giá và ghi lại cho mục đích định tính và định lượng mẫu phân tích.
10.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng
Như đã đề cập ở trên, phương pháp sắc ký lỏng có rất nhiều loại tùy thuộc vào
pha tĩnh và pha động. Ta sẽ xem xét một vài loại cơ bản hay được sử dụng.

Sắc ký lỏng pha thường

Cơ sở của phương pháp là dùng pha tĩnh phân cực ở mức độ khác nhau có khả
năng hấp thu chất phân tích, pha động là các chất ít phân cực hơn. Pha tĩnh có các loại
vật liệu không biến tính, diện bề mặt lớn như oxit nhôm, silicagel, florisil v.v. trong đó
silicagel được sử dụng nhiều hơn. Tùy thuộc vào cách chế tạo mà các vật liệu trên có
các tính chất khác nhau, tuy nhiên đặc điểm chung là có diện tích bề mặt lớn (có thể đạt
500 -800m2/gam), ưa nước. Ngoài ra khi tiến hành tách sắc ký, các chất nhồi này thường
gây ra phản ứng bất thuận nghịch, tạo pic có đuôi và mất dần tính chất sắc ký. Chính vì
hạn chế trên, một vật liệu làm pha tĩnh là silicagel biến tính ra đời.
Pha tĩnh silicagel biến tính là sản phẩm của phản ứng giữa closilan hữu cơ và các
nhóm silanol trên bề mặt silic. Phản ứng này còn gọi là phản ứng ete hoá bởi vì sản
phẩm của phản ứng có dạng ete như sau:

(10.1)
Tuỳ thuộc vào loại closilan hữu cơ mà ta có pha tĩnh khác nhau. Để điều chế các
pha tĩnh cho sắc ký pha liên kết pha thường, người ta sử dụng R1 là các hidrocacbon
phân cực. Có 3 loại nhóm chức phân cực thường, đó là:
- Các loại diol: -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH
- Cyano : -(CH2)3-CN và
- Amino: -(CH2)3-NH2 ... , còn R2 và R3 là các gốc clorua, thí dụ:

Silan hóa bề mặt silic là công việc khó, đòi hỏi điều kiện thí nghiệm phải được
thực hiện nghiêm ngặt. Bề mặt silic cần được chuẩn bị kỹ, để có nhiều nhóm silanol cho
phản ứng silan hóa.
Chất nhồi silic biến tính làm pha tĩnh đối với cả 2 phương pháp sắc ký lỏng pha
thường và pha đảo có những ưu điểm sau:
+ Là vật liệu chịu được áp suất rất cao, có thể chịu được tới 1000 atmotphe
+ Trơ với các dung môi và hóa chất, nó chỉ bị phá hủy trong môi trường rất kiềm
và rất axit
+ Là chất nhồi phù hợp với phân tích vết do vừa khắc phục được hiện tượng phản
ứng bất thuận nghịch
+ Đáp ứng được đa dạng các chất phân tích có độ phân cực khác nhau.
Pha động là các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Để pha chế được
các dung môi như vậy, một hỗn hợp gồm 2 hay nhiều dung môi hữu cơ trộn lẫn. Ngoài
ra pH của pha động, các chất phụ gia khác như chất tạo phức cũng được chú ý để nâng
cao hiệu quả tách của phương pháp.
 Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có các yêu cầu và tính chất sau:
1. Yêu cầu của pha động:
- Phải hòa tan được mẫu phân tích
- Trơ với pha tĩnh cũng như vật liệu trong hệ sắc ký
- Đảm bảo tính chọn lọc của phương pháp
- Có lực dung môi vừa phải sao cho hệ số lưu trong khoảng 1 ≤ k’ ≤ 5
Để đạt được các yêu cầu cơ bản trên, pha động cần có các tính chất sau:
2. Tính chất của pha động
- Phù hợp với hệ phát hiện
- Độ nhớt thấp (để dảm bảo cho áp suất đầu cột không quá cao)
- Bền trong quá trình chạy sắc ký
- Không chứa các tạp chất
- Càng khó cháy càng tốt và ít độc hại
Thiết bị sắc ký lỏng pha thường và vận hành được đề cập chung cùng với sắc ký
lỏng pha đảo.
Sắc ký lỏng pha đảo
Pha tĩnh
Điều chế pha tĩnh trong sắc ký lỏng pha đảo hoàn toàn tương tự như là điều chế
pha tĩnh trong sắc ký lỏng pha thường (phản ứng 10.1). Tuy nhiên điểm khác biệt là
mạch hydrocacbon gắn trên silic là các closilan hữu cơ không phân cực hay rất it phân
cực. Trong trường hợp này ta có pha tĩnh cho sắc ký pha đảo. Thí dụ R1 là C18, ta có
pha tĩnh octadecylsilan (ODS) rất thông dụng.
Đặc điểm của pha tĩnh liên kết ngược
• Bề mặt kỵ nước: Silic sau khi ete hoá, có các nhóm chức hidrocacbon trên bề mặt đã
làm thay đổi tính chất của nó. Tính kị nước càng cao khi lớp ODS càng dày, ngoài
ra thay đổi các nhóm chức làm cho pha tĩnh trở nên đa dạng hơn.
• Còn các nhóm silanol chưa liên kết: Chỉ có khoảng 50% các nhóm silanol trên bề
mặt silic được ete hoá, các nhóm này ảnh hưởng tính không phân cực của pha tĩnh,
phải hạn chế được ảnh hưởng của các nhóm silanol. Vì vậy, người ta còn phải silan
hoá tiếp các nhóm silanol còn lại bằng hợp chất metylsilan Cl-Si(CH3)3. Ngoài ra,
tạp chất kim loại làm hoạt hoá các nhóm silanol, tăng tính axit của pha tĩnh, là nguyên
nhân làm dãn rộng vùng mẫu.
• Chiều dài mạch hydrocacbon liện kết trên bề mặt càng lớn, tính không phân cực càng
cao: Bằng thực mghiệm, sử dụng cột tách có các nhóm chức là các hidrocacbon có
 số cacbon khác nhau, từ C3 – C20 , tách các chất hidrocacbon thơm, người ta đã thấy
hệ số phân bố tỷ lệ thuận với chiều dài mạch hidrocacbon.
Mạch hydrrocacbon càng cồng kềnh, tính không phân cực càng cao, khả năng
hấp phụ càng lớn, các phân tử closilan hữu cơ có thể tương tác với nhau hình thành các
mạch hidrocacbon mạch dài hơn, che phủ bề mặt tốt hơn, càng ít phân cực.
Pha động trong RP-HPLC
Sự lựa chọn pha động tuân theo nguyên tắc chung là chất phân tích phải tan trong
pha động và đảm bảo hệ số tách của các chất phân tích như đã trình bày ở trên. Bằng
cách thay đổi loại dung môi cũng như nồng độ của nó để thay đổi hệ số phân bố để có
được hệ số phân bố phù hợp cho chất phân tích cũng như cho cả dãy chất phân tích.
Người phân tích trước hết căn cứ theo các tài liệu tham khảo để có dung môi với lực
dung môi phù hợp, sau đó giữ lực dung môi và thay đổi loại dung môi trong cùng nhóm
để chọn ra dung môi tối ưu. Các dung môi thường sử dụng trong sắc ký lỏng pha đảo
được đưa ra trong bảng 10.2
Bảng 10.2 Sự phụ thuộc k' vào thành phần dung môi trong RP-HPLC
Dung môi Độ phân cực Số lần giảm k’ khi tăng
10% dung môi vào nước
Nước 10,2
Dimethyl sunfoxide 7,2 1,5 lần
Ethylene glycol 6,9 1,5 –
Acetonitrile 5,8 2,0 –
Methanol 5,1 2,0 –
Acetone 5,1 2,2 –
Dioxane 4,8 2,2 –
Ethanol 4,3 2,3 –
Tetrahydrofuran 4,0 2,8 –
i-propanol 3,9 3,0 –

Sự lựa chọn pha động trong sắc ký lỏng pha đảo khó khăn hơn so với sắc ký lỏng
pha thường do nước cũng là môi trường của mẫu phân tích. Đôi khi thay đổi loại dung
môi làm cho hiệu quả tách của phương pháp tăng lên nhiều, ngoài ra sử dụng dung môi
ba thành phần cũng là một giải pháp tăng cường hiệu quả tách (thí dụ
methanol/dioxan/nước).
Ưu nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm:
 - Phương pháp có thể áp dụng cho nhiều loại đối tượng chất phân tích, từ hợp chất
không phân cực cho đến phân cực, kể cả ion kim loại nếu kết hợp với chất tạo cặp
ion.
- Phương pháp có độ chọn lọc cao khi sử dụng đúng pha tĩnh và pha động.
- Cân bằng phân bố xảy ra nhanh, có thể sử dụng các cân bằng phụ để tăng cường
độ chọn lọc của phương pháp,
- Hiệu quả tách cao, pic cân đối,
- Pha động thường là hỗn hợp của nước và các dung môi phân cực nên rẻ tiền .
Nhược điểm: Hoạt động của pha tĩnh có hiệu quả trong khoảng pH hẹp, từ 2-8,
ảnh hưởng của nhóm silanol và cơ chế tách còn chưa rõ.
Ứng dụng của sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC
Phương pháp RP-HPLC có pha tĩnh không phân cực điển hình là octadesilxilan
(ODS) có ứng dụng rộng rãi, phân tích được đa dạng các chất phân tích. Đó là các các
chất ít phân cực như các hydrocacbon thơm (PAHs), các hợp chất cơclo (PCBs)...cho
đến các chất phân cực: axit amin, phenol.... Ngoài ra phương pháp có thể phân tích được
các chất mang tính ion, thí dụ các ion kim loại.
Phương pháp HPLC trao đổi ion

Ph-¬ng ph¸p s¾c ký trao ®æi ion ra ®êi sím, ®-îc sö dông réng r·i vµo nh÷ng
n¨m 1960, ®ãng gãp vµo viÖc t¸ch vµ x¸c ®Þnh c¸c chÊt ph©n tÝch cã tÝnh chÊt ion.
Ban ®Çu ph-¬ng ph¸p sö dông nhùa trao ®æi ion tæng hîp lµm pha tÜnh, tuy nhiªn do
cã h¹n chÕ vÒ kh¶ n¨ng chÞu ¸p suÊt vµ tÝnh ®éng häc, ph-¬ng ph¸p ngµy cµng ®-îc
hoµn thiÖn bëi c¶i tiÕn c¸c chÊt nhåi, tr-íc hÕt lµ gi¶m ®-êng kÝnh cña h¹t nhåi, sau
®ã thay ®æi chÊt nhåi cét lµm cho hiÖu lùc t¸ch cña cét tèt h¬n.
Pha tĩnh trong HPLC trao đổi ion
Pha tĩnh loại này cũng được điều chế tương tự hai phương pháp sắc ký lỏng pha
đảo và pha thường đã đề cập ở trên (phản ứng 10.1). Tuy nhiên mạch hữu cơ mang
nhóm chức có khả năng trao đổi ion.
≡Si-OH + ClSiR ⇒ ≡Si-O-Si R
trong đó -R mang nhóm chức có khả năng trao đổi ion. Trường hợp R mang
nhóm –SO3H hoặc –COOH, pha tĩnh mang tính trao đổi cation ; khi R mang nhóm chức
-CH2N(CH2CH3)3Cl (hoặc các amin bậc thấp hơn) pha tĩnh mang tính trao đổi anion.
Sự thay đổi chất nhồi hay pha tĩnh là một bước cải tiến đáng kể trong phương
pháp sắc ký trao đổi ion. Hiện tượng khuếch tán chậm khi chất tan phải chui sâu vào
hạt trao đổi đã bị hạn chế đáng kể, mặt khác hạt nhân silic rất cứng nên chịu áp suất rất
tốt, vì vậy chất nhồi đã mang được cả hai tính ưu việt đó là chịu áp suất và khả năng
trao đổi tốt. Cũng từ đây do hiệu lực cao của cột tách, phương pháp HPLC trao đổi ion
đã giải quyết được nhiều mẫu phân tích trong thực tế. Tuy nhiên, nói như vậy không có
nghĩa là chất nhồi này đã hoàn toàn tốt, nhược điểm của nó là khoảng pH làm việc thu
hẹp so với phương pháp dùng ionit truyền thống, mặt khác, hiệu lực của cột vẫn bị giảm
theo thời gian do bản chất của nhựa là không chịu được áp suất cao.
Pha động trong HPLC trao đổi ion là các dung dịch đệm có pH xác định, ngoài
ra trong thành phần pha động còn có chất tạo phức để tăng tính chọn lọc của phương
pháp ( xem bảng 10.3).
Bảng 10.3 Một vài loại cột ion trên thị trường
Loại cột Nhóm Pha động Chất phân tích
chức
Cationit
Shim pack IC-C1 Dung dịch đệm có pH xác Các kim loại Mg2+
(Shimadzu) -RSO3H định, có chất tạo phức Cu2+, Ln3+…
PRPx100. -RSO3H Dung dịch đệm có pH xác Các ion kim loại
PRPx200(Haminton) định, có chất tạo phức hoá trị 2 và3
Nucleosil 5 SA -RSO3H tartaric 4 mmol Mg2+, Ca2+, Ba2+,
(Metrohm) citric 0,5 mmol Sr2+, Fe2+ Co2+ Ni2+
4x125 mm, pH2-7 ethylendiamin 3 mmol Cd2+ Zn2+ Mn2+
acetone 5%; 1,5 ml/phút
Metrosep (Metrohm) Si- tartaric axit 5 mmol Li+, K+, Na+, NH4+,
C1,4,6x125 O(CH2)3- dipicolinic axít 1 mmol Mg2+, Ca2+
(6-1010-100) COOH
Metrosep C2-100 Si- tartaric axit 4 mmol Li+, K+, Na+, Rb2+,
Metrosep C2-250 O(CH2)3- dipicolinic axít 7,5 mmol Cs2+, Mg2+, Ca2+,
(Metrohm) 4x100 COOH Ba2+ …
Ion pack CS 14 -RSO3H 5mmol Methansunfonic axit 20 cation vô cơ và
+2,5% ACN, gradien tới hữu cơ: Li+, Na+,
6mmol Methansunfonic axit NH4+, morphin,
+2,5% ACN Trimetylamin…
Anionit
Shim pack IC-A1 Amin bậc4 Cl-, NO3-, SO42-,
(Shimadzu) HBO32-, HSiO42-
Metrosep A Supp 5- Amin bậc 4 Cl-, Br-, I-, ClO3-,
100 (5-150, 5-150) ClO2-, ClO4-, BrO3-
Ion pack AS11 Amin bậc 4 dung môi 1: 5mmolNaOH 38 anion hữu cơ và
dung môi 2 10 mmol KOH vô cơ: Cl-, F-…
phtalat, xitrat…
Super-sep 4,6x 100 polimeth Phtalic acid 2,5 mmol Cl-, F-, NO2-, Br-
(6.1009.000) acrylate Acetonitril 5%
TRIS pH 3,8

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Hình 10.6 Sơ đồ chức năng thiết bị HPLC
Thiết bị gồm 3 khối chức năng cơ bản: Khối đầu vào gồm bộ phân cấp dung môi,
là áp suất, van bơm mẫu … Khối chức năng thứ 2 là cột tách, đôi khi thêm cột bảo vệ;
Khối thứ 3 là thiết bị đầu cuối gồm detector, máy tích phân, máy ghi và phần mềm điều
khiển và xử lý số liệu. Ngày nay bằng tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều bộ phận
trong thiết bị HPLC được cải tiến như detector, vật nhồi cột và công nghệ thông tin giúp
cho thiết bị ngày càng hoàn hảo, giảm thời gian phân tích và dạt độ nhạy rất cao.
10.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT DUNG MÔI
10.3.1 Định nghĩa
"Chiết là quá trình chuyển chọn lọc chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ"
+ Chiết các chất vô cơ: Các ion kim loại, các anion tan trong nước là các chất có
khả năng hydrat hoá tốt. Muốn chuyển các ion này vào pha hữu cơ, cần loại bỏ lớp vỏ
hydrat hoá, tạo liên kết giữa chúng với các chất tạo phức, còn gọi là tác nhân chiết theo
các cơ chế khác nhau, tạo hợp chất mới gọi là dạng chiết dễ dàng chuyển sang pha hữu
cơ.
 + Chiết các chất hữu cơ: Để chuyển được các chất tan hữu cơ từ pha nước sang
pha hữu cơ, một nguyên tắc cơ bản luôn được áp dụng là “ các chất tương tự nhau sẽ
hoà tan vào nhau”.
Các chất hữu cơ có lực tương tác với các phân tử trong pha chất hữu cơ theo các
lực phân cực hoặc lực phân tán, tuy nhiên để chiết được triệt để, E% chiết cao trước hết,
người phân tích phải chọn các dung môi chiết cho phù hợp để các chất phân tích phải
tan tốt vào pha hữu cơ theo sự tương tự về tính chất của chúng.
Mặt khác ta phải sử dụng các kỹ thuật chiết lặp giải chiết, rửa chiết để có được
chất phân tích tinh khiết, hiệu quả chiết cao.
10.3.2 Nguyên tắc và điều kiện chiết
Chiết lỏng lỏng là kỹ thuật chiết dựa trên sự phân bố khác nhau của chất phân
tích vào 2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chúng ra khỏi nền hoặc tách các tạp chất
ra khỏi chất phân tích. Người ta cố gắng tìm điều kiện chiết thích hợp để chất phân tích
phân bố ưu tiên vào một pha (thường là pha hữu cơ) càng chọn lọc và càng nhiều càng
tốt, còn tạp chất đi vào pha hữu cơ càng ít càng tốt. Các điều kiện cần khảo sát là loại
dung môi chiết, nồng độ thuốc thử, pH của dung dịch, nồng độ các chất che, các chất
cản, nhiệt độ ...
Điều kiện chiết chất phân tích:
1. Hai pha không trộn lẫn: Dung môi và dung dịch chiết là hai pha không tan vào nhau,
đảm bảo có bề mặt phân chia rõ ràng.
2. Hệ số tách a ¹ 1, càng khác 1 càng tốt (a = KDA/KDB); tối ưu là KDA.KDB = 1.
3. Cân bằng chiết xảy ra nhanh và thuận nghịch, các phản ứng trong hệ chiết xảy ra
nhanh, định lượng.
4. Tối ưu hóa các điều kiện chiết: pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ
thuốc thử, chất phụ gia được chọn ở giá trị tối ưu.
10.3.3 Hiệu suất E% chiết và hệ số tạp chất g
Phần trăm chiết là khái niệm chỉ hiệu suất của quá trình chiết. Nó là phần chất
phân tích đã đi vào pha hữu cơ so với lượng chất phân tích ban đầu nhân với 100.
Nếu gọi m2 là lượng chất đi vào pha hữu cơ, m1 là lượng còn lại trong pha nước đều
tính bằng mol hoặc gam đều được ta có:
m2
E% = .100 (10.26)
m1 + m2
Cũng có thể biểu diễn theo dạng số mili mol như sau:
 C 2V2
E%= .100 ; trong đó V2 là thể tích pha hữu cơ, V1 là thể tích pha nước (ml).
C 2V2 +C 1V1
KD
Nếu chia cả tử số và mẫu số cho C1V2 ta có E% = .100 (10.27)
V
KD + 1
V2
EB %
Hệ số tạp chất g là tỉ số E% của tạp chất đối với E% của chất phân tích: g =
EA %
10.3.4 Chiết hoá học, hệ số phân bố điều kiện KD ( một số tài liệu ký hiệu D)
Trong quá trình chiết, chất tan thường có phản ứng với tác nhân chiết và những
cân bằng khác làm cho chất tan có nhiều dạng ngoài dạng chiết thông thường. Như vậy
có thể xem quá trình chiết như phản ứng hóa học mà sau khi phản ứng sản phẩm chuyển
pha từ pha nước sang dung môi. Hệ số phân bố điều kiện KD được định nghĩa:

KD = å Ch / c =
Tæng nång dé chÊt tan trong pha hòu co
(10.28)
å Cn Tæng nång dé chÊt tan trong pha nuí c
Thí dụ chiết I2 từ pha nước vào pha hữu cơ khi pha nước có I-, có cân bằng sau:
[ I 2 ] h/ c
I2 + I- = I3- vì vậy hệ số phân bố điều kiện là KD =
[ I 2 ] n + [ I -3 ] n
Khi chiết 8-oxy quynolin (viết tắt là HOX) từ pha nước vào pha hữu cơ. HOX là
chất có nhiều cân bằng trong nước nên hình thành nhiều cấu tử, tuy nhiên chỉ có HOX
là lên pha hữu cơ:
HOX + H+ = H2OX+
HOX OX- + H+ .
[HOX]h/c
Khi đó KD của cân bằng chiết này: KD =
[HOX]n + [H2OX + ] + [OX- ]
Trong các tính toán về chiết, nếu xét tất cả các cân bằng xảy ra trong hệ, bài toán trở
nên rất phức tạp, người ta thường bỏ qua các cấu tử có nồng độ nhỏ để giải được dễ
dàng hơn. Trong thí dụ trên, tìm điều kiện để OX- và H2OX+ ít hình thành để bỏ qua,
bài toán trở nên đơn giản hơn.
10.3.5 Cơ chế chiết các ion kim loại
10.3.5.1 Chiết theo cơ chế tạo hợp chất nội phức
Hợp chất nội phức còn gọi là phức càng cua là phức giữa ion kim loại và hợp chất
hữu cơ chứa ít nhất là 2 nhóm chức tham gia liên kết.
Một nhóm chức chứa proton có thể phân ly : -S-H hoặc =N-H, -NH2 ...
Nhóm thứ 2 chứa cặp electron tự do : ºN: , =O: , =S: ,
Có thể đưa ra đây một vài thí dụ:
- Các hợp chất oxim - 8 oxy quynolin
 +Men+

.N. .... .N.

OH H.... O n+
.. Me /n

- Các ankyl photphat, ankyl sufonic, ankyl cacboxilic

R O OR
P O .... O:
.. .
O. ....H R S O...H
.. Men+/n R C
O.
. .... Men+/n
M en+/n O: O
ankyl photphat ionit lỏng
10.3.5.2 Chiết theo cơ chế tạo hợp liên hợp ion, A+.B-
Trong loại này bao gồm các ion kim loại liên kết với các chất vô cơ hoặc hữu cơ
tạo thành các cation hoặc anion có khối lượng lớn chúng kết hợp với các ion đối thường
cũng có khối lượng lớn và đi vào pha hữu cơ thí dụ: Hợp chất của Photpho có độ âm
điện lớn liên kết với ion kim loại tạo nên cation có khối lượng lớn:
O RO
-
R C R FeCl 4- ; RO P O: Ce4+ (NO3 )4
H+ RO

Các ion đối là NO3-, FeCL4- ...Trên đây là hệ chiết A+, B- điển hình
10.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết hóa học
10.3.6.1 Ảnh hưởng nồng độ H+ trong tướng nước.
a) [H+] tham gia dạng chiết.
Trường hợp này, khi axit hoá dung dịch, H+ đi vào liên kết với tác nhân chiết, trở
thành ion dương ở ngay trên bề mặt phân chia giữa 2 pha, tiếp theo, chúng liên kết bền
vững với các ion đối trong pha nước là các chất cần chiết và chuyển vào pha hữu cơ.
Thí dụ chiết Fe3+ bằng ete trong môi trường axit
(Fe3+)n + 4(Cl-)n + (H+)n + xSh/c = {H[FeCl4]xS}h/c
{ H[ FeCl 4] . . xS} h / c
Kex = ; Fe(III) còn tồn tại ở dạng tự do, hệ số phân bố điều kiện
[ Fe 3 +] n[ Cl -] 4n[ H +] n[ S] xh / c
{ H( FeCl 4) . . xS] h / c
KD = 3+
[ Fe ] n + { H[ FeCl 4] . . xS} n
Giả sử có bao nhiêu Fe3+ đều chuyển thành FeCl-4 sau đó đều tạo dạng chiết
H(FeCl4)..xS và chuyển lên pha hữu cơ bấy nhiêu và có nồng độ thích hợp để không có
sản phẩm phụ, lúc đó:
[ H( FeCl 4) . . xS] h / c KD
KD = 3+
. Thay KD vào Kex ta có Kex = - 4
[ Fe ] n [Cl ]n .[ H + ]n .[ S ]hx / c
logKD
 A log[H+]
H×nh 10.8 Sù phô thuéc logKD vµo log[H+]
trong đó A = (lgKex + 4lg[Cl-] + xlg[S]h/c) = const.
Nếu trong điều kiện thí nghiệm không đổi, Kex = const, nồng độ [Cl-] đủ lớn =
const ® KD chỉ phụ thuộc vào [H+].
lgKD = lgKex + 4lg[Cl-]n + lg[H+]n + xlg[S]h/c. (10.29)
b) [H+] ảnh hưởng tới tác nhân chiết.
Chiết các ion kim loại có sử dụng các tác nhân chiết, đa số các trường hợp tác
nhân chiết là các phân tử hữu cơ có nhóm -SH, OH, -COOH ..., khi thay đổi nồng độ
H+ sẽ làm thay đổi sự tạo phức hay liên hợp ion của ion kim loại và tác nhân chiết.
Gọi tác nhân chiết có công thức là (HR)h/c, ta có phản ứng chiết:
Mx+ + x(HR)h/c ( MRx)h/c + x(H+)n
[ MRx] h/ c[ H + ] nx
Kex = . Mặt khác theo định nghĩa ta cũng có:
[ M x+ ] n .[ HR] hx / c
[ MR]h / c
KD = .
[ M ]n + [ MR]n + [ M (OH )]x + -1 + ...
x+

Giả sử ở pH thích hợp không có phản ứng phụ, [MR]n chuyển hết vào pha hữu cơ,
K D .[ H + ] xn
M(OH) không có, vậy: Kex =
[ HR] xh/ c
lgKD = lgKex + xlg[HR]h/c + xpH (10.30)
Hình 10.9 Ảnh hưởng của pH đến KD
Khi x=1, pH tăng 1 đơn vị thì KD tăng
10 lần (1® 2)
Khi x=2, pH tăng 1 đơn vị thì KD tăng 100 lần
Khi x=3, pH tăng 1 đơn vị thì KD tăng 1000
lần
pH1/2 là pH ở đó E% = 50%; KD = 1.
XpH1/2 = -lgKex - xlg[HR]
Nồng độ [HR] có thể xác định, nếu biết Kex, tìm được pH1/2 và ngược lại

Thí dụ 10.5 Thuốc thử HR tương tác với A và B theo các phương trình sau:
 Ax+ + x HR ® (ARx)h/c + x(H+)n ; (pH1/2)0,1= 3
By++ y HR ® (BRyh/c + y(H+)n ; (pH1/2)0,1= 5
Xác định pH tách tốt nhất A khỏi B (g nhỏ), cho HR = 0,1 mol, X= 3; y=2; Vn= Vh/c.
Giải Tính Kex A, Kex B , a
Tại pH1/2 ta có KDA=1
0 = lg KexA + x lg[HR] + x pH
0 = lg KexA + 3(-1) +9

lg Kex A = - 6 ® Kex A = 10 vậy K DB = K exB

-6 [HR ]y
[H ]+ y

Tại pH1/2 ta có KDB =1;

0= lg KexB + 2(-1) + 10, vậy lg KexB = -8 ® KexB = 10-8
Điều kiện tách tốt nhất là KDA . KDB =1, α≠ 1

KDAKDB =
10 -610 -8.10 -5
[ ] 5
[ ]
= 1 ® H + = 10 -19 ® H + = 5 10 -19 = 10 -3,8
[H ]+ 5

pH tối ưu = 3,8
Tính EA, EB, g ở pH = 3,8
lg KDA = -6 -3 + 3.3,8 = 2,4 KDA =102.4
lg KDB = -8 -2 + 2.3,8 = -2,4 KDB= 10-2.4
10 2, 4 10 -2, 4
E A = 100 » 99,9% E B = 100 - 2, 4
= 10 - 0, 4 = 0,39
1 + 10 2, 4 1 + 10
10 - 0, 4
g = = 3,98.10 - 3
100
Kết luận, ở điều kiện pH=3,8, hiệu quả tách đạt tốt nhất.
10.3.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích (Mn+)
Từ biểu thức lgKD = lgKex + nlg[HR]h/c + npH. (10.32)
Ta thấy lgKD không phụ thuộc vào nồng độ ion kim loại bị chiết, thuy nhiên
nồng độ HR có hạn, khi nồng độ ion kim loại lớn sẽ bão hoà trong pha hữu cơ, sẽ chuyển
sang pha nước và KD giảm.
10.3.6.3 Ảnh hưởng của hiệu ứng muối.
Các muối không tạo phức.
Giả sử có các hệ chiết Th(NO3)4 hoặc UO2(NO3)2 /NO3-/TBP.
Nếu có thêm các muối trong pha nước ví dụ NH4NO3, Ca(NO3)2, Al(NO3)2. Các
muối này không bị chiết lên pha hữu cơ tuy nhiên nó có ảnh hưởng sau:
- Hằng số điện môi, e thay đổi.
- Lực ion của nước thay đổi
 - Tỷ trọng hai pha thay đổi.
Một cách định tính có thể thấy nồng độ các muối nitrat kim loại tăng dẫn đến nước
hidrat hoá giảm, hơn nữa, ion chung là nitrat tăng làm nồng độ dạng chiết tăng, hệ số
phân bố KD tăng.
Các phối tử lạ tạo phức với ion kim loại trong pha nước.
Giả sử ion kim loại ngoài việc tạo phức với tác nhân chiết HR còn tạo phức với chất tạo
phức phụ X
x
KD = Kex. [HRx ]
[H + ]
[MX]
Giả sử ion kim loại tạo phức với X, ta có b = Þ [ MX] = b.[M][X]
[M][X]
[MR]h/c [MR]h/c KD
K’D= = =
[M]n + [M]n β[X] [M]n (1 + β[X]) (1 + β[X])
K D [H+ ]x
Þ Kex = . . Như vậy khi b tăng Kex giảm (10.33)
1 + βα [HR]x
10.3.6.4 Ảnh hưởng của tác nhân chiết.
Nồng độ tác nhân chiết.
LgKD = lgKex + npH + lg[HR]h/c
lgKD

B C

lg[HR]
A
Hình 10.10 Sự phụ thuộc log KD vào log nồng độ thuốc thử
Khi [HR] tăng ® lgKD tăng tuy nhiên khi đạt tới mức độ nhất định thì không tăng
nữa mặt khác pH1/2 giảm, có nghĩa là có thể chiết ở môi trường axit hơn.
Ảnh hưởng bản chất tác nhân chiết HR.
+ Đối với các chất nội phức: vị trí của nhóm chức, loại nhóm chức có thể hình
thành liên kết có độ bền khác nhau và kết quả có thể gây ảnh hưởng đến hiệu quả chiết.
+ Chiết theo kiểu A+, B-: trường hợp này, loại nhóm liên kết có ảnh hưởng lớn;
đối với các phân tử có chứa oxy, độ bền liên kết được xắp xếp theo dãy:
R
(R - O)3 - P = O < R O P O < R O P O < R3P = O
2
R R

10.3.6.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ.

f1 - (M 02 - M 10 ) 0
Kea = .exp ; T tăng ® KD giảm.
f2 RT
10.3.7 Kỹ thuật chiết lặp
Chất A phân bố giữa pha nước và pha hữu cơ:
[A]h/c
An ⇋ Ah/c ; Hệ số phân bố K D =
[A]n
KD là hệ số phân bố không có thứ nguyên, [A] thường được tính bằng mol/l, hoặc
g/l, hoặc ppm. Giả sử có mo mmol A sau khi chiết với Vh/c ml dung dịch hữu cơ từ Vn
ml dung dịch nước. Gọi m1.1 là lượng chất tan còn lại trong pha nước, như vậy m0-m1.1
là lượng chất tan đi vào pha hữu cơ thì:
m0 -m1.1 m1.1 m 0 -m1.1/Vh/c
[A]h/c = ; [A]n = ⇨ KD =
Vh/c Vn m1.1/V n

ở đó Vh/c , Vn là thể tích của pha hữu cơ và pha nước.

Vh/c m 0 -m1.1 m 0
KD = = -1
Vn m1.1 m1.1
m0 V
=1+K D h/c
m1.1 Vn
æ ö
ç ÷
÷ =m 0 æç
1 1 ö
m1.1 =m 0 ç , ÷
(10.34)
ç 1+K Vh/c ÷ è 1+k ø
ç D
Vn ÷
è ø
Vh/c
k’ gọi là hệ số lưu, K D =k , ; k , = ( mmolA ) h/c
Vn ( mmolA ) n
Có thể nhận xét rằng A không thể chuyển hoàn toàn vào pha hữu cơ. Muốn chuyển
hoàn toàn người ta lại tiếp tục đưa thêm dung môi hữu cơ mới vào. Cân bằng lần thứ 2
lại được thiết lập, m1.2 là lượng chất tan ở pha nước lần 2
2
1 æ 1 ö 1
m1.2 = m1.1 = mo ç ÷ Þ m1.n = m o (10.35)
(1 + k') è 1 + k' ø (1 + k')n
Thường người phân tích có thể không biết lượng chất tan ban đầu x0 nhưng biết
phần trăm chiết được, thí dụ 99%. Trong trường hợp này, A còn lại trong pha nước sau
n lần chiết là 1%. Có thể tìm được n bằng phương trình:
n
æ 1 ö
1 = 100ç ÷
è 1 + K' ø
Thí dụ 10.6: I2 có thể được chiết từ pha nước bằng dung môi hưũ cơ. Hệ số phân bố
khi chiết bằng CCl4 là 85. Nếu 50 ml của dung dịch nước chứa 2.10-2 mmol I2 được tiếp
xúc với 30 ml CCl4. Tính lượng I2 trong pha nước và pha hữu cơ.
 1 1
m1.1 =m0 =2.10-2 =3,85.10-4 mmol
Vh/c 30
1+K D 1+85
Vn 50
m1.1 là lượng chất tan còn trong pha nước 3,85.10-4 mmol
m0- m1.1 là lượng chất tan còn trong pha hữu cơ 1,96.10-2 mmol
Thí dụ 10.7: Chất X có hệ số phân bố là 2,7 giữa pha nước và benzen. Nếu 50 ml dung
dịch chứa 4,5 mg X.
a)Tính thể tích benzen cần thiết để chiết đơn 99% X;
b) chiết bao nhiêu lần 50 ml benzen để đạt 99%
1
Giải: a). 1 = 100 Þ Vh/ c = 1830ml
Vh/ c
1 + 2,7
50
1 -2
b). 1 = 100 Þ lg 0,01 = n lg 0,27 Þ n = = 3,52
(1 + 2, 7) n
- 0, 568
Thí dụ 10.8: Một chất B có thể bị chiết từ pha nước vào ete. Hệ số phân bố = 10. Nếu
dung dịch nước chứa 2,5 mg B.
a) Thể tích pha nước bằng pha hữu cơ thì chiết được bao nhiêu % B ?
b) % B có thể bị chiết bằng bao nhiêu nếu chia Vh/c làm 4 phần và chiết 4 lần
æ ö
ç 1 ÷
Giải: a). m1.1 = 2,5ç ÷ = 0,23mg
ç 1 + 10 1 ÷
ç ÷
è 1ø
B% = (2,27/2,5)x100 = 90,8%
b). Phần trăm còn lại khi giảm Vh/c :
còn lại % = 100 1
4
= 0,67%
æ 1ö
ç1 + 10 ÷
è 4ø
% chiết = 100-0,67=99,33%
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1. Định nghĩa và giải thích quá trình sắc ký, cho thí dụ minh họa
2. Các lực liên kết có thể có trong hệ sắc ký?
3. Đĩa lý thuyết là gì, nêu các biện pháp để tăng số đĩa lý thuyết
4. Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải.
5. Nêu ý nghĩa các đại lượng H1, H2, H3 trong phương trình Van Deemter
6. Một phép tách sắc ký dùng cột mao quản dài 30 m, có tốc độ pha động tối ưu là
5cm/s với số đĩa lý thuyết 12000. Xác định các thông số B, C trong phương trình
Van Deemter với hệ này, cho A=0
7. Dùng một cột sắc ký mao quản dài 30 m chạy chất chuẩn với các tốc độ khác nhau
cho các số liệu sau:
Tốc độ pha động (cm/s) Số đĩa lý thuyết
0,1 2000
0,5 1500
Xác định tốc độ pha động tối ưu và số đĩa lý thuyết ở tốc độ tối ưu đó, cho A=0
8. Một cột sắc ký dài 20 m, tách 2 chất A và B cho các số liệu sau: tRA = 250s , tRB =
260s, độ rộng pic: wA = 10s, wB =10s, thời gian chết, tm=10s. Tính số đĩa lý thuyết
(n), chiều cao đĩa lý thuyết (H) và độ phân giải của cột. Nếu tăng chiều dài cột lên
gấp đôi thì độ phân giải là bao nhiêu.
9. Chất A2+ phản ứng với thuốc thử HL tạo thành AL2 tan tốt trong CHCl3 theo phản
ứng: A2+ + 2 HL = AL2 + 2H+; Có 50ml chứa 4,5mg A2+, nếu dùng HL nồng độ
0,01 M ở pH 2, thể tích pha nước (Vn) bằng pha hữu cơ (Vhc) thì chiết được 50% A
lên CHCl3. A2+ không tham gia phản ứng phụ và AL2 không tồn tại trong pha nước.
b) Chiết bao nhiêu lần ở pH 2,5; nồng độ HL 0,01M để đạt 99,9% A khi Vn=Vhc.
c) Tính thể Vhc để chiết 1lần đạt 99,9% A biết pH 2,5 nồng độ HL 0,01M