KỸ THUẬT

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN

Phạm Thái Bình

Nội dung

• Hướng dẫn khử khuẩn trong phòng xét nghiệm vi sinh.

• Hướng dẫn thao tác vô trùng.

• Hướng dẫn sử dụng các thiết bị thông dụng trong phòng

xét nghiệm vi sinh.

• Hướng dẫn kỹ thuật cơ bản trong xét nghiệm vi sinh.

2
 HƯỚNG DẪN KHỬ KHUẨN
TRONG PXN VI SINH

Phân biệt các dạng khử trùng

Khử trùng (Disinfection) / Thông số Khử trùng Sát trùng

Sát trùng (Antisepsis): tiêu Phương pháp Nhiệt, bức xạ, Hóa chất
lọc, hóa chất
diệt, ức chế, loại bỏ hoặc
Tiêu diệt vi sinh vật Không Có
làm giảm hàm lượng vi sinh
trên bề mặt da hoặc
đến mức gần như hoàn toàn
màng nhầy
(một số vi sinh vật hoặc bào
Tiêu diệt vi sinh vật Có không
tử có thể sống sót). trên vật chất

4
 Phân biệt các dạng khử trùng

• Làm sạch (Sanitization): loại bỏ những

“chất bẩn”.

• Tiệt trùng (Sterilization): tiêu diệt hoặc

loại bỏ hoàn toàn tất cả vi sinh vật, kể
cả bào tử.

• Vô trùng (Aspetic): quá trình ngăn chặn

hoặc dự phòng sự xâm nhập của vi
sinh vật.

Các phương pháp khử trùng

6
 Khử trùng bằng tia cực tím
• Bước sóng 210 –
328nm nhưng khả năng
diệt khuẩn cao ở 240 –
280nm (UV-C).

• Tiêu diệt vi khuẩn bằng

cách phá hủy DNA của
vi khuẩn.

• Tác động trên virus và vi

khuẩn và ít tác động trên
bào tử và vi nấm.

Khử trùng bằng tia cực tím

• Không có tính xuyên thấm.

• Khử trùng không khí, bề mặt,

nguồn nước.

• Hiệu quả khử trùng phụ thuộc:

• Loại vi sinh vật

• Cường độ tia chiếu

• Khoảng cách

• Chất hữu cơ, chất bẩn

• ....

8
 Khử trùng bằng lọc
• Làm giảm hàm lượng hoặc loại bỏ vi sinh
có trong không khí.

• Khẩu trang:
• Y tế / Phẩu thuật

• N95:  95% (0.1 - 0.3m);  99.5% ( 0.75m)

• Màng lọc HEPA (High-efficiency particulate air):

• H 10:  95% (0.3m)

• H 13:  99.99% (0.3m)

• H 14:  99.999% (0.3m)

Khử trùng bằng lọc

Ứng dụng của màng lọc HEPA:
• Tủ thổi khí (laminar flow cabinet / clean beanch)

• Tủ an toàn sinh học (biosafety cabinet)

• Phòng sạch (clean room)

10
 Khử trùng bằng hóa chất

Yếu tố ảnh hưởng đến khử trùng của hóa chất:

• Nồng độ: nồng độ cao khả năng khử trùng mạnh (ngoại trừ cồn);

• Thời gian: thời gian tiếp xúc lâu, khả năng khử trùng tốt;

• Nhiệt độ: nhiệt độ cao, tốc độ phản ứng nhanh;

• Tính chất môi trường xung quanh: pH, sự hiện diện của các vật liệu không
liên quan;

• Tính chất của vi sinh vật: khả năng sinh bào tử, hàm lượng...

11

Khử trùng bằng hóa chất

Hóa chất dùng khử trùng cần:
• Hiệu quả trên nhiều tác nhân;

• Hiệu quả nhanh chóng, thời gian tiếp xúc ngắn;

• Độc tính chọn lọc (không độc hại với người,không ăn mòn hoặc
gây hại đến vật liệu được khử trùng);

• Hiệu quả ngay cả khi có sự hiện diện của chất hữu cơ;

• Nên để lại một lớp kháng khuẩn trên bể mặt sau khi khử trùng.

• Hòa tan trong nước và dễ sử dụng;

• Ít tốn kém và dễ chuẩn bị

• Ổn định trong bảo quản, lưu trữ và các điều kiện vận chuyển;

• Không mùi

12
 Khử trùng bằng hóa chất

13

Khử trùng bằng hóa chất

14
 Khử trùng bằng nhiệt độ

Yếu tố ảnh hưởng đến khử trùng của nhiệt độ:

• Tính chất của vi sinh vật: khả năng sinh bào tử, hàm lượng...

• Nhiệt độ: nhiệt độ cao, khả năng khử trùng tốt;

• Thời gian: thời gian tiếp xúc lâu, khả năng khử trùng tốt;

• Tính chất môi trường xung quanh: sự hiện diện của các vật
liệu không liên quan;

15

Khử trùng bằng nhiệt độ

Khử trùng bằng sức nóng khô:

• Đèn cồn, đèn bunsen;

• Tủ sấy:

Nhiệt độ và thời gian khử trùng bằng tủ sấy

120oC 8 giờ

140oC 3 giờ

160oC 1 giờ

180oC 30 phút

16
 Khử trùng bằng nhiệt độ
Khử trùng bằng hơi nước bão hòa:
Mối tương quan giữa
• Thiết bị: nồi hấp tiệt trùng (autoclave); nhiệt độ & áp suất
• Tiêu diệt tất cả vi sinh vật: 121oC/15 phút 0 atm 100oC

0,5 atm 110oC

1,0 atm 115oC

1,5 atm 121oC

2,0 atm 126oC

3,0 atm 134oC

17

HƯỚNG DẪN
THAO TÁC
VÔ TRÙNG

18
 Mục đích

Thao tác vô trùng nhằm không

để vi sinh vật từ môi trường
hoặc người nhiễm vào vật liệu
xét nghiệm (bệnh phẩm, nguyên
vật liệu) và ngược lại.

19

Tầm quan trọng của thao tác vô trùng

• Làm hư hỏng nguyên vật liệu dùng cho xét nghiệm.

• Không đánh giá được hoặc làm sai kết quả xét nghiệm.

• Làm mất hoặc biến đổi vi sinh vật lưu trữ.

• Làm ô nhiễm môi trường.

• Gây nhiễm trùng cho nhân viên y tế, bệnh nhân….

20
 Tiệt trùng que cấy

• Que cấy tiệt trùng trước và sau khi

sử dụng.
• Cách thực hiện:
• Đưa que cấy vào ngọn lửa và để vòng tròn
đầu kim loại chìm trong nửa trên ngọn lửa;

• Khi vòng tròn nóng đỏ thì đẩy từ từ lên

phía trên để tiệt trùng phần thân que cấy.

• Để nguội que cấy

21

Thao tác với ống nghiệm

• Khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách

hơ trên ngọn lửa trước khi mở nắp và
đóng nắp.
• Ống nghiệm phải được cầm nghiêng một
góc nhỏ hơn 45o so với mặt phẳng ngang.
• Nắp ống nghiệm được giữ bằng ngón tay
út, cùng với tay cầm que cấy.

22
 Thao tác với đĩa thạch (petri)

• Cách để đĩa thạch:

• Trên bàn: nắp ở trên để hạn
chế vi sinh vật trong không khí
rơi vào khe giữa nắp và đĩa.

• Trong tủ ấm, tủ lạnh: nắp ở

dưới để hạn chế sự bốc hơi
nước từ môi trường thạch.

23

Thao tác với đĩa thạch (petri)

• Thao tác khi cấy hoặc lấy

khúm khuẩn từ đĩa thạch:
• Trong tủ ATSH: mở hẳn nắp
để thao tác.

• Không có tủ ATSH: mở hé
nắp để thao tác.

• Thao tác khi đổ môi trường

vào đĩa petri.

24
 HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG
THIẾT BỊ THÔNG DỤNG
TRONG PXN VI SINH

25

Đèn cồn

• Nhiệt độ của đèn cồn 260 – 480oC;

• Vị trí nóng nhất: 2/3 ngọn lửa (kể từ dưới lên);

• Lưu ý khi dùng đèn cồn.

• Không cho cồn quá 2/3;

• Không nghiêng hai đèn cồn để châm lửa cho nhau;

• Tắt đèn bằng cách dùng nắp đậy, không dùng

miệng thổi để tắt đèn;

26
 Kính hiển vi quang học

• Điều chỉnh khoảng cách giữa hai thị kính;

• Mở hết khe chắn sáng;

• Nếu tiếp tục quan sát tiêu bản khác thì

chuyển sang vật kính 10X để lấy tiêu bản
ra và cho tiêu bản khác vào. Khi đó chỉ
cần chỉnh ốc vi cấp;

• Lau sạch dầu sau khi sử dụng.

27

Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Vai trò của tủ ATSH

• Tủ ATSH là hàng rào ngăn chặn sơ cấp.

• Tủ ATSH nhằm bảo vệ:

• Tác nhân lây nhiễm cho người;

• Mẫu bệnh phẩm không bị nhiễm chéo

hoặc nhiễm từ môi trường;

• Tác nhân lây nhiễm cho môi trường.

28
 Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Phân loại tủ ATSH

• Tủ ATSH cấp I
• Tủ ATSH cấp II
• Tủ ATSH cấp II / A1
• Tủ ATSH cấp II / A2 (B3)
• Tủ ATSH cấp II / B2
• Tủ ATSH cấp II / B1

• Tủ ATSH cấp III

29

Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp I

Đặc điểm Thông số

Bảo vệ người: Có
Bảo vệ môi trường: Có
Bảo vệ mẫu: Không
Tốc độ gió: 0,36m/s
Khí thải: Trong phòng
Tỷ lệ thu hồi / thải khí: Không
Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Có
Làm việc với hóa chất độc hại: Không
Sử dụng khi không có yêu cầu bảo vệ mẫu.

30
 Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp II

Đặc điểm A1 A2 B1 B2

Bảo vệ người: Có Có Có Có
Bảo vệ môi trường: Có Có Có Có
Bảo vệ mẫu: Có Có Có Có
Tốc độ gió: 0,36 – 0,51m/s 0,51m/s 0,51m/s 0,51m/s
Khí thải: Trong phòng / Ra ngoài Trong phòng / Ra ngoài Ra ngoài Ra ngoài
Tỷ lệ thu hồi / thải khí: 70 / 30 70 / 30 30 / 70 0 / 100
Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Có Không Không Không
Làm việc với hóa chất độc hại: Không Lượng thấp Lượng thấp Lượng thấp

31

Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp II / A1 & A2

32
 Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp II / A1 & A2

33

Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp II / B1 & B2

34
 Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Tủ ATSH cấp III

Đặc điểm Thông số
Bảo vệ người: Có
Bảo vệ môi trường: Có
Bảo vệ mẫu: Có
Tốc độ gió:
Khí thải: Ra ngoài
Tỷ lệ thu hồi / thải khí: 0 / 100
Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Không
Làm việc với hóa chất độc: Lượng thấp
Dùng cho cấp độ an toàn 4

35

Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Lưu ý:
• Vị trí đặt tủ: xa cửa ra vào, xa
nơi thường xuyên đi lại, xa ngõ
cấp gió của điều hòa không khí.
• Không dùng đèn cồn và các loại
hóa chất dễ bay hơi, cháy nổ.
• Không để vật liệu ngay trên ngõ
lấy và thoát khí.

36
 Tủ an toàn sinh học (BSC: Biological Safety Cabinet)

Lưu ý:
• Bố trí vật liệu,
dụng cụ từ
“vùng sạch” và
“vùng nhiễm”.

37

Tủ ấm

• Thường xuyên vệ sinh tủ ấm;

• Theo dõi nhiệt độ hàng ngày;

• Không để quá nhiều vật dụng

trong tủ ấm;

• Không để cao quá 5 đĩa petri.

38
 Nồi hấp

• Kiểm tra các van và nước cấp trước khi

vận hành;

• Không để quá nhiều vật dụng cho mỗi

lần hấp thanh trùng;

• Theo dõi bằng chỉ thị nhiệt;

• Kiểm tra định kỳ bằng chỉ thị sinh học.

39

HƯỚNG DẪN
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
XÉT NGHIỆM VI SINH

40
 KỸ THUẬT
CỐ ĐỊNH TIÊU BẢN

41

Mục đích

Cố định tiêu bản trên lame để

thực hiện các kỹ thuật soi nhuộm
(Gram, Ziehl Neelsen…)

42
 Cách thực hiện

• Cố định tiêu bản trên lame nhờ sức nóng

của ngọn lửa;

• Chỉ hơ nhẹ lame, không “nướng”

lame trên ngọn lửa.

43

KỸ THUẬT CẤY

44
 Mục đích

Thực hiện cấy trên các loại môi

trường khác nhau:
• Môi trường trong ống nghiệm (lỏng,
thạch nghiêng, thạch đứng và
thạch nghiêng sâu);

• Môi trường đĩa thạch (cấy phân lập,

cấy một chiều, cấy định lượng.

45

Kỹ thuật cấy vào môi trường trong ống nghiệm

• Môi trường lỏng;

• Thạch nghiêng;
• Thạch đứng;
• Thạch nghiêng sâu.

46
 Kỹ thuật cấy phân lập

Mục đích:
• Phân tách các vi khuẩn có
trong bệnh phẩm thành
từng khúm khuẩn rời.

47

Kỹ thuật cấy phân lập

Cách thực hiện:

48
 Kỹ thuật cấy một chiều

Mục đích:
• Phát hiện tác nhân gây
bệnh từ dịch não tủy hoặc
cấy tăng sinh vi khuẩn trên
bề mặt thạch.

49

Kỹ thuật cấy định lượng

Mục đích:
• Xác định hàm lượng vi
khuẩn có trong nước tiểu.

50