BÀI 3: ĐỊNH DANH TRỰC KHUẨN

I. Ôn tập nhuộm gram và định danh một con cầu khuẩn (Mẫu 1):

1.1. Các bước tiến hành nhuộm gram:

B1:
- Lau sạch lamen, nhỏ 1 ít nước lên lamen.
- Hơ nóng đầu que cấy, sau đó để nguội rồi ta lấy chính xác khóm vi khuẩn cần xác định trên bề mặt
thạch nuôi cấy.
- Phết nhẹ vi khuẩn lên giọt nước ta đã nhỏ trên lamen cho thật mỏng đều.
- Vừa phết vừa hơ dưới đèn cồn cho đến khi lamen khô (khô vừa tới, không để khô quá vì sẽ làm chết
hết vi khuẩn).
B2: Sau đó, ta phủ Crystal violet trực tiếp lên lamen, để trong 60s.
B3: Sau 60s, rửa lamen bằng cách cho nước chảy chậm từ tay tới lamen để rửa sạch lớp Crystal violet.
B4: Tiếp theo, phủ Lygol, để trong 30s.
B5: Sau 30s, rửa sạch lớp Lygol.
B6: Sau đó, ta tẩy bằng cồn 95°, để trong 10s.
B7: Sau 10s, rửa sạch lớp cồn 95°.
B8: Tiếp theo, ta phủ Safranin, để trong 30s.
B9: Sau 30s, rửa sạch lớp Safranin.
B10: Thấm khô lamen, nhỏ một giọt dầu Cèdre lên phết nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi bằng vật
kính dầu (100X) để định danh vi khuẩn.
Sau khi xác định được là cầu khuẩn ta tiến hành cấy Catalase.

1.2. Các bước tiến hành cấy Catalase:

B1: Lau sạch lamen, nhỏ 1 ít oxy già ( H 2 O 2) lên lamen.

B2: Dùng que cấy lấy chính xác khóm cần thử đặt vào giọt oxy già ( H 2 O 2), không hơ dưới đèn cồn.

B3: Quan sát hiện tượng. Nếu có bọt khí sủi lên là catalase dương tính, ngược lại là âm tính.

Sau khi xác định được Catalase (+), ta cấy vi khuẩn vào môi trường MSA.

1.3. Các bước tiến hành cấy MSA:

B1: Hơ nóng đầu cây cấy vi khuẩn dưới đèn cồn.
B2: Để đầu cây cấy nguội rồi ta lấy chính xác khóm vi khuẩn trên bề mặt thạch nuôi cấy. Sau đó, cấy vi
khuẩn theo hình zigzag trong môi trường MSA.
B3: Sau đó, đem nuôi cấy trong nhiệt độ 37°C trong 24h. Hết thời gian nuôi cấy ta quan sát hiện tượng,
ghi nhận kết quả.

II. Định danh một con trực khuẩn (Mẫu 3):

2.1. Các bước tiến hành nhuộm gram:

B1:
- Lau sạch lamen, nhỏ 1 ít nước lên lamen.
- Hơ nóng đầu cây phết vi khuẩn, sau đó để nguội rồi ta lấy vi khuẩn trên bề mặt thạch nuôi cấy.
- Phết nhẹ vi khuẩn lên giọt nước ta đã nhỏ trên lamen cho thật mỏng đều.
- Vừa phết vừa hơ dưới đèn cồn cho đến khi lamen khô (khô vừa tới, không để khô quá sẽ làm chết hết
vi khuẩn).
B2: Sau đó, ta phủ Crystal violet trực tiếp lên lamen, để trong 30s.
B3: Sau 30s, rửa lamen bằng cách cho nước chảy chậm từ tay tới lamen để rửa sạch lớp Crystal violet.
B4: Tiếp theo, phủ Lygol, để trong 30s.
B5: Sau 30s, rửa sạch lớp Lygol.
B6: Sau đó, ta tẩy bằng cồn 95°, để trong 20s.
B7: Sau 20s, rửa sạch lớp cồn 95°.
B8: Tiếp theo, ta phủ Safranin, để trong 60s.
B9: Sau 60s, rửa sạch lớp Safranin.
B10: Thấm khô lamen, nhỏ một giọt dầu Cèdre lên phết nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi bằng vật
kính dầu (100X) để định danh vi khuẩn.
Sau khi nhuộm gram xác định được trực khuẩn, ta cấy vi khuẩn vào 6 ống: KIA, SIM, Citrate, Dev
Tryptone, MR-VP, Urê.

2.2. Các bước tiến hành cấy vi khuẩn vào 6 ống:

- KIA: Môi trường màu đỏ, dạng thạch nghiêng. Ta cấy vi khuẩn bằng que cấy (đã lấy vi khuẩn) lên
mặt thạch nuôi cấy trong ống nghiệm theo hình zigzag. Rồi đâm que cấy (đã lấy vi khuẩn) thẳng vào
giữa thạch nuôi cấy, khoảng 2/3 ống nghiệm.
- SIM: Môi trường màu nâu vàng, dạng thạch đứng. Ta đâm que cấy (đã lấy vi khuẩn) thẳng vào giữa
thạch nuôi cấy, khoảng 2/3 ống nghiệm.
- Citrate: Môi trường màu xanh lá cây, dạng thạch nghiêng sâu. Ta cấy vi khuẩn bằng que cấy (đã lấy vi
khuẩn) lên mặt thạch nuôi cấy trong ống nghiệm theo hình zigzag.
- Dev Tryptone: Môi trường trắng trong, dạng lỏng. Ta cấy vi khuẩn bằng que cấy (đã lấy vi khuẩn) lên
thành ống theo hình zigzag kết hợp nghiêng thành ống, làm xuất hiện những mảng lợn cợn trong ống
nghiệm.
- MR-VP: Môi trường vàng trong, dạng lỏng. Ta cấy vi khuẩn bằng que cấy (đã lấy vi khuẩn) lên thành
ống theo hình zigzag kết hợp nghiêng thành ống, làm xuất hiện những mảng lợn cợn trong ống nghiệm.
- Urê: Môi trường hồng cam, dạng lỏng. Ta cấy vi khuẩn bằng que cấy (đã lấy vi khuẩn) lên thành ống
theo hình zigzag kết hợp nghiêng thành ống, làm xuất hiện những mảng lợn cợn trong ống nghiệm.
Sau khi cấy vi khuẩn vào 6 ống: KIA, SIM, Citrate, Dev Tryptone, MR-VP, Urê. Đem nuôi cấy trong
nhiệt độ 37°C trong 24h. Sau đó, quan sát hiện tượng, ghi nhận kết quả.

III. Ghi nhận kết quả và giải thích cơ chế :

❋ Mẫu 1:
- Sau khi nhuộm gram ta xác định được đó là:
+ Cầu khuẩn
+ Gram (+)
+ Cách sắp xếp: đứng riêng lẻ, đôi, ba, chùm, chuỗi. Nhưng sắp xếp chủ yếu thành chùm.
Hình 1. Cầu khuẩn, gram (+), sắp xếp riêng lẻ, đôi, ba, chùm, chuỗi, chủ yếu là chùm.
- Sau khi cấy catalase thấy có xuất hiện bọt khí nên catalase (+).

Hình 2. Cấy Catalase có xuất hiện bọt khí, Catalase (+)

- Do catalase (+) nên tiếp theo ta cấy vi khuẩn vào môi trường MSA, nuôi cấy trong nhiệt độ 37°C,
trong 24h.
- Ghi nhận kết quả sau khi nuôi cấy MSA trong nhiệt độ 37°C, trong 24h ta thấy:
+ MSA thay đổi màu của môi trường từ đỏ sang vàng, suy ra MSA (+), đó là tụ cầu vàng
Staphylococcus.

Hình 3. Môi trường MSA ban đầu có màu đỏ

Hình 4. Môi trường MSA (+) sau khi cấy, là tụ cầu vàng Staphylococcus.
+ Giải thích cơ chế: Do tụ cầu vàng lên men đường manitol, Staphylococcus aureus có enzym catalase
để phân huỷ H 2 O 2 , acid hoá môi trường, thay đổi pH, môi trường đổi màu từ đỏ sang vàng, trên
đường cấy có vi khuẩn mọc được, có màu vàng. Nên ta kết luận được đó là tụ cầu vàng Staphylococcus
aureus.

❋ Mẫu 3:
- Sau khi nhuộm gram ta xác định được vi khuẩn đó là:
+ Trực khuẩn
+ Gram (-)

Hình 5. Trực khuẩn, gram (-)

- Hiện tượng và cơ chế của 6 ống sau khi nuôi cấy:
● KIA:
+ Lactose: (+). Do có sự đổi màu môi trường từ đỏ sang vàng.
+ Glucose: (+). Do có sự đổi màu môi trường từ đỏ sang nâu vàng.
+ H 2S: (-). Do không có xuất hiện vệt đen. Vì vi khuẩn không sinh H2S, nên không có sự kết hợp với
Fe2+ trong môi trường cho ra tủa đen.
+ Gas: (+). Do có sinh khí nên thạch nuôi cấy bị đẩy lên, tạo thành một khoảng trống so với đáy ống
nghiệm, hoặc thạch bị nứt.
● SIM: (-). Do không có xuất hiện vệt đen. Vì vi khuẩn không sinh H2S, nên không có sự kết hợp với
Fe2+ trong môi trường cho ra tủa đen.
● Citrate: (-). Do không đổi màu thành xanh dương, giữ nguyên màu xanh lá của môi trường ban đầu.
● Dev Tryptone: (+). Sau khi nuôi cấy, môi trường ban đầu từ màu trắng trong chuyển thành trắng đục.
Ta thử bằng thuốc thử Kovac’s. Thấy xuất hiện váng màu hồng cánh sen, suy ra Indol (+).
● MR-VP: Sau khi nuôi cấy, môi trường ban đầu từ màu vàng trong chuyển thành vàng đục. Ta chia
làm 2 ống:
+ Ống 1 (MR): Thử bằng Methyl red. Thấy xuất hiện váng màu hồng cánh sen, suy ra MR (+).
+ Ống 2 (VP): Thử bằng 8 giọt α-napthol và 2 giọt KOH. Có hiện tượng sủi bọt, màu vàng đục, không
xuất hiện váng màu hồng cánh sen, suy ra VP (-).
● Urê: (-). Do màu môi trường thay đổi chưa đạt tới ngưỡng hồng cánh sen.
Sau khi ghi nhận kết quả của 6 ống sau khi nuôi cấy. Ta kết luận được đó là Escherichia coli.

Hình 6. 6 ống ở môi trường ban đầu khi chưa cấy vi khuẩn

Hình 7. 6 ống khi vừa mới cấy vi khuẩn.

Hình 8. 6 ống sau khi được nuôi cấy ở nhiệt độ nhiệt độ 37°C, trong 24h
Hình 9. Bảng tóm tắt kết quả thu hoạch cuối buổi học của nhóm 5