NHẬP MÔN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2.2020
 NỘI DUNG TÓM TẮT MÔN HỌC
-Người học hiểu được Công nghệ Sinh học là gì?. Người học nắm được công
nghệ sinh học là ngành khoa học ứng dụng hiểu biết của con người về hệ thống sống
để sử dụng các hệ thống này hoặc các thành phần của chúng cho mục đích công
nghiệp. Người học hiểu được từ các sản phẩm công nghệ lên men truyền thống đến
các sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại để nhận thức được phạm vi nghiên
cứu và ứng dụng của công nghệ sinh học ngày càng mở rộng, đa dạng hướng đến
nền công nghiệp công nghệ sinh học. Người học sẽ nhận thức được công nghệ sinh
học chính là sự phối hợp của khoa học và công nghệ để khai thác những kiến thức về
các hệ thống sống cho các ứng dụng thực hành.
-Môn học sẽ giúp cho người học nắm được những kiến thức cơ bản đi từ
định nghĩa, lịch sử hình thành ngành công nghệ sinh học đến những thông tin về
công nghệ ADN tái tổ hợp, công nghệ lên men vi sinh vật, công nghệ sinh học thực
vật, công nghệ sinh học động vật, công nghệ protein. Mặt khác, sinh viên nắm được
những ứng dụng của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, y-dược và trong môi
trường.
- Từ những điều đã học, sinh viên có thể vận dụng các ưu thế của vật thể sống để sản xuất
các hệ thống sống hàng loạt có năng suất và phẩm chất tiến bộ hơn mang tính chất công nghiệp, phù
hợp theo các nguyên lý của Công nghệ Sinh học.
 GIÁO TRÌNH SỬ DUNG, TÀI LIỆU THAM KHẢO

Giáo trình:
- Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà Xuất bản Đại
học Huế, năm 2007, 366 trang.
Các tài liệu tham khảo:
- Nguyễn Như Hiền (2012) Sinh học phân tử và tế bào- Cơ sở khoa học của công nghệ sinh học. Nhà xuất bản
Giáo dục Việt Nam (Tập 1).
- Vũ Văn Vụ, Trương Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2012) Công nghệ sinh học tế bào (Tập 2). Nhà xuất bản
Giáo dục Việt Nam. 183 trang
- Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2012) Enzyme và ứng dụng (Tập 3). Nhà xuất bản Giáo dục Việt
Nam.
- Trịnh Đình Đạt (2012) Công nghệ di truyền (Tập 4). Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam
- Phạm Văn Ty (2012) Công nghệ vi sinh và môi trường (Tập 5). Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 175 trang
- Lê Trần Bình (Chủ biên), Quyền Đình Thi (2009) Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 1- Công nghệ gen. Nhà
xuất bản Giáo dục Việt Nam. 323 trang
- Đặng Thị Thu (Chủ biên), Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc
Tú, Đỗ Hoa Viên (2009) Cơ sở công nghệ sinh học – tập 2 – Công nghệ hóa sinh. Nhà xuất bản Giáo dục Việt
Nam. 315 trang
- Nguyễn Quang Thạch (Chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Thị
Phương Thảo (2009) Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 3- Công nghệ sinh học tế bào, Nhà xuất bản Giáo dục Việt
Nam, 548 trang
- Lê văn Nhương (Chủ biên), Nguyễn Văn Cách (Chủ biên), Quản Lê Hà, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng,
Hoàng Đình Hòa, Nguyễn Lan Hương, Ngô Thị Mại, Đinh Kim Nhung, Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Quang Thảo,
Phạm Thị Thùy, Phạm Văn Toàn (2009). Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 4- Công nghệ vi sinh. Nhà xuất bản
Giáo dục Việt Nam, 513 trang
- Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Sinh học Phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục.
- Võ Thị Thương Lan (1999). Sinh học Phân tử. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội.
- Lê Đinh Lương (2000). Kỹ thuật Di truyền và ứng dụng. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
 Nội dung:
- Phần 1: Các khái niệm và nguyên lý
-Chương 1: Mở đầu
-Chương 2: Công nghệ DNA tái tổ hợp
-Chương 3: Công nghệ lên men vi sinh vật
-Chương 4: Công nghệ sinh học thực vật
-Chương 5: Công nghệ sinh học động vật
-Chương 6: Công nghệ protein
Phần 2: Các ứng dụng của Công nghệ sinh học
-Chương 7: Các ứng dụng trong nông nghiệp
-Chương 8: Các ứng dụng trong Y-Dược
-Chương 9: Các ứng dụng trong môi trường
Tài liệu tham khảo:
Giáo trình: PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc, 2007. Nhập môn Công
nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Huế, 2007, 355 trang
Diễn biến của Covid-19 trên thế giới cho đến 7AM, ngày 11/3/2020
Giới thiệu về CoVid-19
 Cách gọi tên chủng virus corona mới
gây dịch viêm phổi ở Vũ Hán, Trung
Quốc nhƣ sau:

- Trƣớc ngày 12/2/2020:

+ 2019-nCoV:
Novel Corona Virus 2019
+ Trung Quốc gọi là: NCP
Novel Coronavirus Pneumonia
Virus corona chủng mới
- Ngày 12/2/2020 WHO thống nhất tên gọi:
Đƣờng lây của các ca dƣơng tính Covid-19
nCoV ở Việt Nam (9/2/2020) Co: Corona
Vi: Virus
D: disease
19: 2019
 Covid-19 đƣợc chọn vì không liên quan
đến vị trí địa lý, loài động vật chứa virus
này, cá nhân hay nhóm ngƣời nào, đồng
thời dễ phát âm và liên quan đến căn
bệnh
 Thay thế cách gọi 2019-nCoV và NCP
13/2/2020
Các vấn đề cần giải quyết đồng bộ để dập dịch Covid-19 gồm:
- Các biện pháp phòng dịch lây lan;
- Xác định đặc điểm của chủng virus corona: nguồn gốc chủng; khả
năng lây nhiễm; tốc độ lây lan từ động vật sang ngƣời và từ ngƣời
này sang ngƣời khác; các biện pháp cắt đứt các con đƣờng lây lan
virus; thời gian có thể lây nhiễm (2-14 ngày; cũng có ý kiến cho là
đến 24 ngày…);
- Số ngƣời nhiễm virus corona mới gây bệnh viêm phổi càng tăng thì
việc xác định đƣợc những ca lây nhiễm, nghi ngờ lây nhiễm, ca có
khả năng lây nhiễm để cách ly 14 ngày… là hết sức cần thiết.
+ Các kit chuẩn đoán nhanh/sàng lọc nhanh sự hiện diện của
virus mới corona này;
+ Sử dụng phƣơng pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen của virus
mới corona;  tốn kém và mất thời gian: sau 3-5 ngày
+ Sử dụng kỹ thuật Real Time RT-PCR (theo WHO khuyến cáo)
 bảo đảm việc mẫu bệnh phẩm có mặt virus mới corona có độ chính
xác là 100%.  Tuy nhiên, cũng mất thời gian 2-3 ngày.
+ Cần có các bộ KIT phát hiện nhanh Covid-19 càng ít thời gian
càng tốt  giảm số ngƣời cần phải cách ly nếu họ thực sự không có
virus này trong cơ thể  giảm chi phí về kinh tế cho xã hội  có thể
áp dụng ở các tuyến huyện, Bệnh viện dã chiến…
 RT-qPCR – Các nguyên lý cơ bản
BioMedia
PCR phiên mã ngược định lượng (RT-qPCR) là kỹ thuật PCR định lượng với khuôn ban
đầu là ARN. ARN được phiên mã ngược thành cADN và sử dụng làm khuôn cho phản
ứng qPCR. Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm phân tích
biểu hiện gen, xác nhận iARN (RNAi validation), xác nhận microarray (microarray
validation), phát hiện sinh vật gây bệnh, thử nghiệm di truyền và nghiên cứu bệnh.

RT-qPCR một bước và hai bước

RT-qPCR có thể được tiến hành theo phương thức một bước và hai
bước. Với kiểu RT-qPCR một bước, giai đoạn tổng hợp cADN và
qPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng với cùng một
enzym. Phương thức này phải sử dụng các mồi rất đặc hiệu. Ngược
lại, với phương thức RT-qPCR hai bước, giai đoạn tổng hợp cADN và
qPCR được tiến hành trong hai ống phản ứng riêng biệt với enzym,
đệm, có thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu cho mỗi giai
đoạn.  Hai phương thức RT-qPCR này có ưu và nhược điểm khác
nhau.

Cần có: (1) RNA tổng số và mRNA; (2) Mồi cho phản ứng phiên mã ngược; (3)
Enzym phiên mã ngược (RNAse); (4). Đối chứng cho RT-qPCR
Ngày 25/1, Viện Vi sinh (Viện Hàn lâm Khoa học Trung
Quốc) công bố những hình ảnh đầu tiên về chủng virus
corona gây bệnh Covid-19.
Những chiếc lỗ trên phổi này chủ yếu đƣợc tạo ra bởi chính
sự đáp ứng quá mức của hệ miễn dịch, với việc tạo ra các
mô sẹo vừa có vai trò bảo vệ, vừa làm phổi trở nên cứng
hơn. Tuy nhiên nếu có quá nhiều mô sẹo, phổi sẽ dần mất
hết khả năng hô hấp. Cùng với đó, phản ứng viêm cũng
khiến lớp màng giữa các phế nang và mạch máu trở nên dễ
thấm hơn, điều khiến phổi bị tràn dịch và ảnh hƣởng đến
khả năng cung cấp oxy cho máu.
Giới thiệu về: Tên "coronavirus" có nguồn gốc từ tiếng Latin:
“corona”, có nghĩa là vương miện hoặc hào quang; xuất phát từ
hình thái đặc trưng của CoVs (dưới kính TEM, SEM): một rìa
lớn, tạo thành một hình ảnh như vương miện hoàng gia hoặc vành
nhật hoa. Các thành viên thuộc COVs có dạng hình cầu với đường
kính xấp xỉ 125 nm, với cấu trúc theo thứ tự từ trong ra ngoài như
sau:
-Lõi acid nucleic: Bộ gen của virus, cụ thể là sợi ARN đơn, dương
sẽ giúp virus có thể tổng hợp các thành phần cấu tạo khi đã xâm
nhập vào tế bào vật chủ, nhằm phục vụ cho việc nhân bản. Kích
thước bộ gen của CoVs được xem là lớn nhất trong số các loại
virus ARN: 26-32 kilobase.
- Vỏ protein (vỏ capsit): Lớp vỏ bọc bên ngoài bộ gen được cấu tạo
từ các capsome đóng vai trò bảo vệ.
-Lớp vỏ ngoài: cấu tạo từ lớp kép lipit và protein, bên trên có lớp
gai hình dạng tương tự như quân nhép trong bộ bài tây, đặc trưng
cho CoVs. Lớp gai này sẽ thực hiện các nhiệm vụ của kháng nguyên, điển
hình như giúp virus thâm nhập vào bên trong tế bào vật chủ.
Theo Minh Nhật/dantri.com.vn
 AFP đƣa tin, các nhà khoa học từ đại học Texas và Viện
Y tế quốc gia Mỹ ngày 19/2 tuyên bố họ đã dựng thành
công mô hình 3D đầu tiên về cấu trúc nguyên tử của
virus corona chủng mới. Mô hình này có liên quan tới bộ
phận trong virus có nhiệm vụ kết nối với tế bào ngƣời và
truyền nhiễm bệnh. Đây đƣợc đánh giá là một bƣớc đi
quan trọng, có tính đột phá trong việc phát triển vắc-xin
và các phƣơng pháp điều trị virus Covid-19.
Theo AFP, đội ngũ nhà khoa học Mỹ đã thực hiện việc
nghiên cứu với bộ mã di truyền của Covid-19 do Trung
Quốc cung cấp. Họ dùng bộ mã này để phát triển một
Mô hình 3D cấu phần quan trọng của virus mang tên “protein gai”
trúc nguyên tử (spike protein).
của virus Sau đó, họ sử dụng công nghệ tiên tiến để dựng lại hình
corona chủng ảnh của protein gai.
mới (Ảnh: AFP)
Giáo sƣ đại học Texas Jason McLellan - ngƣời đứng đầu
nhóm nghiên cứu - cho hay, mục đích của đội ngũ nhà
khoa học hiện tại là tìm cách đƣa protein sợi Covid-19
vào cơ thể ngƣời để giúp sinh ra kháng thể. Khi đó, dù
virus corona thực sự tấn công, hệ miễn dịch của con
ngƣời đã sẵn sàng chống lại mầm bệnh.
Thứ sáu, 7/2/2020, 11:35 (GMT+7)

Việt Nam nuôi cấy thành công nCoV

Hà Nội: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ngày 7/2 công bố đã nuôi cấy và phân lập
thành công virus corona mới trong phòng thí nghiệm.
Đại diện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cho biết kết quả nuôi cấy thành công này sẽ
tạo điều kiện cho việc xét nghiệm nhanh các trường hợp nhiễm và nghi nhiễm nCoV.
Nhờ đó mỗi ngày Việt Nam có khả năng xét nghiệm được hàng nghìn mẫu bệnh phẩm
trong trường hợp cần thiết.
Kết quả nuôi cấy thành công nCoV là tiền đề cho
nghiên cứu và phát triển vaccine phòng chống
virus này trong tương lai, cũng giúp đưa ra các
biện pháp dự phòng hiệu quả hơn.

Bộ Y tế cho biết hiện Việt Nam vẫn đảm bảo cung

ứng đủ sinh phẩm cho việc xét nghiệm.
Đây là lần đầu tiên Việt Nam nuôi cấy thành công
nCoV. và là nước thứ 4 trên thế giới (Sau
Singapor, Úc, Nhật bản)
Hình ảnh nCoV trong phòng phí nghiệm tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Ảnh do Viện Vệ
sinh Dịch tễ TW cung cấp.
Các nước đang ráo riết chạy đua để tìm ra vaccine và phác đồ điều trị của bệnh viêm
phổi do chủng virus corona mới, khởi phát từ Vũ Hán, Trung Quốc.
- Các nhà khoa học tại Australia, Singapore và Nhật Bản ngày 5/2 thông báo đã nuôi cấy
virus corona chủng mới để nghiên cứu vaccine và phác đồ điều trị.
- Các nhà nghiên cứu của Trường Đại học Imperial London, Anh, ngày 6/2 công bố có
"đột phá" trong nghiên cứu tìm ra vaccine phòng virus corona. Dự kiến vaccine sẽ được
thử nghiệm trên động vật vào đầu tuần sau.
- Tại một bệnh viện ở Bangkok, Thái Lan, bác sĩ sử dụng kết hợp thuốc cảm cúm
Oseltamivir cùng thuốc kháng HIV Lopinavir và Ritonavir trên 3 bệnh nhân viêm phổi
corona. Cả ba có những dấu hiệu phục hồi rõ rệt.
- Bệnh nhân đầu tiên dương tính với nCoV tại Mỹ xuất viện hôm 3/2 sau khi điều trị
thành công bằng thuốc Remdesivir. Từ thành công này, ngày 6/2 Mỹ đã cho phép thử
nghiệm thuốc Remdesivir trong điều trị viêm phổi do virus corona.
- Nhóm NC tại 3 quốc gia Singapore, Australia và Nhật Bản đang tiến hành tái tạo virus
corona chủng mới bên ngoài lãnh thổ TQ để phục vụ NC. Đây hứa hẹn là một công trình
có ý nghĩa trong việc điều chế vaccine, thử thuốc và rút ngắn thời gian chuẩn đoán bệnh.
Các nhà KH sử dụng virus đã được phân tách, nuôi cấy bằng các mẫu bệnh phẩm của
người dương tính để tìm ra phương/p chẩn đoán, theo dõi dấu hiệu biến thể và điều chế
thuốc, vaccine. Để thử nghiệm, các nhà NC tiến hành tiêm vaccine cho động vật, tạo ra
kháng thể sau đó để chúng nhiễm virus. Nếu các kháng thể này đánh bại mầm bệnh,
vaccine được đánh giá là có hiệu quả.
-Công ty Công nghệ Y tế sinh học Bright Gene (T/p Tô Châu, tỉnh Giang Tô, TQ)- đã phát
triển CN tổng hợp các thành phần dược phẩm của Remdesivir - 1 loại thuốc kháng virus do
Công ty dược phẩm Gilead (Mỹ) phát triển  (có vi phạm bản quyền không?.) (7/2/2020 báo Dân trí).
 Nhóm nghiên cứu Việt đầu tiên chế tạo thành công bộ test
nhanh virus corona
Dân trí (Chủ nhật 09/2/2020) Nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Lê Quang Hòa, trường ĐH
Bách khoa Hà Nội vừa công bố chế tạo thành công sinh phẩm RT-LAMP phát hiện
nhanh virus corona (2019-nCoV) chủng mới trong 70 phút.
RT-LAM: Revere Transcription Loop -
mediated Isothermal Application

Mồi đƣợc thiết kế để nhân

vùng gen đặc hiệu có thể
là:
- Đại học Hồng Kong:
ORF1b và ORF1N (2 vùng
gen đặc hiệu – 2 test nhanh
theo công bố của Leo LM
Poon);
- Trung Quốc : ORF1ab; N
- Đức: 3 gen RdRP, E, N
- Hong Kong: ORF1b-nsp,
N…

Cấu trúc của virus corona (2019-nCoV)

 Quy trình phát hiện chủng Coronavirus mới (2019-nCoV) từ mẫu bệnh phẩm
(dịch hầu họng) có 2 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: Tách chiết RNA, trong giai đoạn này, hạt vi rút có trong
mẫu sẽ bị ly giải dưới tác dụng của dung dịch đệm tách chiết để giải phóng
RNA của virus, tiếp đó dung dịch sẽ được đưa qua cột silica để RNA bám lên
cột. Sau quá trình rửa, RNA sẽ được hòa tan trong nước để được sử dụng
trong giai đoạn tiếp theo. Toàn bộ giai đoạn tách chiết RNA diễn ra trong vòng
30 phút.
Giai đoạn thứ hai: Khuếch đại vùng gen đích của vi rút bằng kỹ thuật RT-
LAMP: đầu tiên RNA sẽ được phiên mã ngược thành DNA để thực hiện phản
ứng khuếch đại LAMP dưới tác dụng của enzym Bst DNA polymerase và
6 mồi hướng đến 8 vùng trình tự đặc hiệu của chủng
nCoV.
Sau khi ủ ở 63ºC trong 30 phút, vùng trình tự gen đích này sẽ được khuếch
đại đến hàng tỷ lần, kết quả là làm thay đổi màu dung dịch của phản ứng. Các
mẫu dương tính có màu đổi từ hồng sang vàng trong khi đó mẫu âm tính vẫn
giữ màu hồng. Quá trình chuẩn bị và thực hiện phản ứng LAMP diễn ra trong
vòng 40 phút.
 Quy trình và các ưu điểm phản ứng RT-LAMP

Tuy nhiên, sinh phẩm dựa trên phản ứng RT-LAMP có thể cho nhiều dƣớng tính
giả cũng nhƣ âm tính giả…(đây là nhƣợc điểm của phƣơng pháp RT-LAMP)
Phản ứng RT-LAMP đổi màu mà nhóm nghiên cứu đã thực hiện
Sản xuất sinh phẩm thử tới 2.000 test/ngày
Lê Quang Hòa, cho biết, so với các kỹ thuật sinh học phân tử khác, RT-LAMP có thiết bị
đơn giản, khả năng ứng dụng tại hiện trường, độ nhạy và độ đặc hiệu cao (tương đương
với real-time RT-PCR).
Ngay sau khi trình tự hệ gene của chủng 2019-nCoV được công bố trên ngân hàng
GenBank ngày 13/1, nhóm nghiên cứu đã chủ động tiến hành phát triển sinh phẩm RT-
LAMP phát hiện nhanh chủng này. Việc tổng hợp gene nhân tạo vùng gene đích mã hóa
nucleocapsid phosphoprotein của chủng nCoV, cũng được thực hiện.
Sau khi được tối ưu hóa, ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-LAMP là 5 phiên bản RNA
vi rút/phản ứng, tương đương với phương pháp nhạy nhất hiện nay dựa trên kỹ thuật
real-time RT-PCR. Đặc biệt, phản ứng RT-LAMP này không cho kết quả dương tính giả
với các loại Coronavirus khác như SARS CoV, MERS-CoV, HKU4, HKU1, OC43 và
229E.
Theo TS Hòa, kết quả này dựa trên các mẫu RNA được phiên mã in vitro. Do vậy, để đảm
bảo độ chính xác, bước tiếp theo cần so sánh các đặc tính của bộ sinh phẩm với phương
pháp tiêu chuẩn real-time RT-PCR (khuyến cáo bởi WHO) trên các mẫu RNA vi rút được
thu nhận từ mẫu bệnh phẩm thực.
Để ứng dụng rộng rãi sản phẩm này, phải có tối thiểu 12 mẫu RNA của chủng nCoV để nội
kiểm và cần thử nghiệm liên phòng trước khi đăng ký sản phẩm và sản xuất hàng loạt.
Ước tính giá thành sản xuất mỗi test của nhóm nghiên cứu là 350.000 đồng (bao gồm cả hóa
chất tách chiết RNA).
Đang trong quá trình kiểm định độ tin cậy; khả năng nhận diện
Covid-19 với các mẫu bệnh phẩm đã được khẳng định dương tính
đối với Covid-19
Ứng dụng được ở bệnh viện tuyến huyện và bệnh viện dã chiến
 Tuy nhiên, sinh phẩm này chưa đáp ứng được tiêu chuẩn của
Bộ Y tế đề ra  nên chưa thấy thông báo đã được sử dụng vào
thực tế
Quân đội nghiên cứu sinh phẩm xét nghiệm nCoV
Đánh giá bƣớc đầu cho thấy 5 bộ test kit của Học viện Quân y có độ
nhạy ổn định sau ba lần lặp lại, có thể phát hiện nCoV bản copy.
Thông tin trên đƣợc Ban Chỉ đạo quốc gia phòng chống Covid-19
thông báo vào ngày 2/3. Theo đó, bộ sinh phẩm xét nghiệm (test kit)
nhiễm nCoV (SARS-CoV-2) của Học viện Quân y phối hợp với Công
ty Việt Á nghiên cứu đã đƣợc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đánh
giá ở ba tiêu chuẩn.
Đó là độ nhạy (xác định ngƣỡng phát hiện tối thiểu thông qua số
bản copy của SARS-CoV-2); độ đặc hiệu (xác định phản ứng chéo
của sinh phẩm với các virus gây viêm đƣờng hô hấp cấp gồm
SARS-CoV, cúm A/H1pdm09, A/H3, A/H5, B và các mẫu âm tính
khác); độ ổn định (xác định tính tƣơng thích của sinh phẩm với
các hệ thống máy Realtime PCR: ABI-7500 fast, Lifecycle (Roche),
CFX-96 (Biorad), Rotorgen (Qiagen). Các thử nghiệm đánh giá đƣợc
lặp lại ba lần trên mỗi bộ sinh phẩm.
Đại diện Bộ Khoa học và Công nghệ đánh giá các bộ test kit của
Học viện Quân y hợp tác với Công ty cổ phần Việt Á nghiên cứu "rất
tốt và khả thi". Đơn vị này có thể sản xuất đƣợc 10.000 test kit mỗi
ngày.
Bộ KIT xét nghiệm nhanh Covid-19 của Hàn Quốc
Thứ tƣ, 4/3/2020, 16:55 (GMT+7)
Phân tích gene hé lộ nCoV phát triển thành hai loại
TRUNG QUỐC: Các nhà nghiên cứu phát hiện nCoV bao gồm hai loại
chính ký hiệu L và S, trong đó loại L phổ biến hơn, lây lan nhanh và
mạnh hơn.

Hai loại nCoV là L và S có đa

hình đơn nucleotide (SNP -
Single Nucleotide
Polymorphisms) khác nhau

Tiến sĩ Xiaolu Tang và cộng sự của Phòng thí nghiệm nghiên cứu
gene thực vật và protein thuộc Trƣờng khoa học đời sống của Đại
học Bắc Kinh khi tìm hiểu về mức độ phân hóa phân tử giữa nCoV và
các chủng virus corona họ gần khác, đã công bố hôm 3/3 trên tạp chí
National Science Review về kết quả phân tích hệ gene của 103 bệnh
nhân mắc Covid-19 cho thấy nCoV có thể tiến hóa thành hai loại
chính ký hiệu là L và S với đặc trƣng là hai SNP khác nhau.
Dù loại L (chiếm 70%) phổ biến hơn loại S (chiếm 30%),
nhóm nghiên cứu đã nhận thấy bản S có trƣớc.
- Loại L xuất hiện nhiều hơn trong giai đoạn đầu của dịch
bệnh ở Vũ Hán, xác suất của chúng giảm dần từ đầu
tháng 1/2020. Sự can thiệp của con ngƣời có thể tạo ra áp
lực chọn lọc lớn hơn đối với loại L, khiến chúng lan
nhanh và mạnh hơn.
- Ngƣợc lại, loại S xuất hiện sớm và tấn công con ngƣời ít
hơn, có xác suất tƣơng đối ngày càng tăng do áp lực
chọn lọc yếu hơn.
Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu chƣa rõ liệu loại L tiến hóa từ
loại S ở ngƣời hay ở vật chủ trung gian. Họ cũng không biết
chắc liệu độc lực của loại L có cao hơn loại S hay không?.
- Các nhà nghiên cứu nhấn mạnh: cần những nghiên cứu
chuyên sâu hơn kết hợp dữ liệu hệ gene, dữ liệu dịch tễ, ghi
chép triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân nhiễm Covid-19
để hiểu rõ hơn quá trình tiến hóa và dịch tễ học của nCoV.
An Khang (Theo National Science Review)
 Đề nghị các em tiếp tục theo dõi dịch bênh Covid-19
trên các kênh truyền thông chính thống của Việt Nam để
có thể nắm bắt nhanh chóng tình hình dịch bệnh và có
đƣợc các biện pháp phòng tránh dịch bệnh hiệu quả
nhất; bảo đảm an toàn sức khỏe cho bản thân và cộng
đồng xã hội

Việt Nam với tình thần “Chống dịch nhƣ chống giặc” và
đƣợc sự quan tâm, chỉ đạo sát sao, quyết liệt và hiệu
quả của Đảng và Nhà nƣớc, chúng ta sẽ chiến thắng
dịch Covid-19 này.

 Hãy nhìn dịch bệnh Covid-19 bằng kiến thức của môn
Công nghệ sinh học hiện đại nhé.

Chúc các em thành công!.

 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

• Định nghĩa công nghệ sinh học là gì?

I

• Lịch sử phát triển công nghệ sinh học

II

• Một số khía cạnh về khoa học và kinh

III tế của công nghệ sinh học hiện đại

• Các vấn đề pháp lý của công nghệ sinh

IV học hiện đại
Thế kỷ 21 là thế kỷ của Công nghệ sinh học!.
Nhiều câu hỏi đang đƣợc đặt ra nhƣ sau:

- Vậy Công nghệ sinh học là gì?

- Tại sao CNSH lại có vai trò to lớn như vậy?.
- Sản phẩm của CNSH là gì?.
- Tương lai của ngành CNSH là gì?.

Học Công nghệ sinh học ở Đại học Thủy Lợi

ra sẽ làm được gì?.
Công nghệ sinh học là công nghệ sử
dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của
cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản
phẩm của chúng (UNESCO, 1985)
 Sử dụng các quá trình sinh
học và phân tử

Giải quyết các vấn đề hoặc tạo

ra sản phẩm có ích
 Công nghệ sinh học là gì?

 Là ngành khoa học sử dụng các sinh vật sống, thành

phần sinh vật sống để tạo ra các sản phẩm và dịch vụ
phục vụ lợi ích tối đa cho con người hoặc các cơ thể
sống khác.
 Nó bao gồm các sinh vật đã được biến đổi thường ở
mức phân tử để tạo ra những ứng dụng mới trong
nông nghiệp, y học, môi trường và công nghiệp.
 Phân loại công nghệ sinh học:
Truyền thống: Traditional Biotechnology
Hiện đại: Modern Biotechnology
 Công nghệ sinh học truyền thống

 Công nghệ sinh học truyền thống đề cập đến công nghệ
thông thường đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ.
 Công nghệ sinh học sử dụng các vi sinh vật để sản xuất
các sản phẩm như cồn, axit axetic, đường, thực phẩm
(nước tương, mắm, bánh mì, bơ…)

Bia, rượu
 Công nghệ Trồng cây, gieo
Ghép cây sinh học hạt truyền thống
truyền thống

Lên men dưa cà Lên men nước mắm

 Nhân giống
vô tính bằng
nuôi cấy mô
tế bào

Thụ tinh
nhân tạo Lên men
vi sinh
Công nghệ vật
sinh học
truyền thống
Nhiên (mức độ cơ
thể/tế bào)
liệu sinh
Sản xuất
học phân bón và
thuốc trừ
sâu vi sinh
Sản xuất
sinh khối
giàu protein
 Lên men nhờ vi sinh vật để sản xuất
bia, rƣợu, sữa chua, phô mai, nƣớc
giải khát, bánh mỳ

Công nghệ sinh

Kháng sinh
học truyền thống
Chọn tạo giống cây trồng

Vắcxin

Chọn tạo giống vật nuôi

 Công nghệ sinh học hiện đại
 Định nghĩa theo Cartagena Protocol on Biosafety, công nghệ
sinh học hiện đại là việc áp dụng các kĩ thuật ADN in vitro hoặc
các tế bào hợp nhất để vượt qua các rào cản tự nhiên, sinh lý và
sinh sản.
 Cho phép các nhà khoa học đưa chính xác đặc điểm mong
muốn bằng cách chèn các gen đặc hiệu vào cơ thể động, thực vật
và vi sinh vật, tảo….
 Gồm các lĩnh vực:
Kĩ thuật di truyền
Nuôi cấy mô, tế bào
Nhân dòng
Công nghệ Nano sinh học
Genomic
Proteomic
Tin sinh học
…
Tạo chủng VSV tái tổ Công nghệ
Kháng sinh/vaccine/kháng
hợp tiềm năng tạo
sinh học hiện thể đơn dòng/liệu pháp
ra các sản phẩm giá đại (mức độ gen
trị gen/ protein)

Vật liệu

TV/ĐV chuyển gen/

chỉnh sửa gen cho
Phục hồi sinh học Vật liệu nano/polymer năng suất và chất
(bioremediation) phân hủy sinh học lƣợng cao
 Dê chuyển gen cung
cấp sữa cho ngƣời
Chuyển gen ở cây ngô

Công nghệ sinh

Vấn đề đạo đức
học hiện đại
Lợn chỉnh gen siêu nạc

Hạt cải dầu) Sản phẩm sữa

Sản xuất insulin ở ngƣời Các giống cây trồng biến đổi gen (GMO)
 Chữa bệnh Nhân bản động vật nuôi
Phương pháp canh tác mới

Cây
trông
CNSH chuyển

Thụ tinh nhận tạo

hiện đại gen

Nuôi cấy mô
Hình sự Sử lý nước thải
Lên men hiện đại
 Hệ dẫn thuốc ( Drug delivery Điều trị cá nhân
Liệu pháp gen system) (Personalized
(Gene Therapy) treatment)

Ứng dụng Công

nghệ sinh học
trong tƣơng lai

Kỹ thuật sinh học

Bio-engineering Thực phẩm giàu omega -3 ở sữa, gà, kem…
Công nghệ sinh Sản phẩm mới

học hiện đại và

tương lai

Tạo giống cây trồng mới

Tạo ra thuốc và vaccine mới

Nhiên liệu sinh

học mới

Xác định hài Chỉnh sửa

cốt liệt sĩ Phương pháp điều trị ung thư và
gen khối u mới, hiệu quả cao
Cái gì là quan trọng nhất với sinh viên bây giờ?
• Hãy bắt đầu học để ra một nghề nhƣ thế nào?.....
• Phƣơng pháp luận cho việc học nhƣ thế nào/Cách tiếp cận
giải quyết một vấn đề cụ thể nhƣ thế nào  Rất quan trọng
đối với ngƣời học nói chung
• Học nhƣ thế nào bây giờ?.
• Học bao nhiêu là đủ?.
• Ngƣời học sẽ hội nhập nhƣ thế nào khi hiện nay công nghệ
4.0 đang dần chiếm lĩnh tất cả các lĩnh vực đời sống?
• Hội nhập nhƣng không hòa tan  rất quan trọng
•  Quan trọng nhất: yêu thích  đam mê  vƣợt qua mọi
khó khăn (Thế nào là đam mê?. khi nào biết mình đã đam mê?....)
•  Quá trình học tập là cả đời, không ngừng học hỏi….
Các cuộc cách mạng công nghệ trên thế giới

“Cuộc cách mạng công nghiệp” (máy móc, nhà máy, kênh rạch)

(Thời đại của hơi nước, than, sắt và đường sắt)

(Thời đại của thép và kỹ thuật nặng (điện, hóa chất, dân dụng, hải
quân)

(Thời đại của ô tô, dầu, hóa dầu và sản xuất hàng loạt)

(Thời đại công nghệ thông tin và viễn thông)

(Thời đại của Công nghệ sinh học, công nghệ nano, điện sinh học và vật liệu mới)
I. CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÀ GÌ?
 Định nghĩa CNSH

1919: Karoly Ereky: “Sản phẩm

đƣợc sản xuất ra từ các nguyên
liệu thô với sự giúp đỡ của các
vật chất sống”
• 1992, Công ƣớc đa dạng sinh
học: bất kỳ ứng dụng công
nghệ sử dụng các hệ thống sinh
vật, các cơ thể sống hoặc bắt
nguồn từ đó để tạo mới hoặc biến
đổi sản phẩm hoặc một quá trình.
• Chấp nhận bởi 168 nƣớc, + FAO
+ WHO
 ĐỊNH NGHĨA CNSH
 Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công
nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ
phận hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật
vào việc khai thác sản phẩm của chúng.
 Do Trường Luật Stanford (1995) định
nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ
chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ
nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức
năng của gen đó. Biology + chemistry + engineering
 Công nghệ sinh học là gì?
Các giai đoạn của công nghệ sinh học

CNSH truyền thống CNSH hiện đại CNSH phân tử CNSH ???

Các lĩnh vực của công nghệ sinh học

* CNSH theo tác nhân tham gia
- CNSH phân tử;
- CNSH protein, enzyme;
- CNSH vi sinh vật;
- CNSH thực vật;
- CNSH động vật.
* CNSH theo đối tượng phục vụ
- CNSH y học;
- CNSH thực phẩm;
- CNSH trong hóa học và vật liệu;
- CNSH nông nghiệp;
- CNSH môi trường.
 Công nghệ sinh học truyền thống
(Traditional Biotechnology)

+ Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional

fermentations);
+ Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation
technology);
+ Sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu vi sinh vật
(production of microbial fertilizer and pesticide);
+ Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass
production);
+ Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực
vật (plant micropropagation);
+ Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization).
 Công nghệ sinh học hiện đại
(Modern biotechnology)
+ Nghiên cứu genome (genomics);
+ Nghiên cứu hệ proteome (proteomics);
+ Thực vật và động vật chuyển gen (transgenic
animal and plant);
+ Động vật nhân bản (animal cloning);
+ Chip DNA (DNA chip);
+ Liệu pháp tế bào và gen (gene and cell therapy);
+ Protein biệt dƣợc (therapeutic protein);
+ Tin sinh học (bioinformatics);
+ Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology);
+ Hoạt chất sinh học (bioactive compounds).
 CNSH truyền thống (CNSH Thế hệ 1)
(từ 1750 BC)

• Thuần hóa cây trồng, vật nuôi

• Các sản phẩm lên men (sữa chua, phomat, …

• Sản xuất rượu, bia (Saccaromyces cerevisieae;

Actinomyces, Leuconostoc)
 CNSH cận đại (CNSH Thế hệ 2)
(từ 1863)

• Chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi;

• Sản xuất vaxcin, kháng thể, kháng
sinh;
• Công nghệ tế bào: nhân giống cây
trồng, vật nuôi…
 CNSH hiện đại (CNSH Thế hệ 3)
(từ 1972)

• Kỹ thuật di truyền (Genetic

engineering)
• Kỹ thuật ADN tái tổ hợp
(Recomninant DNA technology)
• Kỹ thuật gen (Gene technology)
• Công nghệ sinh học hiện đại
(Modern biotechnology)
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CNSH trong nông nghiệp

Giống cây trồng và vật nuôi nhân vô tính và
chuyển gen mang những đặc điểm nông-
sinh quý giá

Các chế phẩm sinh học dùng trong bảo vệ

cây trồng vật nuôi, nhƣ: vaccine, thuốc trừ
sâu bệnh và phân bón vi sinh

Công nghệ bảo quản và chế biến nông-hải

sản bằng các chế phẩm vi sinh và enzyme
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CNSH trong y dƣợc

Các loại kháng sinh và các chất diệt khuẩn, các loại
vitamin và chất bổ dƣỡng, các loại amino acid và hỗn
hợp của chúng trong dịch truyền, các loại vaxcine và
các loại hormone chữa bệnh

Các bộ kit chuẩn dùng trong chẩn đoán

bệnh và chẩn đoán hóa sinh

Chuyển những gen sản sinh ra các

loại protein trị liệu vào cây trồng, vật nuôi
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CNSH trong công nghiệp và chế biến thực phẩm

Công nghiệp hóa chất: dùng các chất xúc tác
sinh học (enzyme), tái sinh và xử lý các dung môi
bằng con đƣờng sinh học
Quá trình chế biến tinh bột: Dùng các enzyme
do công nghệ sinh học tạo ra để dịch hóa và
đƣờng hóa tinh bột thành glucose và chuyển
hóa thành fructose.
Công nghiệp làm sạch: Các chất giặt tẩy hiện
đại đuợc bổ sung protease và các enzyme
khác làm sạch
Công nghiệp bột gỗ và giấy; công nghiệp khai
khoáng
LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CNSH trong môi trƣờng

Công nghệ phân hủy sinh học: Dùng các cơ thể

sống phân hủy các chất thải độc tạo nên các chất
không độc nhƣ nƣớc, khí CO2 và các vật liệu
khác

Dự phòng môi trƣờng: Phát triển

các thiết bị dò và theo dõi ô nhiễm
môi truờng, đặc biệt trong việc dò
nƣớc và khí thải công nghiệp
 TẠI SAO CẦN ĐẾN CNSH
 An ninh lƣơng thực:
- Tăng năng suất, sản lƣợng với diện tích đang bị
giảm;
- Tăng chất lƣợng thực phẩm;
- Tăng tính cạnh tranh trong bối cảnh kinh tế toàn
cầu.
 Lợi ích của CNSH

- Sản lƣợng đƣợc tăng lên …$$$$$$;

- Lãi nhiều hơn/ đơn vị đầu tƣ …$$$$$$;
- Giảm thuốc trừ sâu;

 Các lợi ích xã hội: sức khỏe, thời gian, giá thực
phẩm…
 II. Sơ lƣợc lịch sử hình
thành công nghệ sinh học
 MỘT SỐ MỐC PHÁT TRIỂN CỦA CNSH
(BIOTECHNOLOGY TIMELINE)

8000-4000 B.C.E.
Loài người thuần hóa
cây trồng, vật nuôi

Khoai tây được trồng

lần đầu tiên làm thực phẩm
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
 2000 B.C.E;
 CNSH được sử dụng  Sản xuất pho mai,
trong làm bánh mỳ, lên men rượu
lên men bia sử dụng (Sumeria, China,
nấm men (Egypt). Egypt)
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH

500 B.C. E 100 B.C. E

Chất kháng sinh đầu Thuốc diệt côn
tiên: đậu phụ đƣợc trùng đầu tiên: bột
dùng để trị ung nhọt hoa cúc (Trung
(Trung Quốc). Quốc).
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
 Các phát minh chủ yếu
Robert Hooke
(1635-1703)
phát hiện
sinh vật
đƣợc cấu tạo
từ các tế Robert Hooke Kính hiển vi –Định luật Hooke
bào (1965).

1937-1938
Nghiên cứu về
tế bào
Schleiden Schwann
Đồng tác giả thuyết tế bào
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
• Các phát minh chủ yếu
- Học thuyết tiến
1859 hóa
- Về nguồn gốc
các loài
Charles Robert Darwin
Quy luật di truyền
1865 (3 Quy luật
-Quy luật thứ nhất (Quy tắc đồng
dạng)
-Quy tắc phân ly
-Quy tắc phân ly độc lập
Gregor Johann Mendel
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
• Các phát minh chủ yếu

1868

Tìm ra DNA
F. Miescher

Vi sinh vật học và CNSH vi

1860 sinh vật
- 1670s- Antonie van Leeuwenhock;
- 1850s- Luois Paster
- 1880s: Robert Koch….
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
• Phát minh nền tảng của thế kỷ XX
Hình 1: W. Sutton
(trái) và T. Boveri
(phải) cùng sáng lập
thuyết di truyền
nhiễm sắc thể.
1910 - 1920
Thuyết di truyền NST

Francis
1941- 1953 Crick và
James
Walson

DNA
là vật
liệu di
truyền
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH

1966
Phát hiện mã di truyền của DNA
Ba nhà khoa học đã cùng nhận giải Nobel về Vật lý và Y học cho sự
phát minh của mình về mã di truyền của DNA vào năm 1966

Marshall Nirenberg Robert Holley Har Gobind Khorana

3 nhà khoa học cùng chia giải Nobel về Sinh lý học và Y học về mã di truyền và
mô tả cách thức hoạt động của mã di truyền trong tổng hợp protein
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
1971 1973
● Hoàn tất tổng hợp Stanley Cohen and Herbert
gen nhân tạo. Boyer hoàn thiện kỹ thuật
●Phát hiện enzymes di truyền sử dụng RE để cắt
cắt giới hạn, mở đường và nối DNA.
(1977 sees the first expression of
cho kỹ thuật tách dòng a human gene in bacteria.)
và nhân dòng gen.

Stanley Cohen Herbert Boyer

S. Cohen cùng Rita -Levi-Montalcini chia giải Nobel Sinh lý học và Y
khoa năm 1986 về “Nhân tố tăng trưởng thần kinh”; Herbert Boyer-
nhận giải quốc gia năm 1990 về Scientific career
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH

 1981: Động vật chuyển gen đầu tiên (mice); Bản

quyền đƣợc cấp lần đầu tiên cho vi khuẩn
biến đổi gen có khả năng phân giải dầu thô;
 1983: Phát minh kỹ thuật PCR để nhân bản DNA;
 1986: Vaxcin tái tổ hợp đầu tiên đuợc dùng cho
ngƣời : hepatitis B; Sản xuất interferon
dùng trong trị bệnh ung thƣ;
 1987: Thử nghiệm đồng ruộng với cây cà chua
kháng virus;
 1994: Cà chua biến đổi gen đƣợc bán tại Mỹ lần
đầu tiên.
 CÁC MỐC PHÁT TRIỂN CHÍNH
• Phát minh nền tảng của thế kỷ XX

02/1997 Nhân bản vô tính động

vật (Animal cloning)
Wilmut và Dolly

1999 Tế bào gốc soma

(Somatic Stem Cell)

26/06/2000 Giải trình tự (Sequencing) bộ gen người (Human

Genome Project –HGP)
 Dự án bộ gen người (Human Genome
Project (HGP))
 HGP hoàn thành vào năm 2003 là sự kết hợp của rất nhiều
quốc gia (Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Pháp, Đức …)
Những thành tựu của HGP
• Xác định được gần toàn bộ 20,000-25,000 genes trong DNA
người;
• Xác định được chuỗi 3 tỉ cặp base cấu thành chuỗi DNA
người;
• Lưu giữ thông tin trong cơ sở dữ liệu;
• Nghiên cứu và hoàn thiện thêm nhiều công cụ nghiên cứu,
phân tích dữ liệu;
• Chuyển những kỹ thuật công nghệ có liên quan những tổ chức
cơ sở tư nhân.
 Những thành tựu của HGP

• Cho biết vị trí chính xác trên nhiễm sắc thể và mã

di truyền của mỗi gene trong bộ gen người cũng
như những tiến trình trong tế bào do những gene
này kiểm soát. Những tính trạng như màu tóc,
màu mắt, chiều cao và những bệnh di truyền…

• Định danh và vẽ bản đồ vị trí của mỗi gen nằm

trên từng nhiễm sắc thể.
 Năm 2003 2006
The SARS (severe acute Vaccin tái tổ hợp chống lại
respiratory syndrome) virus human papillomavirus
đƣợc đọc trình tự 3 tuần (HPV) được đưa vào sử dụng.
sau khi đƣợc phát hiện The virus causes genital warts
and can cause cervical cancer.
 Virus gây ra mụn cóc sinh
dục và có thể gây ung thư cổ
tử cung.
Năm 2004
Nhân bản vô tính mèo thành công

2019 Covid-19 đã xảy ra trê toàn thế giới

CNSH là một khoa học bao gồm nhiều lĩnh vực

Hình 2. Cây
CNSH: Những
lĩnh vực khác
nhau tạo nên
Công nghệ sinh
học
 III. MỘT SỐ KHÍA CẠNH VỀ KHOA HỌC VÀ
KINH TẾ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN
ĐẠI (SINH VIÊN ĐỌC THÊM TRONG GIÁO TRÌNH CỦA GS.
NGUYỄN HOÀNG LỘC)
 Về khoa học
- Sự dè dặt trong sử dụng các sản phẩm
chuyển gen làm thực phẩm cho người và gia
súc.
 Về kinh tế
- Những công ty đa quốc gia về công nghệ
sinh học;
- Sự lệ thuộc vào các công ty đa quốc gia về
công nghệ sinh học.
 IV. CÁC VẤN ĐỀ PHÁP LÝ CỦA CÔNG
NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI (THAM KHẢO
TRONG GIÁO TRÌNH CỦA GS. NGUYỄN HOÀNG LỘC)

 An toàn sinh học;

 An toàn thực phẩm;

 Đạo đức sinh học (bioethics);

 Quyền tác giả và sở hữu trí tuệ

 AN TOÀN SINH HỌC
 Sự chuyển gen bằng hạt phấn;

 Sự bền vững của DNA trong đất;

 Chuyển gen ngang từ thực vật vào vi sinh

vật đất;

 Chuyển gen từ thực vật vào virus

AN TOÀN THỰC PHẨM
Câu hỏi ôn tập chương I
Câu 1: Em hãy trình bày những hiểu biết của em về Công nghệ sinh học?.
I. Định nghĩa công nghệ sinh hoc
1. Định nghĩa tổng quát: Có 02 cách định nghĩa CNSH một cách tổng quát:
- Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận
hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng
- Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ chuyển
một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của
gen đó
Sự khác biệt rõ rệt nhất của hai định nghĩa trên thuộc về đối tượng tác động của công
nghệ sinh học: UNESCO xem cơ quan, bộ phận, tế bào và chức năng riêng rẽ của sinh vật
là đối tượng, trong khi đó Trường Luật Stanford lại coi gen là đối tượng tác động của
công nghệ.
Từ các định nghĩa trên, có thể phân biệt được hai nhóm công nghệ sinh học là:
1.1. Công nghệ sinh học truyền thống (traditional biotechnology)
Bao gồm:
+ Thực phẩm lên men truyền thống (food of traditional fermentations)
+ Công nghệ lên men vi sinh vật (microbial fermentation technology)
+ Sản xuất phân bón và thuốc trừ sâu vi sinh vật (production of microbial fertilizer
and pesticide)
+ Sản xuất sinh khối giàu protein (protein-rich biomass production)
+ Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật (plant micropropagation)
+ Thụ tinh nhân tạo (in vitro fertilization)
1.2. Công nghệ sinh học hiện đại (modern biotechnology)
Bao gồm:
+ Nghiên cứu genome (genomics)
+ Nghiên cứu proteome (proteomics)
+ Thực vật và động vật chuyển gen (transgenic animal
and plant)
+ Động vật nhân bản (animal cloning)
+ Chip DNA (DNA chip)
+ Liệu pháp tế bào và gen (gene and cell therapy)
+ Protein biệt dược (therapeutic protein)
+ Tin sinh học (bioinformatics)
+ Công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology)
+ Hoạt chất sinh học (bioactive compounds)
2. Nội dung khoa học của công nghệ sinh học
Công nghệ sinh học cũng có thể được phân loại theo các kiểu khác nhau.
Xét về góc độ các tác nhân sinh học tham gia vào quá trình công nghệ sinh
học, có thể chia thành các nhóm sau:
- Công nghệ sinh học thực vật (plant biotechnology)
- Công nghệ sinh học động vật (animal biotechnology)
- Công nghệ sinh học vi sinh vật (microbial biotechnology)
- Công nghệ sinh học enzyme hay công nghệ enzyme (enzyme biotechnology)
Gần đây, đối với các nhân tố sinh học dưới tế bào còn hình thành khái
niệm công nghệ protein (protein engineering) và công nghệ gen (gene
engineering).
Công nghệ protein và công nghệ gen xuyên suốt và trở thành công nghệ
chìa khóa nằm trong công nghệ sinh học thực vật, công nghệ sinh học động
vật và công nghệ sinh học vi sinh vật.
Nhờ kỹ thuật đọc trình tự gen và kỹ thuật DNA tái tổ hợp, công nghệ
gen đã đạt được những thành tựu hết sức to lớn mang tính quyết định, mở ra
những giai đoạn phát triển mới. Đó là nghiên cứu về toàn bộ genome của
nhiều sinh vật, đáng chú ý là việc giải mã genome của con người và của cây
lúa. Đó là việc hình thành cả một phương hướng nghiên cứu, ứng dụng và
kinh doanh các sinh vật biến đổi gen (gentically modified organism-GMO) và
các thực phẩm biến đổi gen (gentically modified food-GMF).
Công nghệ protein có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong việc sản
xuất ra các protein tái tổ hợp (recombinant protein) dùng làm dược
phẩm điều trị các bệnh hiểm nghèo như interferon, interleukin,
insulin...
Mặt khác, tùy vào đối tượng phục vụ của công nghệ sinh học, có thể
chia ra các lĩnh vực công nghệ sinh học khác nhau như:
- Công nghệ sinh học nông nghiệp (biotechnology in agriculture)
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm (biotechnology in food
processing)
- Công nghệ sinh học y dược (biotechnology in medicine
pharmaceutics)
- Công nghệ sinh học môi trường (environmental biotechnology)
- Công nghệ sinh học vật liệu (material biotechnology)
- Công nghệ sinh học hóa học (biotechnology in chemical
production)
- Công nghệ sinh học năng lượng (biotechnology in energy
production)...
3. Các lĩnh vực ứng dụng của công nghệ sinh học
3.1. Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
Có thể nêu ba lĩnh vực chính là:
- Giống cây trồng và vật nuôi nhân vô tính và chuyển gen mang những đặc
điểm nông-sinh quý giá mà các phương pháp truyền thống không tạo ra
được, đồng thời lại được bảo vệ thông qua bản quyền tác giả.
- Các chế phẩm sinh học dùng trong bảo vệ cây trồng vật nuôi, như:
vaccine, thuốc trừ sâu bệnh và phân bón vi sinh.
- Công nghệ bảo quản và chế biến nông-hải sản bằng các chế phẩm vi sinh
và enzyme. Giá trị nông sản được nâng lên nhiều lần và quy trình
côngnghệ đi kèm trang thiết bị là một dạng hàng hóa trong kinh doanh
chuyển giao công nghệ.
Ngoài ra có thể liệt kê thêm một số lĩnh vực khác:
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm: Các enzyme, các chất phụ gia
thực phẩm
- Các loại thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (kháng sinh mới...).
- Các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ với tính đặc hiệu tăng lên
- Các hormone sinh trưởng thực vật (các cytokinin...).
- Các hóa chất chẩn đoán bệnh cho động-thực vật.
3.2. Công nghệ sinh học trong y dược
Bao gồm các ứng dụng sau:
- Các loại kháng sinh và các chất diệt khuẩn, các loại vitamin và chất bổ
dưỡng, các loại axit amin và hỗn hợp của chúng trong dịch truyền, các loại
vaccine và các loại hormone chữa bệnh.
- Các bộ kit chuẩn dùng trong chẩn đoán bệnh và chẩn đoán hóa sinh trong y
dược.
- Cây trồng và vật nuôi được cấy chuyển những gen sản sinh ra các loại
protein trị liệu đang là mục tiêu đầu tư của khá nhiều công ty y dược hàng
đầu trên thế giới hiện nay.
3.3. Công nghệ sinh học công nghiệp và chế biến thực phẩm
Sau đây là các loại sản phẩm của công nghệ sinh học công nghiệp:
- Công nghiệp hóa chất: Các hóa chất thông dụng (ví dụ: acrylamide) đều có
thể sản xuất bằng công nghệ sinh học. Công nghiệp hóa học sẽ có hiệu quả
hơn nếu dùng các chất xúc tác sinh học (enzyme), tái sinh và xử lý các dung
môi bằng con đường sinh học.
- Quá trình chế biến tinh bột: Dùng các enzyme do công nghệ sinh học tạo ra
để dịch hóa và đường hóa tinh bột thành glucose và chuyển hóa thành
fructose.
- Công nghiệp làm sạch: Các chất giặt tẩy hiện đại đuợc bổ sung protease và
các enzyme khác làm sạch các vết bẩn protein, tinh bột và chất béo.
- Công nghiệp bột gỗ và giấy: Nhu cầu của thị trường và bảo vệ môi trường ngày
càng lớn đối với giấy ít chứa các hợp chất chlorine gây ô nhiễm. Quá trình sản xuất
bột giấy hiện nay gây ô nhiễm rất nặng. Công nghệ sinh học đưa ra giải pháp sinh
học để sản xuất bột giấy không gây ônhiễm bằng cách sử dụng các loại nấm phân
hủy lignin-cellulose để tạo bột. Các enzyme cũng được dùng nâng cao chất lượng sợi
và chất lượng giấy.
- Công nghiệp khai khoáng và phát hiện khoáng sản: Có hai công nghệ: lọc sinh
học/oxy hóa sinh học các kim loại, xử lý ô nhiễm kim loại và tái sinh. Công nghệ lọc
kim loại dùng các vi sinh vật có thể thu được các kim loại quí như đồng, kẽm và
cobalt. Công nghệ xử lý sinh học ô nhiễm có thể áp dụng đối với các kim loại nặng.
3.4. Công nghệ sinh học môi trường
Các hoạt động chính của công nghệ sinh học môi trường đang được chú trọng là:
- Công nghệ phân hủy sinh học: Dùng các cơ thể sống phân hủy các chất thải độc tạo
nên các chất không độc như nước, khí CO2 và các vật liệu khác. Bao gồm, công nghệ
kích thích sinh học: bổ sung chất dinh dưỡng để kích thích sự sinh trưởng của các vi
sinh vật phân hủy chất thải có sẵn trong môi trường, công nghệ bổ sung vi sinh vật
vào môi trường để phân hủy chất ô nhiễm, công nghệ xử lý ô nhiễm kim loại và các
chất ô nhiễm khác bằng thực vật và nấm.
- Dự phòng môi trường: Phát triển các thiết bị dò và theo dõi ô nhiễm môi truờng,
đặc biệt trong việc dò nước và khí thải công nghiệp trước khi giải phóng ra môi
trường.
 Tài liệu tham khảo
Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà
xuất bản Đại học Huế
 Tài liệu trang web/ gogoole
 Nhập môn Công nghệ sinh học
Chương 2
Công nghệ DNA tái tổ hợp

Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 Nội dung

 I. Mở đầu
 II. Phân lập đoạn DNA/gen
 III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào
vector
 IV. Chọn dòng mang DNA tái tái tổ hợp
 V. Biểu hiện gen được tạo dòng
 I. Mở đầu
• Đầu những năm 1970, khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction
endonuclease) là sự phát triển then chốt;
•1972 - 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyền
khác nhau (Berg, Boyer và Cohen);
• 1973 - 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen,
Henlinski, Boyer);
Tên gọi:
• Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology);
• Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetic
technology);
• Thao tác gene (Gene manipulation);
• Tạo dòng phân tử (Molecular cloning);
• Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phần
lớn hơn của bộ gene.
 Cấu trúc hóa học của phân tử ADN
1. Thành phần cấu tạo ADN:
ADN (axit deoxyribonucleic) được cấu tạo từ 5 nguyên
tố hoá học là C, H, O, P, N. ADN là loại phân tử lớn
(đại phân tử), có cấu trúc đa phân, bao gồm nhiều đơn
phân là nucleotit. Mỗi nucleotit gồm:
+ Đường deoxyribose: C5H10O4
+ Axit photphoric: H3PO4
 1 trong 4 loại bazơ nitơ (loại purin gồm:
adenine - A, guianine - G; loại pyrimidine gồm:
cytosine C và thyamine - T). Trong đó A, G có kích
thước lớn còn T, X có kích thước bé hơn.
2. Cấu trúc ADN:
ADN là một chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch polynucleotit xoắn đều
quanh một trục theo chiều từ trái sang phải (xoắn phải): 1 vòng
xoắn có: – 10 cặp nucleotit. – Dài 34 Ăngstrôn – Đường kính 20
Ăngstrôn.
– Liên kết trong 1 mạch đơn: nhờ liên kết hóa trị giữa axít
photphoric của nucleotit với đường C5 của nucleotit tiếp theo.
– Liên kết giữa 2 mạch đơn: nhờ mối liên kết ngang (liên kết
hydrogen) giữa 1 cặp bazơ nitríc đứng đối diện theo nguyên tắc bổ
sung (A liên kết với T bằng 2 liên kết hydrogen hay ngược lại; G liên
kết với X bằng 3 liên kết hydrogen hay ngược lại)
– Hệ quả của nguyên tắc bổ sung:
+ Nếu biết được trình tự sắp xếp các nucleotit trong một mạch đơn
này thì sẽ biết được trình tự sắp xếp các nucleotit trong mạch còn
lại theo nguyên tắc bổ trợ.
+ Trong phân tử ADN: tỉ số: A+T/ G+X là hằng số nhất định đặc
trưng cho mỗi loài
 3. Tính chất của ADN

 – ADN có tính đặc thù: ở mỗi loài, số lượng +

thành phần + trình tự sắp xếp các nucleotit trong
phân tử ADN là nghiêm ngặt và đặc trưng cho
loài.
 – ADN có tính đa dạng: chỉ cần thay đổi cách
sắp xếp của 4 loại nucleotit -> tạo ra các ADN
khác nhau.
 Tính đa dạng + tính đặc thù của ADN là cơ sở
cho tính đa dạng và tính đặc thù của mỗi loài
sinh vật.
 4. Chức năng của ADN
 - Lưu trữ, bảo quản và truyền đạt thông tin di truyền về
cấu trúc và toàn bộ các loại protein của cơ thể sinh vật, do
đó quy định các tính trạng của cơ thể sinh vật.
 - Thông tin di truyền: được chứa đựng trong ADN dưới
hình thức mật mã (bằng sự mã hóa bộ 3) cứ 3 nucleotit kế
tiếp nhau trên 1 mạch đơn quy định 1 axít amin (aa) (= mã
bộ 3) hay bộ 3 mã hóa = mã di truyền = đơn vị mã = 1
codon). Vậy trình tự sắp xếp các axít amin trong phân tử
protein được quy định bởi trình tự sắp xếp các nucleotit
trong ADN.
 - Mỗi đoạn của phân tử ADN mang thông tin di truyền
quy định cấu trúc của 1 loại protein được gọi là gen cấu
trúc.
 Cấu trúc của một đoạn
xoắn kép DNA.
Cấu trúc phân tử 3 chiều của
dạng phổ biến B-DNA

Cấu trúc hóa học của DNA;

liên kết hydro thể hiện
bằng các nét chấm
 Phân biệt cấu trúc nucleoside
và nucleotide

Một phần của DNA. Các

Rãnh lớn và rãnh nhỏ trên phân tử base nằm ngang giữa
DNA. Rãnh nhỏ là một vị trí liên kết hai mạch xoắn
với chất nhuộm màu Hoechst 33258.
 Những mô hình cấu trúc DNA

Cặp Base: Hình trên, cặp base G-C

liên kết bằng ba liên kết hydro.
Hình dưới, cặp base A-T liên kết
bằng hai liên kết hydro. Liên kết
hydro không phải là liên kết cộng Từ trái qua phải, các cấu trúc
hóa trị và được thể hiện bằng các của DNA dạng A, B và Z.
nét chấm nhỏ.

DNA siêu xoắn (DNA supercoiling).

Đặc điểm cấu trúc của ba cấu hình chính DNA[60][61][62]Ghi chú: bp là cặp base
(base pair)
Đặc tính hình học A-DNA B-DNA Z-DNA
Chiều xoắn phải phải trái
Đường kính ≈ 2,3 nm ≈ 2,0 nm ≈ 1,8 nm
Đơn vị lặp lại 1 bp 1 bp 2 bp
Góc quay/bp 32,7° 34,3° 60°/2
Số bp trung bình/vòng xoắn 11 10,4 12
Độ nghiêng của bp so với trục +19° -1,2° -9°
Độ dài dốc/bp dọc theo trục 0,23 nm 0,332 nm 0,38 nm
Bước/vòng xoắn 2,82 nm 3,32 nm 4,56 nm
Góc xoắn trung bình giữa hai bp +18° +16° 0°
Pyrimidine: anti
Góc glycosyl anti anti
Purine: syn

Chế độ gấp phân tử đường Pyrimidine: C2'-endo

C3'-endo C2'-endo
(sugar puckering) Purine: C3'-endo

rộng và sâu, độ
Rãnh lớn hẹp và sâu phẳng
sâu: 0,85 nm

hẹp và sâu, độ
Rãnh nhỏ rộng và phẳng hẹp và sâu
sâu: 0,75 nm
 Cấu trúc bộ bốn DNA phân nhánh

Nhánh đơn mạch Nhánh đa mạch

DNA phân nhánh có thể tạo thành
Cấu trúc bộ bốn DNA hình thành bằng mạng lưới chứa nhiều nhánh
những đoạn telomere lặp lại. Hình dạng
vòng của bộ khung DNA nhìn rất khác so Phá hủy (hư hại)
với dạng xoắn ốc của DNA điển hình. Những
hình cầu xanh lục ở giữa đại diện cho các ion
kali
Những thay đổi hóa học và trình tự của DNA
Chỉnh sửa base và phương cách đóng gói DNA
Metyl hóa DNA và Tái mô hình hóa chất nhiễm sắc
Cấu trúc của cytosine
khi có và không có Một sản phẩm cộng của liên kết
nhóm 5-metyl. Sự cộng hóa trị (covalent adduct)
khử amin biến đổi 5- giữa dạng kích hoạt chuyển hóa
methylcytosine thành của benzo[a]pyrene, tác nhân
đột biến chính trong khói thuốc
cytosine 5-methylcytosine thymine thymine. lá, với DNA.[82] (ở giữa)
Chức năng sinh học

Hình minh họa những mức độ co xoắn từ DNA đến nhiễm sắc thể kép tại kỳ giữa
của quá trình phân bào: Chuỗi xoắn kép DNA 2 nm, cấu trúc nucleosome, chuỗi
nucleosome (sợi cơ bản) 10 nm, sợi chất nhiễm sắc 30 nm, sợi siêu xoắn 300 nm,
chromatid 700 nm và nhiễm sắc thể kép 1400 nm ở mức xoắn cực đại.

Vị trí của DNA nhân chứa

trong chất nhiễm sắc bên
trong nhân tế bào của tế bào
nhân thực
Gene và bộ gene
Nhân tế bào, Chất nhiễm sắc, Nhiễm sắc thể, Gene, và DNA
không mã hóa
Gene là một đoạn của
DNA mã hóa các
thông tin chức năng
sinh học. Nhiễm sắc
thể chứa một chuỗi
DNA dài trên đó bao
gồm rất nhiều gene.
Một nhiễm sắc thể ở
người có thể chứa tới
500 triệu cặp base với
hàng nghìn gene.
DNA chứa các đoạn gene được gói gọn và xếp chặt có thứ tự bởi quá
trình cô đặc DNA (DNA condensation), để có thể vừa vặn trong một
thể tích nhỏ của tế bào. Ở sinh vật nhân thực, DNA nằm trong nhân
tế bào, cùng với một lượng nhỏ nằm trong ty thể và lục lạp. Ở sinh
vật nhân sơ, DNA nằm trong một thể có hình dạng không đều giữa tế
bào chất, gọi là thể nhân (hoặc vùng nhân, nucleoid).[97] Thông tin di
duyền trong một bộ gene được lưu trữ bởi các gene, và tập hợp toàn
bộ các gene trong tế bào của cơ thể thuộc một loài sinh vật được gọi là
kiểu gene. Mỗi gene là một đơn vị của tính di truyền và là một đoạn
của DNA có ảnh hưởng tới một đặc tính cụ thể trong cơ thể sinh vật.
Các gene chứa một khung đọc mở (open reading frame) có thể được
phiên mã, cùng với các vùng trình tự điều hòa (regulatory sequence)
như vùng khởi động (promoter) và vùng tăng cường (enhancer) có
khả năng điều hòa quá trình phiên mã của khung đọc mở.
Ở nhiều loài, chỉ một phần nhỏ trong tổng số trình tự của bộ gene là
mã hóa cho protein. Ví dụ, chỉ khoảng 1,5% bộ gene người chứa các
đoạn exon mã hóa cho protein, trong khi trên 50% DNA ở người
chứa các trình tự lặp lại không mã hóa (non-coding repeated
sequence).[98] Những lý do cho sự có mặt của rất nhiều DNA không
mã hóa ở bộ gene của sinh vật nhân thực và sự cách biệt rất lớn trong
kích cỡ bộ gene, hay giá trị C, giữa các loài đã đưa đến một vấn đề
nan giải lâu năm gọi là "nghịch lý giá trị C".[99] Tuy nhiên, một số
trình tự DNA không mã hóa protein vẫn có thể có chức năng mã hóa
các phân tử RNA không mã hóa tham gia vào quá trình điều hòa biểu
hiện gen
Phiên mã và dịch mã Mã di truyền, Phiên mã, và Sinh tổng hợp protein

Mã di truyền: DNA, qua trung gian RNA thông tin, mã hóa cho protein với các bộ ba mã hóa
Mỗi gene là một đoạn trình tự DNA chứa thông tin di truyền và có thể ảnh hưởng đến kiểu hình của
sinh vật. Bên trong một gene, trình tự các base dọc theo một mạch DNA xác định nên trình tự của
RNA thông tin, rồi từ đó xác lập nên trình tự của một hay nhiều protein. Mối liên hệ giữa trình tự
nucleotide của các gene và trình tự các axit amino của protein được xác định bởi những quy tắc trong
quá trình dịch mã, được biết đến với cái tên bộ mã di truyền. Mỗi mã di truyền chứa bộ ba 'chữ cái'
gọi là triplet (bộ ba mã gốc) trên DNA hay codon (bộ ba mã sao) trên mRNA hay anticodon (bộ ba đối
mã) trên tRNA tạo thành một trình tự gồm ba nucleotide (v.d. ACT, CAG, TTT trên mạch gốc DNA).

Trong quá trình phiên mã, các triplet của một gene được sao chép sang RNA thông tin thành các
codon tương ứng bằng enzyme RNA polymerase. Bản sao RNA này sau đó được giải mã bởi ribosome
thông qua hoạt động đọc trình tự RNA bằng cách bổ sung cặp base trong RNA thông tin với RNA vận
chuyển, loại phân tử mang theo axit amino. Vì có bốn loại base khác nhau được tổ hợp thành các mã
bộ ba, do vậy có tất cả 64 codon (tổ hợp 43). Tất cả chúng được phân bổ để mã hóa cho 20 loại axit
amino cơ bản của sự sống, do đó một axit amino có thể có nhiều hơn một codon mã hóa cho nó. Bên
cạnh đó cũng có ba codon 'kết thúc' hoặc 'vô nghĩa' (nonsense) đánh dấu điểm kết thúc của một vùng
mã hóa; chúng là các codon UAA, UAG và UGA (tương ứng với các triplet TAA, TAG và TGA).
Nhân đôi DNA (sao chép, tái bản)

Nhân đôi DNA: Chuỗi xoắn kép được tháo xoắn theo chiều 3' → 5' bởi enzyme
topoisomerase và cắt tách hai mạch đơn bởi enzyme helicaza. Tiếp theo, một DNA
polymerase lần lượt liên kết liên tục các nucleotide tự do từ môi trường nội bào với các
nucleotide trên mạch khuôn có chiều 3' → 5' tổng hợp nên mạch dẫn đầu (leading
strand) theo nguyên tắc bổ sung. Những DNA polymerase khác liên kết với mạch khuôn
có chiều 5' → 3' ngược với chiều tháo xoắn tổng hợp nên mạch theo sau (lagging strand)
thành những đoạn ngắt quãng gọi là đoạn Okazaki. Sau đó, các đoạn Okazaki này sẽ
được nối lại với nhau bởi enzyme DNA ligase.
 Axit nucleic ngoại bào

DNA ngoại bào trần (extracellular DNA - eDNA), hầu hết được giải phóng khi tế
bào chết đi, xuất hiện khắp nơi trong môi trường. Mức độ tập trung của nó trong
đất có thể lên tới 2 μg/lít, và trong môi trường nước tự nhiên lên tới 88 μg/lít.[107]
Đã có một số chức năng khả thi của eDNA được đề xuất: nó có thể tham gia vào
chuyển gene ngang;[108] cung cấp dinh dưỡng;[109] và có khả năng hoạt động như
một chất đệm để khôi phục hoặc chuẩn độ ion hoặc tính kháng sinh.[110] DNA
ngoại bào hoạt động như một thành phần chức năng của chất nền ngoại bào
trong lớp màng vi sinh vật (màng sinh học - biofilm) của một số loài vi khuẩn. Nó
có thể hoạt động như một nhân tố nhận diện để điều phối sự bám dính và phân
tán của một số loại tế bào đặc hiệu trong màng sinh học;[111] hoặc đóng góp vào
sự hình thành phim sinh học;[112] cũng như đóng góp vào đặc tính vật lý chắc
chắn của phim sinh học và sức đề kháng trước những căng thẳng sinh học
(biological stress).[113]
Tương tác với protein

Mọi chức năng của DNA phụ thuộc vào tương tác với protein. Những tương tác
protein này có thể không đặc hiệu hoặc đặc hiệu khi protein liên kết với một
trình tự DNA cụ thể. Các enzyme cũng liên kết với DNA và trong số này, những
enzyme polymerase sao chép trình tự base của DNA trong quá trình phiên mã
và nhân đôi DNA có vai trò đặc biệt quan trọng.
Protein liên kết DNA

Tương tác của DNA (màu cam)

với protein histone (màu lam).
Những axit amino cơ bản của
protein liên kết với các nhóm
phosphat tính axit trên DNA.

Các protein cấu trúc liên kết với DNA là những ví dụ đã được nghiên cứu khá kĩ về tương tác
không đặc hiệu DNA-protein. Bên trong nhiễm sắc thể, DNA được giữ trong phức hợp với
protein cấu trúc. Những protein này tổ chức DNA thành một cấu trúc thắt đặc gọi là chất
nhiễm sắc (chromatin). Trong sinh vật nhân thực, cấu trúc này bao gồm DNA liên kết với phức
hợp các đơn vị protein cơ sở nhỏ gọi là histone, trong khi ở sinh vật nhân sơ lại có nhiều loại
protein tham gia hơn.[114][115] Các histone tạo thành một phức hợp dạng đĩa gọi là nucleosome,
với chuỗi xoắn kép DNA bao quanh bề mặt cấu trúc bằng hai vòng xoắn. Những tương tác
không đặc hiệu được hình thành thông qua các phần dư cơ bản trong histone, tạo ra liên kết
ion với bộ khung đường-phosphat có tính axit của DNA, và do vậy phần lớn tương tác là độc
lập với trình tự các base.[116] Những phản ứng hóa học làm thay đổi các axit amino cơ bản này
bao gồm phản ứng metyl hóa, phosphoryl hóa và acetyl hóa.[117] Những thay đổi hóa học này
làm ảnh hưởng tới cường độ tương tác giữa DNA và histone, khiến cho các nhân tố phiên mã
trở nên dễ dàng hoặc khó tiếp cận được với DNA và do vậy thay đổi tốc độ quá trình phiên
mã.[118] Những protein liên kết DNA không đặc hiệu khác trong chất nhiễm sắc bao gồm các
nhóm protein có tính linh động cao mà khi liên kết có thể uốn hoặc làm vặn DNA.[119] Các
protein này có vai trò quan trọng trong việc sắp uốn nucleosome và xếp đặt chúng thành
những cấu trúc lớn hơn tạo thành nhiễm sắc thể
Có một nhóm protein liên kết DNA đặc biệt là các protein chỉ liên kết đặc hiệu với một mạch
đơn DNA. Ở người, protein A phục vụ quá trình nhân đôi DNA là protein được hiểu biết rõ
ràng nhất trong nhóm này và tham gia vào những quá trình khi hai mạch xoắn kép đã tách
rời nhau, bao gồm sao chép DNA, tái tổ hợp và sửa chữa DNA.[121] Những protein liên kết
này giúp ổn định hóa mạch đơn DNA và bảo vệ nó khỏi hiện tượng hình thành cấu trúc
vòng gấp kẹp tóc (stem-loop/hairpin loop) hoặc bị phân cắt bởi enzyme nuclease.

Ngược lại, có những protein khác phải biến đổi cấu hình để liên kết với những trình tự DNA riêng
biệt. Lĩnh vực nghiên cứu sâu rộng nhất về những protein này đó là nghiên cứu nhiều loại nhân tố
phiên mã (transcription factor) khác nhau, đây chính là các protein điều hòa quá trình phiên mã.
Mỗi nhân tố phiên mã liên kết với một tập hợp cụ thể các trình tự DNA và kích hoạt hoặc ức chế
hoạt động phiên mã của gene tại những trình tự gần với vùng khởi động của chúng. Nhân tố phiên
mã thực hiện vai trò này theo hai cách. Đầu tiên, chúng có thể gắn với RNA polymerase chịu trách
nhiệm cho quá trình phiên mã, hoặc trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các protein trung gian;
giúp định vị polymerase tại vùng gene khởi động và cho phép bắt đầu phiên mã.[123] Hoặc cách
khác, nhân tố phiên mã có thể gắn với enzyme làm biến đổi các histone ở vùng khởi động. Điều này
làm thay đổi khả năng tiếp cận của polymerase với mạch khuôn DNA.[124]

Do những DNA đích này xuất hiện trong toàn thể bộ gene sinh vật, vì vậy những thay đổi trong
hoạt động của một loại nhân tố phiên mã có thể ảnh hưởng tới hàng nghìn gene.[125] Hệ quả là,
những protein này thường là mục tiêu của các quá trình truyền tín hiệu tải nạp (signal
transduction) mà điều khiển sự đáp ứng đối với những thay đổi của môi trường hoặc biệt hóa tế
bào và điều khiển sự phát triển. Nét đặc trưng của những tương tác của các nhân tố phiên mã vớ
DNA đến từ các protein tạo nhiều tiếp xúc với các cạnh của các base DNA, cho phép chúng "đọc"
được trình tự DNA. Phần lớn những tương tác với base diễn ra ở rãnh lớn, nơi có thể tiếp xúc
nhiều nhất với các bas

Protein nhân tố ức chế phiên
mã lambda motif cấu trúc
xoắn-ngoặt-xoắn (helix-turn-
helix - HTH) gắn vào DNA đích
Enzyme chỉnh sửa DNA Nuclease và ligase
Nuclease là các enzyme có khả năng cắt mạch
DNA bằng cách xúc tác cho phản ứng thủy phân
các liên kết phosphodieste. Loại nuclease thủy
phân nucleotide từ những đầu mút của mạch DNA
được gọi là exonuclease, trong khi endonuclease
lại phân cắt từ những điểm trong mạch. Những
nuclease được sử dụng thường xuyên nhất trong
sinh học phân tử là các endonuclease giới hạn, do
chúng cắt DNA tại những đoạn trình tự đặc hiệu.
Ví dụ, enzyme EcoRV ở hình ảnh bên trái nhận ra
trình tự gồm 6 base 5′-GATATC-3′ và thực hiện
việc cắt theo một đường nằm ngang. Trong tự
nhiên, những enzyme này bảo vệ vi khuẩn chống
lại sự tấn công của thể thực khuẩn bằng cách tiêu
hóa DNA thể thực khuẩn khi chúng xâm nhập vào
tế bào vi khuẩn, lúc này các enzyme hoạt động
như một phần trong hệ thống hạn chế cải biến
(restriction modification system).[127] Trong công
nghệ sinh học, những nuclease hoạt động với các
trình tự đặc hiệu được sử dụng trong tách dòng
phân tử (molecular cloning) và kỹ thuật nhận diện
DNA (DNA profiling).
Những enzyme có chức năng nối lại những đoạn DNA bị cắt hoặc bị đứt gãy được gọi là
DNA ligase.[128] Ligase đặc biệt quan trọng trong việc nối lại các mạch theo sau ngắt quãng
của DNA, tức là các đoạn Okazaki tại chạc tái bản thành một bản sao hoàn chỉnh từ mạch
khuôn DNA. Chúng cũng tham gia vào việc sửa chữa DNA và tái tổ hợp di truyền.[128]

Minh họa cấu trúc chạc tái bản

(replication fork): a: mạch khuôn, b:
Enzyme giới hạn EcoRV (xanh lục) trong mạch dẫn đầu (leading strand), c: mạch
phức hệ với cơ chất DNA theo sau (lagging strand), d: chạc tái bản,
e: đoạn mồi RNA, f: các đoạn Okazak
Topoizomeraza và helicaza

•Topoizomeraza (topoisomerase) là những enzyme mang hoạt tính của cả

nuclease lẫn ligase. Những protein này có khả năng thay đổi cấu trúc chuỗi
xoắn kép DNA: chúng có thể gỡ bỏ trạng thái siêu xoắn, hoặc ngược lại - chúng
đóng xoắn. Một số enzyme trong nhóm này thực hiện hoạt động cắt chuỗi xoắn
ốc DNA và cho phép một phần phân tử quay được, do vậy làm giảm mức siêu
xoắn của nó; sau cuối enzyme sẽ gắn khít hoàn chỉnh lại đoạn DNA bị gãy.[46]
Những loại enzyme khác có thể cắt một chuỗi xoắn kép DNA và rồi kéo một
mạch DNA thứ hai vào vị trí cắt này, trước khi thực hiện việc nối lại chuỗi xoắn
kép.[129] Tôpôizômêraza cần thiết cho nhiều quá trình liên quan đến DNA, như
nhân đôi và phiên mã.[47].

•Helicaza là những protein thuộc một trong những loại động cơ phân tử. Chúng
sử dụng năng lượng hóa học trong nucleoside triphosphat, thường sử dụng nhất
là adenosine triphosphat (ATP), để phá vỡ liên kết hydro giữa các base và tháo
xoắn chuỗi kép DNA thành hai mạch đơn.[130] Những enzyme này có vai trò
quan trọng thiết yếu đối với hầu hết quá trình enzyme cần thiết có tương tác với
các bazơ nitơ.
Polymerase
Polymerase là những enzyme thực hiện tổng hợp mạch polynucleotide từ
nucleoside triphosphat. Tính tuần tự của các sản phẩm của chúng được sinh ra
dựa trên những mạch polynucleotide đã có—gọi là mạch khuôn. Những enzyme
này hoạt động bằng lần lượt thêm vào một nucleotide tại nhóm 3′ hydroxyl ở
điểm cuối của mạch polynucleotide đang phát triển. Kết quả là, mọi polymerase
hoạt động luôn theo chiều từ đầu 5′ đến đầu 3′.[131] Tại trung tâm hoạt động của
các enzyme này, phân tử nucleoside triphosphat đi đến ghép cặp với base của
mạch khuôn: điều này cho phép polymerase tổng hợp một cách chính xác mạch
bổ sung đối với mạch khuôn của nó. Các polymerase được phân loại theo các
nhóm mạch khuôn mà chúng sử dụng.
Trong quá trình sao chép DNA, DNA polymerase phụ thuộc DNA tạo nên những
bản sao của những mạch polynucleotide DNA. Để bảo toàn thông tin sinh học,
điều cơ bản là trình tự của các base trong mỗi bản sao là trình tự bổ sung chính
xác cho trình tự base trong mạch khuôn mẫu. Nhiều DNA polymerase có hoạt
tính đọc và sửa sai (proofreading). Ở đây, polymerase nhận ra các lỗi thường
xuất hiện trong phản ứng tổng hợp do sự thiếu đi những base ghép cặp giữa các
nucleotide không khớp với nhau. Nếu polymerase phát hiện một sự không ăn
khớp, hoạt tính exonuclease 3'-5′ được kích hoạt và base không khớp nào được
phát hiện sẽ bị cắt bỏ.[132] Trong hầu hết các sinh vật, DNA polymerase hoạt động
trong một phức hệ lớn gọi là replisome có chứa nhiều tiểu đơn vị phụ, như
protein kẹp DNA (DNA clamp) hay helicaza
DNA polymerase phụ thuộc RNA là những loại polymerase chuyên biệt thực
hiện sao chép trình tự của mạch RNA sang DNA. Chúng bao gồm enzyme
phiên mã ngược (reverse transcriptase, RT), ví dụ như một enzyme của virut
retrovirus tham gia vào quá trình xâm nhập tế bào, và telomerase, cần cho
quá trình sao chép telomere.[67][134] Telomerase là một polymerase khác thường
bởi vì nó chứa chính mạch khuôn RNA của nó như là một phần trong cấu trúc
của enzyme này.

Sự phiên mã được thực hiện bởi RNA polymerase phụ thuộc DNA thông qua
quá trình sao chép trình tự của mạch DNA sang RNA. Để bắt đầu giải mã một
gene, RNA polymerase gắn với một trình tự của DNA gọi là vùng khởi động
(promoter) và tách hai mạch DNA khỏi nhau. Sau đó nó sao chép trình tự gene
vào một RNA thông tin cho đến khi nó đi đến vùng kết thúc (terminator) của
DNA, nơi RNA polymerase dừng lại và tách khỏi DNA. Với DNA polymerase
phụ thuộc DNA ở người, RNA polymerase II, enzyme thực hiện phiên mã hầu
hết các gene trong bộ gene người, hoạt động như là một phần của một phức hệ
protein lớn với nhiều tiểu đơn vị phụ và vùng điều hòa khác nhau
Tái tổ hợp di truyền

Tái tổ hợp bao gồm tách rời và kết nối lại

hai nhiễm sắc thể (M và F) để tạo thành hai
nhiễm sắc thể được sắp xếp lại (C1 và C2)

Cấu trúc của thể trung gian điểm giao Holliday

trong tái tổ hợp di truyền. Bốn đoạn mạch DNA
tách rời có màu đỏ, lam, lục và vàng
 II. Phân lập đoạn DNA
Gồm 2 kỹ thuật chính:
• Tách các đoạn DNA từ genome Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA

DNA hệ gen
của một sinh
Thư viện genome là
vật được cắt
một tập hợp các đoạn
thành các
DNA đại diện cho một
đọan nhỏ dài
genome nguyên vẹn
(khoảng 21
của cá thể. Các đoạn
kb) bằng RE
DNA này nằm trong các
rồi gắn vào
vector tự sao chép cho
vector để XD
phép chúng được duy
thư viện
trì và sinh sản cũng với
genome
tế bào của VSV như
-Thư viện
Escherichia
genome chứa
coli/Saccharomyces
các đoạn DNA
cerevisiae
dài ngắn
-Cơ thể có thư viện
k/nhau nhưng
cDNA khác nhau đặc
có cùng thông
trưng cho từng loại tổ
tin di truyền
chức chuyên hóa
Phân lập đoạn DNA bằng phản ứng tạo chuỗi
nucleotide (Polymerase Chain Reaction, PCR)
- Phân lập 1 trình tự nucleotide
1985, Kary Mullis (gen) từ DNA genome nhờ các
primer đặc hiệu cho trình tự DNA
Nguyên tắc: cần nhân; đơn giản, ít tốn thời
gian.n
Thành phần tối ưu trong phản ứng PCR
Magnesium
 Nồng độ thích hợp của Mg2+: 0,5-2,5 mM.
Các deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)
 Nồng độ thích hợp: 20-200 µM.
Enzyme Taq polymerase
 Nồng độ enzyme Taq thích hợp: 1-2,5 unit/100 µl.
Đệm ổn định hoạt động của enzyme Taq
 Gelatin: 0,01% và Triston X-100: 0,1%.
Nồng độ các primer
 Nồng độ thích hợp: 2,5 pmol/primer.
Nồng độ DNA khuôn mẫu
 Nồng độ thường thích hợp: 10-100 ng/25 µl
Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn mẫu
 Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ khác nhau:
 Gây biến tính: 90-95oC
 Ủ để gắn primer: 40-65oC
 Tổng hợp: 70-72oC

Các chu kỳ của kỹ thuật khuếch đại PCR

III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector
Tạo dòng phân tử (cloning molecular)
 Tạo dòng phân tử dùng kỹ thuật di truyền phân
lập và làm thuần một gen:
 + Tách và phân đoạn DNA nguồn;
 + Gắn các đoạn DNA bị cắt vào vector tách dòng;
 + Biến nạp và giữ DNA tái tổ hợp trong tế bào
chủ: ngân hàng;
 DNA (DNA library, DNA bank);
 + Phát hiện và làm thuần dòng mục tiêu;
 + Nuôi cấy dòng mục tiêu để ly trích và nghiên
cứu DNA tái tổ hợp.
 Các công cụ sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng:
• Enzymes - cắt, nối nucleic acid …;
• Vector- tạo dòng phân tử;
• Tế bào chủ để khuếch đại DNA;
• Công cụ để chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ;
• Công cụ để giữ DNA trong tế bào chủ;
• PCR (Polymerase chain reaction);
• Giải trình tự DNA (DNA sequencing);
• Điện di (Electrophoretic separation);
• Phát hiện gene: DNA-Southern blotting; lai tại chỗ
(in situ hybridization); kỹ thuật FISH; RNA- Northern
blotting; Protein -Western blotting; lai miễn dịch IHC
(immunohistochemistry)
• Tinh sạch • Sinh vật chuyển gene
III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector
3.1. ENZYME HẠN CHẾ (RE)
 Các RE cắt DNA ngoại lai ở các vị trí nhận biết đặc hiệu của
chúng gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược
nhau, có khả năng tạo ra các đoạn DNA có đầu tận cùng đầu bằng
hay đầu so le.
 Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi 6 nucleotide, enzyme HaeIII
nhận biết chuỗi 4 nucleotide:
EcoRI
đầu so le

HaeIII
đầu bằng
Các kiểu cắt của enzyme cắt hạn chế
Trình tự nhận biết của một số enzyme cắt hạn
chế (RE)
 Đầu dính và đầu bằng
Khi các enzyme cắt, chúng có thể tạo ra:
– Đầu dính: một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai
mạch. Trong trường hợp này các đầu dính có thể bắt
cặp trở lại;
– Đầu bằng: một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một
điểm, sau khi cắt hai đầu bằng không có khả năng tự
kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4
ligase.
Tên của enzyme RE xuất phát từ:
• Loại vi khuẩn mà enzyme được tìm thấy;
• Thứ tự mà restriction enzyme được xác định và phân lập;
EcoRI : Chủng R của vi khuẩn E.coli
I là restriction enzyme đầu tiên của E.coli được khám phá
 3.2. Polymerase
• DNA pol xúc tác sự tổng hợp DNA
theo chiều 5’→ 3’ như:
– DNA pol I (Klenow pol): polymerase 5’→ 3’ , exonuclease
3’→ 5’
– T4 DNA pol: giống Klenow pol nhưng exonuclease 3’→ 5’
mạnh hơn – Taq pol: phân lập từ Thermus aquaticus
– Pfu pol : phân lập từ Pyroccus furiosus
–Reverse transcriptase:do các Retrovirus sản sinh

– DNA terminal transferase: li trích từ tuyến ức bê

• RNA pol tham gia vào việc tổng hợp

RNA theo chiều 5’→ 3’, thông dụng nhất là:
–SP6 RNA polymerase: có nguồn từ phage xâm nhiễm
Salmonella typhimurium
–T3 và T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm
nhiễm E.coli
 3.3. Các ligase
• Đây là enzyme xúc tác
cho phản ứng nối giữa hai đoạn
DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA
ligase).
• Có các ligase sau:
– T4 DNA (RNA) ligase:
li trích từ phage T4 xâm nhiễm E.
coli
– T4 polynucleotide
kinase: li trích từ phage T4 xâm
nhiễm E. coli
–Alkaline phosphastase:
li trích từ E. coli hay từ ruột bê
 3.4. Các Nuclease
Đây là nhóm phân cắt DNA hay RNA gồm
các enzyme chính sau:

– DNAase I: có nguồn gốc từ tụy tạng bò;

– Nuclease S1: ly trích từ Aspergillus oryzae;
– Exonuclease III: tách chiết từ E. coli;
– RNAase A: hiện diện khắp mọi nơi;
– RNAase H: dùng trong tổng hợp cDNA.
3.5. Các vector được dùng để tạo
dòng các đoạn DNA
Yêu cầu tối thiểu đối
với vector chuyển gene

- Có trình tự khởi đầu sao

chép (ori) để tự sao chép mà
tồn tại độc lập;
- Trình tự nhận biết cho RE
tạo vết cắt để chèn gene lạ;
- Trình tự điều hòa
(promoter) tạo điều kiện thuận
lợi phiên mã gene lạ;
- Đảm bảo sự di truyền bền
vững của DNA tái tổ hợp;
- Có gene đánh dấu (marker)
để dễ dàng nhận biết các gene
lạ.
Sự khác nhau của các vector tạo dòng
• Loại tế bào mà chúng có thể vào;
• Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp
hay bằng cách xâm nhiễm của virus/phage);
• Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai mà chúng có
thể mang;
• Vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt
giới hạn;
• Sự ổn định của DNA khi được chèn vào;
• Những khía cạnh quan tâm
– Hiệu quả tạo dòng;
– Số lượng bản sao (trên một tế bào chủ);
– Khả năng tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z)
Các loại vector thường dùng
 Vector tạo dòng là phage

Vector tạo dòng là Cosmid

Vector tạo dòng là bacteriophage λ
 3.6. Hệ thống tế bào chủ (host)
Escherichia coli (E.coli)
 - Dễ nuôi cấy và nhân dòng;
 - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau;
 - Vi khuẩn Gram- hình que;
 - Bộ gene khoảng 4,6 x 106 cặp base.
Saccharomyces cerevisiae
 - Eukaryote đơn bào;
 - Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối;
 - Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh;
 - Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có
 đủ hoạt tính sinh học;
 - Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng;
 - Sinh vật an toàn.
 Hệ thống tế bào chủ (host)
- Hệ thống tế bào thực vật
- Hệ thống tế bào động vật
- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey
kidney);
- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney);
- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic
kidney;
- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary);
- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người;
- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.
 3.7. Gắn đoạn DNA vào vector

Tạo dòng các sản phẩm PCR bằng

Tạo dòng cDNA bằng cách phương thức tạo dòng dA:dT
bổ sung tuần tự các linker
nhân tạo
 3.8. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi
khuẩn/tế bào vật chủ
Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E. coli . Hai phương
pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli là:

 Điện biến nạp: Dùng xung điện làm thủng lỗ tạm thời
màng tế bào;
 Hóa biến nạp: Dùng CaCl2.

Hệ thống chuyển gen

bằng xung điện
 Điện biến nạp
-Là phương pháp hiệu quả nhất để biến nạp;
- Hai thông số quan trọng: Loại tế bào vi khuẩn và tần số
xung điện cần thiết.
Ưu điểm
- Hiệu suất biến nạp cao;
- Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ;
- Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản,
không sử dụng các kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian;
- Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn và DNA mạch
vòng là giống nhau;
- Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vòng rất cao.
Nhược điểm
Đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền
 Hóa biến nạp
 Là phương thức kinh điển để biến nạp plasmid
vào tế bào E. coli.
 Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để
trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ
tiếp nhận plasmid.
 Plasmid được đưa vào bằng cách shock nhiệt
nhanh (40-50 giây)
 Chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương
tính trên đĩa agar chứa môi trường LB với
kháng sinh thích hợp và bổ sung cơ chất β-
galactosidase (X-gal).
 Các khuẩn lạc trắng mang ADN ngoại lai
 Tạo dòng theo
phương thức khử
hoạt tính bằng chèn
đoạn

Ampr: gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa β-

galactosidase
 Tạo dòng định
hướng

Tetr: gen kháng tetracycline,

Tets: gen kháng tetracycline bị
khuyết đoạn và mất hoạt tính
 V. Biểu hiện gen được tạo dòng
Vector biểu hiện (expression vector)
Để biểu hiện gen ngoại lai:
+ Thu protein tái tổ hợp;
+ Nghiên cứu các yếu tố điều hòa thể hiện của gen;
- Gen ngoại lai được kiểm soát bằng promoter được
nhận diện bởi RNA polymerase của tế bào chủ:
+ Promoter mạnh;
+ Khung dịch mã đúng;
+ Promoter thường dùng: lac, trp (cơ chế tắt mở)
IV. Chọn dòng mang DNA tái tái tổ hợp
V. Biểu hiện gen được tạo dòng
 Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng
Kỹ thuật SDS-PAGE
Điện di trên polyacrylamide gel có mặt sodium dodecyl
sulphate (SDS-PAGE) cho phép phân chia các phân tử protein
có khối lượng khác nhau.

WM 1 2 3 4 5 6 7

Điện di SDS và nhuộm bằng Coomasie blue. WM: Chuẩn khối

lượng phân tử của protein. Các đường từ 1-7: Các mẫu protein
Kỹ thuật Western blot
Dựa trên cơ sở phản ứng lai kháng nguyên-kháng
thể.

Sơ đồ kỹ thuật
Western blot
Liên kết protein (kháng nguyên) với kháng
thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai
có đánh dấu enzyme trong Western blot
Tín hiệu lai giữa kháng nguyên và kháng thể ở Western
blot. WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường
1, 2 và 4: có tín hiệu lai. 3: không có tín hiệu lai
ELISA
 Nguyên lý tương tự
Western blot.
 Kỹ thuật này dùng
để định lượng protein
kháng nguyên.
Các phương pháp và
kỹ thuật cơ bản
Các phương pháp và kỹ thuật cơ bản
 Lai nucleic acid
Đặc tính biến tính và hồi tính có thể lai giữa
DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
Thu nhận gen
Lập ngân hàng cDNA
 Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối

(linkers)

c) Dùng enzyme terminal transferase

Phản ứng tạo chuỗi nucleotide
(Polymerase Chain Reaction, PCR)

1985, Kary Mullis

Nguyên tắc:
Thành phần tối ưu trong phản ứng PCR
Magnesium
 Nồng độ thích hợp của Mg2+: 0,5-2,5 mM.
Các deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)
 Nồng độ thích hợp: 20-200 µM.
Enzyme Taq polymerase
 Nồng độ enzyme Taq thích hợp: 1-2,5 unit/100 µl.
Đệm ổn định hoạt động của enzyme Taq
 Gelatin: 0,01% và Triston X-100: 0,1%.
Nồng độ các primer
 Nồng độ thích hợp: 2,5 pmol/primer.
Nồng độ DNA khuôn mẫu
 Nồng độ thường thích hợp: 10-100 ng/25 µl
Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn mẫu
 Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ khác nhau:
 Gây biến tính: 90-95oC
 Ủ để gắn primer: 40-65oC
 Tổng hợp: 70-72oC

Các chu kỳ của kỹ thuật khuếch đại PCR

 Có 3 kỹ thuật PCR được dùng phổ biến: PCR
chuẩn, PCR mỏ neo và PCR đảo ngược
Điện di các sản phẩm PCR.

SM: Maker DNA. Các đường từ 1-5: các sản

phẩm PCR khác nhau.
 RT-PCR
 Phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA
theo nguyên lý của PCR, bao gồm hai giai đoạn:
◆ Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã khuôn mẫu RNA
thành sợi DNA thứ nhất nhờ enzyme phiên mã
ngược, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để
tổng hợp sợi DNA thứ hai nhờ DNA polymerase
I (thường dùng là đoạn Klenow).
◆ Giai đoạn thứ hai: Dùng DNA sợi đôi làm khuôn
mẫu để thực hiện phản ứng PCR như đã trình
bày ở trên.
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PCR

1. Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp

 Sử dụng phương pháp PCR hai giai đoạn (two-step
PCR).
2. Tạo dòng cDNA
 Ứng dụng kỹ thuật PCR đảo ngược
3. Ứng dụng trong di truyền
 Lập bản đồ gen của sinh vật;
 Phân loại động-thực vật;
 Nghiên cứu đa dạng di truyền, định vị gen và lập bản
đồ gen.
4. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng
 Thu nhận thông tin về trình tự gen nhanh;
 Chẩn đoán bệnh nhiễm trùng.
Phân tích trình tự gen
Phân tích trình tự nucleotide bằng phương pháp
enzyme (Sanger)
3. Phân tích trình tự nucleotide trên máy đọc tự động

Máy phân tích trình tự nucleotide tự động và hình ảnh

điện di các băng DNA phát huỳnh quang quan sát được
trên computer
Minh họa trình tự nucleotide của một đoạn DNA
 Điện di gel

I. ĐiỆN DI AGAROSE GEL

 Điện di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để
phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.
 Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai
thành phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin
chiếm khoảng 30%.

Cấu trúc phân tử của agarose

1. Các thông số ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển
điện di
 Kích thước của phân tử DNA
 Nồng độ agarose
 Cấu hình của DNA
 Thành phần base và nhiệt độ.
 0,7% 1,0% 1,5%

1000 bp

1000 bp

1000 bp

Điện di DNA ở các nồng độ agarose khác nhau

2. Phương pháp điện di
 Đệm pH
Đệm Tris-acetate, Tris-borate, Tris-phosphate (50
mM và pH 7,5-7,8).
 Agarose gel
Agarose type II có nội thẩm thấu thấp.
 Nhuộm DNA trong agarose gel
Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr và quan sát
dưới UV.
 Một số phương pháp thu hồi DNA từ agarose
gel
Agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp, ly tâm, điện
di vào bẫy, hạt thủy tinh.
3. Quy trình điện di
Điện di DNA trên agarose gel chụp dưới ánh
sáng tử ngoại. SM: Chuẩn kích thước của
DNA (pUC18/HaeIII). Các đường từ 1-8: các
mẫu DNA khác nhau.
Thiết bị chụp ảnh DNA dưới ánh sáng
UV (Gel documentation)
II. ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL
 Được dùng để phân tách các đoạn DNA có chiều dài <1
kb.
 Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau
của polyacrylamide từ 3,5%-20% tùy thuộc vào kích
thước của phân tử protein hoặc đoạn DNA quan tâm.
 Có hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là:
 Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân
chia và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi.
 Polyacrylamide gel biến tính dùng để phân chia và
tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn.
Sơ đồ và hình ảnh của buồng
điện di SDS-PAGE
Các câu hỏi ôn tập
chương II
Câu 1: Em hãy trình bày hiểu biết của em về phản ứng PCR (polymerase chain
reaction PCR) và ứng dụng của phản ứng PCR trong Công nghệ sinh học?.
- Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) là kỹ thuật
cho phép khuếch đại một đoạn gen trong ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt. Dựa
vào các thành phần phản ứng cần thiết, đoạn gen mục tiêu sẽ được nhân bản ra
hàng triệu bản sao giống hệt nhau, từ đó phục vụ những mục đích nghiên cứu
tiếp theo.
- Đây được xem là một quá trình cơ bản cho việc phát triển của hàng loạt công
nghệ phân tích gen và hệ gen sau này.
Nguyên tắc của PCR
- Nguyên tắc của phương pháp PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù từ ADN
khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme Taq polymerase để tổng hợp sợi mới bổ
sung.
- Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR (tổng thể tích 20-50 µl) bao gồm:
+ Sợi khuôn ADN;
+ Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (mồi dài
khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau
theo nguyên tắc bổ sung nhau);
+ Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP;
+ Môi trường đệm cũng cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme
ARNase và ADNase;
+Enzyme chịu nhiệt Taq- Taq polymerase là một loại enzyme ADN polymerase
chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng
hợp các đoạn ADN mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP,
dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đọạn ADN
nhất định đã biết hoặc chưa biết trước trình tự;

-Các đoạn ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu
kỳ, số lượng đoạn ADN nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ
số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng.

-Primer ở bên trái tác động trên sợi ADN 3’-> 5’ được gọi là primer thuận
(forward primer - ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi ADN 5’ -> 3’
được gọi là primer ngược (reverse primer - ký hiệu là R);

- Từ chu kỳ thứ 2 Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn ADN có chiều dài xác
định. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo
các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di
- PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 µg ADN ban đầu có
thể khuếch đại kên tới trên 1 µg (khoảng 2 kb).
-Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn nhiệt độ khác nhau:
+ Gây biến tính (denaturation ở 90-95oC. Trong giai đoạn biến tính,
phân tử ADN khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single
strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại.
+ Gắn primer (annealing) ở 40-65oC. Trong giai đoạn này các primer
gắn vào các vị trí có tình tự tương đồng ở ADN khuôn mẫu. Các primer bị lắc
nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành
và bị đứt gẫy liên tục giữa primer sợi đơn và ADN khuôn mẫu sợi đơn, Các
liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp chính xác)
và trên các đoạn nhỏ ADN sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq
polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
+ Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC đây là khoảng nhiệt độ tối
thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp ADN bắt đầu từ các vị trí có
primer theo chiều 5’-> 3’. Các primer có một vài base gắn vào khuôn mẫu có
mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá vỡ các liên kết này sẽ không bị đứt gãy.
Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt độ cao)
khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được ADN. Enzyme Taq polymerase bổ
sung các dNTP từ đầu 5’ đến đầu 3’.
Ứng dụng của phản ứng PCR
- Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ y học, cổ sinh vật học đến pháp
y…
- Trong y học hiện đại, PCR đã trở thành công cụ quan trọng trong lĩnh vực
nghiên cứu ung thư như dùng PCR để phát hiện một số bênh do virus gây ra như
ung thư cổ tử cung, ung thư da, ung thư miệng…;
- Sử dụng trong việc phân loại mô để xem xét khả năng tương hợp giữa mô người
hiến tạng và người được hiến tạng;
-Xét nghiệm quan hệ di truyền;
-Xác định sớm các bệnh truyền nhiễm cũng như theo dõi sự lây lan của các bệnh
truyền nhiễm ở người và động vật…;
- PCR dùng trong lĩnh vực cổ sinh vật học giúp xác định và tìm hiểu về các sinh
vật đã tuyệt chủng cùng các quá trình hóa thạch và tiến hóa;
-Kỹ thuật PCR được sử dụng trong một số khía cạnh vi sinh vật môi trường: giúp phát
hiện, xác định vi khuẩn và nấm bệnh có hại trong nguồn nước công cộng, phát hiện vi sinh
vật thoái hóa, nơi chất thải độc hại và sự cố ô nhiễm đã xảy ra.
Tại Việt Nam:
-Phát hiện bệnh di truyền, nhận dạng vân tay ADN, và xác định huyết thống,
-Trong nông nghiệp: chọn dòng cá thể lai nhờ chỉ thị phân tử, xác định bệnh và kiểm định
giống…
 Tài liệu tham khảo
Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà
xuất bản Đại học Huế
 Tài liệu trang web/ gogoole
 CHƢƠNG 3
CÔNG NGHỆ LÊN MEN
VI SINH VẬT
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 Nội dung
I
• Mở đầu

II
• Sinh trưởng của vi sinh vật

III
• Sinh khối vi sinh vật và công nghệ lên men

IV
• Các sản phẩm lên men vi sinh vật

V
• Công nghệ tái tổ hợp vi sinh vật
MỘT SỐ DỤNG CỤ TỐI
CẦN THIẾT CHO NUÔI
VI SINH VẬT VÀ VI TẢO
Dụng cụ cần thiết cho nuôi cấy vi sinh vật –
vi tảo/rong biển

Các hệ thống kính hiển vi

khác nhau
Tạo ra pipette pasteur
 Các kiểu cấy
trải trên bề
mặt thạch của
đĩa petry

Tra mẫu vào lam kính

lõm để soi mẫu

Pha loãng mẫu và bổ sung mẫu

vào các giếng của phiến nuôi
Thanh trùng
Các thao tác kỹ thuật thường thực hiện trong nuôi cấy vi sinh vật được
thực hiện trong bỗ cấy vô trùng
 I. Mở đầu
Các cơ thể vi sinh
vật có khả năng
sinh trƣởng trên
nhiều loại cơ chất
(môi trƣờng dinh
dƣỡng) khác nhau
và có thể sản xuất
Các Bioreactor/fermentor nhiều sản phẩm
thƣơng mại
 Áp dụng các kỹ thuật di truyền in vitro  giúp tăng
sản lƣợng của sản phẩm
 Theo các nhà vi sinh vật học: thuật ngữ lên men có
nghĩa là quá trình sản xuất một sản phẩm bằng nuôi
cấy sinh khối vi sinh vật.
 1. Sinh trưởng của vi sinh vật và tảo
Sinh trưởng của VSV và vi tảo được nuôi trồng trong điều kiện
vô trùng đặc trưng bằng đường cong sinh trưởng có 5 pha (Hình 1.).
- Trong đó phần ký hiệu là 1 - được gọi là pha tiềm hay pha thích
nghi.
- Pha sinh trưởng theo hàm số mũ được ký hiệu là 2. Trong pha
thứ hai, mật độ tế bào tăng theo hàm số của thời gian t, đặc trưng
bằng hàm logarit: Xt=X0.emt
Với Xt và X0 là mật độ tế bào tại thời điểm t và ban đầu (O), tương
ứng, và m là tốc độ sinh trưởng đặc trưng.

Hình 1. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật và vi tảo

 Tốc độ sinh trưởng đặc trưng của từng loài tảo sẽ phụ thuộc
chủ yếu vào đặc điểm di truyền của loài vi sinh vật hay vi tảo đó
cũng như điều kiện môi trường nuôi ...

- Pha giảm tốc độ sinh trưởng được ký hiệu là 3. Ở pha này, sự

phân chia tế bào sẽ chậm lại khi các chất dinh dưỡng, độ pH,
cường độ ánh sáng, hàm lượng CO2 (đối với vi tảo) hoặc các yếu tố
lý hóa khác bắt đầu trở thành yếu tố giới hạn đối với sự sinh
trưởng của VSV và vi tảo.
- Pha ổn định được ký hiệu là 4. Ở pha thứ tư này các yếu tố
giới hạn nêu trên và tốc độ sinh trưởng của VSV và vi tảo được cân
bằng và làm cho mật độ tế bào nhìn chung là tương đối ổn định,
không thay đổi.
- Pha tàn lụi được ký hiệu là 5. Trong pha cuối cùng này, chất
lượng nước xấu đi và các chất dinh dưỡng suy kiệt tới mức không
thể duy trì được sự sinh trưởng của vi sinh vật và vi tảo. Khi đó,
mật độ tế bào giảm mạnh và vi sinh vật hay vi tảo chết.
II. Sinh trưởng của vi sinh vật

Đường cong
sinh trưởng đặc
trưng của các
cơ thể đơn bào
trong nuôi cấy
mẻ
Sự cân bằng giữa sinh trƣởng của tế bào (growth) và sự
hao hụt của chúng từ hệ thống này có thể đƣợc mô tả
nhƣ sau:
Mối quan hệ giữa μ (tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng) và s
(nồng độ cơ chất giới hạn trong chemostat):

Sự khác nhau giữa trạng thái ổn định của chemostat và

trạng thái gần nhƣ ổn định của fed-batch ở chỗ trong
chemostat thì D (hay μ) là hằng số còn ở fed-batch thì D
(hay μ) lại giảm theo thời gian
Nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất (được gọi là fed-batch culture) được xem là hệ
thống trung gian giữa các quá trình nuôi cấy theo mẻ và nuôi cấy liên tục (continuous).
Nếu sinh trưởng của một cơ thể bị giới hạn bởi nồng độ cơ chất trong môi trường nuôi
thì sinh khối ở pha tĩnh (x max) sẽ được mô tả bởi phương trình:

X max = Y x SR Trong đó, Y: yếu tố hiệu suất, bằng khối lượng tế bào được SX trên
một gram cơ chất được sử dụng; SR là nồng độ ban đầu của cơ chất giới hạn sự sinh
trưởng.

Nếu MT mới được bổ sung vào bình nuôi ở tốc độ pha loãng kém hơn µ max thì hầu như
các cơ chất được sử dụng hầu hết. Khi đó:

FSR = µ x (X/Y) Trong đó, F: tốc độ dòng chảy và X: sinh khối tổng số trong bình nuôi
Ví dụ: nồng độ tế bào được nhân lên bởi thể tích nuôi cấy.

Cho dù sinh khối tổng số X trong bình nuôi tăng lên theo thời gian nhưng nồng độ tế
bào (x) lại hầu như không đổi; Vì vậy dx/dt = 0 và µ = D  khi đó hệ thống ở trạng
thái ổn định (quasi – steady – state).
Khi thời gian và thể tích nuôi cấy tăng lên thì tốc độ pha loãng lại giảm. Như vậy, giá trị
của D được tính như sau:
D= F/ (Vo + Ft) Trong đó, F: tốc độ dòng chảy; V0: thể tích nuôi cấy ban đầu; t: thời
gian
Động học Monod dự báo khi D hạ xuống thì nồng độ cơ chất còn thừa sẽ giảm và kết
quả là làm tăng sinh khối.
Tuy nhiên, trên phạm vi các tốc độ sinh trưởng hoạt động thì sự tăng sinh khối
sẽ không có ý nghĩa.

Sự khác nhau giữa trạng thái ổn định của chemostat và trạng thái gần như ổn
định của fed-batch ở chỗ trong chemostat thì D (kể từ đây là μ) là hằng số còn ở
fed-batch thì D (kể từ đây là μ) lại giảm theo thời gian.

Tốc độ pha loãng trong fed-batch có thể được giữ không đổi bằng cách tăng
(theo hàm mũ) tốc độ dòng chảy nhờ sử dụng một hệ thống điều chỉnh thông
qua computer.
 III.Sinh khối vi sinh vật và công
nghệ lên men:
Sx các tế bào vi sinh vật nhƣ là sản phẩm
Sự
lên
men Sản xuất các chất trao đổi của vi sinh vật
vi
sinh Sản xuất các enzyme vi sinh vật
vật

Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp

 1.Sinh khối vi sinh vật:
Khái niệm:
Công nghệ thu sinh khối vi sinh vật là các quá trình nuôi
cấy các chủng thuần khiết hoặc hỗn hợp vài chủng để thu
đƣợc khối lƣợng tế bào sau khi sinh trƣởng
Mục đích:
 Sinh khối giàu protein
 Sinh khối nấm men
 Sinh khối cố định đạm
 Sinh khối vi khuẩn sinh độc tố
 Sinh khối vi sinh vật có hệ enzyme phân giải các
chất hữu cơ
Sinh khối giàu protein:

(ProTyton-1 thành phần

thức ăn protein đơn bào)

Sinh khối nấm men:

 Sinh khối cố định đạm:

 Sinh khối vi
khuẩn sinh độc tố:
 Sinh vật có hệ Emzyme phân giải
 2. Quá trình lên men

Sơ đồ chung của một quá trình lên men

Cấu hình cơ bản của một hệ lên men mẻ
 Công nghệ nuôi trồng vi sinh vật/vi tảo
Sơ đồ tổng quát của
lên men theo mẻ, lên
men fed-batch, lên
men liên tục và động
học tăng trưởng của
các quá trình lên men
tương ứng (Lowrey,
2016).

Lên men theo Lên men fed Lên men liên Nuôi cấy Perfusion
mẻ batch tục
Ưu điểm Đơn giản, dễ Không giới hạn Cơ chất và Ngăn chặn sự giới hạn
làm, chi phí thấp về cơ chất, sinh sinh trưởng tế về cơ chất và sự ức
trưởng tế bào bào được duy chế trao đổi chất độc
theo cấp số trì ổn định. hại sinh ra trong quá
nhân trình nuôi
Nhược Giới hạn về cơ Phức tạp hơn Phức tạp hơn Phức tạp hơn
điểm chất 24
 Nuôi cấy mẻ.
Hiệu suất của nuôi cấy mẻ:
𝑥 𝑚𝑎𝑥−𝑥0
Rbatch=
𝑡𝑖 +𝑡𝑖𝑖
Trong đó, Rbatch là sản lượng nuôi cấy trong giới hạn nồng độ sinh
khối/giờ; Xmax: là nồng độ tế bào đạt cực đại ở pha tĩnh; xo là nồng độ tế
bào ban đầu ở lúc gây nhiễm; ti là thời gian cở thể sinh trưởng ở µmax và
Vi sinh vật tii: thời gian cơ thể ko sinh trưởng ở µmax (gồm pha lag, pha giảm tốc độ
và các chu kỳ từng mẻ, khử trùng, thu hoạch

Nuôi cấy liên tục: Hiệu suất của nuôi cấy liên
tục: Rcont= Dx (1- tiii/T)

Trong đó: Rcont là sản lượng của nuôi cấy trong giới hạn nồng độ tế bào/giờ, tiii là thời gian
trước khi thiết lập trạng thái ổn định bao gồm thời gian chuẩn bị bình nuôi, khử trùng và
hoạt động trong nuôi cấy mẻ trước khi hoạt động liên tục. T là thời gian mà các điều kiện
trạng thái ổn định chiếm ưu thế, và x là nồng độ tế bào ở trạng thái ổn định.
Sản lượng cực đại của sinh khối trên một đơn vị thời gian (ví dụ hiệu suất)
trong một chemostat có thể đạt tới bằng cách hoạt động ở tốc độ pha loãng
cao nhất của Dx , giá trị này được xem như là Dmax.

Hiệu suất lên men mẻ, như đã mô tả trong phương trình (5), là một giá trị
trung bình cho thời gian tổng số của sự lên men. Do dx/dt = μx, nên hiệu suất
của nuôi cấy tăng lên theo thời gian, và như vậy, phần lớn sinh khối trong
quá trình nuôi cấy mẻ được sản xuất ở gần phần kết thúc của pha log. Trong
chemostat trạng thái ổn định, hoạt động ở (hoặc gần) Dmax cho hiệu suất
duy trì không đổi, và đạt cực đại cho sự lên men toàn phần.

Cũng như vậy, một quá trình liên tục có thể được hoạt động một thời gian
rất lâu sao cho thời kỳ không sản xuất, tiii trong phương trình (6), có thể
không có ý nghĩa. Tuy nhiên, yếu tố thời gian không sản xuất cho nuôi cấy
mẻ là rất có ý nghĩa, đặc biệt khi hệ lên men được thiết lập lại nhiều lần
trong suốt thời gian vận hành, và vì thế tii sẽ tái diễn nhiều lần.

- Ưu và nhược điểm của nuôi cấy liên tục; theo mẻ; theo mẻ có bổ sung cơ
chất….dễ nhiễm; cho phép SX vừa sinh khối vừa chất chuyển hóa; SKK;
squalene, carotenoid/astxanthin…
 Hình 4. Phương pháp nuôi Vi
sinh vât và vi tảo theo kiểu
“Perfusion”
(Nguồn: Park và cs., 2014)

Sử dụng với các loại cơ thể vi sinh vật và vi tảo có khả năng sinh các chất chuyển
hóa trong quá trình nuôi nhưng lại gây ức chế sinh trưởng của chính cơ thể đó.
IV. Các sản phẩm lên men vi sinh vật

Lên men rƣợu

Sản xuất
enzyme
Sản xuất kháng
sinh
Sản xuất acid
hữu cơ
 Lên men rượu
 Rƣợu đã đƣợc con ngƣời sản xuất và sử dụng
rất lâu, vào khoảng 6.000 năm trƣớc công
nguyên
 Có 3 loại chủ yếu sau: Rƣợu trắng (ethanol),
rƣợu vang (wine) và rƣợu mùi (liquor).

Nhà máy sản xuất

ethanol quy mô nhỏ
 Rƣợu trắng
 2 phƣơng pháp: lên men vi sinh vật và hóa học
 Lên men vi sinh vật: chủ yếu, là quá trình lên men rƣợu
của nấm men (Saccharomyces cerevisiae - chính) và
một số vi sinh vật khác trong điều kiện yếm khí. Phƣơng
trình tổng quát:

 Các bƣớc:
- Chế biến nguyên liệu thành dịch đƣờng
- Lên men biến đƣờng thành rƣợu: đƣờng đạt 90- 120 g/L
và pH = 4,5-4,8. Thời gian lên men từ 65-72 giờ
- Chƣng cất
- Tinh chế ethanol
 Phương pháp hóa học
 Rượu vang
Lịch sử và công nghệ sản xuất rượu vang
• Rượu vang là một loại đồ uống lên men ethylic sản
xuất từ quả nho, có hƣơng
vị đặc trƣng, độ cồn nhẹ. Rƣợu vang đỏ
thƣờng đƣợc lên men từ nƣớc ép và vỏ quả
nho, còn rƣợu vang trắng đƣợc lên men chỉ từ
nƣớc nho.
• Rƣợu vang chứa: nƣớc (85-90%), ethanol (10-14%),
acid (<1%) và chất tạo hƣơng (nồng độ rất thấp)
 Rƣợu vang: khó hỏng, có khả năng diệt các vi sinh
vật gây bệnh
 Yếu tố ảnh hƣởng chất lƣợng rƣợu vang: loại quả,
nơi trồng trọt và phƣơng pháp sản xuất
Các giai đoạn sản xuất rƣợu vang (3)

Giai đoạn
II. Giai đoạn
I. Giai đoạn hình phát triển rượu III. Giai đoạn
thành rượu: vang chín
- Thu “rượu non”
- Thời gian: tính và tiếp tục lên - Rượu non đã
từ lúc cấy giống men để phân hủy
đến khi dịch lên lượng đường còn đủ thành phần
men hết sủi bọt nhưng vẫn còn
mạnh lại “sống”  hạ
- Là giai đoạn nấm - Mùi vị: Rượu thổ ở nơi mát
men hoạt động chuyển từ mùi để đạt chất
mạnh nhất chua gắt sang
chua nhẹ dễ chịu lượng tốt
Sơ đồ công nghệ lên men rượu vang
• Phân loại theo màu
- Rƣợu vang trắng (White wine): Chablis, Chardonnay, Pinot
Blanc, Rhine wine, Riesling.
- Rƣợu vang hồng (Rose wine): Rose, Vonorosso.
- Rƣợu vang đỏ (Red wine): Barbera, Cabernet Sauvignon,
Claret, Carnelian, Gamay, George.

White wine Rose wine Red wine

Phân loại rượu vang: dựa vào chủng loại nho,
nguồn gốc địa lý, màu sắc, nhà sản xuất hoặc công
nghệ sản xuất
• 3 loại
- Vang bàn ăn (table wine): vang vàng, đỏ, hồng
- Vang có ga (sparking wine): làm từ vang bàn ăn nhưng được bổ
sung thêm đường và nấm mem để lên men lần hai nhằm tạo ga.
- Vang bổ sung (Fortified wine): là loại cho thêm cồn từ bên
ngoài. Hai loại chủ yếu là port và sherry.

Fortified wine Semi-dry wine

 Ngoài ra, còn có các tiêu chí khác để phân loại
rượu vang như:
• Phân loại theo lượng CO2
- Rượu vang không có gas (table wine).
- Rượu vang có gas (sparkling wine): 2 loại
+ Rượu vang có gas tự nhiên: Champagne.
+ Rượu vang có gas nhân tạo: Carbonated wine

Table wine Champagne - sparkling wine

• Phân loại theo nơi sản xuất
- Phân loại theo quốc gia:
+ Rượu vang Pháp
+ Rượu vang Úc
+ Rượu vang Tây Ban Nha. . .

- Phân loại theo vùng: Rượu vang Pháp

+ Bordeaux
+ Burgandy
+ California
+ Chablis. . .

Bordeaux
Chablis
 Vi sinh trong sản xuất rƣợu vang
 Chia làm 2 dạng: nội sinh (từ quả nho, bề mặt thiết bị) và dạng
đƣa vào (chủng giống khởi động)
 Cả nấm men và vi khuẩn đều đóng vai trò tích cực và tiêu cực
trong sản xuất.
 Những VSV chính trong/trên bề mặt quả nho gồm:
- Nấm men: chủ yếu là Kloeckera/ Hanseniaspora. Một số ít
Candida, Metchnikowia, Cryptococcus, Pichia, Kluyveromyces
và lƣợng rất nhỏ Saccharomyces cerevisiae
- Vi khuẩn lactic: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus
- Vi khuẩn sinh acid acetic: Gluconobacter, Acetobacter
- Nấm mốc: Botrytis, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus,
Alternaria, Ucinula và Cladosporium
 Mật độ VSV trên quả nho: 103-105 cfu/g.
 Bảng 4.3. Biến đổi của nấm men trong quá trình
lên men rƣợu vang theo công nghệ truyền thống
 Vai trò của nấm men trong sản xuất rƣợu vang
Giống nấm men Saccharomyces
cerevisiae có nhiều ƣu điểm:
-Lên men nhanh và sâu các loại đƣờng
(glucose + Fructose) theo con đƣờng
Embden –Meyerhof –Parnas thành
pyruvate.
-Kết lắng tốt, do đó dễ tách sinh khối nấm
men ra khỏi dịch lên men.
-Tạo mùi thơm đặc trƣng cho rƣợu vang.
-Bền vững với rƣợu, acid và các chất sát Saccharomyces
trùng cerevisiae
Do đó các nhà máy sản xuất rƣợu vang
hiện nay thƣờng chọn giống nấm men
S.cerevisiae để lên men dịch nho
 2. Sản xuất enzyme
 Ứng dụng thƣơng mại enzyme vi sinh vật là
trong công nghiệp thực phẩm và sản xuất bia.
 Hấu hết enzyme đƣợc tổng hợp trong pha log
của nuôi cấy mẻ.
 Các enzyme sản xuất từ động-thực vật và vi sinh
vật.
2.1 Các loại enzyme vi sinh vật
Protease Amylase Amylase
nấm mốc vi khuẩn

Pectinase Enzyme
vi sinh vật Cytolase

Enzyme oxy hóa

Invertase glucosooxydase-
catalase
 Amylase nấm mốc

α-
α-amylase
glucosidase

Amylase
nấm mốc

Glucoamylase Dextrinase
 Amylase vi khuẩn
 - Cókhả năng phân hủy tinh bột mạnh và
tạo thành những α-dextrin.

α-Amylase
Protease
- Là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptide
trong phân tử Protein hoặc polypeptide.
- Đƣợc dùng để nâng cao giá trị dinh dƣỡng của
thịt, cá.

Cấu trúc không gian của enzyme protease

Pectinase

Pectinesterase Polygalacturonase
Cytolase
 Là hệ enzyme có hoạt tính cao có thể phân hủy
hemicellulose, pentozan, lignin...
 Cytolase gồm: cellulase
hemicellulase, pentosinase

Cellulase
 Invertase
• Là enzyme nội bào
và chỉ thoát ra khỏi
môi trƣờng khi tế
bào bị phân hủy.
• Đƣợc dùng rộng rải
trong sản xuất bánh
kẹo, kem…

Invertase
Enzyme oxy hóa glucosooxydase-catalase
 Là enzyme oxy hóa khử tác dụng β-D-
glucose khi có oxygen.
 Có thể loại bỏ oxygen không khí khỏi môi
trƣờng.
 Cho phép kéo dài thời gian bảo quản thực
phẩm.
 2.2. Sinh học tổng hợp enzyme cảm ứng
 Enzyme tạo thành trong tế bào vi sinh vật phụ
thuộc vào hoạt tính riêng và điều kiện nuôi cấy.
 Nó chỉ xảy ra trong nuôi cấy vi sinh vật.

Có gen tƣơng ứng trong nhiễm sắc thể tế bào

Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng

Điều kiện enyme

Năng lƣợng cần thiết dùng cho việc tổng hợp

Chất cảm ứng

2.3. Những phương pháp nuôi cấy vi
sinh vật để sản xuất enzyme

Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt

2
phƣơng
pháp
Phƣơng pháp nuôi cấy chìm
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt

Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng

phương pháp bề mặt
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt
- Thời gian nuôi cấy nấm mốc 36-60 giờ.
- Có 3 giai đoạn chính:
+ Khoảng 10-14 h đầu: Bào tử nảy mầm
+Khoảng 14-18 h giữa: Mốc phát triển nhanh
+Khoảng 10-20 h cuối: quá trình trao đổi chất tiếp tục xảy ra
nhƣng yếu

Lên men trên môi

trường rắn.
A: lên men kỵ khí
trong nồi bằng đất
nung
B: lên men hiếu khí.
 Phương pháp nuôi cấy chìm
 Phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong các bình lên
men có cánh khuấy và sục khí liên tục.

Dây chuyền nuôi cấy vi sinh vật băng phƣơng

pháp nuôi cấy chìm
- Đƣợc thực hiện trong các bình lên men có cánh
khuấy và sục khí.
- Chọn thành phần môi trƣờng, tỷ lệ chất dinh dƣỡng
thích hợp.
- Nguồn carbon thƣờng là tinh bột.

Lên men trong môi trƣờng lỏng ở quy mô

phòng thí nghiệm 5L
Lên men bằng phương pháp nuôi cấy chìm trong môi
trường lỏng ở quy mô pilot (200 L)
 2.4 Tách và tinh sạch chế phẩm
enzyme
2.4.1. Chế phẩm enzyme từ môi trƣờng nuôi cấy bề
mặt
 Dịch chiết có màu nâu sẫm.
 Đƣợc cô đặc trong chân không.
 Có 2 phƣơng pháp:
+ Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ.
+ Dùng muối trung tính để kết tủa
2.4.2. Chế phẩm enzyme từ dịch nuôi cấy chìm
 Có 2 phƣơng pháp tách enzyme:
+ Cô chân không.
+ Hấp phụ.
 Còn một số phƣơng pháp: lọc gel, điện di, siêu ly tâm…..
 3. Sản xuất kháng sinh
 3.1. Penicillin
 Penicillin là kháng sinh đƣợc tìm ra đầu tiên và đƣợc
sản xuất sớm nhất dùng để chữa một số bệnh nhiễm
khuẩn vào những năm đầu của Thến chiến thứ 2.
 Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm
mốc Penicillum và Aspergillus
 Quá trình lên men penicillin thuộc vào loại lên men hai
pha: pha sinh trƣởng và pha sinh penicillin
 Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm Pen.
chrysogenum có thể là glucose, saccharose, lactose,
tinh bột, dextrin, các acid hữu cơ
 Trong pha thứ nhất: sử dụng glucose + lactic acid của
cao ngô. Pha 2: sử dụng lactose để tạo penicillin.
Phương pháp sản xuất penicillin
 Quy trình công nghiệp sản xuất penicillin dựa trên
nấm mốc Pen. chrysogenum có khả năng sinh
penicillin cao
 Trong quá trình nuôi cấy, giống vi sinh vật phát triển
sẽ tích tụ các sản phẩm trao đổi chất trong môi
trƣờng hoặc trong sinh khối.
 2 phƣơng pháp:
- Lên men bề mặt
- Lên men chìm
Ảnh minh họa
khuẩn lạc và
các sản phẩm
của penicillin
https://www.nlm.nih.gov/exhibition/fromdnatobeer/exhibition-
interactive/illustrations/penicillin-alternative.html
 Sản xuất penicillin bằng phương
pháp lên men bề mặt
 Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong thời gian đầu của công
nghiệp kháng sinh.
 Môi trƣờng nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất rắn hoặc
lỏng.
- (1) Cơ chất rắn có thể là cám hoặc các loại hạt. Tiến hành:
+ Cám đƣợc làm ƣớt rồi trải lên khay, dày khoảng 2 cm
+ Giống nấm mốc trộn vào môi trƣờng (đã vô trùng, làm nguội
300C) có độ ẩm 50-60%.
+ Thời gian lên men 6-7 ngày ở 24-28oC trong các buồng nuôi
cấy
- (2) Môi trƣờng lỏng dùng nguồn carbon là lactose, cao ngô và
một số nguyên tố khoáng. Giống đƣợc cấy vào môi trƣờng rồi
lên men ở 24oC khoảng 6-7 ngày đạt hiệu suất khoảng 193
unit/mL penicillin.
 Sản xuất penicillin bằng phương pháp lên men
chìm
 Thành phần môi trường : cao ngô, glucose, lactose và các muối
khoáng.
 Giống: Bào tử đƣợc nuôi trên các bình nhân giống có cánh khuấy và
sục khí 36-50 m3/giờ để hệ sợi nấm phát triển, sau đó chuyển vào các
bình lên men.
 Điều kiện nuôi: Quá trình lên men penicillin bằng nấm mốc Pen.
chrysogenum ở 26±1oC, 120-125 giờ. Gồm 2 pha:
- Pha 1: nấm phát triển hệ sợi mạnh, sinh khối tăng nhanh, các nguồn
carbon dễ đồng hóa (glucose, saccharose) cùng các nguồn nitrogen
đƣợc tiêu hao nhanh, cƣờng độ hô hấp tăng dần đến cực đại, pH tăng
và penicillin đƣợc tạo thành ít.
- Pha 2: hệ sợi nấm phát triển chậm, lactose đƣợc tiêu hao dần, pH tăng
đến khoảng 7-7,5 và tạo thành penicillin (chủ yếu)
 Nếu nguồn carbon trong môi trƣờng cạn, pH>8  lƣợng penicillin
đƣợc tạo thành giảm
 Nấm mốc sinh penicillin rất hiếu khí quá trình nuôi cấy cần khuấy
sục. Nếu không đủ oxygen hiệu suất penicillin có thể giảm tới hai lần.
 3.2. Streptomycin
 Streptomycin là một kháng sinh dùng phổ biến trong y học, thú y và
bảo vệ thực vật
 Schatz và cs (1944) đã phát hiện ra streptomycin từ dịch nuôi cấy
một chủng xạ khuẩn Streptomyces griseus
 Giống xạ khuẩn sinh streptomycin khi nuôi cấy chìm phát triển
thành hai pha:
- Pha thứ nhất (pha sinh trưởng mạnh). Các bào tử nảy chồi và
mọc thành sợi sau 6-8 giờ, mỗi bào tử mọc một chồi, khuẩn ty
thƣờng thẳng và phân nhánh rất yếu, tế bào chất ƣa kiềm.
- Pha thứ hai (khuẩn ty không phát triển). Cuối ngày thứ ba sợi xạ
khuẩn bị chia nhỏ và bắt đầu tự phân.
 Những giống sinh streptomycin rất không ổn định  cần can thiệp
của kỹ thuật di truyền
 Hoạt lực của giống: giữ đƣợc 96-99% (5 năm ở điều kiện đông
khô; 3 năm ở cát thạch anh; 1 năm ở môi trƣờng nƣớc đậu ở 50C)
 Nguồn C: glucose, tinh bột, dextrin, maltose, fructose, galactose,
manose
Phương pháp sản xuất streptomycin
 Phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Gồm 2 công đoạn
- Nhân giống: Giống xạ khuẩn đƣợc bảo quản ở
dạng bào tử. Nuôi lắc bào tử trong bình tam giác
ở 26-28oC, 30-70 giờ ,180-220 vòng/phút. Sau
đó cho tiếp vào các bình nhân giống (có sục khí
và khuấy), 20 – 40 giờ  nhằm tạo ra một khối
lƣợng lớn khuẩn ty xạ khuẩn ƣa kiềm
- Lên men. Lên men streptomycin là quá trình lên
men hai pha điển hình ở nhiệt độ 26-28oC, thời
gian 96 giờ, có thông khí (1v khí/1v môi trƣờng)
và khuấy trộn môi trƣờng. Nếu dừng khuấy sẽ
làm giảm hiệu suất streptomycin.
 3.3. Tetracycline
 Tetracycline là một dãy các chất kháng sinh có cùng
một nhân chung tetracycline va một số nhóm chung
(nhóm amide CONH2…), dùng rộng rãi trong y học và
thú y.
 Sản xuất bằng lên men xạ khuẩn Streptomyces
aureofaciens
 Nguồn carbon: glucose
 Quá trình lên men: 2 pha:
- Pha 1: Chất dinh dƣỡng tiêu hao nhanh ( 24-48 giờ
nuôi cấy  khối khuẩn ty đã đƣợc 70-80%, sử dụng
60-80% các chất dinh dƣỡng)
- Pha 2: Giống phát triển chậm lại, phát triển khuẩn ty
chậm lại. Kháng sinh tích tụ tối đa ở 110-120 giờ.
Phương pháp sản xuất tetracycline
 Phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Gồm 2 công đoạn
nhân giống và lên men.
 Giống Strep. Aureofaciens: dùng trong lên men
tetracycline và chlotetracycline hoặc các
halogentetracycline khác. Bào tử đƣợc nuôi lắc
bào tử trong bình tam giác ở 26-28oC, pH 6,8 -7,
24-40 giờ, 220-250 vòng/phút. Sau đó cho tiếp
vào các bình nhân giống (có sục khí và khuấy)
 Giống Strep. rimosus đƣợc nhân giống ở bình
tam giác lắc 220-250 vòng/phút ở 27-28oC/48-72
giờ, sau đó nhân tiếp tục trong nồi có sục khí và
khuấy rồi chuyển sang môi trƣờng lên men có
điều kiện tƣơng tự nhƣng kéo dài từ 5-7 ngày
 4. Sản xuất acid hữu cơ:
4.1. Acetic acid
Acid acetic có thể thu đƣợc bằng phƣơng pháp lên men vi
khuẩn acetic. Acid này đƣợc dung trong chế biến thực phẩm,
ƣớp chua rau quả.
Quá trình lên men acetic acid
 Vi khuẩn acetic: ƣa ấm và rất hiếu khí, có tốc
độ sinh trƣởng rất nhanh (từ một tế bào  12
triệu tế bào sau 12 giờ). Trong quá trình sinh
trƣởng và phát triển chúng tạo thành acetic acid
và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trƣởng
của chúng.
 Số lƣợng: 20 loài. Các loài vi khuẩn acetic có
giá trị nhƣ: Acetobacter aceti, Ace. pasteurianum,
Ace. orleaneuse, Ace. xylium, Ace. schiitzenbachii,
Ace. curvum, Ace. Suboxydans
 Nguồn cơ chất: ethanol (chủ yếu) + ít đƣờng +
nguồn nitrogen vô cơ hoặc hữu cơ + một số chất
khoáng khác
Có 3 phƣơng pháp lên men acetic:

Phương pháp chậm:

( Ace. Orleaneuse)

Phƣơng pháp nhanh:

(Ace. Curvum)

Phương pháp lên men chìm:

( Ace. Suboxydans)
 4.2. Citric acid

 Là loại acid có nhiều trong thiên nhiên, các loài

cây ăn quả có múi (cam, chanh…)
 Cơ chế sinh tổng hợp citric acid ở vi sinh vật có
thể biểu diễn bằng phƣơng trình tổng quát nhƣ
sau: 2𝐶6 𝐻12 𝑂6 +3𝑂2 2𝐶6 𝐻8 𝑂7 + 4𝐻2 𝑂

Giống: Các nấm mốc sinh citric acid hiếu khí, nhiệt
độ thích hợp cho phát triển và lên men là 30-32oC
Nguồn carbon: saccharose (với Asper. Niger),
maltose (với Citromyces)
Nguồn N: nitrate. Chú ý các nguyên tố khoáng P,
Mg, K, Fe và Zn.
Có 2 phƣơng pháp lên men citric:

Phương pháp lên men bề mặt trên môi

trường lỏng

Phƣơng pháp lên men chìm

V. Công nghệ tái tổ hợp vi sinh vật
Nguyên lý cơ bản của công nghệ này là
thao tác có định hƣớng và có chủ ý ( đƣa vào
hoặc loại bỏ) DNA và các loại nguyên liệu di
truyền khác nhằm làm thay đổi đặc tính di truyền
của cơ thể sinh vật.
1. Các vi sinh vật tái tổ hợp:

-Vi khuẩn Pseudomonas

syringae
Vi khuẩn này chứa một
gen tạo băng, gen này
kích thích sự tạo
băng trên các bề mặt lạnh
và ẩm

Sự biến đổi gen của VK

này giúp hạn chế sự tạo
thành băng (Frostban)
trong quá trình bảo quan
lạnh dâu tây và khoai tây
Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas fluorescens đã
đƣợc tái tổ hợp với các gen
sản sinh chất diệt côn trùng
sinh học Bac. thuringiensis.
Các vi khuẩn này đƣợc thả
vào đất, chúng sẽ bám vào rễ
và giúp tiêu diệt các côn trùng
đang tấn công.
2. Các ứng dụng trong công nghệ vi sinh
- Insulin - thay thế hormone dùng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng
type I.
- Hormone sinh trƣởng của ngƣời - điều trị những trẻ em bị bệnh
lùn hoặc bệnh già trƣớc tuổi.
- Interferone - điều trị một số loại ung thƣ, viêm gan mạn tính.
- Interleukin-2, một chất hoạt hóa tế bào T và B - điều trị ung thƣ.
- Erythropoietin (EPO), một chất kích thích các tế bào tủy sống
sinh hồng cầu - điều trị một số bệnh thiếu máu.
- Hoạt tố plasminogen của mô (tPA), một enzyme tham gia vào
quá trình làm tan các cục máu đông (huyết khối).
- Nhân tố VIII, một protein gây đông máu cho những ngƣời ƣa
chảy máu.
- Các vaccine tái tổ hợp cho bệnh viêm gan và bệnh viêm màng
não do Hemophilus influenza B gây ra.
- Octolon, một chất ức chế miễn dịch dùng cho các bệnh nhân
cấy ghép nội tạng.
2. Các ứng dụng trong công nghệ vi sinh

Insulin, chất thay thế

hormone dung trong
điều trị bệnh tiểu
đƣờng type I

Interleukin 2, một chất

hoạt hóa tế bào T và B
đƣợc dung trong điều trị
ung thƣ
Interferone, một chất
miễn dịch đƣợc sử
dụng để điều trị một
số loại ung thƣ, viêm
gan mạn tính

Erythropoietin, một
chất kích thích các tế
bảo tủy sống sinh
hồng cầu
Câu hỏi ôn tập của Chương 3
Câu 2: Em hãy trình bày các đặc điểm chính trong sinh trưởng của vi sinh vật?

Sinh trưởng của vi sinh vật có thể tạo ra sự trao đổi chất, nhưng để sản xuất một chất trao đổi
như mong muốn thì cơ thể của chúng phải được sinh trưởng dưới những điều kiện nuôi cấy đặc biệt
với một tốc độ sinh trưởng đặc trưng.
- Nếu vi sinh vật chỉ được đưa một lần vào môi trường sinh trưởng, thì nuôi cấy ban đầu sẽ trải qua
một số giai đoạn và hệ thống này được gọi là nuôi cấy mẻ (batch culture).
- Đầu tiên, sự sinh trưởng không xuất hiện và quá trình này được xem như là pha lag, có thể coi đây
là thời kỳ thích nghi. Tiếp theo là khoảng thời gian mà ở đó tốc độ sinh trưởng của tế bào tăng dần,
các tế bào sinh trưởng với một tốc độ cực đại và không đổi, thời kỳ này được xem là pha log hoặc pha
sinh trưởng theo hàm mũ và được mô tả bằng phương trình: dx/dt=µx (1)
Trong đó: x là nồng độ tế bào (mg/ml), t là thời gian nuôi cấy (giờ), và µ là tốc độ sinh trưởng đặc
trưng (giờ). Từ phương trình tích phân (1) ta sẽ có: xt=xoeµt (2)
Trong đó, xo là nồng độ tế bào ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy và xt là nồng độ tế bào sau một khoảng
thời gian t (giờ)
- Như vậy, đường cong logarithm tự nhiên của nồng độ tế bào theo thời gian t có độ dốc bằng tốc độ
sinh trưởng đặc trưng.
- Tốc độ sinh trưởng đặc trưng trong suốt pha log đạt cực đại ở các điều kiện nuôi cấy thông thường
và được mô tả như là tốc độ sinh trưởng cực đại đặc trưng (μmax).
- Phương trình (1) và (2) bỏ qua trường hợp sự sinh trưởng sẽ làm tiêu hao các chất dinh dưỡng và
tăng tích lũy độc tố của sản phẩm. Tuy nhiên, trong thực tế khi chất dinh dưỡng bị hao hụt và các sản
phẩm độc được tích lũy, thì tốc độ sinh trưởng của tế bào sẽ không đạt cực đại và cuối cùng làm
ngừng quá trình sinh trưởng, lúc này nuôi cấy đi vào pha tĩnh và sau một thời gian sẽ đi vào pha chết,
dẫn đến giảm số lượng tế bào sống sót.
- µ = (µmax S)/(KS + S) (3)
Trong đó: Ks là hằng số sử dụng hoặc bão hòa, bằng giá trị của nồng độ cơ chất
khi μ bằng 1/2 của μmax. Ở trạng thái ổn định, μ =D, vì thế: D= (µmax S)/ (KS+S)
Trong đó: S là nồng độ cơ chất ở trạng thái ổn định trong chemostat và S=
(KSD)/(µmax –D) (4)
Phương trình (4) cho thấy nồng độ cơ chất được xác định bằng tốc độ pha loãng.
- Trong thực tế, điều này xảy ra do sinh trưởng của tế bào đã làm tiêu hao cơ chất
tới một nồng độ cần thiết để tốc độ sinh trưởng bằng tốc độ pha loãng. Nếu cơ
chất bị hao hụt dưới mức cần thiết thì tốc độ sinh trưởng phụ thuộc tốc độ pha
loãng và một loạt các khả năng có thể xảy ra như sau:
- Tốc độ sinh trưởng của tế bào kém hơn tốc độ pha loãng và chúng sẽ bị rửa trôi
khỏi bình nuôi ở một tốc độ lớn hơn tốc độ mà chúng đang được sản xuất, kết
quả là làm giảm nồng độ sinh khối tế bào.
- Nồng độ cơ chất trong bình nuôi sẽ tăng lên do các tế bào được để lại ít hơn
trong bình nuôi để tiêu thụ nó.
- Nồng độ cơ chất được tăng lên trong bình nuôi sẽ cho kết quả các tế bào sinh
trưởng ở một tốc độ lớn hơn tốc độ pha loãng và nồng độ sinh khối sẽ tăng.
- Trạng thái ổn định sẽ được thiết lập trở lại.
- Chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng được giới hạn chất dinh dưỡng, có
thể duy trì trạng thái ổn định trong một phạm vi rộng của các tốc độ sinh trưởng
cực đại đặc trưng.
+ Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng (fed-batch culture) được xem là hệ thống
trung gian giữa quá trình nuôi cấy mẻ (batch) và nuôi cấy liên tục (continuous).
Thuật ngữ nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng được dùng để mô tả các nuôi cấy
mẻ được cung cấp dinh dưỡng liên tục (hoặc nối tiếp nhau) bằng môi trường mới
mà không loại bỏ dịch nuôi cấy cũ. Như vậy, thể tích của loại nuôi cấy này tăng
lên theo thời gian.

- Pirt (1975) đã mô tả động học của hệ thống này như sau: Nếu sinh trưởng của
một cơ thể bị giới hạn bởi nồng độ của cơ chất trong môi trường thì sinh khối
ở pha tĩnh, xmax, sẽ được mô tả bởi phương trình: x = Y SR max

Trong đó: Y là yếu tố hiệu suất, bằng khối lượng tế bào được sản xuất trên một
gram cơ chất được sử dụng, và SR là nồng độ ban đầu của cơ chất giới hạn sự
sinh trưởng.

- Nếu môi trường mới được bổ sung vào bình nuôi ở tốc độ pha loãng kém hơn
μmax thì sau đó hầu như tất cả cơ chất sẽ được sử dụng khi nó đi vào hệ
thống: FSR = µ (X/ Y)
Trong đó: F là tốc độ dòng chảy và X là sinh khối tổng số trong bình nuôi, ví dụ:
nồng độ tế bào được nhân lên bởi thể tích nuôi cấy.
- Cho dù khi sinh khối tổng số (X) trong bình nuôi tăng lên theo thời gian
thì nồng độ tế bào (x) hầu như vẫn không đổi; vì vậy dx/ dt = 0 và m = D.
Một hệ thống như thế được xem là ở trạng thái gần như ổn định (quasi-
steady-state). Khi thời gian và thể tích nuôi cấy tăng lên, thì tốc độ pha
loãng lại giảm. Như vậy, giá trị của D được đưa ra như sau: D= (F/(Vo +
Ft)

Trong đó: F là tốc độ dòng chảy, V0 là thể tích nuôi cấy ban đầu, và t là
thời gian.

- Động học Monod dự báo rằng khi D hạ xuống thì nồng độ cơ chất còn
thừa cũng sẽ giảm và kết quả là làm tăng sinh khối. Tuy nhiên, trên phạm vi
các tốc độ sinh trưởng hoạt động thì sự tăng sinh khối sẽ không có ý nghĩa.
Sự khác nhau giữa trạng thái ổn định của chemostat và trạng thái gần như
ổn định của fed-batch ở chỗ trong chemostat thì D (kể từ đây là μ) là hằng
số còn ở fed-batch thì D lại giảm theo thời gian. Tốc độ pha loãng trong fed-
batch có thể được giữ không đổi bằng cách tăng (theo hàm mũ) tốc độ dòng
chảy nhờ sử dụng một hệ thống điều chỉnh thông qua computer.
Câu 2: Em hãy trình bày hiểu biết của mình về sinh khối vi sinh vật và công nghệ
lên men trong nuôi sinh khối vi sinh vật?
Sự lên men vi sinh vật có thể được phân loại theo các nhóm chính sau:
- Sản xuất các tế bào vi sinh vật (sinh khối) như là sản phẩm.
- Sản xuất các chất trao đổi của vi sinh vật.
- Sản xuất các enzyme vi sinh vật.
- Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp.
1. Sinh khối vi sinh vật
Công nghệ thu sinh khối vi sinh vật là các quá trình nuôi cấy các chủng
thuần khiết hoặc hỗn hợp vài chủng để thu được khối lượng tế bào sau khi sinh
trưởng với các mục đích:
- Sinh khối giàu protein dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc là
những tế bào vi sinh vật (kể cả sinh khối tảo) đã sấy khô và chết, giàu protein,
các vitamin nhóm B và chất khoáng. Nguồn sinh khối này được gọi là protein
đơn bào.
- Sinh khối nấm men là những tế bào sống để dùng trong công nghiệp bánh mì-men
bánh mì, sinh khối vi khuẩn lactic sống có hoạt tính enzyme tiêu hóa để sản xuất các
thuốc hỗ trợ tiêu hóa như biolactovin…
- Sinh khối cố định đạm làm phân bón vi sinh, các loại phân bón visinh với vi
khuẩn sống tự do trong đất và sống cộng sinh với cây họ đậu.
- Sinh khối vi khuẩn sinh độc tố đối với các loại sâu thân mềm phá hoại rau
màu, để sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.
- Sinh khối vi sinh vật có hệ enzyme phân giải các chất hữu cơ kể cả thuốc trừ
sâu và hydrocarbon để sản xuất các chế phẩm vi sinh xử lý nướcthải và ô
nhiễm trong bảo vệ môi trường.
2. Quá trình lên men
- Đưa ra được sơ đồ chung của một quá trình lên men
-Phân tích được từng bước của sơ đồ chung của một quá trình lên men
+ Phần trung tâm của hệ thống là hệ lên men, trong đó cơ thể được sinh
trưởng dưới các điều kiện tối ưu để tạo thành sản phẩm.
+ Trước khi sự lên men bắt đầu, môi trường phải được pha chế và khử
trùng, hệ lên men đã vô trùng, và nuôi cấy khởi đầu phải có một số lượng vi
sinh vật vừa đủ ở trong một trạng thái sinh lý phù hợp để cấy truyền vào hệ
lên men sản xuất.
+ Kết thúc quá trình lên men các sản phẩm phải được tinh sạch và xử lý
thêm.
Các kiểu lên men khác nhau
Các cơ thể vi sinh vật có thể sinh trưởng trong kiểu nuôi cấy mẻ.
a. Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục
Ưu điểm của nuôi cấy liên tục đối với sản xuất sinh khối là quá rõ rệt
nhưng đối với các sản phẩm vi sinh khác thì nhược điểm của nó lại lớn hơn
ưu điểm kỹ thuật là có khả năng điều chỉnh để cải thiện quá trình lên men.

- Hiệu suất của nuôi cấy theo mẻ (đưa ra công thức) - Rbatch
- Hiệu suất của nuôi cấy liên tục – Rcont

- Nhược điểm thường xuyên của hệ thống nuôi cấy liên tục là sự mẫn cảm
của chúng với sự nhiễm bẩn bởi các cơ thể bên ngoài. Ngăn cản sự nhiễm
bẩn là vấn đề hàng đầu khi thiết kế hệ lên men, xây dựng và vận hành, và
phải được khắc phục bởi một công nghệ tốt. Sản xuất các sản phẩm phụ
được kết hợp với sự sinh trưởng sẽ hiệu quả hơn trong nuôi cấy liên tục.
Nhưng việc ứng dụng nuôi cấy liên tục để sản xuất các sản phẩm sinh tổng
hợp của vi sinh vật (ngược với sự dị hóa) đã gặp nhiều hạn chế.
b. Nuôi cấy mẻ có cung cấp dinh dưỡng (nuôi cấy fed batch)
+ Có thể được sử dụng để đạt tới một mức độ rất đáng kể của sự
điều chỉnh quá trình và mở rộng thời gian sản xuất của quá trình nuôi
cấy mẻ truyền thống mà không có các nhược điểm cố hữu của nuôi cấy
liên tục đã được mô tả ở trên.
+Ưu điểm chính của cung cấp thành phần môi trường vào nuôi cấy
là chất dinh dưỡng có thể được duy trì ở nồng độ rất thấp trong suốt
quá trình lên men.
Nồng độ chất dinh dưỡng thấp có thể thuận lợi trong một số mặt
sau:
+ Duy trì các điều kiện nuôi cấy trong phạm vi khả năng thông khí
của hệ lên men.
+ Loại bỏ các ảnh hưởng khắc nghiệt của các thành phần môi
trường,
+ Tránh các hiệu quả độc của thành phần môi trường.
+ Cung cấp một mức độ giới hạn chất dinh dưỡng cần thiết cho các
chủng dị dưỡng.
c. Nuôi cấy theo kiểu perfusion

-Hàng ngày lấy dịch nuôi ra, thu lại tế bào để bổ sung lại bình
nuôi, và bỏ môi trường cũ đi đồng thời bổ sung một lượng tương
ứng môi trường mới nhằm loại bỏ các chất chuyển hóa có thể
tích lũy tỏng môi trường nuôi ức chế sinh trưởng của tế bào.
 Tài liệu tham khảo:

1. Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình Nhập

môn Công nghệ sinh học, nhà xuất bản Đại học
Huế.
2. Tài liệu trang Web
 CHƢƠNG 4
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 NỘI DUNG
I. Mở đầu
II. Nuôi cấy mô và nhân giống in vitro
III. Các kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
IV. Sản xuất các dƣợc liệu sinh học
 I. MỞ ĐẦU
 Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực
ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công
nghệ sinh học thực vật
+ Kỹ thuật thuật vô trùng các bộ phân tách rời của TV
 Nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng
có giá trị mà phƣơng thức nhân giống truyền thống
gặp nhiều khó khăn
+ Nhiều kỹ thuật đã áp dụng thành công:
+Nuôi cấy đơn bội (1n) để tạo dòng thuần chủng cho
phục tráng giống cây trồng;
+ Dung nạp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo
tính trạng mới;
+ Chọn dòng biến dị soma và biến dị giao tử có khả
năng chống chịu với đ/kiện môi trƣờng bất lợi, sản xuất cây
sạch bệnh virus từ những các thể nhiễm virus
 I. MỞ ĐẦU
 Biến nạp và biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào TV
+ Biến đổi di truyền ở TV bằng cách đƣa DNA ngoại lại
vào trong tế bào là một quá trình phức tạp nhờ có: (1) RE; (2)
kỹ thuật lai phân tử và gen chỉ thị; (3) Thiết kế vector biểu hiện
cao; (4) Xây dựng kỹ thuật chuyển gen hiện đại…
+ Thành công không chỉ ở mức tế bào mà còn ở mức độ
cơ thể hoàn chỉnh, truyền lại cho thế hệ sau.
 Chuyển các gen quan trọng có giá trị kinh tế vào
thực vật nhờ biến nạp và tải nạp để cải thiện
phẩm chất cây trồng
 Nuôi cấy dịch huyền phù thực vật thành công
trong bioreactor để khai các hợp chất tự nhiên
có giá trị sinh học cao (SX protein ngoại lai để điều trị bệnh ở
TV có ƣu điểm các chất nhiễm bẩn và virus TV không phải là tác nhân
gây bệnh cho ngƣời so với protein có nguồn gốc từ tế bào động vật).
 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
• 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu
• 1934 – 1954:
- Nuôi thành công tế bào cà rốt (Gautheret, 1937);
- Phát hiện vitamine, auxin và cytokinin.
• 1957 – 1992:
- Tách và nuôi tế bào đơn;
- Vai trò auxin/cytokinin;
- Tạo protoplast và tái sinh cây;
- Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn;
• Sản xuất quy mô lớn và trên diện rộng.
I. Nuôi cấy mô và nhân giống in vitro

 Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá

trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau
của thực vật (MĐ: nhân giống và cải thiện di truyền,SX sinh khối các sản phẩm
hóa sinh, bệnh học TV, duy tì bảo quản nguồn gen quý= Các hoạt động của CNSH
TV)
 Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn
gọi là vi nhân giống (micropropagation) đƣợc sử dụng đặc
biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân
giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của
thực vật có kích thƣớc nhỏ, sinh trƣởng ở điều kiện vô trùng
trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NUÔI
CẤY MÔ- TẾ BÀO

Tính toàn năng :

- Tếbào bất kì của cơ thể
sinh vật nào cũng mang
toàn bộ lƣợng thông tin
di truyền cần thiết và
đủ của sinh vật đó, khi
gặp điều kiện thích hợp
mỗi tế bào đều có thể
phát triển thành cá thể
hoàn chỉnh.
 Tùy từng tế bào, từng
loại mô, từng thời kì
sinh trƣởng, phát triển
mà các gen phù hợp
hoạt động; các gen
không cùng hoạt động
nhƣ nhau trong các giai
đoạn phát triển của cơ
thể (do cơ chế điều hòa
hoạt động của gen).
 SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PHẢN PHÂN HOÁ
CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ-TẾ BÀO
 Phân hóa: 1 tế bào,1khối tế bàophân hóa tạo
mô cơ quan hệ cơ quan.
 Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa
thành các mô chức năng riêng biệt nhƣng vẫn
có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh
ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi.
 NHỮNG ƢU THẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO
Micropropagation
- Hệ số nhân giống cao, chủ động
- Giữ nguyên đặc tính cây mẹ

Chọn giống in vitro

- Rút ngắn thời gian
- Chọn các đặc tính quý

Khai thác các hợp chất

- Chất quý, cấu trúc phức tạp, không tổng hợp
đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học
- Giảm giá thành
 VAI TRÒ CNSH TV TRONG
TƢƠNG LAI

• Tăng sản lƣợng lƣơng thực gấp đôi

- Chọn giống;
- Biện pháp chống sâu bệnh, cỏ dại.
• Phát triển bền vững
- Hệ thống canh tác;
- Sản xuất sạch và xanh.
 thuật ngữ trong quá trình nhân giống
 Các
gồm:

+ explant: mẫu vật

 + cutting: cành giâm

 + layer: cành chiết

 + section: cành ghép

 + seed: hạt

5 thuật ngữ khác dùng để chỉ các loại tái sinh

sinh dƣỡng (vegetative or somatic
regeneration) nhƣ:
 Nuôi cấy đỉnh phân sinh (merstem – tip culture): PP nhân giống bằng cách dùng
các phần rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot –tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ
(single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot
elongation) ngay sau đó  lần đầu tiên dùng để làm sạch virus (virus free) ở TV 
nếu ko thể sống và tạo rễ một cách độc lập thì thay thế bằng phƣơng thức vi ghép
(micrografting).  nhân giống thành công cây 1 lá mầm (hoa lan, dứa, huệ và chuối…
hoặc cây 2 lá mầm (khoai tây, cà chua và cúc…)
 Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation): Sử dụng chồi ở các điểm
sinh trƣởng bên và ngọn – nơi mà sự kéo dài của chồi tận cùng (elongation of
termination shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách đƣợc đẩy mạnh. cho
phép nhân nhanh các chồi in vitro (mcroshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in
vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc cắt nó ra riêng biệt để
tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro (thành
công ở cây hai lá mầm nhƣ cúc, cà chua, thuốc lá…).
 Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction): cho phép hình thành các chồi bất
định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus đƣợc hình thành
trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Yêu cầu của hệ thống này tƣơng tự với nuôi
cấy mô phân sinh đỉnh; chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của
các chồi mới. Một số mẫu vật đƣợc dùng nhƣ: đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà
chua, bắp cải); mảnh lá (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao); cuống lá (thủy
tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ
thủy tiên), đoạn mầm (măng tây…).
 Phát sinh cơ quan (organogenesis): để mô tả quá trình tái sinh chồi
hoặc/và rễ bất định từ các khối tế bào callus; quá trình xảy ra sau
thời điểm mẫu vật đƣợc đặt vào MT nuôi cấy và bắt đầu cảm ứng tạo
callus. Đối với nhân giống in vitro: nhân đƣợc cây khá đồng nhất về
mặt di truyền; nhiều trƣờng hợp mô nuôi cấy ko tái sinh đƣợc cây
ngay mà tạo khối callus  cấy chuyển nhiều lần sẽ ko ổn định về mặt
di truyển  để tránh việc nêu trên nên dùng callus vừa phân sinh.

 Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis): dùng cho sự phát

triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dƣỡng đƣợc sản xuất
từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trƣởng trong nuôi cấy in vitro.
Thuật ngữ tƣơng đƣơng với sự phát triển phôi ở TV sinh
trƣởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic
embryohenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis).
Phôi vô tính có cấu trúc tƣơng tự phôi hữu tính của TV sinh trƣởng
trong ĐK tự nhiên. Điểm khác nhau cơ bản: Phôi HT luôn đi kèm với
nội nhũ (cơ quan dự trữ năng lƣợng và chất dinh dƣỡng phục vụ cho
quá trình nẩy mầm) còn phôi VT: hoàn toàn ko có nội nhũ.
Phƣơng thức tạo phôi vô tính có hiệu quả cao trong SX hạt
nhân tạo (synthetic seed).
1.2. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ
1.2.1.Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dƣỡng
a/ Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh
- Phƣơng thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của
đỉnh chồi hay đỉnh sinh trƣởng (apex) làm mẫu vật
nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm
lá non.
- Kích thƣớc mẫu: 0,1- 0,15 mm tính từ chóp sinh
trƣởng
- Các thực vật phổ biến nhất sử dụng phƣơng pháp
này: phong lan, dứa, mía, chuối…
 Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn);

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ;
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh.
Hoa lan  thành công đem lại hiệu quả cao; Gần đây: cây ăn quả và
cây lâm nghiệp (cà phê, táo, lê; thông, bồ đề….) trên 30 chi khác/n
đã đƣợc nuôi cấy thành công
 Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép
b/ Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot
culture)
Giống với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, chỉ khác
về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của
các chồi mới
- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp
cải…
- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca
cao…
- Cuống lá: thủy tiên…
- Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…
- Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

- Đoạn mầm: măng tây

SỰ PHÁT SINH CHỒI
 2.2. NHÂN GIỐNG THÔNG QUA GIAI ĐOẠN CALLUS

 Trong nhiều trƣờng hợp mô nuôi cấy không tái

sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus
 Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không
ổn định về mặt di truyền
 Cần  sử dụng loại callus vừa phát sinh  thu
cây tái sinh đồng nhất
2.3. NHÂN GIỐNG THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ
TÍNH - CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN TẠO
 PHÔI VÔ TÍNH

Trƣờng hợp cây hai lá mầm:

Dạng cầu  dạng thủy lôi dạng có lá
mầm
- Trƣờng hợp cây một lá mầm:
Dạng cầu dạng scutellar dạng diệp tiêu
 CÁC HÌNH DẠNG PHÔI VÔ TÍNH
HÌNH CẦU, HÌNH TRÁI TIM, HÌNH CÁ ĐUỐI
 NUÔI CẤY PHÔI SOMA
Các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhƣng sự
phát triển của chúng có thể bị ngăn cản do mất cân
bằng của các chất trong môi trƣờng nuôi cấy. Sự hình
thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có
thể xảy ra nếu những môi trƣờng có nồng độ auxin
cao sau khi tế bào đã biệt hóa.

Hai loại môi trƣờng đƣợc sử dụng:

+ Môi trƣờng có auxin: tạo các tế bào có khả năng
phát sinh phôi
+ Môi trƣờng không có auxin hoặc có với nồng độ
thấp: môi trƣờng cho những tế bào phát triển thành
phôi
Hạt nhân tạo
 Hạt nhân tạo
Hạt vô tính gồm 3 phần:
+ Phôi vô tính
+ Vỏ bọc polyme (alginate,
agarose,…)
+ Màng ngoài (calcium
alginate)
Trạng thái phát triển của phôi
vô tính đƣợc duy trì ở nhiệt
độ thấp hoặc dùng các chất ức
chế trƣớc khi bao hạt.
Khi sử dụng đem hạt vào môi
trƣờng thích hợp phôi này sẽ
nảy mầm tạo thành cây hoàn
chỉnh.
 CÁC BƢỚC CƠ BẢN TẠO HẠT NHÂN TẠO

-Tạo mô sẹo phôi hóa;

- Nuôi và nhân tế bào trong dịch lỏng;
- Lọc lấy các cụm tế bào phôi hóa nhỏ đồng
nhất;
- Đƣa tế bào tiền phôi vào nuôi cấy trong
môi trƣờng thích hợp;
- Làm khô và bọc màng nhân;
- Tiến hành bảo quản.
 2.3.3. NHÂN GIỐNG TRONG CÁC NỒI PHẢN ỨNG SINH
HỌC

 Các nồi phản ứng sinh học hay còn gọi

là bình lên men (fermenter) chủ yếu đƣợc
dùng cho công nghệ vi sinh;
 Vận hành theo nguyên tắc của bình lên
men;
 Ứng dụng thành công để:
- Kích thích ra rễ và tạo củ nhỏ: Khoai tây
bi;
- Nuôi cấy phôi vô tính: Cà phê.
Các phƣơng thức tạo cây hoàn chỉnh in vitro
3. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
VÔ TÍNH IN VITRO

Quy trình nhân giống vô tính in vitro

đƣợc thực hiện theo ba (hoặc bốn) giai
đoạn tùy theo tác giả
GIAI ĐOẠN CẤY GÂY
 GIAI ĐOẠN CẤY GÂY
Một số dạng môi trƣờng dinh dƣỡng phổ biến:
- Muối khoáng: Theo White (1943), Heller (1953),
Murashige và Skoog (1962) (Bảng 4.2).
- Chất hữu cơ:
+ Đƣờng saccharose 1-6 %.
+ Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid.
+ Amino acid: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2,
Tyr.
+ Phytohormone:
Nhóm auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D…
Nhóm cytokinin: BAP, kinetin, 2-iP, zeatin...
Nhóm gibberellin: GA3
 3.2. GIAI ĐOẠN II-NHÂN NHANH

Ở giai đoạn này  kích thích tạo cơ quan

phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây
hoàn chỉnh có thể phát sinh.
Những khả năng tạo cây đó là:

- Phát triển chồi nách;

- Tạo phôi vô tính;

- Tạo đỉnh sinh trƣởng mới.

3.2. GIAI ĐOẠN II-NHÂN NHANH
3.3. GIAI ĐOẠN III-CHUẨN BỊ VÀ ĐƢA RA NGOÀI
ĐẤT

 Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc

tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi
nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nƣớc, sâu bệnh và
chuyển từ trạng thái dị dƣỡng sang tự dƣỡng
hoàn toàn
 Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3
tuần, trong thời gian này cây phải đƣợc chăm
sóc và bảo bệ trƣớc những yếu tố bất lợi sau:
- Mất nƣớc nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tƣợng
thối nhũn.
- Cháy lá do nắng.
 4. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG GIỐNG
ƢU THẾ LAI

 Là biện phát tăng năng suất bậc nhất

 Các đối tƣợng nhƣ: ngô, cà chua, lúa, cải dầu, bắp
cải, hành tây, măng tây, và đặc biệt là các giống hoa…
 Giúp tăng năng suất từ 20-40%
 Con lai đồng đều so với giống bố mẹ
 Nghiên cứu các quy trình nhân giống tối ƣu và cải
tiến quy trình
Kiểu hình ƣu thế lai khi lai giống ngô B73 x Mo17
Ảnh minh họa về cây ngô và bắp ngô của giống B73 (trái),
Mo17 (phải) và con lai (3 hàng ở giữa phía trên + 2 bắp ở
giữa phía dƣới)
 5. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM KHÔNG DI
TRUYỀN
5.1. Hiện tƣợng các đặc điểm epigenetic (ngoại di truyền)
đƣợc lƣu lại
- Mô phân sinh của cành khác
mô phân sinh của thân
- Khi nhân giống vô tính các
bộ phận khác nhau sẽ thu Cây Phyllanthus amarys
đƣợc các dạng cây khác nhau

5.2. Hiện tƣợng các đặc điểm epigenetic không đƣợc lƣu lại
Khi gieo hạt hoặc
nuôi cấy phôi vô
tính từ mô phôi tâm
sẽ thu đƣợc những
Dứa Cayen cá thể có gai.
 III. CÁC KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở
THỰC VẬT
 Lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật
Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) đƣợc
chuyển vào thực vật nhờ VK đất Agrobacterium tumefaciens.
Tuy nhiên, T-DNA (Ti-plasmid của VK đất) vẫn chƣa đƣợc
thay đổi.
Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và
đƣa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng
sinh.
Năm 1984, biến nạp bằng tế bào trần (protoplast) ở
ngô đƣợc thực hiện nhờ polyethylene glycol (PEG)
hoặc xung điện (electroporation).
Năm 1986, tạo đƣợc thực vật kháng virus.
Năm 1987, phƣơng pháp biến nạp phi sinh học đƣợc
sử dụng. 43
 Chuyển gen là kỹ thuật sử dụng DNA ngoại
lai (tinh khiết) để đƣa vào cơ thể hoặc tế bào
khác và theo dõi sự biểu hiện của thông tin di
truyền mới này

 Mặc dù thực vật có chứa 3 bộ gen: nhân, ty

thể, lạp thể, nhƣng đa số các nghiên cứu
chuyển gen đều thực hiện với bộ gen của
nhân, chỉ một số ít thực hiện trên bộ gen ty
thể hoặc lạp thể.
 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT
CHUYỂN GEN
 Mục đích
 Tạo các giống cây năng suất cao, chất
lƣợng tốt.
 Không làm mất tính đa dạng sinh học
của muôn loài.
 Nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu
đối với nông nghiệp và môi trƣờng.
 Tăng thu nhập, giảm đói nghèo ở các
nƣớc đang phát triển.
 Cho phép các nhà tạo giống thực vật
đƣa ra giống mới nhanh hơn và vƣợt
qua những giới hạn của tạo giống
truyền thống.
 CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN CHO CHUYỂN
GEN Ở THỰC VẬT
 Muốn đƣa 1 gen vào tế bào thực vật, trƣớc tiên nó
phải đƣợc gắn vào 1 vector. Đặc tính của 1 vector cần
có:
+ Kích thƣớc của vector càng nhỏ càng tốt
+ Có khả năng tái bản
+ Cho phép pháp hiện dễ dàng, đƣợc mã hóa bởi
các gen chỉ thị chọn lọc
+ Chứa ít nhất một vị trí nhận biết của enzyme giới
hạn để dùng làm vị trí ghép ADN trong tạo thể tái tổ hợp
+ Đƣa một hoặc vài gen ngoại lai vào thực vật. Các
gen ngoại lai này phải đƣợc truyền thông qua dòng
mầm. Vì vậy, mọi tế bào kể cả tế bào mầm sinh sản đều
chứa vật chất di truyền đã đƣợc sửa đổi nhƣ nhau.
Một số điểm cần lƣu ý khi chuyển gen:

 Không phải tất cả các tế bào đều thể

hiện tính toàn năng.
 Các cây khác nhau có phản ứng không
giống nhau với sự xâm nhập của một
gen ngoại lai.
 Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các
tế bào có khả năng tái sinh và khả năng
thu nhận gen biến nạp vào genome.
 Chỉ có một số tế bào có khả năng biến
nạp và tái sinh cây.
 3. Các bƣớc
1. Tách DNA plasmid và DNA
tế bào cho nhờ enzym cắt.

2. Trộn chung DNA plasmid

với đoạn DNA TB cho, thêm

49
enzym nối ligaza tạo DNA
tái tổ hợp hoàn chỉnh

3. Biến nạp DNA tái tổ hợp

vào tế bào nhận (VK E. coli)

4. Chọn lọc và tạo dòng vi

khuẩn mang gen lạ. Sau đó,
tạo điều kiện để gen biểu
hiện tạo ra sản phẩm.
 Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở thực
vật là thành TB => phá vỡ thành TB, để tạo ra
TB trần.
 Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng
thƣờng là một cơ thể biến nạp hoàn toàn.
 Phần lớn thực vật đƣợc tái sinh dễ dàng bằng
nuôi cấy mô TB. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá
mầm nhƣ ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp
một vài khó khăn.
 Từ một TB duy nhất ngƣời ta có thể tạo ra một
cây chuyển gen, trong đó mỗi TB mang DNA
ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau khi
nở hoa và tạo hạt.
 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
 3.1. Chuyển gen gián tiếp
a. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
tumefaciens
 Nguyên lý

 Sử dụng Ti - plasmid của Agrobacterium

tumefaciens làm vector.
 Ti - plasmid gồm hai thành phần:

 T – DNA chứa gen điều hòa sinh trƣởng

cục bộ, gen tổng hợp các chất Opine và
gen gây khối u, có khả năng xâm nhập vào
DNA thực vật.
 Vùng vir làm tăng tần số biến nạp.
 1. Chuyển gen dán tiếp qua Agrobacterium

 1.1. Vi khuẩn Agrobacterium

+ A. tumefaciens và A. rhizogenes  2 VK gây bệnh cho TV  đƣợc
sử dụng nhƣ vector tự nhiên mang gen ngoại lại để đƣa vào TB TV
+ A. tumefaciens có chứa 1 plasmid lớn 200 kb gọi là Ti-plasmid
(tumor inducing plasmid)- chính là tác nhân gây bệnh cho cây.
+ Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng, thì hình
thành các khối u ở chỗ lây nhiễm; khối u hình thành tiếp tục ngay cả khi ko
có sự hiện diện của VK  khả năng này là do A. tumefaciens đã chuyển
một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị
bệnh
 1.2.Ti-plasmid
+ Thế giới động, thực vật đều tồn tại các thể plasmid- đó là các
vòng DNA tự sinh sản độc lập
+ Ở VK và ĐTV, plasmid liên quan đến yếu tố giới tính của TB, đến
khả năng chống chịu các loại kháng sinh
+ Đặc điểm quan trọng của plasmid: chúng có thể liên kết vào
nhiễm sắc thể (NST) nhƣng cũng có thể tồn tại bên ngoài NST một cách
độc lập
 Các plasmid của Agrobacterium đƣợc sử dụng vào CN gen TV
+ Có 2 dạng vector cis và trans  2 dạng vector này đều thuận lợi để tái
tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào TB TV;
+ Dạng cis: chỉ sử dụng Ti-plasmid và TB vật chủ A. tumefaciens mà ko
có sự tham gia của các plasmid và VK khác
+ Vùng T-DNA của Ti-plasmid đƣợc thiết kế lại để gắn gen ngoại lai và
các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn giữ nguyên;
+ A. tumefaciens đƣợc dùng làm TB vật chủ để nhân lên nhiều bản sao
của Ti-plasmid và chuyển gen.
+ Dạng trans hay binary - sử dụng 2 hay nhiều loại plasmid và VK cùng
lúc
Ví dụ: VK E. coli và Agrobacterium
+ Plasmid của E.coli chứa đoạn T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải (right
border - RB); và bờ trái (Left border - LB) mang gen ngoại lai đƣợc thiết kế và
nhân trong E. coli
+ Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai đƣợc chuyển nạp vào
Agrobacterium nhờ một helper plasmid thực hiện sự tiếp hợp thông qua quá
trình giao phối bộ ba (triparental matting)
+ VK Agorbacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir
(virulence region) có chức năng quan trọng trong qúa trình chuyển gen ngoại lai.
  Gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm
trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này đƣợc gọi là hệ trans.
BẢN ĐỒ CÁC DẠNG TI- PLASMID

A: dạng tự nhiên ban đầu

B: dạng cis
C: dạng trans
 1.3. Vùng T-DNA:
+ Là 1 đoạn DNA 25 kb, chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp
auxin, cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes)
+ Trong Ti-plasmid: vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bằng RB và
LB
+ Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có chứa các vùng DNA mã
hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và
tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism)
+ Ngoài T-DNA, vùng vir đƣợc nghiên cứu nhiều - phụ trách khả
năng lây nhiễm
 + Sản phầm hoạt động của các gen nằm vùng vir dƣới tác dụng kích thích
của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thƣơng là một số các protein nhƣ
virE2, virB, virD, virD2, virC1…  các protein này nhận biết các vết thƣơng
của cây chủ thích hợp (chủ yếu là cây 2 lá mầm); kích thích sản sinh ra các
đoạn T-DNA, bao bọc cho các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ
gen của cây chủ 1 cách an toàn.
 + Khi cây nhiễm A. tu, do T-DNA nạp vào trong hệ gen cây chủ bắt đầu hoạt
động và ss ra auxin, cytokinin, opine  sinh trƣởng của cây bị rối loạn;
các TB phân chia vô tổ chức hình thành khối u.
 Opin đƣợc VK sử dụng nhƣ 1 loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine
trên Ti-plasmid.
 + Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng xảy
ra tƣơng tự, nhƣng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen ss ra auxin
 vì thế sự thay đổi hình thái chính của TV là chúng tạo rất nhiều rễ tơ (hairy
roots) khi bị nhiệm bệnh
+ Agrobacterium chỉ gây bệnh, hại với cây 2 lá mầm  có thể chúng
chỉ có thể đƣa T-DNA vào hệ gen cây 2 lá mầm  Tuy nhiên, kết quả nghiên
cứu gần đây cho thấy cả cây 1 lá mầm (do có SX opine ở cây 1 lá mầm nên
Agrobacterium cũng chuyển gen vào cây 1 lá mầm đƣợc)

1.4. Chuyển DNA ngoại lai vào TB và TV nhờ A. tumefaciens

- Cơ chế gây bệnh của Agro là sau khi xâm nhiễm vào TB, chúng gắn đoạn T-DNA
vào bộ máy di truyền của TB TV  gây rối loạn chất dinh dƣỡng nội sinh, tạo ra
khối u (đối/v A. tu) hoặc rễ tơ (với A. rhizogenes)  cho khai thác để chuyển gen
ngoại lai vào bộ máy di truyền TB TV theo ý muốn.
+ Để gắn T-DNA vào TB TV, đầu tiên VK A.tu phải tiếp xúc với thành TB TV
bị tổn thƣơng. Đó là nhờ các gen chvA và chvB.
+ Gen chvB mã hóa protein liên quan đến hình thành ß-1,2 glucan mạch
vòng; chvA mã hóa cho protein vận chuyển, định vị ở màng trong của TB VK
+ Protein vận chuyển giúp vận chuyển ß-1,2 glucan vào khoảng giữa thành
TB và màng sinh chất.
+ ß-1,2 glucan có vai trò quan trọng để VK Agro tiếp xúc với thành TB TV
( ko có sẽ ko có sự tiếp xúc  ko có sự dẫn truyền T-DNA)
 Các sản phẩm protein của vùng vir có vai trò dẫn truyền T-
DNA từ VK vào TB TV; cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi
Ti-plasmid; cảm ứng thay đổi màng TB TV mà chúng tiếp xúc;
tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng VK tới TB chất của
TB TV; vận chuyển tới nhân rồi cuối cũng xâm nhập vào
genome của cây chủ.
 + Chỉ có T-DNA của Ti-plasmid đƣợc chuyển vào genome
TB TV
 + Quá trình dẫn truyền chỉ có sản phẩm của các gen vir
(vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến
các gen khác trên T-DNA.
 + Chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí
cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir,
đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào
TB TV
 + Trƣớc hết gen virA đƣợc phosphoryl hóa nhờ tác động
của các hợp chất phenol nhƣ acetosyringone giải phóng ra
từ các TB TV
 + Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa
gen virG
 + Sản phẩm gen virG liên tiếp hoạt hóa toàn bộ các gen vir
còn lại, với 2 gen cuối cùng đƣợc hoạt hóa là gen virB và
virE.
 + Trong đó, khi gen virD đƣợc hoạt hóa, sản phẩm của nó
cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-
DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn.
 + Đồng thời quá trình phosphoryl hóa nêu trên cũng làm
thay đổi tính thấm của màng TB TV  màng TB TV bị mềm ra
và bị thủng
 + Các sợi đơn T-DNA đƣợc gắn vào protein do gen virE tổng
hợp và dịch chuyển về phía màng TB VK.
 + Sau đó, sợi T-DNA trƣợt từ VK vào TB TV.
 + Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa TB do cảm
ứng sản phẩm gen virB mà thành.
 + Khi T-DNA đã đƣợc chuyển giao vào TB TV, chúng nhanh
chóng hợp nhất (integration) trong genome TB TV đƣợc ổn
định và di truyền nhƣ các gen bình thƣờng khác.
 Thiết kế vector: cắt bộ gen điều hòa sinh trƣởng cục
bộ, gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt
cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các
thể biến nạp và gắn vào gen biến nạp.

VK Agrobacterium tumefaciens
PHƢƠNG THỨC CHUYỂN T- ADN VÀO
GENOME THỰC VẬT
CÁC GEN CHỈ THỊ CHỌN LỌC VÀ GEN CHỈ
THỊ SÀNG LỌC
CÁC GEN CHỈ THỊ CHỌN LỌC VÀ GEN CHỈ
THỊ SÀNG LỌC
GEN CHỈ THỊ CHỌN LỌC
GEN CHỈ THỊ SÀNG LỌC
 TẠO CÀ CHUA BIẾN ĐỔI GEN

(1) Sao chép một đoạn gen từ cà rốt

(2) Chèn đoạn gen vào một plasmid
(3) Plasmid này lại đƣợc đƣa vào Agrobacterium
(4) Agrobacterium chuyển đoạn gen của cà rốt vào các TB
cà chua nằm trên đĩa petri.
(5) TB cà chua này tiếp tục sinh trƣởng và chuyển sang
môi trƣờng có chứa hormone kích thích sự mọc rễ và chồi
(6) Gen từ cà rốt đã làm biến đổi sắc tố của cà chua
thành màu của ß – carotene, tạo ra cà chua có giá trị cao
 Ƣu điểm
Nhƣợc điểm
Gen ít bị đào
thải. Khả năng
Số lƣợng bản biến nạp giới
sao ít hơn => hạn.
Tránh đƣợc hiện
tƣợng ức chế lẫn
nhau.
Tồn tại bền
vững trong cơ thể
thực vật.
 b. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
 Nguyên lý
 Hệ gen của virus phải là DNA.
 Virus có khả năng di chuyển từ TB
này sang TB khác qua các lỗ ở vách
TB.
 Có khả năng mang đƣợc đoạn DNA
mới, sau đó chuyển vào TB thực vật.
 Có phổ ký chủ rộng.
 Không gây tác hại đáng kể cho thực
vật.
 Ƣu điểm Nhƣợc điểm
 Dễ xâm DNA virus
nhập và lây khó ghép nối
lan trong cơ với hệ gen của
thể vật chủ. thực vật
 Có thể
mang đoạn
DNA lớn.

69
3.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN TRỰC TIẾP

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Chuyển gen bằng xung điện

Chuyển gen bằng vi tiêm

Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học

Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

70
 Chuyển gen
 a. bằng súng bắn gen (gene
gun)
 Nguyên lý
 Ngâm những vi đạn với dung dịch có
chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển.
 Các vi đạn này đƣợc làm khô trên một
đĩa kim loại mỏng.
 Đĩa này đƣợc gắn vào đầu một viên đạn
lớn có kích thƣớc vừa khít đầu nòng
súng bắn gen.
 Khi bắn, viên đạn lớn bị giữ lại còn vi đạn
xuyên vào TB.
 Sau khi bắn, tách các mô, TB và nuôi cấy
in vitro để tái sinh cây.
Súng bắn gen Sơ đồ nguyên lý hoạt
động của súng bắn gen
THAO TÁC CHUYỂN GEN BẰNG PHƢƠNG THỨC
DỘI BOM
 Ƣu điểm Nhƣợc điểm
Thao tác dễ Tần số biến nạp
dàng, bắn một lần ổn định thấp
đƣợc nhiều TB.
Nguyên liệu để
bắn đa dạng (hạt
phấn, TB nuôi
cấy, TB mô hóa
và mô phân sinh).
 b. Chuyển gen bằng xung điện

Xuất hiện
Tế bào lỗ tạm thời
Màng DNA
Xung điện ngắn TB chui vào
trong TB

 Sau khi biến nạp, tách những enzym phân giải và

để cho TB phát triển, thành TB mới đƣợc tạo nên.
 Các TB này đƣợc nuôi cấy trên các môi trƣờng
thích hợp kích thích sinh trƣởng tạo nên cây hoàn
chỉnh.
 Sau đó sử dụng các phƣơng pháp phân tích
genome để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.

Nhược điểm: chƣa chắc chắn có sự biến nạp

 c. Chuyển gen bằng vi tiêm
Nguyên lý
Sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đƣa DNA vào những TB
nhất định nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast (TB
trần) và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.

Ƣu điểm
 Tối ƣu lƣợng DNA đƣa vào TB. Nhƣợc điểm
 Quyết định đƣợc đƣa DNA vào  Mỗi lần tiêm chỉ
loại TB nào. đƣợc một phát và một
 Có thể đƣa một cách chính xác TB.
thậm chí vào tận nhân và có thể  Thao tác đòi hỏi độ
quan sát đƣợc. chính xác cao.
 Có thể nuôi riêng lẻ các TB vi
tiêm và biến nạp đƣợc vào mọi
giống cây.
 d. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Nguyên lý

Tạo TB Plasmid tái tổ hợp

trần (mang gen mong muốn)

Dung dịch huyền phù

 Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập

trong hỗn hợp huyền phù khoảng 3mm.
 Đem TB trần nuôi cấy trong môi trƣờng thích
hợp và chọn ra TB trần đƣợc chuyển gen.
 e. Chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học

Polyethylen
 Nguyên lý glycol (PEG)
TB trần
Gen

Khi có mặt PEG màng của TB trần bị thay đổi

và TB trần có thể thu nhận DNA ngoại lai

Ưu điểm Nhược điểm

Cùng một lúc Tần số chuyển gen
chuyển gen đƣợc rất thấp
vào nhiều TB
 f. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

 Nguyên lý

DNA ngoại lai Đầu ống phấn Bầu nhụy Hợp tử

 Thời gian chuyển gen tốt nhất khi quá trình thụ
tinh xảy ra ở noãn và cho hợp tử chƣa phân chia.
 Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế
hệ sau.

Ưu điểm Nhược điểm

 Tần số chuyển  Khó xác định
gen cao đƣợc thời điểm
chuyển gen
MỘT SỐ ĐÁNH GIÁ VỀ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
a. Những lợi ích
• Có khả năng chống chịu bệnh
• Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu
• Tăng thành phần dinh dƣỡng
• Tăng thời gian bảo quản
• Tăng sản lƣợng
• Giảm chi phí sản xuất
• Tăng lợi nhuận nông nghiệp
• Cải thiện môi trƣờng
• Giống mô có thể đƣợc trồng trong điều kiện nghèo dinh
dƣỡng.
b.Những nguy cơ tiềm ẩn và rủi ro có thể
• Cây chuyển gen, những rủi ro có thể: khả năng tạo ra
những loại cỏ mới
• Ảnh hƣởng trực tiếp lên các sinh vật không phải là sinh vật
cần diệt
• Phát triển tính kháng của côn trùng
PHÂN TÍCH THỰC VẬT CHUYỂN GEN
 Việc quan trọng và cần thiết nhất sau chuyển
gen là xác định xem gen chuyển vào tế bào
đƣợc chấp nhận nhƣ thế nào.
 Sau khi tiến hành lựa chọn sơ bộ trên môi
trƣờng chọn lọc (thƣờng chứa kháng sinh),
các mẫu chuyển gen phải đƣợc phân tích
đánh giá
 Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng:

- PCR

- Southern

- Phân tích biểu hiện gen….

 CÁC ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN

- Công nghệ di truyền trong kháng chất

diệt cỏ
- Công nghệ di truyền trong kháng sâu-
bệnh
 Kháng côn trùng
 Kháng các virus thực vật
 Bảo vệ chéo
 Sử dụng RNA vệ tinh
 Sử dụng enzyme replicase
 Kháng các bệnh nấm
 Kháng các bệnh vi khuẩn
 ỨNG DỤNG
a.Chuyển gen kháng sâu

Chuyển gen kháng sâu bệnh

b.Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

c.Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh

Cây thuốc lá chuyển gen Lá cây đu đủ chuyển gen

kháng virus CMV và đối kháng PRSV và đối chứng
83
chứng
d.Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật

Thực phẩm chức năng

e. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh
dưỡng của cây

Cà chua chuyển gen

Hạt gạo vàng
chín chậm
84
 Hình 44: Bắp chuyển gen Bt

Bt Control

f. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc

Hình 45: Đa dạng màu hoa Hình 46: Hoa hồng xanh

85
 Đa dạng màu hoa

Bông cải chuyển gen

86
 87
Cà chua chuyển gen kháng vật kí sinh
(phải) và cà chua đối chứng (trái)
Ngô (Bt corn) mang gen Bt
(chống sâu hại)
 Cây thuốc lá chuyển gen
kháng virus CMV và đối
chứng

Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối

chứng (PRSV: papaya ringspor virus, gây
bệnh đốm vòng)
89
IV. SẢN XUẤT CÁC DƢỢC LIỆU SINH HỌC
 1. CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN

 Thực vật là nguồn cung cấp các hợp

chất hóa học dùng làm dƣợc liệu rất có
giá trị
 NUÔI CẤY TẾ BÀO DỊCH HUYỀN PHÙ
THỰC VẬT TRONG HỆ LÊN MEN 100 L

Để sản xuất các sản phẩm

thứ cấp từ thực vật, các mô
thực vật ngoại sinh từ cây
hoàn chỉnh đƣợc nuôi cấy
dịch huyền phù (suspension
culture) trong điều kiện vô
trùng
 CÁC ALKANOID

CÁC STREROID
MỘT SỐ CHẤT KHÁC
 2. CÁC PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) là protein tự nhiên
đƣợc biến đổi bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng
cao hoặc thay đổi hoạt tính của chúng.
SẢN XUẤT CÁC PROTEIN TÁI TỔ HỢP BẰNG NUÔI
CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
 Cấu trúc phân tử của
interferon alpha trong
cơ thể ngƣời
Feronsure (Interferon
alpha a-2a ngƣời, tái tổ hợp)

Gạo chuyển
gen chứa
lƣợng lớn
protein
huyết
Albumin huyết thanh tƣơng
ngƣời
 3. VACCINE THỰC PHẨM (EDIBLE VACCINE)
 Sử dụng vaccine sống nhƣợc độc làm kháng nguyên
kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể ngƣời
và vật nuôi
 Hạn chế: có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc
hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể ngƣời
và vật nuôi
 Nguyên lý:

- Chuyển một loại gen đặc biệt vào tế bào thực vật
- Khi gen này hoạt động trong cơ thể thực vật, sẽ biến
thành nơi sinh ra protein kháng nguyên
- Thông qua ăn uống (dƣới dạng tƣơi sống không nấu
chín, nếu không sẽ làm mất hoạt tính kháng nguyên),
hệ thống miễn dịch của ngƣời sẽ tự động sinh ra
kháng thể để chống lại kháng nguyên
3. VACCINE THỰC PHẨM (EDIBLE VACCINE)
MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN VACCINE THỰC PHẨM
MỘT SỐ KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU

Sản xuất vaccin

viêm gan B trong
chuối chuyển gen,
cà chua
Câu hỏi ôn tập chƣơng 4
Câu 1: Em hãy trình bày hiểu biết của mình về nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro?.
1. Thuật ngữ:
+ Nuôi cấy mô (tissue culture): là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy
vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật, đƣợc dùng cho cả
hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền
+ Nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống
(micropropagation) đƣợc sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi
cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực
vật có kích thƣớc nhỏ, sinh trƣởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm
hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
+ Trong thực tế: dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho
nhau để chỉ phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng- thuật ngữ
đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (in vitro culture)
- Có 5 thuật ngữ khác đƣợc dùng để chỉ tái sinh sinh dƣỡng (vegetative or
somatic regeneration) trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:
+ Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng; + Sinh sản chối nách
+Tạo chồi bất định; + Phát sinh cơ quan
+ Phát sinh phôi vô tính
2. Nhân giống in vitro và các hệ thống nuôi cấy mô
- Tái sinh cây mới từ cấu trúc sinh dƣỡng
a. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh: sử dụng các bộ phận nhỏ
nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trƣởng làm mẫu vật nuôi cấy (gồm mô phân
sinh đỉnh nhƣ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ, chồi mới phát sinh và các mầm lá
non)
+ Phát triển cây trực tiếp: chủ yếu đối tƣợng hai lá mầm
+ Phát triển thông qua giai đoạn protocorm: chủ yếu ở đối tƣợng 1 lá
mầm; cùng một lúc đỉnh sinh trƣởng tạo hàng loạt protocorm và các
protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành protocorm mới hoặc phát triển
thành cây hoàn chỉnh (hàng triệu cá thể).
+ Ghép đỉnh chồi hay vi ghép: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhƣng thông
qua dinh dƣỡng tự nhiên của gốc gép. Có nhiều cách ghép khác nhau: ghép
lên mặt cắt; ghép chữ T-ngƣợc; ghép hàm ếch
b. Nuôi cấy chồi bất định
- Yêu cầu tƣơng tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh nhƣng chỉ khác về
nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới.
- Nhân giống thông qua giai đoạn callus (0,5 điểm): tế bào callus khi cấy
chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do vậy, phải sử dụng
loại callus vừa phát sinh.
-Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính – công nghệ hạt nhân tạo
+ Phôi vô tính: một phƣơng thức nhân giống vô tính – tạo phôi vô
tính từ tế bào callus
+ Công nghệ hạt nhân tạo: hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong
một lớp vỏ polymer nhƣ agar, agarose, alginate…với cấu tạo ba phần
(phôi vô tính, vỏ bọc polymer và màng ngoài). Trong cấu trúc lƣới của các
lớp vỏ đó, nƣớc, chất dinh dƣỡng và chất sinh trƣởng đƣợc cung cấp thay
cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn
chỉnh. Dụng cụ không thể thiếu trong công nghệ hạt nhân tạo là nồi phản
ứng sinh học (bioreactor)
+ Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học
3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro
- Cấy gây: (đƣa mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm: tỷ lệ
nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trƣởng nhanh; sử dụng một số môi
trƣờng dinh dƣỡng)
- Nhân nhanh: kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây
hoàn chỉnh có thể phát sinh nhƣ: phát triển chồi nách; tạo phôi vô tính; tạo
đỉnh sinh trƣởng mới. Trong đó có bổ sung tổ hợp phytohocmon để kích thích
mô nuôi cấy tạo rễ hay kích thích phát sinh chồi hay là thay đổi quang chu kỳ
sáng: tối cũng nhƣ là chất lƣợng ánh sáng, bảo đảm nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
-Chuẩn bị và đƣa ra ngoài đất: bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với
thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nƣớc, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị
dƣỡng sang tự dƣỡng hoàn toàn.
4. Nhân giống in vitro và việc sử dụng giống ƣu thế lai: làm tăng năng suất từ
20-40% mà giống lai còn có đặc điểm là rất đồng đều so với giống bố mẹ.
5. Nhân giống in vitro và các đặc điểm không di truyền
- Hiện tƣợng các đặc điểm epigenetic đƣợc lƣu lại: một số tính chống chịu mặn,
chịu bệnh, chịu lạnh vần thƣờng là những đặc tính epigenetic và liệu thông qua
nhân giống in vitro các đặc tính có còn đƣợc giữ hay không.
-Hiện tƣợng các đặc điểm epigenetic không lƣu lại
Câu 2: Em hãy trình bày các phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật?.
- Chuyển gen là kỹ thuật sử dụng DNA ngoại lai (tinh khiết) để đƣa vào cơ
thể hoặc tế bào khác và theo dõi sự biểu hiện của thông tin di truyền mới
này.
- Mặc dù thực vật có chứa 3 bộ gen: nhân, ty thể, lạp thể, nhƣng đa số các
nghiên cứu chuyển gen đều thực hiện với bộ gen của nhân, chỉ một số ít
thực hiện trên bộ gen ty thể hoặc lạp thể.
CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
+ Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn (Agrobacterium tumefaciens; A.
rhizogenes) và virus
+ Chuyển gen trực tiếp bằng sung bắn gen, bằng xung điện, bằng vi tiêm,
nhờ kỹ thuật siêu âm, bằng phƣơng pháp hóa học và chuyển gen trực tiếp
qua ống phấn
1.Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
Nguyên lý
Sử dụng Ti - plasmid của Agrobacterium tumefaciens làm vector.
Ti - plasmid gồm hai thành phần:
T – DNA chứa gen điều hòa sinh trƣởng cục bộ, gen tổng hợp các chất
Opine và gen gây khối u, có khả năng xâm nhập vào DNA thực vật.
Vùng vir làm tăng tần số biến nạp.
- Vi khuẩn Agrobacterium
+ A. tumefaciens và A. rhizogenes  2 vi khuẩn gây bệnh cho thực vật  được sử dụng
như vector tự nhiên mang gen ngoại lại để đưa vào tế bào thực vật
+ A. tumefaciens có chứa 1 plasmid lớn 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing
plasmid)- chính là tác nhân gây bệnh cho cây.
+ Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng, thì hình thành các
khối u ở chỗ lây nhiễm; khối u hình thành tiếp tục ngay cả khi ko có sự hiện diện của vi
khuẩn  khả năng này là do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid
(T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh
+ Ti-plasmid
+ Thế giới động, thực vật đều tồn tại các thể plasmid- đó là các vòng DNA tự
sinh sản độc lập
+ Ở vi khuẩn và động, thực vật, plasmid liên quan đến yếu tố giới tính của tế
bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh
+ Đặc điểm quan trọng của plasmid: chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể
(NST) nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài NST một cách độc lập
Các plasmid của Agrobacterium đƣợc sử dụng vào công nghệ gen thực vật
+ Có 2 dạng vector cis và trans  2 dạng vector này đều thuận lợi để tái tổ
hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật;
+ Dạng cis: chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ A. tumefaciens mà ko có
sự tham gia của các plasmid và vi khuẩn khác
+ Vùng T-DNA của Ti-plasmid đƣợc thiết kế lại để gắn gen ngoại lai và các
phần còn lại của Ti-plasmid vẫn giữ nguyên;
+ A. tumefaciens đƣợc dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của
Ti-plasmid và chuyển gen.
+ Dạng trans hay binary - sử dụng 2 hay nhiều loại plasmid và vi
khuẩn cùng lúc
Ví dụ: Vi khuẩn E. coli và Agrobacterium
+ Plasmid của E.coli chứa đoạn T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải
(right border - RB); và bờ trái (Left border - LB) mang gen ngoại lai đƣợc
thiết kế và nhân trong E. coli
+ Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lại đƣợc chuyển nạp vào
Agrobacterium nhờ một helper plasmid thực hiện sự tiếp hợp thông qua quá
trình giao phối bộ ba (triparental matting)
+ Vi khuẩn Agorbacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa
vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong qúa trình chuyển
gen ngoại lai.
 Gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir)
không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này đƣợc gọi là
hệ trans.
- Vùng T-DNA:
+ Là 1 đoạn DNA 25 kb, chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin,
cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes)
+ Trong Ti-plasmid: vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bằng RB và LB
+ Ngoài T-DNA, vùng vir đƣợc nghiên cứu nhiều - phụ trách khả năng lây
nhiễm
+ Sản phầm hoạt động của các gen nằm vùng vir dưới tác dụng kích thích của các
hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một số các protein như virE2, virB, virD,
virD2, virC1…  các protein này nhận biết các vết thương của cây chủ thích hợp
(chủ yếu là cây 2 lá mầm); kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc cho các
đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ 1 cách an toàn.
+ Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen cây chủ bắt đầu
hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin, opine  sinh trưởng của cây bị rối loạn;
các tế bào phân chia vô tổ chức hình thành khối u.
+Opin được vi khuẩn sử dụng như 1 loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên
Ti-plasmid.
+ Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng xảy ra tương tự,
nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin  vì thế
sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo rất nhiều rễ tơ (hairy roots)
khi bị nhiệm bệnh
+ Agrobacterium chỉ gây bệnh, hại với cây 2 lá mầm  có thể chúng chỉ
có thể đưa T-DNA vào hệ gen cây 2 lá mầm  Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu gần
đây cho thấy cả cây 1 lá mầm (do có sản sinh opine ở cây 1 lá mầm nên
Agrobacterium cũng chuyển gen vào cây 1 lá mầm được)
- Cơ chế chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật nhờ A. tumefaciens
- Cơ chế gây bệnh của Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-
DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật  gây rối loạn chất dinh dưỡng nội sinh, tạo
ra khối u (đối với A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (với A. rhizogenes)  cho khai thác để chuyển
gen ngoại lai vào bộ máy di truyền tế bào thực vật theo ý muốn.
+ Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A.tumefaciens phải tiếp
xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thƣơng. Đó là nhờ các gen chvA và chvB.
+ Gen chvB mã hóa protein liên quan đến hình thành ß-1,2 glucan mạch vòng;
chvA mã hóa cho protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn
+ Protein vận chuyển giúp vận chuyển ß-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế
bào và màng sinh chất.
+ ß-1,2 glucan có vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với
thành tế bào thực vật ( ko có sẽ ko có sự tiếp xúc  ko có sự dẫn truyền T-DNA)
- Các sản phẩm protein của vùng vir có vai trò dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào
thực vật; cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid; cảm ứng thay đổi màng tế
bào thực vật mà chúng tiếp xúc; tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới
tế bào chất của tế bào thực vật; vận chuyển tới nhân rồi cuối cũng xâm nhập vào
genome của cây chủ.
+ Chỉ có T-DNA của Ti-plasmid đƣợc chuyển vào genome tế bào thực vật
+ Quá trình dẫn truyền chỉ có sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định
mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA.
+ Chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các
sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang
chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật
+ Trƣớc hết gen virA đƣợc phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất
phenol nhƣ acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật
+ Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG
+ Sản phẩm gen virG liên tiếp hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, với 2 gen
cuối cùng đƣợc hoạt hóa là gen virB và virE.
+ Trong đó, khi gen virD đƣợc hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết
RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid
thành các sợi đơn.
+ Đồng thời quá trình phosphoryl hóa nêu trên cũng làm thay đổi tính thấm
của màng tế bào thực vật  màng tế bào thực vật bị mềm ra và bị thủng
+ Các sợi đơn T-DNA đƣợc gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch
chuyển về phía màng tế bào thực vật.
+ Sau đó, sợi T-DNA trƣợt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật.
+ Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa tế bào do cảm ứng sản phẩm
gen virB mà thành.
+ Khi T-DNA đã đƣợc chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng
hợp nhất (integration) trong genome tế bào thực vật đƣợc ổn định và di truyền
nhƣ các gen bình thƣờng khác.
1.5. Các gen chỉ thị chọn lọc và gen chỉ thị sàng lọc
- Gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố ức
chế trao đổi chất nhƣ các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ;
- Các gen chỉ thị chọn lọc thƣờng dùng nhất là các gen mã hóa cho một số
enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới
thực vật;
- Các gen chỉ thị thƣờng dùng nhất là các gen: npt II, hyg, gent, aat, bleo, bar,
bxn
- Các gen chỉ thị sàng lọc hay dùng là: gus A, lac Z, luc, lux, cat, nos

2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

- Nguyên lý
+ Hệ gen của virus phải là DNA.
+ Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở
vách tế bào.
+ Có khả năng mang đƣợc đoạn DNA mới, sau đó chuyển vào tế bào thực vật.
+Có phổ ký chủ rộng.
+ Không gây tác hại đáng kể cho thực vật.
- Ƣu điểm: dễ xâm nhập và lây lan trong co thể vật chủ. Có thể mang đoạn
ADN lớn
- Nhƣợc điểm: ADN virus khó ghép nối với hệ gen của thực vật
3. Phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp
a. Chuyển gen bằng súng bắn gen
Nguyên lý
+ Ngâm những vi đạn với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển.
+ Các vi đạn này đƣợc làm khô trên một đĩa kim loại mỏng.
+ Đĩa này đƣợc gắn vào đầu một viên đạn lớn có kích thƣớc vừa khít đầu
nòng súng bắn gen.
+ Khi bắn, viên đạn lớn bị giữ lại còn vi đạn xuyên vào tế bào.
+ Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây.
Ƣu điểm: Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào. Nguyên liệu để bắn
đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh)
Nhƣợc điểm: Tần số biến nạp ổn định nhưng thấp

b. Chuyển gen bằng xung điện

Dƣới tác dụng của xung điện, trên màng tế bào xuất hiện các lỗ tạm thời để
cho ADN chui vào trong tế bào.
Nhƣợc điểm: chƣa chắc chắn có sự biến nạp
c. Chuyển gen bằng vi tiêm
Nguyên lý: Sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đƣa DNA vào những tế
bào nhất định nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast (tế bào trần) và
cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.
- Ƣu điểm:
+Tối ƣu lƣợng DNA đƣa vào tế bào.
+ Quyết định đƣợc đƣa DNA vào loại tế bào nào.
+ Có thể đƣa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát
đƣợc.
+ Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp đƣợc vào mọi giống cây.
- Nhƣợc điểm: Mỗi lần tiêm chỉ đƣợc một phát và một tế bào; Thao tác đòi
hỏi độ chính xác cao.

d. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm:

Nguyên lý: Tạo tế bào trần kết hợp với plasmid tài tổ hợp (mang gen mong
muốn) để tạo dung dịch huyền phù).
-Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù
khoảng 3 mm
- Đem tế bào trần nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp và chọn ra tế bào
trần đƣợc chuyển gen
e. Chuyển gen bằng phƣơng pháp hóa học
Nguyên lý: Gen được xử ý với polyethylene glycol (PEG) và tế
bào trần. Khi có mặt PEG màng của tế bào trần bị thay đổi và tế
bào trần có thể thu nhận ADN ngoại lai.
-Ƣu điểm: Cùng một lúc chuyển gen được vào nhiều tế bào
-Nhƣợc điểm: Tần số chuyển gen rất thấp

f. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

Nguyên lý: ADN ngoại lai được đưa vào đầu ống phấn và bầu
nhụy để cho ra hợp tử. Thời gian chuyển gen tốt nhất khi quá trình
thụ tinh xảy ra ở noãn và cho hợp tử chưa phân chia.
Phân tích và xác định kế quả chuyển gen ở thế hệ sau.
-Ƣu điểm: Tần số chuyển gen cao
- Nhƣợc điểm: Khó xác định được thời điểm chuyển gen.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo
trình nhập môn công nghệ sinh
học. Nhà xuất bản Đại học Huế.
Tài liệu trang web
 CHƢƠNG 5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỘNG VẬT
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 Nội dung
I. Mở đầu
II. Nuôi cấy tế bào động vật có vú
III. Công nghệ di truyền của các tế bào
động vật có vú
IV. Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất cơ
quan người
V. Công nghệ phôi động vật có vú
VI. Nhân bản vô tính động vật có vú
 I. MỞ ĐẦU
• Tế bào động vật có thể sinh trưởng trên các loại môi trường dinh
dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể nên dùng để:
- Nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính,
xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép, nghiên cứu
các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng, sản xuất tế
bào gốc…
- Ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng
trong chẩn đoán như các hormone sinh trưởng của người,
interferon, hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các
kháng thể đơn dòng
• Chuyển gen vào động vật để tạo ra nguồn thực phẩm có giá trị
là một trong những ứng dụng có ý nghĩa của công nghệ sinh
học động vật
• Nhân bản vô tính (tạo dòng) đối với các vật nuôi có năng suất
cao có một số thành công nhất định, kỹ thuật này cho phép tái
tạo các vật nuôi có đầy đủ phẩm chất như ban đầu bằng
phương thức vô tính
 II. Nuôi cấy tế bào động vật có vú
Ưu điểm
- Thích hợp cho sản xuất các phân tử
phức tạp và các kháng thể dùng làm
thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn
đoán
- Các tế bào động vật đáp ứng được
quá trình hậu dịch mã chính xác đối
với các sản phẩm protein sinh-dược
- Sản xuất các vector virus dùng trong
liệu pháp gen
- Sản xuất các tế bào động vật để dùng
như một cơ chất in vitro trong nghiên
cứu độc học các chất học và dược học
- Phát triển công nghệ mô hoặc phát
sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan
thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng
cụ trợ giúp
Hạn chế
- Các tế bào động vật có kích
thước lớn hơn và cấu trúc
phức tạp hơn các tế bào vi
sinh vật.
- Tốc độ sinh trưởng chậm 
sản lượng thấp, thời gian nuôi
dài
- Tế bào có màng huyết tương
mỏng  rất dễ bị vỡ
- Môi trường nuôi cấy đắt tiền
- Tế bào động vật là một phần
của mô đã được tổ chức
(phân hóa)
- Chỉ sinh trưởng khi được
gắn trên một bề mặt.
 Các sản phẩm quan trọng của nuôi cấy tế bào
động vật
Urokinase, hoạt tố plasminogen
Enzyme
mô
Nhóm I Hoocmon Hormone sinh trưởng (GH)
Các nhân tố sinh
Các cytokine khác
trưởng
Bệnh dại, bệnh quai bị, bệnh
sởi ở người…
Nhóm II Vaccine
Veterinary-FMD vaccine, New
Cattle’s Disease ...
Nhóm III Kháng thể đơn dòng Các công cụ chẩn đoán
Thuốc trừ sâu sinh học cho
Nhóm IV Virus côn trùng
Baculovirus
Các chất điều hòa
Nhóm V miễn dịch
Interferon và interleukin

Các tế bào nguyên

Nhóm VI Thử nghiệm độc chất học
vẹn
 2. Các dòng tế bào động vật có vú và các đặc
điểm của nó
Đặc điểm của tế bào động vật
-Là tế bào eukaryote, chúng
được liên kết với nhau bởi
các nguyên liệu gian bào để
tạo thành mô

- 4 nhóm mô: biểu mô

(epithelium), mô liên kết
(connective tissue), mô cơ
(muscle) và mô thần kinh
(nerve).
 2. Các dòng tế bào động vật có vú và các
đặc điểm của nó
2.1. Các tế bào dịch
huyền phù
• Tế bào hồng cầu
(blood) và bạch huyết
(lymph) là các mô liên
kết không điển hình
dạng thể lỏng  không
dính bám khi chúng
sinh trưởng trong nuôi
cấy in vitro.
 2. Các dòng tế bào động vật có vú và các
đặc điểm của nó
2.2. Các tế bào dính bám
• Tế bào động vật bình thường là các tế
bào dính bám, vì thế  chúng cần có bề
mặt để gắn vào và sinh trưởng
• Tế bào thường sử dụng: tế bào biểu mô
và nguyên bào sợi (fibroblast).
• Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng
lên khi các tế bào sinh trưởng trên các
giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể
gốm (ceramic), các sợi rỗng...
 3. Các sản phẩm thương mại của nuôi
cấy tế bào động vật có vú
Loại
Protein dược liệu Chức năng
glycosylation
Hoạt tố plasminogen Tác nhân phân giải fibrino-
Liên kết N
mô (tPA) gen (chất tạo tơ huyết)
Erythropoietin (EPO)
Tác nhân chống thiếu máu Liên kết N và O

Nhân tố VII, VIII, IX Các tác nhân gây cục máu,

Liên kết N và O
và X bệnh máu loãng khó đông
Hormone kích thích
nang noãn (FSH), kích
Điều trị vô sinh Liên kết N và O
dục tố màng đệm ở
người (hCG)
Chống ung thư, điều hòa
Interleukin-2 miễn Liên kết O
dịch, điều trị HIV
 Một số protein dùng làm dược phẩm được sản xuất
bằng nuôi cấy tế bào động vật có vú
Loại
Protein dược liệu Chức năng
glycosylation
Chống ung thư, điều hòa
Interleukin-2 Liên kết O
miễn dịch, điều trị HIV
Interferon-alpha Chống ung thư, điều hòa Liên kết N và
(IFN- ) miễn dịch O

Interferon-beta Chống ung thư, tác nhân

(IFN- ) chống virus

Interferon-gamma Chống ung thư, điều hòa

Liên kết N
(IFN- ) miễn dịch
Nhân tố kích thích
khuẩn lạc bạch cầu hạt Chống ung thư Liên kết O
(G-CSF)
Kháng thể đơn dòng Trị liệu và chẩn đoán Liên kết N
 3. Các sản phẩm thương mại của nuôi cấy tế
bào động vật có vú
• Sản xuất chủ yếu là sản phẩm glucoprotein
• Chỉ kinh tế khi các sản phẩm có giá trị cao
(>USD 106/kg): VD: kháng thể đơn dòng... 
thường sử dụng làm dược phẩm
• Tế bào động vật chứa enzyme
glycosyltransferase và glycosidase nên có khả
năng glycosyl hóa một phân tử protein (hậu dịch
mã) ở mạng lưới nội chất và bộ máy Golgi
• Một số protein không cần glycosyl hóa như
Insulin, haemoglobin, hoocmon sinh trưởng ở
người ... có thể sử dụng vi khuẩn để sản xuất
4. Glycosyl hóa protein (glycosylation)
• Các glycoprotein có trình tự amino acid giống nhau,
nhưng các cấu trúc oligosaccharide khác nhau được
gọi là các glycoform
• Hầu hết các protein hiện diện trên bề mặt tế bào, virus,
và trong máu của các động vật được glycosyl hóa
• Vi khuẩn không glycosyl hóa các protein của chúng
(hoặc đúng hơn là có các loại liên kết peptide-đường
hoàn toàn khác với động vật)  không sử dụng
• Đường có thể được liên kết với protein thông qua các
nhóm amide của asparagine (Asn) trong chuỗi peptide
ngắn Asn-X-Ser/Thr (Threonin- T)
• Glycosyl hóa là một dạng của sự biến đổi hậu dịch mã,
tức là biến đổi hóa học của protein sau khi protein
được dịch mã từ RNA
 5. Môi trường nuôi cấy tế bào động
vật có vú
• Môi trường tự nhiên: máu, huyết tương, nước ối ,
dịch chiết của phôi...
• Môi trường tổng hợp: cần có huyết tương (serum) +
dung dịch sinh lý (các loại muối)
• Thành phần cơ bản
– Ion vô cơ căn bản (Na, Ca, K,...)
– Áp suất thẩm thấu phải chính xác
– pH chính xác (7-7,3)
– Nguồn năng lượng từ glucose
– Có phenol để theo dõi pH
– Huyết tương: 5-10%
– Chất kháng khuẩn và kháng nấm
 Đặc điểm nuôi cấy tế bào
động vật
• Kỹ thuật phức tạp khó thực hiện;

• Phục vụ cho phòng và chữa bệnh;

• Dễ ứng dụng cho con người, nhạy cảm

đối với vấn đề xã hội;

• Nhiều ứng dụng trong chăn nuôi.

 Những khó khăn của nuôi cấy tế
bào động vật
• Không có tính toàn thế (totipotency)

• Phát sinh số bội thể trong quá trình nuôi cấy

• Chết theo chương trình (apotosis)

* Sinh sản rất chậm : 15 - 40h tăng gấp đôi số lượng

* Nhạy cảm đối với môi trường nuôi cấy

- Nhiệt độ 35-39oC;

- Oxygen cần ổn định;

- Ít va chạm khi khuấy.

 6. Nuôi cấy tế bào động vật có vú
trên quy mô lớn
• Điều kiện chung
 Do quá trình trao đổi chất trong tế bào động vật
diễn ra chậm nên sinh trưởng của TB chậm;
 Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng
phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men;
 Chúng không có thành tế bào rất dễ biến dạng
và vỡ  khuấy bằng cánh khuấy hình mái chèo,
cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua
ống silicone, sử dụng hệ lên men cải tiến;
Đối với các tế bào bám dính nên sử dụng hệ
thống microcarier.
 6. Nuôi cấy tế bào động vật có vú
trên quy mô lớn
• Phương pháp nuôi
Nuôi cấy theo mẻ (batch culture)
 Nuôi cấy mẻ có cấp dinh dưỡng (fed-batch
culture)
 Nuôi cấy thể ổn định hóa tính: Nuôi cấy
chemostat là kiểu nuôi cấy có sự bổ sung
liên tục môi trường sạch và sự chảy ra của
chất lỏng nuôi cấy, đồng thời giữ thể tích
nuôi cấy không đổi
 Nuôi cấy perfusion
Thiết bị nuôi
» Bình Broux
» Bioreactor
 Thiết bị nuôi

Các loại bình nuôi cấy tế bào động vật

(A) Bình T-flask
(B) Bình spinner loại 0,5 L
Nuôi cấy tế bào động vật trong hệ lên
men 50 L
Các phương pháp nuôi cấy tế bào động vật có vú

- Mũi tên trống

chỉ dòng chảy môi
trường
- Mũi tên đen dày chỉ
dòng chảy của dịch
nuôi cấy có sinh khối,
- Mũi tên xám nhạt chỉ
dịch nuôi cấy đã tách
sinh khối ra.
 6.6. Số lượng và chất lượng sản phẩm
• Hoạt tính sinh học của sản phẩm được tinh sạch từ
nuôi cấy tế bào động vật có vú tùy thuộc vào những
biến đổi trong kiểu glycosylation hoặc sự phân giải
protein;
• Hai thông số này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi
trường (kiểu nuôi cấy, thành phần môi trường, pH,
oxy hòa tan...;
• Hiệu suất toàn phần của nuôi cấy động vật có vú
cũng phụ thuộc vào điều kiện nuôi;
• Số lượng sản phẩm được sản xuất trong quá trình
nuôi cấy có thể biểu diễn bằng phần trăm của
lượng protein tổng số được sản xuất;
• Nuôi cấy tế bào động vật có vú thành công nhất
(nồng độ và hiệu suất) là để sản xuất kháng thể đơn
dòng với các tế bào hybridoma hoặc myeloma.
 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào
động vật
• Vaccine virus: bại liệt, viêm gan B, quai bị,
sởi, bại liệt, lở mồm long móng gia súc...

• Protein: interferon, kháng thể, hormon

• Protein trị liệu:

• Protein tái tổ hợp

• Hormone

• Virus diệt côn trùng

 Hybridoma và kháng thể đơn dòng

• Kháng thể đơn dòng: đặc

hiệu chống lại kháng
nguyên
• Tế bào bình thường: sinh
kháng thể, chết sau 1 thời
gian
• Myeloma (TB bạch cầu
ung thư): sinh sản vô hạn
nhưng không sinh kháng
thể
Hybridoma= tế bào bình
thường + myeloma
 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng
- Tăng độ nhạy trong xét nghiệm: thử kháng nguyên,
nhóm máu, tinh trùng, phát hiện thai, yếu tố đông
máu
- Chẩn đoán: bệnh ung thư, bệnh truyền qua đường
tình dục
- Trị liệu
- Thuốc hướng mục tiêu: gắn độc tố lên kháng thể
đơn dòng để chúng hướng đúng đến tế bào ung thư
- Kháng thể gắn các chất đồng vị phóng xạ
- Nghiên cứu
- Tinh sạch sản phẩm: enzyme, protein,...
 III. Công nghệ di truyền của các tế bào
động vật có vú
• Chuyển nạp và biểu hiện DNA ngoại lai trong tế bào eukaryote
nuôi cấy in vitro được bắt đầu cách đây hơn 30 năm
• Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã
được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động
vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp
hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen
này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới
việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen
• Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là
thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genom của
tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định
qua các thế hệ con cháu
• Kỹ thuật tế bào mầm phôi (embryo stem-ES) cũng đã có
những kết quả thành công bước đầu khi nghiên cứu chức
năng của gen
 CHUYỂN GEN VÀO ĐỘNG VẬT

Được tiêm vào

Trứng được cấy chuyển
nhân vào trong chuột
Plasmid mang gen Trứng chuột
hormon tăng
trưởng từ chuột
Lai mẫu thử Chuột sinh con
với plasmid
bằng Tách chiết DNA từ
Southern mô sinh thiết
blotting
Nếu có DNA
hormone tăng
trưởng ở
chuột, xét Giao phối chuột
nghiệm để có được con
hormon tăng cháu
trưởng ở mô
chuột
 Các phương pháp chuyển gen vào động vật

Phương pháp chuyển gen trực tiếp :

– Chuyển gen nhờ chuyển nhiễm (transfection)
– Chuyển gen nhờ lipofection
– Chuyển gen nhờ vi tiêm
– Chuyển gen nhờ súng bắn gen
– Chuyển gen nhờ xung điện

Phương pháp chuyển gen gián tiếp: nhờ virus

 *Chuyển gen nhờ chuyển nhiễm (transfection)
Nguyên lý:
 Các DNA ngoại lai được trộn với CaCl2 sau đó
được chuyển vào một dung dịch chứa ion
phosphat. Một phức hợp đồng ngưng kết
(coprecipitate) giữa canxi phosphat và DNA sẽ
được hình thành, phức hợp này sẽ được các tế
bào động vật có vú tiếp nhận khi nuôi cấy, kết quả
là có sự thể hiện gen ngoại lai trong tế bào.
 Kỹ thuật này có thể sử dụng để đưa bất kì
DNA vào tế bào động vật có vú với mục đích các
test thể hiện chuyển nạp hay biến nạp lâu dài.
 Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị
chọn lọc (VD aminoglycoside phosphatransferase)
để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp
nhận DNA).
 Chuyển gen nhờ lipofection

Nguyên lý:
 Sử dụng các lipid trung tính hoặc mang
cation để tạo thành các liposome. Phức
lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ
phóng thích ADN dính bám vào trong phần
bào tan (cytosol).
 Thiết kế tạo vector liposome thực chất là
tạo các phức hợp liposome - DNA. Phân tử
DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với
liposome tạo nên các phức hợp ổn định,
được sử dụng làm vectơ chuyển gen.
 Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của vectơ liposom

- Các liposome mang cation (lipofection) thích

hợp cho chuyển nạp gen in vitro với hiệu suất
trên 90% ở một số loài TB nuôi cấy

- Liposome được dùng để phân phối in vivo

và ex vivo các gen người tới TB đích thích
hợp
 Chuyển gen nhờ xung điện
Nguyên lý:

 Khi có một nồng độ tế bào cao và tạo ra một điện

thế cao trong một thời gian rất ngắn, lúc đó trên màng tế
bào xuất hiện các lỗ nhỏ, DNA có thể đi sâu vào trong tế
bào và ở một số tế bào chúng có thể tương tác với
genome của tế bào.
 Máy electroporation thường được lắp đặt một
công suất ổn định (và cả thời gian gây xung ổn định) với
các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm. Đối với hầu hết
tế bào, sự thiết lập như vậy đảm bảo 20-50% số tế bào
còn sống sau khi thực nghiệm chuyển DNA.
 Quá trình chuyển gen nhờ electroporation được
thực hiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào được giữ liên
tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ trên thành các tế
bào.
 Chuyển gen nhờ vi tiêm
Nguyên lý:
 Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào tiền
nhân (pronucleus) của hợp tử nhờ dụng cụ vi tiêm
với kim tiêm rất mảnh.
 Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt
nhất là chuyển vào một trong những pronucleus
của trứng đã thụ tinh trước khi chúng kết hợp với
nhau để tạo ra hợp tử lưỡng bội.
 Nếu tiến hành chuyển gen ở các giai
đoạn muộn có thể tạo ra phôi khảm: chỉ có một số
tế bào có gen chuyển vào.
 Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn
tiền nhân, gen chuyển vào sẽ được truyền cho các
thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con
cháu.
Thiết bị chuyển gen bằng vi tiêm
-Hiệu quả cao nhưng số lượng tế bào hạn chế do phải thao tác
trên từng tế bào một;
- Phương pháp này thường dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc
các tế bào phôi sớm
 Chuột
giao phối
Vi tiêm vào
dòng mẫm Động vật chuyển
gen
Trứng Tinh trùng
Rửa trứng thụ
tinh ra khỏi ống
Gene đã dẫn trứng
được
đưa vào
Trứng thụ tinh

Vi tiêm DNA ngoại

lai vào pronucleus

Pipette hút
giữ trứng

Cấy trứng vào

chuột giả

Chuột giả

Gene
Gen injected
được gắn into
vàothe male
trong
pronuclei
pronucleus của con cái
Con cháu

Phân tích DNA

Sự có mặt của các gen được

chuyển được thể hiện bằng
các đoạn PCR
 Quá trình vi tiêm

(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng
thí nghiệm.
(2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống
dẫn trứng.
(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm.
(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời
con non có gen đã chuyển.
(5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non
có tính ổn định di truyền về tính trạng
38 mới.
 Phƣơng pháp dùng các viral vector
• Nguyên lý:
Khi xâm nhiễm vào tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen
của nó vào tế bào chủ. Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen
hoặc một số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ, tạo thành
một thể thống nhất. Các gen virus gắn với bộ gen của tế bào
chủ có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia của tế
bào chủ, tạo nên các provirus.
 Phương pháp dùng các viral vector
• Đây là các cấu trúc tái tổ hợp trong đó một hoặc nhiều
gen của virus đƣợc thay thế bởi DNA tạo dòng
• Chuyển nạp gen đặc trƣng mô hoặc tế bào thực hiện
bằng cách chọn lọc các điểm thụ cảm của tế bào đặc
hiệu virus. Một đặc điểm của viral vector là điều hòa
biểu hiện gen khi có mặt promoter và enhancer của
virus.
• Các viral vector có nguồn gốc từ hầu hết các virus
DNA,
• Kích thƣớc của đoạn chèn (insert DNA) thay đổi từ 2-3
kb ở các papovavirus tới > 50 kb ở vaccinia.
• Các viral vector có thểcho phép biểu hiện trong thời
gian ngắn và gần nhƣ 100% ở điều kiện in vitro.
• Nồng độ DNA dùng trong thí nghiệm chuyển gen thay
đổi từ 1 ng đến 10 μg cho 105-106 tế bào nhận
SƠ ĐỒ CHUYỂN GEN NHỜ VIRUS
Siêu cấu trúc của Retrovirus env
Retrovirus vector
Các điều kiện cần thiết cho biểu hiện gen
ngoại lai
• Tùy thuộc vào các nhân tố điều hòa: enhancer và
promoter trình tự cis 5’ và các nhân tố phiên mã
tác động trans (transacting) của tế bào vật chủ.
• Điều kiện tối thiểu là phải có vùng khởi đầu sao
chép (ori) vi khuẩn, promoter vi khuẩn và gen chỉ
thị chọn lọc hoặc sàng lọc để phân lập DNA tái tổ
hợp đƣợc khuếch đại. Cần có các gen chỉ thị
chọn lọc để sàng lọc gen
• Các hiểu biết ban đầu về cơ chế phức tạp và tinh
vi của sự điều hòa gen là cơ sở để chuyển nạp
gen thành công ở điều kiện in vitro và in vivo.
 Các điều kiện thực nghiệm tối ưu

• Các thông số cần xác định: Số lƣợng tế

bào, Nồng độ DNA, Điều hòa biểu hiện
gen trong các tế bào nhận, Chọn lựa các
hệ thống phân tích.
• Xác định đặc trƣng điều hòa của gen trong
các môi trƣờng tế bào khác nhau bằng cách
phân tích biểu hiện tạm thời nhƣ CAT, B-
GAT, hoặc GFP.
• Để phân tích biểu hiện ổn định bền vững
có thể sử dụng các gen chỉ thị nhƣ β-gal,
hoặc các gen đánh dấu chọn lọc như neo.
4. Đồng chuyển nạp gen chỉ thị và gen thử
nghiệm
• Chuyển nạp gen bằng cách dùng hai
plasmid, một mang DNA quan tâm và một
mang gen chỉ thị, nhƣ neo, -gal, luc hoặc
gfp, vào trong các tế bào động vật có vú
thƣờng đánh dấu các tế bào biểu hiện
DNA ngoại lai.
• Nếu gen chỉ thị hoặc gen chọn lọc đƣợc
biểu hiện trong tế bào nhận, thì gen thứ
hai (gen quan tâm) cũng sẽ đƣợc biểu
hiện.
ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT

a.Sản xuất thịt b.Sản xuất len

Lợn siêu nạc

Cừu sản xuất len

47
c.Sản xuất sữa d.Giảm ô nhiễm photpho – Lợn enviro-pig

Bò sữa
Lợn enviro-pig

e.Sản xuất Biosteel f.Động vật thủy sinh chuyển gen

Dê sản xuất biosteel Cá chuyển gen

48
 g.Côn trùng chuyển gen h.Ứng dụng trong y học

Ruồi dấm
Gà chuyển gen để nghiên cứu
quá trình phát triển phôi

i.Kháng bệnh trong thú y

49
 5. Kỹ thuật tế bào mầm phôi, chuyển gen
và tái tổ hợp tương đồng
 Là kỹ thuật đƣa DNA ngoại lai vào các tế bào mầm phôi
(embryonic stem-ES), còn gọi là tế bào gốc
 DNA ngoại lai có thể đƣợc đƣa vào trong các tế bào ES
bằng một số phƣơng thức sau: xung điện, chuyển nhiễm
hoặc vi tiêm. Sau đó, các tế bào chọn lọc đƣợc đƣa trở lại
vào trong túi phôi và đƣợc dính vào trong con cái mang thai
giả cho phép phát triển tới kỳ hạn sinh đẻ
 Chúng tạo ra các thể khảm vì các tế bào mang gen đƣợc
biến nạp chỉ chiếm một tỷ lệ nhất định của sinh khối tế bào
bên trong của túi phôi
Ý nghĩa: nhờ ƣu điểm thực tế là DNA ngoại lai có thể đƣợc
thiết kế để tái tổ hợp tƣơng đồng với bản sao nội sinh của nó
 Chuyển gen động
vật.
(a) Sinh sản của các động vật
chuyển gen bằng các phƣơng thức
thao tác tế bào ES.
(b) Tiếp theo việc chuyển DNA,
các tế bào ES mang thể tái tổ hợp
tƣơng đồng có thể đƣợc chọn lọc
trƣớc khi đƣa vào trong túi
phôi.
Tái tổ hợp DNA và tạo động vật
chuyển gene
 Tính trạng chuyển gene ở vật nuôi

• Năng suất

• Hormone tăng trƣởng

• Kích thích sự tăng trƣởng cơ

• Tăng năng suất tạo lông ở cừu

Transgene -> Gene
coding for a growth
hormone
Alba, the EGFP (enhanced GFP) bunny
Created in 2000 as a transgenic artwork
http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor
Transgenic Pigs Pass on the Transgene

http://news.aol.com/story/_a/glowing-pig-passes-genes-to-
piglets/20080109143909990001?ncid=NWS00010000000001
 Naturally Occurring GDF8 Mutants

http://www.canada.com/victoriatimescolonist/story.html?id=67f15c17-2717-4022-bb76-1b982456e793&k=94653
http://www.bbc.co.uk/science/genes/gene_safari/wild_west/bigger_and_better02.shtml
IV. Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất
cơ quan người
• Khả năng sử dụng tế bào ES trong nghiên cứu y sinh
học đã hé mở một lĩnh vực ứng dụng mới đó là “y học
tái tạo” bắt nguồn từ tính đa năng của chúng
• Năm 1981, Martin và Evans cùng lúc phát hiện thấy rằng
các tế bào ES của chuột có khả năng phân chia vô hạn
mà không phân hóa
• Năm 1998, Thomson và cộng sự đã phân lập đƣợc tế
bào ES từ phôi ngƣời và nhận thấy chúng khác với tế
bào gốc của chuột ở nhiều điểm
• Hai tính chất của tế bào ES ngƣời đa năng là khả năng
sinh sản vô hạn ở trạng thái phôi nguyên thủy trong điều
kiện in vitro, và khả năng phân hóa thật sự thành bất kỳ
loại tế bào trƣởng thành nào
Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất cơ quan
người
Ứng dụng của tế bào mầm phôi
• Nghiên cứu cơ bản
• Nghiên cứu chức năng gen
• Nghiên cứu các mô hình bệnh lý: Tế bào
ES là một nguồn in vitro đối với bất kỳ loại tế
bào nào của cơ thể, vì thế chúng có vai trò quan
trọng trong nghiên cứu độc chất học và quá
trình tìm ra các loại thuốc.
• Ứng dụng trong y học tái tạo: sử dụng để
cấy ghép mô
V. Công nghệ phôi động vật có vú
 Phôi là những thực thể
có hình thái rõ ràng và
đảm nhiệm chức năng
nhƣ giai đoạn trung gian
trong thời kỳ chuyển tiếp
giữa pha giao tử thể và
bào tử thể
Các thao tác trong công nghệ phôi
• Cấy truyền hợp tử
• Bảo quản phôi
• Nuôi cấy tạm thời phôi trong cơ thể sống

• Bọc phôi
• Kỹ thuật cấy phôi trong ống dẫn trứng
5.1. Cấy truyền hợp tử (Cấy truyền phôi)
 Định nghĩa
Cấy truyền phôi là một kỹ thuật lấy phôi từ
đƣờng sinh dục của con cái cho phôi và
cấy vào đƣờng sinh dục của con cái nhận
phôi.
Gồm các thao tác:
- Tách phôi thành hai hay nhiều phần.
- Phối hợp hai hay nhiều phôi thành một thể
khảm.
- Biến đổi các thành phần trong tế bào của
phôi khi mới phát triển.
Một số dụng cụ cấy truyền
Một số hóa chất cần thiết

Lidocaine Penicillin FSH Prostaglandin

(Lutalyse)
 Các bước tiến hành cấy truyền phôi:
Con cái cho phôi Con cái nhận phôi
Bò nhận phôi
Bò cho phôi

Gây động
dục đồng
Gây
pha động
dục
Gây trứng
Gây rụng rụng trứng
nhiềunhiều đồng
pha Gâyđộng
Gây độngdục
dục đồng
đồng phapha
với
Phối giống vớibòbò cho
cho phôi
phôi
Phối giống

ThuThu
hoạch
hoạch phôi Cấy
Cấy truyền phôi
truyền phôi
Bògiống
con đực đực
giống phôi
Connhận
Bò cái nhận
phôiphôi có chửa
có chửa

ConBòcáicho
chophôi
phôicho
chosinh
sinhsản
sảnbình
bình
thường
thường hoặc lấy phôi lặp lại
lại
Đàn
Đàncon
connăng
năngsuất
suấtcao
caođược
đượcsinh
sinhra
ra
 5.2. Bảo quản phôi
 Nguyên tắc:
Dừng tất cả hoạt động chức năng bên trong tế bào

 Một số thay đổi phôi khi bảo quản lạnh:

 Giảm tốc độ hoạt động của enzyme
 Giảm độ hòa tan của các khí trong môi trƣờng
 Hình thành tinh thể nƣớc đá
 Tăng nhiệt độ tiềm ẩn
 Tăng nồng độ chất hòa tan trong môi trƣờng
Sự thay đổi hình thái tế bào trong điều kiện lạnh

Ấm Lạnh Rất lạnh

Biện pháp hạn chế tác động của làm lạnh
 Kiểm soát tốc độ làm lạnh
 Sử dụng chất bảo quản lạnh nhƣ:
-Glycerol
- Dimethyl sulfoxide
-1,2- propanediol (hay propylen glycol)
-1,2-ethanediol (hay ethylene glycol)
 Khởi phát sự tạo thành tinh thể nƣớc đá.
Trong thực tiễn:
Bảo quản lạnh phôi các loại vật nuôi ở nitrogen
lỏng
(-196oC)
 Một số dụng cụ trong bảo quản phôi

Bình nitơ lỏng Cryoloop

5.3. Nuôi cấy tạm thời phôi trong cơ thể sống

 Ống dẫn trứng của cừu, chuột, thỏ

 Tử cung của bò cái
 Xoang màng bụng (phúc mạc, periton) của
chuột
 Xoang ối phôi gà
Lưu ý: Tất cả các phôi đƣợc bọc trong một loại
chất bảo vệ (thƣờng là agar) để bảo vệ màng
trong suốt của phôi không bị tổn thƣơng.
 5.4. Kỹ thuật bọc phôi bằng agar
 Hoá chất: dung dịch agar trong 0,9% NaCl.

 Các bước:
•Đun nóng chảy agar
•Làm nguội agar ở 39oC
•Bọc agar quanh phôi (khi agar chƣa kịp đông)
 Lưu ý: Trƣớc khi bọc agar, các phôi đã mở lớp
màng trong suốt phải đƣợc nhúng vào huyết
thanh bê đƣợc đun ấm. Mục đích của thao tác
nêu trên là để không làm thƣơng tổn tế bào phôi.
 5.5. Kỹ thuật nuôi cấy tạm thời phôi
trong ống dẫn trứng
 Lấy một hoặc hai khối agar bọc phôi, chuyển
vào ống dẫn trứng của con cái, kèm theo một
lƣợng môi trƣờng tối thiểu.
 Con cái phải đƣợc tạm ngừng sinh dục, không
động dục hoặc không chửa trong thời gian nuôi
cấy. Trƣớc ngày thao tác cấy phôi, ngƣời ta tiêm
vào tử cung progestagen.
 Các phôi bình thƣờng sẽ đi vào tử cung ở giai
đoạn 8 đến 16 tế bào.
Ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi
Áp dụng đại trà với gia súc: Trâu, Bò, Lợn, dê
cừu...để sản xuất thịt, sữa.. Tạo giống bò sữa tại
Thanh Hoá, Đồng Nai
 Thụ tinh nhân tạo

Trong ống nghiệm

Thu trứng Trứng

Thụ tinh
Bò cái Elite
Tinh Hợp tử Phôi nang
Thu tinh dịch trùng
Phôi tiếp tục
Bò đực phát triển
Elite
 Hổ Siberia
(Trung Quốc, 2007) Gấu trúc (Trung
Quốc-2009)
Thụ tinh nhân
tạo

Voi (Thái Lan, 2007) Gấu túi koala

Tê giác (Hungary, (Australia,2006)
2007)
 VI. Nhân bản vô tính động vật có vú

KHÁI NIỆM
 Nhân bản vô tính (hay còn gọi là tạo dòng vô tính) là
quá trình tạo ra một một tập hợp các cơ thể giống hệt
nhau về mặt di truyền và giống bố (hoặc mẹ) ban đầu
bằng phƣơng thức sinh sản vô tính
 Sinh sản vô tính là sự sinh sản không kèm theo tái tổ
hợp di truyền, đƣợc thực hiện theo cơ chế phân bào
mitose, trong đó genome đƣợc tái bản nguyên vẹn
 Sử dụng nhân của tế bào sinh dƣỡng (tế bào soma) và
tế bào trứng đã loại bỏ nhân để tạo phôi vô tính trong ống
nghiệm. Sau đó cấy phôi này vào tử cung của con cái để
nuôi phôi vô tính thành cơ thể hoàn chỉnh.
 Nhân bản vô tính động vật thành công đã chứng minh
đƣợc tính toàn năng của tế bào động vật.
TÍNH TOÀN NĂNG Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Tế bào hợp tử
Trước 1997
Tế bào phôi ở giai đoạn sớm

Năm 1997, J.Wilmus và cộng sự Viện Roslin

đã tạo ra chú cừu Dolly.
1997 Thành công này khẳng định học thuyết về
tính toàn năng của tế bào không chỉ thể hiện ở
(cừu Dolly)
thực vật mà còn ở cả động vật.

Hiện nay việc ứng dụng tính toàn

năng của tế bào động vật thông
Ngày nay qua sử dụng tế bào gốc trong y
sinh học trị liệu – hƣớng mới trong
CNSH ĐV
2. Nhân bản vô tính ở động vật
Là kỹ thuật nhân nhiều cá thể từ những tế bào
vô tính (somatic cell)

Sơ đồ nhân bản
vô tính ếch
 3. Nhân bản vô tính cừu Dolly
Đây là công trình
của Wilmut,
Campbell và các
cộng sự (Ecosse,
Anh).
Chuyển
Dung hợp phôi

Cừu cái mặt trắng Phát triển thành phôi

Tế bào tuyến vú

Trứng chưa thụ tinh

Cừu cái mặt đen

Cừu Dolly sinh ngày 5/7/1996

 QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN BẢN CỪU DOLLY
• Lấy nhân của tế bào thượng bì tuyến vú của con cừu Dorset cho
dung hợp vào tế bào trứng đã loại bỏ nhân (1n) của một cừu khác (cừu
Black face –mặt đen) hình thành nên tế bào trứng chứa nhân tế bào
soma (2n).

• Nuôi cấy tế bào trứng này cho phát triển thành phôi.

• Sau đó cấy vào tử cung của một cừu khác (mặt đen) để “chửa” hộ.

• Sau 5 tháng cừu cái này đã sinh ra cừu con và được đặt tên là Dolly
có các đặc điểm giống hệt như cừu cho nhân (Dorset –mặt trắng)

Chuẩn bị Dung hợp Phân bàoNuôi phôi  cấy phôi  Sinh con nhân bản
Sơ đồ nhân bản vô tính cừu Dolly
 Bò Dewey
Bò cái đốm
Các tế bào
cho phát Trứng tách từ buồng trứng
triển trên
môi trường
nuôi cấy Loại bỏ nhân

Nhân của tế bào cho dung hợp với

trứng “rỗng” nhờ xung điện

7 ngày nuôi cấy Phôi chỉ chứa ADN

trong ống nghiệm của bò cái đốm

Chuyển phôi vào

bò cái đen Bò Dewey đốm
Trứng mất nhân từ con
cái tạo dòng
Tế bào trứng và DNA hợp
nhất với nhau và sự kích
hoạt môi trường nuôi cấy để Chó Snuppy lông
phôi phát triển đen được sinh ra

ADN từ tế
bào da
trong tai
Phôi phát triển
trong chó mẹ
lông vàng

Chó Snuppy
Khỉ Tetra Ngựa Prometea
Lợn Xena

Mèo Little Nicky Nhân bản người ?

 Nhân bản vô tính động vật
• Nhân bản các động vật khác

• Các ứng dụng

 Nhân bản vô tính động vật

• Nhân bản các động vật khác

• Các ứng dụng

 “CC” Carbon Copy
• 2001 – Cat
cloned
2002 – Rabbits cloned
2003 – Mule cloned

2004 – Bull serial-cloned

 NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT Ở VIỆT NAM

Từ 2006 đến nay, Viện công nghệ

sinh học bước đầu thành công trong
tạo phôi vô tính một số loài vật nuôi
và động vật hoang dã, quý hiếm
(chuột, trâu, bò nhà, bò tót, gấu, khỉ
và sao la).
HẠN CHẾ CỦA NHÂN BẢN VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT
Cừu
Con vật Chó Snuppy
- Tỷ lệ sống thấp Dolly
- Con vật mang thai có 1095 phôi
thể gặp nguy hiểm 123 con chó cái
277 trứng
- Tuổi thọ ngắn mang thai hộ
29 phôi
3 con cừu 3 con có chửa (1
- Xác suất thất bại cao Hiệu suất
duy nhất chó con chết ngay
Gần đây người ta đã phát hiện Dolly sống sau sinh, 1 con
có sự thoái hoá telomer (các
sót. chết sau 22 ngày,
trình tự cuối của nhiễm sắc thể còn sống sót 1 con
có tác dụng như “mũ bảo vệ” có tên Snuppy)
cho chuỗi ADN) - theo hướng Lão hóa
ngắn dần khi cơ thể già hoá. Khi
sớm, mắc
toàn bộ telomer bị tiêu huỷ, Sinh lý Viêm phổi
nhiễm sắc thể sẽ bị hỏng, cơ bệnh viêm
thể dễ dàng nhiễm bệnh và phổi…
chết. Người ta đã xác định 7 năm
được độ dài telomer của cừu Tuổi thọ (ĐC :11-12
Dolly ngắn hơn 20% so với năm)
con cừu sinh ra cùng ngày.
 Tài liệu tham khảo
• Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn công nghệ sinh học. Nhà xuất
bản Đại học Huế.
• Tài liệu trang web/google
 CHƢƠNG 8
CÁC ỨNG DỤNG TRONG
Y DƢỢC
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 I. Mở đầu

Văc xin

Ứng dụng
Hooc mon
CNSH trong
Y, Dƣợc Liệu pháp gen

Bộ kit chẩn
Kháng sinh đoán
 II. Vaccine
 Vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống nhƣợc độc làm kháng
nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể ngƣời
và vật nuôi là chủ yếu.
 Hạn chế: vaccine sống nhƣợc độc có khả năng quay trở lại
dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể
ngƣời và vật nuôi.
 Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp đã sản xuất đƣợc protein vỏ
của một số loại virus nhƣ virus bệnh dại và viêm gan B,
vaccine tả kiểu mới, vaccine sốt rét và vaccine bệnh
phong. .
 Sản xuất vaccine kỹ thuật gen là một lĩnh vực phát triển mạnh
hiện nay của công nghệ DNA tái tổ hợp. Đây là loại vaccine
đƣợc bào chế từ vi khuẩn đã đƣợc chuyển gen mã hóa tổng
hợp một protein kháng nguyên của một loại virus hay một loại
vi khuẩn gây bệnh nào đó.
 Mô hình sản xuất vaccine dựa trên cơ sở thực vật (vaccine thực
phẩm): chuyển một loại gen kháng nguyên của virus hoặc vi khuẩn
vào tế bào thực vật, gen này sẽ hoạt động trong cơ thể và biến thực
vật thành nơi sinh ra kháng nguyên. Khi những kháng nguyên này đi
vào cơ thể ngƣời thì hệ thống miễn dịch của ngƣời sẽ tự động sinh ra
kháng thể đặc hiệu tƣơng ứng.
1. Các phƣơng thức tiêm chủng vaccine hiện nay
1. Các vaccine bất hoạt
 Các vaccine bất hoạt đƣợc sản xuất từ các virus gây bệnh bằng cách
phá hủy độc tính của chúng bằng -propiolactone hoặc formalin nhƣng
vẫn duy trì khả năng sinh miễn dịch đầy đủ.
 Ƣu điểm: tƣơng đối an toàn và kích thích các kháng thể chống lại các
protein bề mặt của tác nhân gây bệnh.
 Các vaccine tiểu đơn vị đƣợc xem là một dạng vaccine bất hoạt
nhƣng có mức độ thấp hơn. Trong trƣờng hợp này, một phần của tác
nhân gây bệnh (nhƣ là protein bề mặt) đƣợc sử dụng để gây tạo
kháng thể nhằm trung hòa tác nhân gây bệnh.
 Khái niệm: Vaccine là chế phẩm có tính kháng
nguyên, dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động
nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số
tác nhân gây bệnh cụ thể.

Thành phần của vaccine

: Là cơ chất hóa học có khả năng gây ra trong cơ

thê sư trả lời miễn dịch

:Là những chất được bổ sung vào vaccine, có

khả năng kích thích sinh miễn dịch không đặc
hiệu nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn
dịch của vaccine
 Đặc tính cơ bản của vaccine

An toàn

Vô trùng, thuần khiết, không độc.

Hiệu lực
Vacxin có hiệu lực lớn là vaccin gây được miễn dịch ở mức độ cao
và tồn tại trong một thời gian dài.

Tính kháng nguyên

Kháng nguyên mạnh là kháng nguyên khi đưa vào cơ thể một lần
đã sinh ra nhiều kháng thể. kháng nguyên yếu là những chất phải
đưa vào nhiều hoặc phải kèm theo một tá dược mới sinh được một
ít kháng thể.

Tính miễn dịch

Tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm
nhập với đầy đủ độc tính.
Dựa vào thành phần kháng nguyên
Vaccine thế hệ I – vaccine toàn khuẩn (bao gồm kháng nguyên thân,
vỏ bọc và độc tố )
Vaccine thế hệ II: Trong vacxin chỉ chứa một số thành phần gây
bệnh của mầm bệnh
Vaccine thế hệ III-Vaccine tái tổ hợp :vaccine được sản xuất bằng
nghệ gen

: Vaccine chứa kháng nguyên đã được vô hoạt

Vaccine vô hoạt không có bổ trợ
vaccine vô hoạt
bằng các yếu tố vật lý (Nhiệt độ, tia tử ngoại,
sóng siêu âm
:Vaccin chứa chất bổ trợ : phèn axit,
chuaformol…v.v..))

vaccine nhược độc :Vaccine vaccine chứa mầm bệnh được làm
nhược độc hoặc vô độc, nhưng vẫn bảo toàn
tính kháng nguyên.
 PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT VACXIN
1.1. Các phƣơng pháp truyền thống

Vacxin vi khuẩn chết: dùng các tác nhân diệt khuẩn nhƣ
các hóa chất (formalin, alcool, aceton), tia cực tím, siêu âm…

Vacxin từ vi khuẩn sống giảm độc: dùng phƣơng pháp cấy

chuyền vi khuẩn nhiều lần trong môi trƣờng nuôi cấy

Độ vô trùng
Nồng độ
Khả năng gây miễn dịch
 1.1.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated vaccine):

Là vaccine chế từ tác nhân gây bệnh

đã làm giảm tính độc bằng các tác
nhân vật lý, hóa học…nên không gây
bệnh, nhƣng vẫn còn khả năng sinh
sản và kích thích cơ thể tổng hợp
kháng thể bảo vệ.

Ƣu điểm: Gây được đáp ứng miễn

dịch dài hạn, không cần tiêm nhiều lần
Khuyết điểm: Có thể gây bệnh nhẹ, có
thể chuyển thành dạng gây bệnh,virus
có thể bị chết, cần bảo quản lạnh,có
thể gây bệnh ung thư
1.1.2. Vaccine bất hoạt (inactivated vaccine)

-Vaccine chứa các tác nhân gây

bệnh đã bị giết chết bằng hóa chất
(β-propiolacton hoặc formalin) hoặc
đun nóng. Do VSV đã chết, không
nhân lên đƣợc nữa nên lƣợng kháng
nguyên đƣa vào cơ thể phải lớn.
-Ƣu điểm: An toàn
- Nhƣợc điểm: Gây đáp ứng miễn
dịch không hoàn toàn và ngắn hạn,
phải tiêm nhắc lại nhiều lần .
.

1.1.3. Vaccine dƣới đơn vị (subunit/subvirion)

hay vaccine dƣới thành phần

Loại vaccine này không dùng toàn

bộ tế bào vi khuẩn hay toàn bô virus
mà chỉ dùng một số thành phần có
tính kháng nguyên của chúng.

Ví dụ HBsAg của virus viêm gan B,

hay hemaglutinin của virus cúm.
Vaccine này có tính an toàn nhƣng
tính công hiệu không cao
1.1.4. Vaccine giải độc tố

-Một số vi sinh vật gây bệnh (vi

khuẩn bạch hầu, uốn ván) sinh ra
ngoại độc tố. Khi bị nhiễm, các độc
tố này sẽ gây ra triệu chứng bệnh.
Do vậy, cần tạo đáp ứng miễn dịch
(ĐƢMD) chống độc tố chứ không
phải chống kháng nguyên
- Có thể dùng nhiệt hoặc formadehyt
làm biến đổi hóa học để mất độc
tính, nhƣng vẫn còn tính kháng
nguyên. Lúc đó gọi là giải độc tố
-Muốn tạo ĐƢMD có hiệu quả cần
phải tiêm nhắc lại nhiều lần
1.1.5. Vaccine kháng kháng thể idiotyp
(anti – idiotype antibody)
- Kỹ thuật Idiotype là cấu trúc không
gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng
nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên
tƣơng ứng
- Anti – idiotype là các kháng thể đặc
hiệu đối với idiotype, do đó anti –
idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tƣơng
tự với kháng nguyên.
- Vậy thay vì dùng kháng nguyên X làm
vaccine, ngƣời ta dung idiotype anti-
anti-X
Ví dụ: KN: Salmonella KT :anti-Salmonella
KN: anti-Salmonella KT:anti- anti-Salmonella

dùng anti-anti-Salmonella làm kháng nguyên thi sẽ an

toàn hơn.
Nhược điểm của vaccine truyền thống

- Chỉ một sô ít vaccine được sản xuất do không phải mọi tác
nhân
gây bệnh đều có thê được nhân thành sô lượng lớn đu đê sản
xuất vaccine.
- Cần phải nuôi tê bào người hoặc động vật rất tốn kém đê
sản xuất vaccine tư virus ở người va động vật.
- Cần có biện pháp an toàn khi thao tác với sô lượng lớn tác
nhân gây bệnh

- Các chủng nhược độc có thê trơ lại trạng thái cường độc.
- Việc bất hoạt có thê không hữu hiệu gây lan truyền bệnh
bởi vaccine.
Thời hạn sư dụng ngắn va cần điều kiện bảo quản lạnh.
 Vaccine tổng hợp
• Vaccine sống giảm độc lực sản xuất bằng kỹ
thuật di truyền
• Vaccine chứa KN sản xuất bằng phƣơng pháp
tái tổ hợp
• Vaccine vector
• Vaccine ADN
• Vaccine dựa trên cơ thể chuyển gen. Sản xuất
cây chuyển gen nhờ Agrobacter tumefaciens
• Vaccine bào tử
C. một số loại DNA vaccine
Gen mã hóa
cho KN

Đưa plasmid vào VK nhơ tiếp hợp

Agrobacter tumefaciens

Tê bào thực vật

Cây hoàn chỉnh

Phân tích mức đô biểu hiện

Phân tích kha năng sinh miễn dịch

 Bào tƣ có cấu trúc đặc biệt gồm nhiều lớp màng dày kho thắm bao bọc, có
kha năng đê kháng cao với các tác nhân vật ly, hóa học va đặc biệt có kha
năng chịu nhiệt (chứa canxi dipicolinat).

Bào tƣ vi khuẩn lần đầu tiên đƣợc Lê.H.Đức va Simong M. Cutting sƣ dụng
làm vật tải vaccine. Họ tiến hành gắn kháng nguyên làm mảnh C của độc tô
uốn ván TTFC (tetanus toxin fragment C) vào vỏ bào tử Bacillus subtilis để
gây miễn dịch theo đƣờng uống và đƣờng hô hấp (hít) cho chuột và đã tạo
đƣợc đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc va miễn dịch hê thống.

Ƣu điểm của bào tử Bacillus là dễ nhân lên, bảo quản lâu dài, thao tác di
truyền đơn giản nên sẽ trở thành một loại chất tải vaccine rất hấp dẫn.
2. Vai trò của công nghệ DNA tái tổ hợp trong nhận
dạng, phân tích và sản xuất vaccine
2.1. Nhận dạng và tạo dòng các kháng nguyên có tiềm năng vaccine
 Nhiều tác nhân gây bệnh gần nhƣ không có khả năng nuôi cấy bên
ngoài vật chủ tự nhiên của chúng  cản trở cho các cách tiếp cận
truyền thống để phát triển liệu pháp vaccine.
 Ví dụ: virus viêm gan B (HBV), tác nhân gây bệnh giang mai ở ngƣời
(Treponema pallidum) và vi khuẩn gây bệnh phong (Mycobacterium
leprae) không thể sinh trƣởng trong điều kiện in vitro mặc dù chúng
có thể sinh sản trong các loại động vật mô hình  không thể tạo ra
các vaccine sống nhƣợc độc hoặc các vaccine bất hoạt
 Công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chuyển thông tin di truyền từ
những cơ thể “khó tính” này vào những vật chủ “dễ bảo” hơn nhƣ là
E. coli, nấm men hoặc tế bào động vật có vú.
 Đối với gen kháng nguyên bề mặt của viêm gan B: Trình tự nguyên
vẹn của genome HBV có kích thƣớc nhỏ hơn 10 kb. Bởi vậy, tƣơng
đối đơn giản khi thiết lập khung đọc mở để biểu hiện.
 Đối với bệnh sốt rét: các thoa trùng (sporozoite) sốt rét bị
chiếu xạ có thể bảo vệ chống lại bệnh sốt rét. Nhƣng giai
đoạn thoa trùng trong chu kỳ sống của ký sinh trùng sốt
rét chỉ sinh trƣởng với một lƣợng nhỏ, nên ngƣời ta cần
phải ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất
vaccine. Tuy nhiên, genome của ký sinh trùng sốt rét lại
lớn hơn genome của HBV hàng ngàn lần, vì thế ngƣời ta
đã gặp rất nhiều khó khăn trong việc thu thập các thông
tin về trình tự gen thích hợp và sản phẩm của nó để tạo ra
bảo vệ miễn dịch.
 Điểm khởi đầu của công nghệ DNA tái tổ hợp là xây dựng
thƣ viện DNA của cơ thể đƣợc nghiên cứu trong E. coli.
Thƣ viện cDNA hoặc genomic DNA có thể cung cấp các
phƣơng thức cơ bản để nhận dạng và phân lập các gen
quan tâm.
 2.2. Phân tích các kháng nguyên vaccine
2.2.1. Những yếu tố quyết định kháng nguyên tế bào B (B-cell epitopes)
 Phân tích cấu trúc của kháng nguyên vaccine có thể thu đƣợc các thông
tin giá trị trong việc phát triển vaccine. Chẳng hạn, hiểu biết về những
epitope (yếu tố quyết định kháng nguyên) chống lại các kháng thể trung
hòa có thể cho phép nghiên cứu loại vaccine peptide thích hợp.
 Phân loại: các epitope có thể liên tục hoặc gián đoạn.
- Các epitope liên tục là các peptide ở dạng xoắn ngẫu nhiên để các huyết
thanh miễn dịch cho epitope phản ứng với phân tử hoàn chỉnh từ trình tự
mà nó đƣợc bắt nguồn.
- Các epitope gián đoạn lắp ghép các phân tử đƣợc nhóm lại do cấu trúc
thứ cấp của protein. Một vài epitope trung hòa ở dạng liên tục trong khi
những epitope khác là gián đoạn.
2.2.2. Những yếu tố quyết định kháng nguyên tế bào T (T-cell epitopes)
 Các T lymphocyte có thể nhận diện các kháng nguyên ngoại lai nhƣ các
peptide đƣợc tạo thành trong sự phối hợp với phần ngoại bào của phân
tử MHC.
- Các tế bào T trợ giúp (helper T-cell) CD4+ nhận diện đƣợc kháng nguyên
tiếp hợp với MHC loại II,
- Các tế bào T độc hại tế bào (cytotoxic T-cell) CD8+ (CTLs) nhận diện kháng
nguyên liên kết với các phân tử MHC loại I. Đa hình di truyền của các phân
tử MHC loại I và II xác định sự đặc hiệu và ái lực của liên kết peptide trong
sự nhận diện của tế bào T.
2.3. Sản xuất các vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine)
 Nuôi cấy tế bào động vật có vú là phƣơng pháp thích hợp để sản
xuất các vaccine chống lại các tác nhân gây bệnh trong các tế bào
eukaryote, do quá trình glycosyl hóa protein là rất quan trọng để gây
ra phản ứng miễn dịch của HbsAg
 Vi khuẩn E. coli không phù hợp để tiến hành biến đổi hậu dịch mã
của một số vaccine quan tâm là do:
- Các hệ thống vi khuẩn không thể bổ sung carbohydrate là yếu tố
quan trọng trong đặc tính kháng nguyên và cấu trúc của nhiều
kháng nguyên bảo vệ của virus;
- Hiệu suất của kháng nguyên bề mặt trong vi khuẩn khá thấp và
protein hoàn toàn thiếu khả năng cuộn xoắn chính xác để lắp ráp
trong các tiểu thể có đƣờng kính 22 nm;
 Nấm men S. cerevisiae là một trong những hệ thống thích hợp cho
biểu hiện gen do nó không những cho hiệu suất protein hợp lý mà
còn tạo thành các tiểu thể 22 nm.
 Hƣớng nghiên cứu tiểu đơn vị là phƣơng pháp thích hợp nhất để
phát triển các vaccine mới.
3. Cải thiện và sản xuất các vaccine sống nhƣợc độc mới
3.1. Cải thiện các vaccine sống nhƣợc độc
 Các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phân tích độc
tính và đặc tính kháng nguyên ở mức độ phân tử, là cơ
sở thuận lợi để triển khai một hƣớng nghiên cứu thích
hợp hơn trong việc sản xuất các cơ thể nhƣợc độc để
công nghiệp hóa vaccine sống với các tính chất mong
muốn.
 Các virus loại DNA và các vi sinh vật khác có thể đƣợc
chuyển gen trực tiếp hoặc gián tiếp. Tuy nhiên, các
virus loại RNA ở một mức độ nào đó khó giải quyết
hơn, mặc dù đã có một vài thành công với virus bại liệt
(poliovirus) và virus bệnh cúm (influenza), do độ rắn
chắc của genome virus.
3.2. Các vector sống tái tổ hợp
3.2.1. Các thể tái tổ hợp của virus vaccine
 Các virus vaccine cho bệnh đậu mùa đã đƣợc sử dụng hơn 150 năm
dƣới dạng vaccine sống nhƣợc độc.
 Ƣu điểm: Giá thành rẻ, sản xuất đơn giản, bảo quản không cần lạnh,
khả năng ổn định khi tiêm chủng và kích thích đáp ứng kháng thể
trung gian tế bào (cell-mediated).
 Hơn 1.000 thể tái tổ hợp vaccine khác nhau biểu hiện các gen của
virus, vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh ký sinh trùng đã đƣợc công
bố. Đa số trong chúng đã cho thấy khả năng bảo vệ ở các hệ thống
động vật mô hình chống lại các tác nhân gây bệnh. Thể tái tổ hợp
vaccine biểu hiện glycoprotein vỏ gp160 của HIV-1 đƣợc thử nghiệm
trên ngƣời cho thấy đã cảm ứng các đáp ứng miễn dịch đối với HIV
gp160. Tuy nhiên, các biến chứng kết hợp với liệu pháp vaccine và
việc tăng số lƣợng các cá thể riêng lẽ mang sự thiếu hụt miễn dịch
có thể giới hạn hữu ích của các thể tái tổ hợp đối với liệu pháp
vaccine ở ngƣời.
Hình 8.1: Virus đậu mùa đƣợc tái tổ hợp
trong tế bào động vật có vú với một gen
ngoại lai. Các virus đậu mùa đƣợc sinh
sản bao gồm cả hai dạng: hoang dại và tái
tổ hợp. Các virus tái tổ hợp đƣợc phân lập
và sử dụng để phát triển thành một loại
vaccine an toàn và hiệu quả
3.2.2. Các vaccine tái tổ hợp BCG
 Vaccine BCG (Bacillus gây bệnh lao xƣơng của
avirulent) là loại vaccine đƣợc sử dụng rộng
rãi nhất trên thế giới. Từ 1948 đến nay hơn 5 tỷ
liều vaccine đã đƣợc tiêm chủng.
 Ƣu điểm: Chỉ hai vaccine BCG và vaccine polio
uống mới đƣợc WHO khuyến cáo dùng cho trẻ
em mới sinh và ngƣời trẻ tuổi
 Chủng ngừa riêng rẽ với BCG tạo ra một miễn
dịch trung gian tế bào bền vững đối với bệnh
lao là rất hiệu quả. Mặc dù, các vector loại
phage và plasmid đã đƣợc sử dụng có một vài
thành công nhƣng những nghiên cứu tiếp theo
vẫn còn đƣợc tiến hành để có thể hƣớng tới
các mức độ biểu hiện cao và cho phép hệ
thống đƣợc thao tác dễ dàng hơn.
3.2.3. Các chủng Salmonella nhƣợc độc (vaccine vi khuẩn sống)
 Công nghệ DNA tái tổ hợp có khả năng đƣa toàn bộ các đột
biến hoặc đoạn khuyết vào các chủng vi khuẩn khác nhau để
làm yếu độc tính của chúng.
 Các vaccine nhƣợc độc đƣợc thiết kế hợp lý dùng nhƣ là các
chất mang cho các kháng nguyên đƣợc tạo dòng từ các cơ
thể gây bệnh khác.
 Các chủng Salmonella nhƣợc độc đƣợc xem là một ứng cử
viên tốt cho hƣớng này do chúng có thể đƣợc dùng nhƣ một
vaccine uống để kích thích các phản ứng miễn dịch nội bào và
bài tiết trong vật chủ.
 Ví dụ, gen của tiểu đơn vị B không ổn nhiệt (heat labile B
subunit) ở enterotoxic E. coli đƣợc đƣa vào trong chủng
Salmonella nhƣợc độc AroA. Vi khuẩn Salmonella tái tổ hợp
này có thể cảm ứng các kháng thể IgG và IgA đối với tiểu đơn
vị B enterotoxic (cũng nhƣ Salmonella) trong các động vật
đƣợc chủng ngừa vaccine.
3.2.4. Các thể khảm của virus bại liệt (poliovirus)
 Poliovirus chủng Sabin type 1 sống nhƣợc độc là một
vacxine rất an toàn và hiệu quả, kích thích các đáp ứng
kháng thể tuần hoàn và bài tiết.
 Sự hiểu biết về cấu trúc tinh thể của virus cùng với khả năng
tạo virus từ các phân tử cDNA cho phép các vùng kháng
nguyên của các tác nhân gây bệnh khác đƣợc hợp nhất
chính xác trong tiểu thể virus ở hầu hết các vị trí kháng
nguyên.
 DNA mã hóa cho vị trí kháng nguyên chủ yếu của chủng
Sabin type 1 đƣợc thay bằng DNA của chuỗi peptide từ HIV-
1. Huyết thanh miễn dịch đối với peptide đƣợc xem nhƣ là
tiểu thể poliovirus tái tổ hợp và ngƣời ta nhận thấy trong các
nghiên cứu miễn dịch virus tái tổ hợp có thể cảm ứng rộng
rãi các kháng thể trung hòa anti-HIV.
3.2.5. Các chủng E. coli tái tổ hợp
 Chủng enterotoxigenic E. coli (ETEC) gây bệnh đi chảy ở lợn con và
một vài trƣờng hợp ở ngƣời (E. coli type huyết thanh O 157). Các vi
khuẩn này bám chặt vào ruột của vật chủ qua fimbrae liên kết bề
mặt để tiết độc tố ổn nhiệt (ST-toxin) và không ổn nhiệt (LT-toxin).
 Fimbrae là kháng nguyên mạnh và các vacxine đầu tiên chống
ETEC gồm có các tế bào hoàn chỉnh hoặc các dịch chiết vô bào
đƣợc làm giàu để chống lại fimbrae.
 Các vacxine đƣợc bào chế từ các chủng ETEC đã sinh ra các phản
ứng bất lợi đáng kể do các nồng độ cao của lipopolysaccharide và
các kháng nguyên vỏ trên bề mặt của chủng ETEC hoang dại.
 Chủng vi khuẩn E. coli K12 dùng nhƣ là một vật chủ để xây dựng
plasmid vector biểu hiện một hoặc nhiều loại kháng nguyên khác
nhau của fimbrae. Tuy nhiên, để sản xuất một vaccine có phạm vi
bảo vệ rộng thì cần đƣa vào các thành phần kháng độc tố. Các
plasmid vector đƣợc xây dựng bằng cách sử dụng promoter mạnh
của prokaryote biểu hiện cao LT toxin B subunit.
 4. Các hƣớng tiếp cận khác trong sản xuất vacxine
 4.1. Các DNA vaccine (miễn dịch di truyền)
- Các plasmid mang các gen đặc hiệu cho một hoặc nhiều
protein kháng nguyên có thể đƣợc dùng để tạo miễn dịch
(chủng ngừa).
- Các plasmid đƣợc phân phối bằng cách tiêm (thƣờng vào
cơ) đƣa gen trực tiếp vào trong một số tế bào và đƣợc hấp
thu bởi các tế bào lân cận nơi kim tiêm đƣợc đƣa vào hoặc
bằng súng bắn gen (các viên đạn vàng đƣợc bọc DNA của
plasmid) bằng cách đẩy các plasmid vào trong các tế bào
gần bề mặt cơ thể (thƣờng là da hoặc màng nhầy.
- Một khi vào bên trong tế bào, một vài plasmid tái tổ hợp sẽ
đi vào nhân và do gen đƣợc điều hòa bởi một promoter
mạnh của eukaryote, các tế bào sẽ tổng hợp các kháng
nguyên đƣợc mã hóa bởi plasmid
 Tối ƣu các đáp ứng miễn dịch
- Các đáp ứng đối với DNA vacxine thƣờng cần một lƣợng nhất định
của plasmid DNA ( 50 g/một lần tiêm) và hiệu quả miễn dịch không
bằng tiêm chủng tự nhiên với tác nhân gây bệnh hoặc đƣợc kích
thích bởi các vaccine sống nhƣợc độc.
- Các đáp ứng miễn dịch có thể đƣợc cải thiện bằng các phƣơng
pháp khác nhƣ dùng súng bắn gen để đƣa DNA vào tế bào. Phản
ứng miễn dịch đối với kháng nguyên bị ảnh hƣởng bởi DNA của
plasmid mang gen.
- Do DNA của plasmid (có nguồn gốc từ vi khuẩn) có tỷ lệ CG lớn
hơn so với DNA trong động vật có xƣơng sống, hơn nữa các đơn vị
CG trong plasmid của vi khuẩn có xu hƣớng không methyl hóa
(không gắn các nhóm methyl) trong khi ở động vật chúng thƣờng
đƣợc methyl hóa. Việc tăng số lƣợng các chuỗi kích thích miễn
dịch trong plasmid có thể sẽ khuếch đại tốt khả năng sinh miễn
dịch của các kháng nguyên đƣợc mã hóa trong DNA vaccine.
4.2. Các peptide vaccine
 Phân lập các tế bào nhánh (dendritic cells) từ
tủy xƣơng hoặc máu ngoại biên của ngƣời bệnh
và nuôi cấy chúng trong điều kiện in vitro.
 Các tế bào này sau đó đƣợc chèn peptide (hoặc
một nguồn kháng nguyên khác) và đƣa trở lại
vào trong ngƣời bệnh.
 Các tế bào hiện diện kháng nguyên chuyên
nghiệp này sau đó sẽ tạo ra một đáp ứng miễn
dịch hiệu quả mà không thể tạo ra bằng cách
khác.
 Liệu pháp miễn dịch này đƣợc tập trung nghiên
cứu để điều trị ung thƣ và có thể liên quan với
một vài loại tác nhân gây nhiễm.
 Hạn chế: mất nhiều thời gian và chi phí cao
4.3. Kháng các kiểu gen cá thể (anti-idiotypes)
 Anti-idiotype (anti-Id) cũng có thể tạo ra các vacxine
hiệu quả, vì các kháng thể tự chúng cũng hoạt động
nhƣ là các chất kháng nguyên (immunogens).
 Một đáp ứng miễn dịch tăng lên chống lại vị trí liên
kết kháng nguyên đơn nhất (unique antigen
combining site) của một kháng thể đƣợc gọi là một
phản ứng anti-idiotype và có thể tƣơng đồng cấu trúc
với kháng nguyên gốc đầu tiên. Khi hiện tƣợng này
xuất hiện thì kháng thể antiidiotype (đơn dòng hoặc
đa dòng) có thể gây ra một đáp ứng kháng thể nhận
dạng kháng nguyên gốc và do đó hoạt động nhƣ một
vaccine.
Vaccin chứa kháng nguyên
 Kháng thể là gì?
Kháng thể là những phân tử protein
đƣợc sản xuất bởi những những tế
bào lympho B khi có sự kích ứng đáp
ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên
cơ thể vật chủ .
III. Kháng thể đơn dòng
- Kháng thể đơn dòng: Các kháng thể chỉ đáp ứng với
một loại kháng nguyên chuyên biệt (chỉ với một độc tố
hay một siêu vi);
+ Chỉ nhận biết 1 epitope trên một kháng nguyên cho
sẵn;
+ Tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một 1 dòng thì
giống hệt nhau và đƣợc sản xuất bởi cùng một dòng
tƣơng bào (biệt hóa tƣ̀ lympho B);
- Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng dựa trên
nguyên lý sử dụng tế bào lai (giữa tế bào ung thƣ
myeloma với tế bào lympho B của hệ miễn dịch ở động
vật hoặc ngƣời) để sản xuất kháng thể.
Hạn chế của kháng thể đơn dòng:
- Hệ thống miễn dịch của con ngƣời nhận diện kháng thể
đơn dòng (KTĐD) (đƣợc sản xuất tƣ̀ tế bào B của chuột)
nhƣ là protein lạ nên tạo ra các kháng thể chống lại
chúng, thậm chí trung hòa chúng, làm hiệu quả của chúng
suy giảm đáng kể. Hơn nữa một số KTĐD khi tiếp cận và
bám đƣợc vào các kháng nguyên, chúng không trung hòa
hoặc phá hủy đƣợc các kháng nguyên gây bệnh;
- Thành phần kết hợp với KTĐD đƣợc đƣa vào cơ thể
ngƣời bệnh có thể bị tách và đi khắp nơi, gây nên các
phản ứng phụ và hậu quả khó lƣờng. Ngoài ra, với một số
khối u đƣợc bao bọc chắc chắn bở các lớp mạch máu
nuôi dƣỡng, KTĐD rất khố thâm nhập vào bên trong để
phá hủy;
- Giá thành đắt.
 Hƣớng khắc phục:
- Đƣa tế bào Lympho B của ngƣời vào cơ thể
chuột, các tế bào này sẽ tạo ra các KTĐD mà
hệ thống miễn dịch của ngƣời bệnh chấp nhận
nhƣ là của mình.
- Sƣ̉ dụng công nghệ gene và thay thế chuột
bằng các VK để tạo ra các KTĐD nhỏ hơn,
hoạt động hiệu quả hơn, gắn chặt các vật
mang hơn, dễ dàng thâm nhập các khối u và
giá thành rẻ hơn.
 Ứng dụng của KTĐD
- Phát hiện kháng nguyên, ức chế phản ứng đào thải khi ghép cơ
quan, chẩn đoán sự hình thành khối u, định hƣớng thuốc chữa
bệnh, tinh sạch protein…
- Thƣ̉ thai;
- Chẩn đoán bệnh AIDS: KTĐD phát hiện sƣ̣ hiện diện của HIV trong
máu các bệnh nhân mắc bệnh AIDS;
- Ghép tạng: KTĐD giúp xác định mô ngƣời cho có tƣơng thích với
ngƣời nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn dịch của bệnh
nhân thải loại mô ghép;
- Chữa trị ung thƣ máu bằng kháng thể đơn dòng Alemtuzumab:
+ Bệnh ung thƣ máu CLL là bệnh lý ác tính của dòng limpho B tăng
lên quá mức bình thƣờng về số lƣợng (chỉ dƣới 2% là của dòng
limpho T);
+ Khi bị bệnh đa số các tế bào máu sẽ phát triển thành các tế bào
bạch cầu limphocytes không bình thƣờng và không thể đảm nhiệm
chức năng của một bạch cầu chống lại bệnh tật;
Các ví dụ
1. Sản xuất hybridoma bằng cách dung hợp tế bào sinh
dƣỡng
 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nhƣng phải định kỳ làm lại sau mỗi
lần thu đƣợc kháng thể, vì ở điều kiện nuôi cấy trong ống
nghiệm, các tế bào thƣờng chỉ tiến hành một số lần phân bào
nhất định rồi bị hủy.
 Trong CNSH, kỹ thuật tế bào lai hybridoma (lai giữa tế bào
myeloma với tế bào lympho B) đã mở ra một phƣơng thức
mới trong miễn dịch học, để sản xuất vaccine hàng loạt.
- Tạo ra một loại tế bào lai có thể phân bào liên tục trong điều
kiện nuôi cấy, đồng thời lại có khả năng sản sinh ra kháng thể, từ
đó kháng thể đƣợc sản xuất ra với khối lƣợng rất lớn.
- Hiện nay, tế bào lách của chuột nhắt đƣợc miễn dịch chống
một loại kháng nguyên nhất định đã đƣợc sƣ̉ dụng. ra kháng thể
(Hình 8.2).
2. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
2.1 . Phân lập các gen immunoglobulin
 Phân lập và tạo dòng các gen immunoglobulin từ các tế bào B
(thuần thục hoặc chƣa thuần thục) và các tế bào hybridoma bằng
các cặp primer đặc hiệu nhờ kỹ thuật PCR.
 Vật liệu chủ yêu là mRNA vì mRNA chỉ chứa các exon mã hóa. Hầu
hết sự quan tâm đều tập trung vào việc phân lập và tạo dòng các
vùng immunoglobulin có thể thay đổi (immunoglobulin variable
regions) của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) chứa các vùng bổ
trợ xác định (complementarity determining regions-CDRs) cần thiết
trong liên kết kháng nguyên.
 Bằng cách liên kết các sản phẩm của các gen VH và VL các đoạn
chuỗi đơn có thể thay đổi (scFV) sẽ đƣợc tạo ra, các sản phẩm
protein của chúng có đủ khả năng để liên kết với kháng nguyên.
 Các cấu trúc scFV này có thể đƣợc đƣa vào trong các phagemid
vector để thể hiện ở bề mặt các bacteriophage dạng sợi kết đôi với
một protein vỏ không quan trọng hiện diện ở một đầu của phage
 F (ab): fragment antigen binding
F (c ) : crystallizable fragment

Cấu trúc của IgG1 với sƣ̣ kết hợp của chuỗi (H) và chuỗi (L)
 Sơ đồ các mảnh kháng thể lƣỡng cực không có phân tử Fc.
Schematic diagram of bispecific antibody fragments without Fc moiety
(A) Single Chain Variable fragment (scFv); (B) Two scFv fused with a linker
(BITE Technology); (C) diabody (Db).
2.2. Biểu hiện scFV trên bề mặt bacteriophage
 Các thƣ viện của phage trong E. coli TG1 đƣợc sinh trƣởng
trong môi trƣờng chứa glucose và helper phage (ví dụ
M13KO7) đƣợc bổ sung để gây nhiễm lần thứ hai (superinfect)
các vi khuẩn.
 Các tế bào bị gây nhiễm lần hai sau đó đƣợc ly tâm nhanh và
cho sinh trƣởng qua đêm trên môi trƣờng không có glucose
nhƣng có bổ sung ampicillin và kanamycin, trƣớc tiên cảm
ứng gây đóng gói phagemid biểu hiện scFV phối hợp với
protein của gen III và sau đó tạo thành phage.
 Các vi khuẩn nguyên vẹn đƣợc tạo tiểu thể bằng ly tâm và
phage đƣợc kết tủa từ các thể nổi với PEG. Các bƣớc này cho
phép tinh sạch và cô đặc phage thành stock để dùng trong
chọn lọc theo vòng tròn trên kháng nguyên
3. Kháng thể đơn dòng trong nghiên cứu Sinh-Y
- Các kháng thể đơn dòng dựa theo các chỉ thị tế bào chất và bề mặt tế bào có
một ảnh hƣởng không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn cho phép phát
triển các phƣơng thức trong điều trị;
+ Sự biểu hiện dƣ thừa của thụ thể đối với nhân tố sinh trƣởng biểu mô (EGFR -
Epidermal Growth Factor Receptor ) và các thụ thể liên quan, một sản phẩm của
proto-oncogene c-erbB-1, đƣợc tìm thấy là chỉ thị của sự tiên lƣợng nghèo nàn
trong các bệnh nhân mang ung thƣ biểu mô tế bào vảy hoặc u tuyến.
Cơ chế kháng EGFR của
kháng thể đơn dòng
(A) Các kháng thể đơn dòng liên
kết chặt chẽ với EGFR, khiến yếu
tố tăng trƣởng không liên kết đƣợc
với thụ thể, từ đó ức chế các con
đƣờng tín hiệu phụ thuộc EGFR;
(B) Tuy nhiên trong trƣờng hợp
KRAS bị đột biến, nó có khả năng
tự phát ra tín hiệu nội bào để kích
hoạt trở lại các con đƣờng tín hiệu
mà không phụ thuộc tín hiệu từ
Con đƣờng tín hiệu MAPK và cơ chế tác động
của thuốc kháng EGFR
(A): Ở tế bào bình thƣờng, tín hiệu bắt đầu từ thụ thể
yếu tố tăng trƣởng biểu bì (EGFR) bằng cách phối tử
(hình tam giác) gắn với EGFR và làm thụ thể này
chuyển sang dạng hoạt động. Từ đó kích hoạt các
protein trung gian truyền tín hiệu bao gồm RAS, RAF
và 13 MEK. Con đƣờng này dẫn đến tăng sinh tế
bào, sống sót tế bào, tăng sinh mạch, xâm lấn và di
căn;
(B): Kháng thể đơn dòng kháng domain ngoại bào
của EGFR (thuốc kháng EGFR: cetuximab và
panitumumab) ngăn chặn sự kết hợp phối tử với thụ
thể, từ đó chặn sự kích hoạt con đƣờng MAPK;
(C): Trong tế bào ung thƣ, đột biến gen KRAS và
BRAF dẫn đến thay đổi cấu trúc các protein này làm
nó luôn luôn trong trạng thái kích hoạt. Do RAS và
RAF là các protein nằm phía hạ nguồn của EGFR
nên tín hiệu vẫn luôn đƣợc kích hoạt cho dù bị chặn
bằng thuốc kháng EGFR.
- Phân tích miễn dịch bằng phƣơng pháp RIA và ELISA: dựa trên nguyên tắc
dùng kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên tƣơng ứng của nó
trong các mẫu phân tích nhờ phản ứng gắn rất đặc hiệu của kháng thể đơn
dòng với kháng nguyên
+ Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assays):

Sƣ̣ kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

ELISA là phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ sử dụng enzyme liên kết dùng để
phát hiện những hợp chất mong muốn (kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu
xét nghiệm), dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (Antigen) và
kháng thể (Antibody), trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho
thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thuỷ phân cơ chất thành một
chất có màu. Thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên
hay kháng thể cần phát hiện.
- Ức chế thải loại khi ghép cơ quan bằng cách sử dụng kháng
thể đơn dòng chống kháng nguyên đặc hiệu của tế bào
lympho T, nhằm loại bỏ phản ứng thải loại khi ghép các cơ
quan của ngƣời với nhau.
- Chẩn đoán hình thành khối u, khi có sự hình thành khối u
trong máu sẽ xuất hiện một số tác nhân đánh dấu. Do đó, có
thể sử dụng các phƣơng pháp phân tích miễn dịch để phát
hiện các tác nhân trên trong máu hoặc trên khối u.
- Định hƣớng thuốc chữa bệnh, lợi dụng khả năng các phân tử
kháng thể gắn rất đặc hiệu với tế bào ở vị trí xác định nào đó
của cơ thể (trong đó có tế bào ung thƣ) để định hƣớng thuốc
chữa bệnh hoặc độc chất tới trực tiếp khối u hoặc nơi cần
chữa trị nhƣ vậy sẽ tăng hiệu quả chữa trị lên nhiều lần.
4. Kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh: Dùng trong
 Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, dị ứng, rối loạn miễn
dịch. Dùng kháng thể đơn dòng là phƣơng tiện rất nhạy và đơn giản
để chẩn đoán có thai, các bệnh lao, phong...
 Chống thụ thai, làm triệt sinh ở gia súc, ngoài ra giúp chẩn đoán di
căn ung thƣ nếu có gắn thêm đồng vị phóng xạ;
 Thay thế các phƣơng pháp miễn dịch học và huyết thanh học truyền
thống trong các xét nghiệm nhƣ:
- Xác định lƣợng hormone để đánh giá chức năng nội tiết.
- Phát hiện một số protein có ý nghĩa để chẩn đoán khối u.
- Xác định vi khuẩn và virus gây bệnh.
- Phát hiện trong máu các cầu thủ, các chất kích thích bị cấm sử
dụng, kiểm tra nồng độ thuốc trong máu và các tổ chức cơ thể nhằm
bảo đảm liều thuốc dùng không quá ngƣỡng gây độc.
 Ức chế phản ứng đào thải khi cấy ghép cơ quan (ghép thận, truyền
tủy...). Dùng để phát hiện bệnh AIDS (hội chứng suy giảm miễn dịch).
 5. Liệu pháp gen
Liệu pháp gen (gene therapy) thực chất là phƣơng pháp chữa bệnh
bằng gen. Trong đó, gen trị liệu có thể là::
- Các gen hoạt động bình thƣờng (gen lành) có thể đƣa vào tế bào để
thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục hoạt động bình
thƣờng của tế bào và sự sống của cơ thể.
- Là những gen có khả năng mã hóa một protein đặc hiệu khi đƣa vào
tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu. Các protein đặc
hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào, kìm hãm
khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.
- Những gen khi đƣa vào tế bào hoạt động đồng thời với các gen bệnh
(gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động của gen bệnh
hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng
- Gen liệu pháp còn là các gen bất hoạt đƣợc đƣa vào tế bào thay thế
cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm không cần thiết
của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có tác dụng
chống lại bệnh tật.
- Gen trị liệu có thể là những đoạn oligonucleotide có tác dụng kìm
hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.
Các loại liệu pháp gen
(Gene therapy)
Có 2 loại:

- Liệu pháp gen soma

- Liệu pháp gen giao tử

(liệu pháp tế bào mầm).
5.1. Liệu pháp soma (somatic gene therapy)
- Điều trị thay thế hoặc sữa chửa gen hỏng, gen bệnh của các tế bào
soma trong cơ thể ngƣời bệnh, giúp ngƣời bệnh có thể có cuộc sống
bình thƣờng.
- Liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào nhƣ: tế bào
lympho (lymphocyte), nguyên bào sợi (fibroblast), tế bào gốc (stem
cells), tế bào gan (hepatocyte), tế bào biểu bì (keratinocyte)...
- Liệu pháp gen soma đến nay đã chữa và điều trị khỏi hoặc hạn chế
biểu hiện cho một số khá lớn ngƣời bệnh mang các bệnh hiểm nghèo
nhƣ: thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (SCID), ung thƣ, thiếu
máu hồng cầu liềm, xơ nang...
5.2. Liệu pháp gen tế bào mầm (germline gene therapy)
- Phƣơng pháp điều trị, sửa chữa hoặc thay thế gen hỏng cho các giao
tử (tinh trùng hoặc tế bào trứng) nhằm tạo ra thế hệ sau bình thƣờng.
- Liệu pháp này hiện nay còn là vấn đề đang đƣợc tranh luận ở nhiều
nƣớc trên thế giới chủ yếu vì lý do đạo đức và nhân đạo.
Cở sở của liệu pháp gen

Gắn Sử Chuyển
trực dụng gen
thông
tiếp vector
virus để qua
AND
đƣa phức
trần hệ hóa
vào TB gen
vào TB học
Các bƣớc cơ bản của liệu pháp gen
Liệu pháp gen: ex vivo, in vivo và in situ.
 Ex vivo

• Tế bào đích đƣợc loại bỏ khỏi cơ thể và

sinh trƣởng trong in vitro
• Các gen này sau đó đƣợc đƣa vào tế bào
nuôi cấy
• Các tế bào này đƣợc đƣa trở lại cùng một
cơ thể
• Ví dụ: tế bào nguyên bào sợi, tế bào sinh
huyết
 In vivo (truyền gen trực tiếp)

• Các gen trị liệu

đƣợc nhân
dòng trực tiếp ở
trong mô
• Ví dụ: Phổi, não
Vector virus trong chuyển gen
Đặc tính của vector virus
Các rào cản của quá trình truyền
vector
Cách thức xâm nhập của Retrovirus
Cách thức xâm nhập của Andenovirus
 Liposome
 Sử dụng các lipid trung tính hoặc mang
cation để tạo thành các liposome.
 Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương
sẽ phóng thích ADN dính bám vào trong phần
bào tan (cytosol).
 Thiết kế tạo vector liposom thực chất là tạo
các phức hợp liposom - DNA. Phân tử DNA có
điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom tạo
nên các phức hợp ổn định, đƣợc sử dụng làm
vectơ chuyển gen.
Sơ đồ cấu trúc và hoạt
động của vectơ
liposom
Cách thức xâm
nhập của liposome
 5.2. Các ứng dụng của liệu pháp gen
trong chữa bệnh
2.1. Bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (severe combined
immuno deficiency-SCID)
- Bệnh SCID là bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng ở
ngƣời, gây giảm sút sức khỏe hoặc có thể gây chết do dễ bị mắc
các bệnh truyền nhiễm khác.
- Bệnh SCID do rối loạn di truyền, gây mất chức năng tế bào miễn
dịch lympho T, lympho B, tế bào NK (tế bào giết tự nhiên, natural
killer cell)...
- Bệnh SCID ở ngƣời đƣợc chia làm hai nhóm:
+ Bệnh SCID liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (XSCID, chẳng hạn: sai
hỏng gen c nằm ở locus 13.1 trên cánh dài của nhiễm sắc thể giới tính
X của ngƣời)
+ Bệnh SCID do sai hỏng các gen (ADA, PNP, CD3 và ZAP 70...) nằm
trên nhiễm sắc thể thƣờng.
 5.2.1. Liệu pháp gen chữa bệnh
ADA-SCID
 Gen mã hóa enzyme adenosine deaminase bị hỏng, dẫn đến rối
loạn chức năng của các lympho T và B gây bệnh ADA-SCID.
Liệu pháp gen ex vivo gồm có bốn bƣớc cơ bản sau:
- Lấy các tế bào lympho T từ máu của bệnh nhân ADA-SCID.
- Thiết kế vector liệu pháp retrovirus mang gen ADA bình thƣờng.
- Trộn vector liệu pháp với tế bào lympho T để thực hiện quá trình
chuyển gen vào tế bào lympho T.
- Đƣa các tế bào lympho T mang gen liệu pháp trở lại cơ thể
ngƣời bệnh. Kết quả sau khi điều trị liệu pháp gen từ 5-6 tháng
số tế bào miễn dịch lympho T tăng dần lên, sau hai năm khả
năng miễn dịch của bệnh nhân đƣợc phục hồi.
 5.2.2. Liệu pháp gen chữa bệnh X-SCID
Liệu pháp gen điều trị loại bệnh này đƣợc thực hiện bằng
phƣơng pháp ex vivo để ghép tế bào tủy xƣơng. Tế bào
tủy xƣơng của bệnh nhân đƣợc lấy ra kết hợp xạ trị, sau
đó chọn lọc những tế bào khỏe để chuyển gen c bình
thƣờng nhờ retroviral vector. Kết quả sau khi điều trị từ
3-13 tháng thì 10/11 bệnh nhi đã khôi phục đƣợc các tế
bào lympho T, B và NK, khả năng miễn dịch tăng lên rất
dáng kể.
Liệu pháp gen SCID đã thành công ở Ý, Israel, Anh, Pháp
và Mỹ.
 Đột biến
 Đột biến của protein
IL2RG, gây ra bởi mất
mát hoặc có mặt của
chuỗi gamma

 Ở cuối tế bào T không

thể cung các tín hiệu tới
tế bào T hoặc NK dẫn
đến ngăn chặn các đột
biến của chúng
 ADA là enzym tác
động trong suốt quá
trình thiếu hụt ADA
Deoxyadenosine
đƣợc tích lũy nhƣ là kết
quả của ADA
 5.3. Bệnh ung thƣ
Ung thƣ là sự phát triển không bình thƣờng của tế bào, do sai
lệch hoặc đột biến một hoặc một số gen trong tế bào. Các tế
bào ung thƣ có quá trình phân chia vô tổ chức, không chịu sự
kiểm soát của sự chết theo chƣơng trình (apoptosis), tạo nên
các dạng khối u.
Nguyên nhân :
+ Do tế bào và cơ thể bị nhiễm virus gây ung thƣ và
+ Đột biến gen do ảnh hƣởng của các tác nhân vật lý và hóa
học (tia UV, chất gây phóng xạ, khói thuốc lá, chất độc hóa
học...).
Điều trị ung thƣ : xạ trị, hóa chất, các dạng độc tố miễn dịch
hoặc liệu pháp gen.
Trong điều trị ung thƣ nhiều cytokine đƣợc chú ý và thử
nghiệm, trong đó interleukin 2 (IL-2) có hiệu quả điều trị ung thƣ
cao, thời gian điều trị ngắn, ít gây các tác dụng phụ nhƣ điều trị
bằng hóa chất và xạ trị.
Liệu pháp gen (in vivo và ex vivo) là phƣơng pháp mới điều
trị ung thƣ có hiệu quả.
- Bằng kỹ thuật vi tiêm, ngƣời ta đƣa thẳng vào giữa khối u
các vector mang gen trị liệu tƣơng ứng, để ức chế hoặc
tiêu diệt các tế bào ung thƣ.
- Sử dụng nhiều loại vector liệu pháp khác nhƣ retrovirus,
adenovirus và plasmid.
- Liệu pháp gen điều trị ung thƣ bằng cách tác động trực tiếp
vào khối u, có thể đƣợc thực hiện theo nhiều phƣơng thức
khác nhau:
+ Ức chế phát triển của khối u bằng cách thực hiện các
liệu pháp ex vivo hoặc in vivo với các viral vector mang các
gen liệu pháp nhƣ p53, pRb...
+ Kích hoạt tế bào chết theo chƣơng trình bằng cách: sử
dụng các gen liệu pháp Bax tăng cƣờng gây kích hoạt chết
theo chƣơng trình, hoặc sử dụng gen Bcl-2 để ngăn chặn các
phản ứng chống apoptosis (anti-apoptosis).
 Trƣờng hợp apoptosis các tế bào co lại, tách khỏi các tế bào xung
quanh, các gen ced (gen tự sát-suicide gene) đƣợc hoạt hóa làm
cho tế bào teo dần rồi chết.
- Thực hiện các liệu pháp thay gen nhằm phục hồi các protein bị
hỏng, phục hồi khả năng miễn dịch của tế bào.
- Sử dụng liệu pháp antisense để kìm hãm hoạt động của các
oncogen, hoặc ức chế tác dụng các sản phẩm của oncogen.
- Hạn chế sự phát triển của khối u bằng vi tiêm các protein tiền
apoptosis (pro-apoptosis protein) nhƣ các protein BAX (sản phẩm
của gen Bax) hoặc interferon (TNF), kết hợp sử dụng xạ trị hoặc điều
trị hóa chất.
- Sử dụng các gen tự sát ced và các sản phẩm của nó để tiêm thẳng
vào khối u, chẳng hạn tiêm ganciclovir-sản phẩm của gen mã hóa
enzyme thymidin kinase có tác dụng tiêu diệt các tế bào ung thƣ.
- Biện pháp tác động trực tiếp vào tế bào ung thƣ bằng bao vây
thành mạch (anti-angiogenic). Đây là biện pháp chặn mối liên hệ về
mặt dinh dƣỡng của tế bào ung thƣ, làm cho tế bào ung thƣ thiếu
dinh dƣỡng và chết dần dần. Hiện nay, đã phát hiện hơn 40 hợp chất
tự nhiên có chức năng này nhƣ: endostatin, angiostatin...
 5.4. Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm
SCA (sickle cell anemia)
 Là bệnh do đột biến gen globin làm thay đổi chức năng phân tử
protein, xuất hiện hemoglobin S. Khi các phân tử hemoglobin S
trao đổi oxygen với các tế bào, có thể liên kết với nhau tạo các
cấu trúc hình que, làm cho hồng cầu biến dạng thành hình liềm.
 Hồng cầu liềm không có hình lõm hai mặt nhƣ hồng cầu bình
thƣờng, độ trơn kém không chui qua đƣợc các mao mạch,
thƣờng xếp lại thành đám gây tắc mao mạch gây cản trở quá
trình lƣu thông của máu. Sau một thời gian số lƣợng tế bào hồng
cầu bình thƣờng giảm dần, do các tế bào hồng cầu mới sinh ra
không bù đắp kịp số tế bào hồng cầu chết đi, trong máu thiếu một
lƣợng hồng cầu ngày càng lớn  bệnh thiếu máu hồng cầu liềm.
5.4.1. Vector liệu pháp sử dụng trong điều trị bệnh
SCA
Lentivirus vector là loại vector có hiệu quả nhất, vì
lentivirus giúp cho các gen liệu pháp hòa nhập rất tốt.
Nhiều loại virus trong họ lentivirus là nguyên nhân gây
nhiều bệnh hiểm nghèo ở ngƣời nhƣ AIDS, lao, ung
thƣ... nên sử dụng lentivirus làm vector liệu pháp còn
nhiều hạn chế. Các lentivirus có thể biến đổi rất mạnh và
nhanh, nên có thể gây các hậu quả không lƣờng trƣớc
cho cơ thể ngƣời. Do vậy, sử dụng các retrovirus quen
thuộc để thiết kế vector liệu pháp nhằm hạn chế bớt các
rủi ro.
5.4.2. Các bƣớc điều trị bệnh SCA bằng liệu pháp gen
- Tách tế bào tủy xƣơng của ngƣời bệnh và chiếu xạ để
chọn các tế bào khỏe mạnh, trộn chung với retrovirus vector
mang gen globin bình thƣờng để tạo các tế bào tủy xƣơng
tái tổ hợp.
- Xạ trị và điều trị hóa dƣợc để tiêu diệt bớt các tế bào tủy
xƣơng mang gen đột biến.
- Chuyển các tế bào tủy xƣơng mang gen globin bình
thƣờng vào bệnh nhân. Sau một thời gian các tế bào này
sinh trƣởng và bệnh thiếu máu giảm dần.
- Do lƣợng tế bào mang gen đột biến ( S globin) vẫn tiếp tục
đƣợc hình thành trong cơ thể ngƣời bệnh, nên sau một
thời gian nhất định mức độ bệnh thiếu máu lại tăng lên, do
đó phải lập lại các bƣớc điều trị gây nhiều tốn kém.
 5.5. Bệnh xơ nang (cystic fibrosis-CF)
 Nguyên nhân: do đột biến gen trên NST thƣờng (loại protein màng (CFTR)
bị mất chức năng), gây rối loạn trong chuyển hóa các ion Cl, làm mất cân
bằng giữa nƣớc và muối trong tế bào dẫn đễn chứng viêm phổi, viêm tụy,
viêm gan... gây giảm sút sức khỏe, có thể dẫn tới tử vong. Bệnh xơ nang là
một bệnh di truyền, tỷ lệ mắc bệnh là 1/2.500 ngƣời.
 Điều trị: bằng liệu pháp gen, gồm:
- Sử dụng vector liệu pháp mang gen trị liệu cDNA (do kích thƣớc gen CF rất
lớn nên chỉ tổng hợp cDNA từ mRNA mã hóa protein CFTR và một số trình tự
đặc hiệu) làm cho gen liệu pháp gắn với nhiễm sắc thể ở những điểm đặc
hiệu.
- Sửa chữa gen bằng vector mang các oligonucleotide để sửa chữa đột biến
trên gen CF.
- Sử dụng kỹ thuật episomal, nghĩa là chuyển các đoạn cDNA cần thiết vào
tế bào, sao cho cDNA vào nhân dính với hệ gen ở một điểm nào đó và tồn
tại nhƣ một đơn vị độc lập trong tế bào.
 5.6. Bệnh HIV/AIDS

Khái niệm: Bệnh AIDS (acquired immuno

deficiency syndrome) là hội chứng suy giảm miễn
dịch mắc phải do nhiễm virus HIV (human immuno-
deficiency virus), làm mất sức đề kháng của cơ thể
với các tác nhân gây bệnh, có thể dẫn tới ung thƣ
hoặc tử vong
 Các xu hƣớng điều trị nhiễm HIV/AIDS
+ Điều trị kháng sinh và biệt dƣợc (starudine,
lamirudine, nerirapine, azathioprine, antiretrovir...)
Cấu trúc của virus
HIV -1
Lây nhiễm HIV
+ Liệu pháp gen:
- Sử dụng vector liệu pháp để chuyển các gen trị liệu vào tế bào nhằm hạn chế khả
năng xâm nhiễm và tái bản của của HIV. Gồm hai loại: viral virus (adenovirus, AAV và
HIV1), non-viral virus (oligonucleotide, polycation, liposome...).
+ Kích hoạt hệ thống gen của tế bào, tăng cƣờng miễn dịch chống sự phát triển của
HIV/AIDS.
+ Sử dụng các gen tự sát ced đã biến đổi, làm cho tế bào bị chết khi có HIV xâm
nhiễm. Khi HIV mới xâm nhiễm tế bào, bằng liệu pháp đƣa các gen tự sát (ced)
thymidin kinase (tk) phối hợp sử dụng thuốc chống virus ganciclovir (GCV), tạo
thành phức hợp ganciclovir-phosphate. Ganciclovirphosphate ức chế hoạt động của
enzyme DNA polymerase, làm cho quá trình tái bản gen của tế bào bị ngừng, sự
phân chia tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại và chết dần. Tế bào nhiễm HIV bị chết,
sẽ hạn chế khả năng lây lan của HIV trong cơ thể.
+ Tạo các DNA vaccine phòng chống nhiễm HIV. DNA vaccine HIV-1 đã và đang
đƣợc thử nghiệm trên chuột có hiệu quả.
 6. Protein trị liệu
 Nhiều chất có hoạt tính sinh học dùng làm dƣợc phẩm
đƣợc tạo thành trong quá trình nuôi cấy tế bào động -
thực vật nguyên vẹn trong hệ lên men
(fermenter/bioreactor).
+ Ví dụ: Tổng hợp interferon trong quá trình nuôi cấy tế
bào nguyên bào bạch huyết (lymphoblast); kỹ thuật tạo
kháng nguyên làm nguyên liệu để sản xuất vaccine và tạo
kháng thể đơn dòng; sản xuất hormone... Tất cả chúng
đều là những sản phẩm y học cao cấp và có tƣơng lai rất
lớn.
 Đối tƣợng: hormone và enzyme
 6.1.Sản xuất hormone
6.1.1. Hormone sinh trƣởng ngƣời (human growth hormone-HGH)
- Hormone sinh trƣởng ngƣời là protein chứa khoảng 191 amino acid, thiếu
nó cơ thể ngƣời sẽ bị lùn.
- Hormone này đƣợc sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua E.
coli (cả insulin và hormone sinh trƣởng ngƣời là các protein tƣơng đối
đơn giản vì không bị glycosyl hóa và hoặc biến đổi nhiều sau dịch mã,
nên có thể dùng E. coli làm tế bào vật chủ đƣợc sản xuất chúng).
- Hormone sinh trƣởng ngƣời tái tổ hợp khác với hormone sinh trƣởng
ngƣời bình thƣờng một amino acid đó là do E. coli không có khả năng
loại bỏ gốc methionine khởi đầu, thông thƣờng amino acid này chỉ bị loại
sau khi dịch mã trong tế bào ngƣời.
- Là protein đƣợc sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp sớm nhất.
Trƣớc đây, muốn có chế phẩm này ngƣời ta phải tách chiết từ tuyến yên
của ngƣời chết. Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH và muốn chữa khỏi
cho một ngƣời lùn phải cần lƣợng HGH thu đƣợc từ 100-150 tử thi. Bằng
công nghệ DNA tái tổ hợp, ngƣời ta có thể thu nhận một lƣợng lớn HGH
từ vi khuẩn E. coli đã tái tổ hợp (1 lít dịch lên men của E. coli thu đƣợc
một lƣợng HGH tƣơng đƣơng với lƣợng thu đƣợc từ 60 tử thi).
 6.2. Somatostatin
Somatostatin là loại hormone đặc biệt, thƣờng đƣợc tổng
hợp trong não động vật và ngƣời với một hàm lƣợng vô
cùng thấp.
Vai trò: điều hòa hormone sinh trƣởng và insulin đi vào
máu, kiểm tra sự tổng hợp hai loại hormone này.
Quy trình sản xuất: gồm các bƣớc chủ yếu sau đây:
- Phân lập gen mã hóa somatostatin hoặc tổng hợp trong ống
nghiệm.
- Tạo dòng gen somatostain bằng cách gắn gen này vào
plasmid vector để chuyển gen vào E. coli. Mỗi mẻ 7,5 L vi
khuẩn E. coli nuôi cấy sẽ cho ra 5 mg somatostatin nguyên
chất. Khối lƣợng hormone này trƣớc đây muốn có phải tiến
hành cả năm trên nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu.
 6.3. Sản xuất enzyme
Hiện nay, một số enzyme nhƣ: glucooxydase,
hexokinase, esterase, urease, cholesteroloxydase,
alcoholdehydrogenase… đã đƣợc sử dụng khá rộng
rãi trong y học.
Trong y học, enzyme còn đƣợc sử dụng để chữa trị
một số bệnh liên quan đến sự thiếu hụt của một số
enzyme trong cơ thể ngƣời, dùng enzyme để loại bỏ
những cục thịt, mỡ dƣ thừa gây nguy hiểm cho một
số bộ phận của cơ thể ngƣời nhƣ dùng enzyme
streptokinase và urokinase để làm tan máu đông gây
tắc nghẽn mạch máu.
 7. Sản xuất thuốc nhờ công nghệ
DNA tái tổ hợp
Thay đổi bộ máy di truyền của tế bào bằng cách đƣa
gen ngoại lai vào và bắt nó hoạt động.
Công nghệ này đã tạo ra một bƣớc ngoặt lớn trong
lĩnh vực sinh học. Các sản phẩm do nó tạo ra đa dạng
và một số hiện đang đƣợc sản xuất ở mức độ công
nghiệp.
 7.1. Sản xuất insulin
o Insulin là polypeptide,
hormon protein do các tế
bào beta của tiểu đảo
Langerhan trong tuyến tụy
sinh ra
o Bao gồm:
• Chuỗi A 21 acid amin
• Chuỗi B 30 acid amin
• Có một cầu nối disulfur trong
chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối
giữa hai chuỗi A và B.
o Công thức hóa học:
Cấu trúc Insulin ngƣời C257H383N65O77S6
o Trọng lƣợng phân tử: 6000 Da
Hoạt động của Insulin
Cơ chế trao đổi Glycogen đƣợc điều hòa
thông qua Insulin
Sản xuất Insulin tái tổ hợp bằng E. coli
 7.2. Sản xuất interferon

• Interferon (IFN) là các

glycoprotein do các tế bào của
nhiều loại động vật tiết ra để
chống lại một cách không đặc
hiệu sự tấn công của các virus
khác vào các tế bào cùng loài,
chứa 146 – 166 amino acid
• Interferon (IFN) được Interferon Alfa
Isaacs và Linderman phát hiện
năm 1957.
Sự tạo thành interferon
• Sự tạo thành IFN không chỉ để đáp ứng lại sự
xâm nhập của virus và các sản phẩm của nó
(glycoprotein, ARN mạch kép) mà còn đáp ứng
lại sự xuất hiện của nhiều loại tác nhân nhƣ vi
khuẩn và các sản phẩm của chúng (nội độc tố,
lông), các chất phân bào polynucleotit tổng hợp
(poly IC, poly GC) hoặc một số loại thuốc
• Các chất cảm ứng tạo thành IFN đƣợc gọi là
interferonogen.
• IFN tạo số lƣợng lớn khi tế bào bị nhiễm virus
độc lực thấp và ngƣợc lại.
• Có 3 loại IFN
- IFN alpha: do bạch cầu tiết ra, do 1 gen mã
hóa, nằm trên nhiễm sắc thể số 9
- IFN beta: do nguyên bào sợi tiết ra, do 1 gen
mã hóa, nằm trên nhiễm sắc thể số 12
- IFN gamma: do các tế bào T hoạt hóa và tế
bào giết tự nhiên (NK) tiết ra.

• Ở trạng thái bình thƣờng, các gen này đóng.

Khi có mặt chất cảm ứng có tác dụng kìm
hãm, hoạt hóa các gen để chúng tổng hợp
IFN
 Tính chất của interferon
• IFN bị bất hoạt bởi các enzym protease
• IFN tƣơng đối bền với nhiệt, hoạt tính bị
mất khi đun ở 60 – 75oC trong 1 giờ hoặc
100 oC trong 5 phút.
• IFN alpha và beta bền ở pH thấp. ở pH
=2, hoạt tính không bị mất
• IFN có tính kháng nguyên yếu. Sự tác
động của IFN không mang tính đặc hiệu
 Tác dụng sinh học của Interferon
• IFN có tác dụng ngăn cản sự nhân lên của nhiều loại
virus  bảo vệ cơ thể
• Sau khi nhiễm virus, lƣợng IFN trong máu tăng dần 
lƣợng virus sinh ra giảm dần
• IFN đƣợc hình thành tại chỗ, tạo thành sớm hơn
kháng thể
• IFN có khả năng làm thay đổi ĐƢMD thông qua:
- Thay đổi sự biểu hiện của các phân tử bề mặt của tế
bào hệ miễn dịch
- Thay đổi sự tạo thành và tiết các protein (cytokin) của
tế bào nói trên
- Tăng cƣờng, hoặc ứng chế chức năng của tế bào
hiệu ứng (effector) – tế bào trực tiếp tạo ra ĐƢMD
 Cơ chế tác dụng của IFN
Khi virus xâm nhập hoặc các chất kích thích ngoại lai
(axit nucleic, vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn, nguyên sinh động
vật ) vào tế bào, chúng sẽ giải tỏa sự kìm hãm và hoạt hóa các
gen cấu trúc này tổng hợp IFN.
IFN thấm qua màng sinh chất tới gắn lên receptor dành
cho nó trên bề mặt các tế bào lân cận, cảm ứng tế bào tổng
hợp các protein kháng virus, gồm 2 loại enzyme ức chế tổng
hợp protein:
- E cảm ứng kinase sau khi tạo thành sẽ đƣợc ARN mạch kép (sản
phẩm trung gian do virus tạo ra trong tế bào) hoạt hóa. Kinase sẽ
photphoryl hóa yếu tố khởi đầu dịch mã eIF2  bất hoạt  không
tham gia tổng hợp Pr
- Cả 3 loại IFN đều có thể cảm ứng để hình thành trong tế bào enzym
2,5 oligoadenylate synthetase (2,5 –A-synthetase). Khi có mặt ATP và
ARN mạch kép, E này đƣợc hoạt hóa để tạo thành
oligoandenylateppp (A2’p)  hoạt hóa endonuclease  ức chế tổng
hợp protein.
Ứng dụng điều trị của IFN đối với con người.

• IFN-α và IFN-β được sử dụng trong điều trị

nhiều bệnh do vi rút gây nên. Hiện nay
Interferon alpha được sử dụng hiệu quả trong
điều trị viêm gan C cấp và mãn; viêm gan B
mãn; HIV….
• IFN-γ là vũ khí hữu hiệu trong điều trị cúm
A/H5N1.
• Ngoài ra IFN-α còn dùng chẩn đoán bệnh lao, bệnh
phong hủi ở người.
Một số sản phẩm IFN
 Sản xuất Interferon
• Phƣơng pháp chế tạo IFN đầu tiên do Carry Canter, nhà
khoa học Phần Lan đƣa ra. Tách bạch cầu từ máu rồi
nhiễm virus để tế bào này cảm ứng tạo IFN. Phƣơng
pháp này cho năng suất thấp (1 tế bào BC  100- 1000
IFN), giá thành cao, không có khả năng mở rộng quy mô
sản xuất.
• Năm 1980, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ là Boyer và
Coken đã tách gen mã hóa cho IFN, tách dòng rồi biến
nạp vào Saccharomyces cerevisiae (hoặc dùng E. coli).
1 tế bào VK 200.000 phân tử IFN
• Cuba là nƣớc đầu tiên nghiên cứu và sản xuất IFN.
• Năm 1982, Trung Quốc bắt đầu sản xuất IFN
• Năm 200, Viện vacxin Nha Trang cho ra đời IFN bằng
công nghệ mới sử dụng phage gắn với gen mã hóa cho
IFN.
Sản xuất Interferon bằng kỹ thuật
tái tổ hợp
Sản xuất Interferon

Ngoài ra nghiên cứu tại trường

đại học Quốc gia St Peterburg cho biết
đã tạo ra hàng loạt cây trồng biến đổi
gen như đậu, cà rốt,... có khả năng sản
xuất interferon. Những sản phẩm này
dùng cho gia súc giúp chúng cải thiện
được hệ miễn dịch cùng với khả năng
chống virut,vi khuẩn gây bệnh.
 7.3. Sản xuất interleukin
Interleukin là một lymphokine bao gồm interleukin-1
(IL-1) và interleukin-2 (IL-2), có khả năng điều hòa
miễn dịch và chống ung thƣ

Vai trò của

IL -2
 Sản xuất: theo công nghệ DNA tái tổ hợp.
Interleukin-2 (IL-2): là một cytokine quan trọng nhất đối
với sự phát triển và đáp ứng miễn dịch thích ứng. IL-2 có
vai trò chính trong hoạt hóa các lympho T
ví dụ : Các tế bào ác tính lympho T đã bộc lộ quá mức các
thụ thể IL-2, nên có thể nghĩ rằng IL-2 là yếu tố sinh
trƣởng của tế bào. Ngƣợc lại, việc sử dụng tăng cƣờng
chức năng của IL-2, cũng làm tăng đáp ứng miễn dịch
chống lại các khối u. Liệu pháp tiêm trực tiếp IL-2 vào
mạch máu cũng làm tăng lƣợng tế bào lympho, làm tăng
tế bào NK và làm tăng hoạt động của các dạng tế bào kiểu
LAK. Liệu pháp này đang đƣợc sử dụng cho một số bệnh
ung thƣ, nhƣ ung thƣ da ác tính (melanoma) và ung thƣ
biểu mô thận.
 8. Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm
8.1. Chẩn đoán sớm giới tính của thai
 Từ năm 1948, Murray Barr đã phát hiện vật thể giới tính gọi là
thể Barr giúp phân biệt nam và nữ. Thể Barr chỉ có ở con cái.
 Thể Barr: có ở tế bào niêm mạc da, âm đạo, tế bào chân tóc, tế
bào các tuyến.
 Dùng kỹ thuật chọc ối để xét nghiệm thể Barr, chẩn đoán sớm
giới tính và chẩn đoán dị hình, quái thai, để nếu cần phải sử
dụng các liệu pháp can thiệp sớm.
 Nhiễm sắc thể giới tính của con cái là XX, con đực là XY. NST Y
về căn bản, rất ít gen. Số lƣợng gen liên kết giới tính chủ yếu
nằm trong X. Trong X, có các gen tổng hợp nhiều loại protein
enzyme nhƣ glucose-6-phosphatedehydrogenase,... Tuy nhiên,
hàm lƣợng các loại enzyme nêu trên ở nam và nữ đều tƣơng
đƣơng nhau.
 Xét nghiệm tế bào phôi (hợp tử) để phát hiện thể Barr từ 12-14
ngày sau khi thụ thai, kỹ thuật tiên tiến có thể phát hiện từ ba
ngày đầu sau thụ thai
 8.2. Chẩn đoán sớm dị hình, quái thai
trƣớc khi sinh
Phân Chẩn
tích máu đoán
Kỹ thuật
bố mẹ sớm
chọc ối
bằng E trƣớc khi
hạn chế sinh
 Do enzyme hạn chế có khả năng phân biệt đƣợc gen đột biến với
gen bình thƣờng.
 Các đoạn DNA cắt ra, đƣợc phân tách qua phƣơng pháp điện di,
đem lai với các mẫu dò DNA hoặc RNA đã đánh dấu phóng xạ bằng
32P. Ảnh phóng xạ tự ghi cho ta thấy các đoạn DNA đƣợc lai với các
mẫu dò. Các đoạn này đƣợc tách ra để nghiên cứu và xác định đột
biến hay bình thƣờng bằng enzyme hạn chế, vì một số đột biến di
truyền có ảnh hƣởng đến các vị trí dành cho enzyme hạn chế.
 8.3. Chẩn đoán phát hiện các tác nhân
gây bệnh ngoại lai
 Ƣu điểm của việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử:
- Rút ngắn đƣợc thời gian: ứng dụng kỹ thuật PCR/ lai phân tử,
ví dụ: chẩn đoán bệnh HIV-1, dùng phƣơng pháp PCR chỉ mất
một ngày so với 3-4 tuần nuôi cấy của phƣơng pháp truyền
thống.
- Đối với các tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy hay không thể
nuôi cấy thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp duy nhất,
chẳng hạn Chlamydia, Brucella, viêm gan B...
- Việc tạo dòng một gen dùng làm probe đơn giản hơn việc sản
xuất kháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một probe ngƣời ta có
thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác
nhân gây bệnh, điều mà chỉ một kháng thể không thể làm
đƣợc.
Đối với tác nhân là virus: Lai phân tử và PCR đã cho
phép chẩn đoán nhiều nhóm nhƣ papillomavirus, HBV,
HIV. Phƣơng pháp lai tại chỗ còn cho phép xác định trực
tiếp virus trên lát cắt sinh thiết.
 Đối với các tác nhân vi khuẩn: nhiều bộ kit chẩn đoán
sinh học phân tử đƣợc thƣơng mại hóa cho các loài:
Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella, ...
Đối với các tác nhân ký sinh trùng: Lai phân tử giúp chẩn
đoán Plasmodium, Schistosoma, Trypanosoma,
Toxoplasma, Leishmania.
Phƣơng pháp PCR còn cho phép phát hiện tác nhân ngay
trong vật trung gian truyền bệnh..
 8.4. Chẩn đoán các bệnh di truyền
Hiện có hàng trăm bệnh di truyền do gen lặn.
Các bệnh này hầu nhƣ chƣa có cách chữa trị,
hiện chỉ hy vọng liệu pháp gen để dự phòng.
Hƣớng giải quyết: chẩn đoán sớm bệnh ở thai
nhi trong bụng mẹ để cho sẩy thai sớm.
Phƣơng pháp PCR đã làm tăng đáng kể hiệu quả
chẩn đoán phân tử. Nhờ sự khuếch đại nucleic
acid không cần tạo dòng  nguyên liệu ít (có thể
chỉ một tế bào).
Corner và cộng sự (1983) đã xây dựng phƣơng
pháp phân tích có hiệu quả và trực tiếp để xác
định đột biến ở các gen hemoglobin α và β.
Vấn đề nảy sinh: đạo đức sinh học (bioethics).
 8.5. In dấu DNA (DNA fingerprinting)
Ứng dụng:
- Phân tích phả hệ ở chó, mèo và trong lai tạo giống.
- Xác định nguồn gốc và sự di cƣ của các quần thể
ngƣời cổ.
- Xử dụng trong pháp y  xác định tội phạm.
Ƣu điểm
- Nguỗn mẫu phong phú (Vệt máu, lông hay tinh trùng
trên áo trƣớc đó nhiều năm)
- Mẫu bẩn vẫn sử dụng đƣợc.
-Tính đặc hiệu cao.
Các bƣớc phân tích của phƣơng pháp
“In dấu DNA”
 Tài liệu tham khảo
• Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn công nghệ sinh học. Nhà xuất
bản Đại học Huế.
• Tài liệu trang web/google
 CHƢƠNG 6
CÔNG NGHỆ PROTEIN

Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 Nội dung
I • Mở đầu

II • Cấu trúc protein

III • Các công cụ

IV • Một số ứng dụng của công nghệ protein

V • Sản xuất protein trên quy mô lớn

• Các quy trình tách chiết và tinh sạch

VI protein
 MỞ ĐẦU
 Công nghệ protein là một hướng nghiên cứu
quan trọng của công nghệ sinh học, có tiềm
năng ứng dụng rất lớn
 Trên cơ sở công nghệ DNA tái tổ hợp, nhiều
loại protein nguyên thể (protein thế hệ thứ nhất),
protein đã được sửa đổi hoặc mới (protein thế
hệ thứ hai) đang được sản xuất nhờ các sinh
vật prokaryote như vi khuẩn E. coli hoặc
eukaryote như nấm men Sac. cerevisiae.
 MỞ ĐẦU (tiếp)
 Công nghệ protein là quá trình xây dựng các
phân tử protein mới, bằng cách thiết kế một
phân tử protein dựa trên các nguyên lý cơ bản
nhất, hoặc sửa đổi cấu trúc của một protein
đang có
Mục đích:
- Nghiên cứu quá trình lắp ráp của các protein
và các nhân tố của chuỗi sơ cấp tham gia vào
sự cuộn xoắn, ổn định và thể hiện chức năng
của chúng
- Sản xuất các phân tử protein ổn định cho một
mục đích công nghệ đặc biệt
 II. Cấu trúc protein
Liên kết peptide được hình thành từ phản ứng
polymer hóa amino acid, loại nước để tạo thành
peptide

2 axit amin

Loại 1 phân
tử nước

Cầu peptide

Hình thành Mô tả sự hình thành liên

liên kết
CO-NH
kết peptide
Đầu amino Đầu
cacboxyl
 Cấu trúc của protein
- Protein có cấu tạo theo nguyên tắc đa
phân, đơn phân là các amino acid

- Tính đa dạng cao của protein do cấu tạo

từ 20 loại axit amin

-Tính đa dạng của protein do khác nhau

về số lượng, thành phần và trình tự sắp
xếp các amino acid
2.1. Axit Amin (AA)
Tiều đơn vị: -amino acids

Biopolymer: các AA được liên kết với nhau thông qua liên kết peptide
giữa nhóm carboxyl của AA này với nhóm amin của AA tiếp theo

Đầu - C
Đầu - N

Peptide hoặc protein (polypeptide)

peptide (< 50 AA)

protein (> 50 AA)
 Phân loại AA
Dựa vào tính chất của gốc R để phân loại AA

Amino acid phân cực Các axit amin không

phân cực

Ưa nước Kỵ nước
Cấu trúc của protein
 Cấu trúc bậc 1
Cấu trúc bậc 1 của Insulin người
Chuỗi 1: GIVEQ CCTSI CSLYQ LENYC N • Dạng thẳng
Chuỗi 2: FVNQH LCGSH LVEAL YLVCG ERGFF YTPKT

• Là trình tự sắp xếp

của các amino acid
trên chuỗi polypeptide

• Trình tự aa trên chuỗi

polypeptide thể hiện
sự tương tác giữa các
phần trong chuỗi, tạo
nên hình dạng lập thể
của protein  quyết
định tính chất và vai
trò của protein
Cấu trúc bậc 2

• Chuỗi polypeptide
xoắn lại tạo nên cấu
trúc xoắn alpha và
cấu trúc nếp gấp
beta

• Được cố định bởi

liên kết H giữa các
aa ở gần nhau
Xoắn Alpha
Nếp gấp Beta

Vị trí và tương tác của các AA trong cấu

trúc dạng nếp gấp beta
(a): dạng song song; (b): dạng không song song
Cấu trúc bậc 3

Chuỗi
polypeptide
ở dạng xoắn
hoặc dạng
nếp gấp tiếp
tục co xoắn
tạo nên cấu
trúc không
gian 3 chiều
đặc trưng
Các liên kết trong cấu trúc bậc 3 của protein

Tương tác Van der Waals (lực

phân tán) hoạt động giữa các
nhánh bên kỵ nước

Cầu hydrogen
Liên kết ngược
polypeptide

Liên kết disulfide

(liên kết cộng hóa trị)

Liên kết ion

Cấu trúc bậc 4

Các chuỗi
polypeptide
liên kết với
nhau theo một
cách nào đó
tạo nên cấu
trúc bậc 4
Bốn dạng cấu trúc của phân tử protein
 III. Các công cụ
1 • Nhận dạng trình tự

2 • Xác định cấu trúc và mô hình hóa

3 • Biến đổi trình tự

4 • Phát triển phân tử

5 • Thiết kế trình tự de novo

6 • Biểu hiện

7 • Phân tích
 3.1. Nhận dạng trình tự
 Nhận dạng trình tự (sequence identification) bằng
phân tích trình tự gen hoặc protein là một quá trình
tương đối dễ.
 Các dự án phân tích trình tự genome đang cung cấp
các trình tự mới và các khung đọc mở (open reading
frame) với một tốc độ tăng lên liên tục
 Các chức năng của nhiều trình tự này đã được biết,
từ các dữ liệu di truyền hoặc hóa sinh, hoặc bằng sự
tương đồng trình tự đối với các trình tự chưa biết
khác
  giúp cho công nghệ protein một phương pháp tiếp
cận với sự thiết kế hợp lý.
 3.2. Xác định cấu trúc và mô hình hóa
 Cấu trúc có độ phân giải cao được xác định bằng Tia
X hoặc tinh thể học điện tử (electron
crystallography) hoặc kỹ thuật cộng hưởng từ hạt
nhân (nuclear magnetic resonance-NMR), là điểm cốt
lõi của sự hiểu biết về hóa sinh protein.
 Hiện có một số lớn các trình tự đã xác định nhưng
chưa biết được cấu trúc
 Dự báo cấu trúc bằng cách mô hình hóa các trình tự
mới dựa trên các cấu trúc đã biết của các trình tự
hoặc các tiểu trình tự (subsequence) tương đồng
hoặc gần tương đồng bằng kỹ thuật “xâu kim thành
chuỗi” (threading), trong đó một trình tự mới được
so sánh trực tiếp với các kiểu cấu trúc đã biết.
 3.3. Biến đổi trình tự
 Biến đổi trình tự protein bằng phát sinh
đột biến điểm định hướng oligonucleotide
(oligonucleotide-directed site
mutagenesis) theo phương thức tổng hợp
gen hoàn chỉnh từ các oligonucleotide
primer hoặc dùng phản ứng chuỗi
polymerase (PCR)
 Chỉ giới hạn cho các amino acid được mã
hóa bởi gen.
 Có 2 phương pháp
- Phương pháp không dùng PCR
- Phương pháp dựa trên PCR
-Phương pháp không dùng PCR

Phương thức phát sinh đột biến ssDNA không

dùng PCR
 Các oligonuleotide được ủ hoạt động như một primer cho sự
tổng hợp in vitro DNA bằng cách dùng enzyme DNA
polymerase, thường dùng là DNA polymerase T4 hoặc T7, cùng
với sự hiện diện của enzyme DNA ligase các phân tử DNA sợi
đôi (dsDNA) mạch vòng đóng sẽ được tạo ra (Hình 6.2c). DNA
sợi đôi được đưa vào trong các tế bào vật chủ thích hợp để tái
bản và phân chia. Sau đó, sự biến đổi mong muốn được xác
định bằng một trong số phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc.
 Tuy nhiên, gần đây các phương pháp dựa trên cơ sở PCR được
ứng dụng rộng rãi hơ n, đặc biệt để tái sắp xếp nhanh các vùng
protein n ơi mà các vị trí cắt hạn chế phổ biến thường không có
sẵn.
 Phương pháp dựa trên cơ sở PCR cho phép thực hiện sự biến đổi
mong muốn và khuếch đại in vitro bằng cách ủ DNA đích (target DNA)
được biến tính với một oligonucleotide mang đột biến cần thiết có thể
hoạt động như một primer cho sự tái bản sợi DNA bổ sung (Hình 6.3).
Có nhiều cách thức khác nhau trong phương pháp dựa trên PCR, một
số trong chúng cần các vị trí cắt hạn chế ở các oligonucleotide đột
biến. Điều này có thể làm giảm số lượng các phản ứng.
 Phương pháp dựa trên PCR

Phát sinh đột biến PCR bằng sự mở rộng chồng lấp đơn
Phương pháp dựa trên PCR

Dung
hợp
vùng
PCR
 3.4. Phát triển phân tử (molecular
evolution)
 Dựa trên 3 đặc điểm chính:
- Axit nucleic mã hóa cho trình tự protein quan tâm duy
trì liên kết vật lý với protein.
- Đưa các đoạn oligonucleotide thoái biến (degenerate
oligonucleotide) vào trong trình tự mã hóa theo phương
thức chèn đoạn cassette hoặc dùng kỹ thuật PCR, hoặc
bằng phương thức phát sinh đột biến in vitro.
- Phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc từ thư viện các
trình tự protein mới có kiểu hình quan tâm
  Những protein hữu ích phân lập được sẽ
được khuếch đại nhờ cách nhân (sinh sản)
phage hoặc tế bào vi khuẩn mang trình tự gen
của nó bằng kỹ thuật PCR
 3.5. Thiết kế trình tự de novo

 Là công việc phức tạp

 Về nguyên tắc: protein bất kỳ có (n) gốc
amino acid thì khả năng sẽ có 2×10n trình tự
khác nhau.
 Dahiyat và Mayo (1997) đã mô tả các
phƣơng pháp máy tính để thiết kế các trình
tự của vùng peptide đã biết.
 Phƣơng pháp khuếch đại PCR để tổng hợp
gen thƣờng đƣợc sử dụng để làm đầy và
khuếch đại từng phần các oligonucleotide
chồng lên nhau (overlap extension).
 3.6. Biểu hiện
 Cần biểu hiện để chứng minh chức năng của
protein
 Là công việc phức tạp, cần có các hệ thống
biểu hiện vật chủ: vi khuẩn, nấm men, tế bào
động vật….
 Tùy mục đích thử nghiệm mà lượng protein cần
sẽ khác nhau. Ví dụ:
 - Xác định đặc tính sinh học của protein:
lượng nhỏ (μg)
 - Thông tin về cấu trúc đặc trưng và thực hiện
thêm một số thử nghiệm in vitro và in vivo: 10
đến 100 mg
 3.7. Phân tích
 Cần nhiều phương pháp khác nhau để phân
tích đặc điểm của các protein được sửa đổi.
 Phương pháp thử nghiệm sinh học thích hợp
được sử dụng để phân tích protein sửa đổi
 Việc phân tích cần kết hợp với nhiều thông tin
khác như: cấu trúc được sửa đổi, sự cuộn
xoắn của protein, số lượng protein mới…
 Tuy nhiên, thông tin cấu trúc chi tiết của sản
phẩm cuối cùng vẫn còn là bước hạn chế trong
thiết kế và triển khai công nghệ protein thích
hợp.
IV. Một số ứng dụng của công
nghệ protein
 Các đột biến điểm
 Sắp xếp lại vùng
 Sắp xếp lại toàn bộ protein
 Các tương tác protein – phối tử
 4.1. Các đột biến điểm
1.1. Betaseron/Betaferon (Interferon β-1b):
Protein mới này được tạo ra bởi sự thay thế của cysteine
(Cys) cho serine (Ser) ở gốc thứ 17 của phân tử
interferon β dài 154 amino acid.
1.2. Humalog (Lispro Insulin):
Là một dạng biến đổi gen của insulin người trong đó hai
gốc ở C-terminus của chuỗi B, proline (Pro) và lysine
(Lys) ở các vị trí 28 và 29 được đảo ngược thứ tự
1.3. Các tá dược vaccine mới (adjuvants):
Xây dựng các phân tử protein mới cung cấp sự hỗ trợ
miễn dịch (adjuvant) để gây ra một đáp ứng miễn dịch
đối với một kháng nguyên đồng phân phối (co-
administered antigen). Ví dụ: độc tố của Vibrio cholerae
(CT) và độc tố không bền nhiệt của E. coli (LT)
 4.2. Sắp xếp lại vùng (liên kết, trao đổi và xóa
bỏ)
2.1. Các vùng liên kết:
 Các dung hợp vùng cho tế bào đích: EnbrelTM gồm có các
vùng thụ thể ngoại bào cho nhân tố α gây hoại tử khối u
(TNFα) được dung hợp di truyền với các vùng Fc của IgG để
dùng trong việc ngăn chặn hoạt tính của TNFα
 Các cytokine được dung hợp: các gen trong khung (in-frame)
buộc hai nhóm chức năng lại với nhau và có thể về nguyên
tắc dẫn đến hiệu quả sinh học mong muốn ở các liều thấp
hơn nếu được thực hiện riêng rẽ (ví dụ: Interferon)
2.2. Trao đổi các vùng protein
 Các kháng thể khảm người-chuột: kháng nguyên ở kháng
thể đơn dòng của chuột được gắn với các vùng không thay
đổi của một kháng thể người  giảm khả năng tạo miễn dịch
không mong muốn
- Xóa các vùng: Hoạt tố plasminogen mô (tPA)
 4.3. Sắp xếp lại toàn bộ protein

 Các gen đại diện cho hai hoặc nhiều thành

viên của họ được phân đoạn ngẫu nhiên
bằng enzyme DNase I
 Các đoạn này được dùng như các PCR
primer để tạo ra các trình tự gen mới bằng
cách lai ngẫu nhiên giữa các đoạn.
 Các biến thể mới có thể được nhận biết
bằng phương thức chọn lọc hoặc sàng lọc
 Một số trường hợp đã được tạo ra theo
phương thức này là các enzyme, cytokine
và các vị trí liên kết kháng thể
 4.4. Các tương tác protein – phối tử
4.1. Biến đổi enzyme
Biến đổi tương tác enzyme – cơ chất:
- Tăng hoạt tính xúc tác;
- Biến đổi tính đặc hiệu cơ chất
- Biến đổi các profile của pH
- Cải thiện sự chống oxy hóa
- Cải thiện khả năng ổn định đối với các kim loại nặng
- Loại bỏ các vị trí mà ở đó sản phẩm xúc tác có thể liên kết
4.2. Các chất chủ vận hormone (hormone agonist)
 Sự phát triển các chất siêu chủ vận (super-agonist) có hoạt tính
sinh học tăng lên rõ rệt có thể làm tăng ái lực liên kết của các
hormone với các receptor của chúng
4.3. Thay thế các liên kết đặc hiệu
 Thay thế các liên kết đặc hiệu được thực hiện bằng cách
chuyển vùng đặc hiệu cho một phối tử từ một protein này đến
một protein khá
 V. Sản xuất protein trên quy mô lớn
Ưu điểm sản xuất ở quy mô lớn:
 Sử dụng các môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền.
 Thời gian lên men ngắn ngày.
 Kiểm kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật và
đảm bảo tính đồng nhất của các mẻ lên men.
 Chủ động việc thu hoạch protein một cách hợp lý, phù
hợp với các quá trình phân tách và tinh sạch
 Hiệu suất protein có thể đƣợc tăng lên nhiều lần bằng
cách cải thiện các chủng truyền thống và kỹ thuật lên
men.
 Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA  giúp sản xuất sinh khối
enzyme từ việc nuôi cấy những loài vi sinh vật đòi hỏi
điều kiện sinh trƣ
 ởng khắc khe, giúp các VSV có thể sinh trƣởng thuận
lợi trong các điều kiện khắc nghiệt và tạo enzyme với
các đặc điểm chịu nhiệt hoặc chịu muối ở nồng độ cao.
 5.1. Lên men E. coli tái tổ hợp

 Các enzyme có nguồn gốc từ các sinh

vật prokaryote có thể đƣợc sản xuất
dễ dàng trên quy mô lớn với hiệu suất
cao trong các vật chủ E. coli tái tổ
hợp.
 Các quá trình lên men này có thể
đƣợc tiến hành ở quy mô từ 3.000-
6.000 L
 Không đòi hỏi các bƣớc cấy gây
(inoculum cuture) phức tạp
 5.1. Lên men E. coli tái tổ hợp (tiếp)
 Cấu trúc vật chủ đặc trƣng chứa:
- plasmid vector có gen mã hóa cho enzyme cần thiết
- Gen chỉ thị kháng kháng sinh thích hợp
- Nhân tố cảm ứng
 Phƣơng pháp nuôi hiệu quả: lên men có bổ sung
dinh dƣỡng
 Nguồn dinh dƣỡng: nguồn C: glucose, nguồn N: dịch
chiết nấm men, urea....
 Điều kiện lên men: nhiệt độ 24-28oC, thời giai nuôi 2
ngày
 Yều cầu mong muốn : OD600nm > 200 (tƣơng ứng50 g
khối lƣợng khô của tế bào/L) và sự biểu hiện protein
khoảng 10 g/L (30% của protein tổng số)
 5.2. Lên men nấm
 Các loài nấm vật chủ nhƣ Aspergillus và
Fusarium và nấm men hƣớng methyl
(Pichia) thích hợp cho sản xuất các protein
glycosyl hóa từ các nguồn động vật hoặc
nấm. DNA của protein đƣợc hợp nhất trực
tiếp trong DNA nhiễm sắc thể cùng với hệ
thống promoter điều hòa biểu hiện gen.
 Phƣơng pháp: kỹ thuật lên men truyền thống
 Nguyên liệu nuôi cấy: rẻ tiền (bột đậu tƣơng,
dịch chiết nấm men…..)
 Quá trình lên men: Lên men đặc trƣng kéo
dài từ 4-8 ngày. Hàm lƣợng protein thu đƣợc
10 g/L ở quy mô công nghiệp
 5.3. Các enzyme vi sinh vật thay thế
các enzyme động-thực vật
 Bằng phƣơng thức tách chiết enzyme truyền
thống từ các nguồn vi sinh vật + kỹ thuật sàng
lọc thích hợp, nhiều enzyme mới giống nhƣ
enzyme động-thực vật đƣợc sản xuất:
- Enzyme protease của Mucor  thay thế renin dạ
dày của bê
- Protease của Aspergillus và Bacillus  CN thuộc
da
- Amylase vi sinh vật  thay amylase thực vật
trong tạo malt của lúa mạch hoặc lúa mỳ
 Enzyme có nguồn gốc động vật  sản xuất
trong Saccharomyces và Aspergillus cần quá
trình glycosyl hóa enzyme
 5.4. Các nguyên tắc hóa sinh cơ
bản

 Cải thiện di truyền + quá trình lên men

 tăng hiệu suất.
 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất
enzyme:
- Sự cảm ứng
- Ức chế ngƣợc
- Ức chế dinh dƣỡng
 Sự cảm ứng
 Enzyme sẽ chỉ đƣợc sản xuất trong sự hiện diện của
một chất cảm ứng, thƣờng là cơ chất của nó. Ví dụ:
- Sucrose cần thiết cho sản xuất invertase.
- Tinh bột cho sản xuất amylase
 Sự cảm ứng sản phẩm thƣờng xảy ra trong quá trình
tổng hợp các enzyme ngoại bào
 Các coenzyme cũng có thể hoạt động nhƣ các chất
cảm ứng
 Trên thực tế: sự cảm ứng đƣợc tiến hành bằng hỗn
hợp các tác nhân cảm ứng đắt tiền, đƣợc khử trùng và
bổ sung ở các thời gian đặc biệt để thiết lập sự lên
men.
 Khắc phục : đột biến điều hòa có thể đƣợc sản xuất để
không phụ thuộc vào các nhân tố cảm ứng và vì vậy
đƣợc gọi là các đột biến cấu thành
 Ức chế ngƣợc
 Là tác dụng ức chế bằng cách cố định tác động dị
lập thể của một chất lên hoạt tính của ít nhất một
trong những enzyme xúc tác các bƣớc chuyển hóa
dẫn đến sinh tổng hợp riêng của chất đó
 Tổng hợp enzyme cũng đƣợc điều chỉnh bởi sự ức
chế ngƣợc:

Sơ đồ chuỗi phản ứng hóa sinh tổng hợp chất (X)

 Ức chế ngƣợc (tiếp)
 Các đột biến ức chế ngược có thể thu được bằng
cách chọn lọc các nuôi cấy kháng các độc tố là các
chất đồng đẳng của sản phẩm

Cơ chế ức
chế ngược
đối với
tryptophan
 Ức chế dinh dƣỡng
 Tổng hợp enzyme đƣợc điều chỉnh bằng sự ức chế
dinh dƣỡng đặc trƣng bởi carbon, nitrogen,
phosphate hoặc sulphate. Những cơ chế này tồn tại
để duy trì sự sản xuất của các enzyme không cần
thiết
 Ví dụ Ức chế glucose:
- Sự ức chế dị hóa glucose có thể là rất mạnh và
thƣờng kìm hãm hiệu quả của chất cảm ứng. Các
nguồn carbon khác nhƣ lactate, pyruvate, succinate
và citrate, cũng là các chất ức chế hiệu quả trong một
số vi sinh vật. Thậm chí citrate cũng có thể ức chế sự
chuyển hóa của glucose ở một số vi khuẩn
- Sự ức chế dị hóa glucose đƣợc giải quyết bằng các
đột biến có thể chọn lọc dễ dàng từ môi trƣờng nuôi
cấy chứa glucose và cơ chất của enzyme cần thiết
 5.5. Công nghệ di truyền
 Khả năng ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp
DNA có hiệu quả rất lớn trong sản xuất
protein vi sinh vật
 Vật chủ E. Coli thích hợp cho sự biểu hiện
cao của protein, cung cấp protein không có
glycosyl hóa
 Các loài Bacillus: thích hợp cho sản xuất
các protein ngoại bào không có glycosyl
hóa.
 Các loài Aspergillus: cũng sản xuất rất
nhiều các protein ngoại bào và hơn nữa có
thể sản xuất các protein đƣợc glycosyl hóa.
 5.5. Công nghệ di truyền (tiếp)
 Các điểm chú ý khi sản xuất protein ở qui
mô lớn:
 Chọn lựa vật chủ là vấn đề then chốt: sinh
trƣởng mạnh, không khuyết dƣỡng và
không có các hệ thống enzyme không
mong muốn
 Cấu trúc vector biểu hiện phải càng đơn
giản càng tốt
 Các promoter cơ bản hoạt động mạnh
 Chất cảm ứng đƣợc chọn phải đƣợc duy trì
trên một nồng độ tới hạn
 Phát sinh đột biến điểm định hƣớng.
 VI. Các quá trình tách chiết và tinh sạch
protein
 Trong thiết kế quy trình tinh sạch ở quy mô lớn thì số
lƣợng các bƣớc + sự thu hồi sản phẩm ở mỗi bƣớc
đã ảnh hƣởng quan trọng lên sản lƣợng toàn phần
 Gồm các bƣớc:
- Thu hồi protein
- Tinh sạch sơ bộ
- Hệ phân tách 2 pha nƣớc
- Các phƣơng pháp kết tủa
- Các phƣơng pháp sắc ký
- Siêu lọc
- Thiết kế các protein để tinh sạch
 6.1. Thu hồi protein
 Là giai đoạn quan trọng. Mục tiêu là giảm
thiểu sự mất hoạt tính của protein
 Gồm 2 dạng: protein ngoại bào và protein nội
bào
 Thu hồi protein ngoại bào
- Tƣơng đối dễ thu hồi và tinh sạch
- Dung dịch protein tƣơng đối sạch
 Thu hồi protein nội bào : cần phá vỡ tế bào
- Phá vỡ tế bào
- Phân lập các enzyme hòa tan
 Thu hồi protein nội bào
 Phá vỡ tế bào: gồm 3 phƣơng pháp:
- Enzyme: Lysozyme
- Hóa học: Xử lý kiềm, Chất tẩy rửa.
- Vật lý: Shock thẩm thấu, Nghiền, Trƣợt
rắn, Trƣợt lỏng.

 Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng

protein phụ thuộc vào một số nhân tố
nhƣ: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng
độ và tiền xử lý (chẳng hạn đông lạnh,
Thiết bị đồng hóa Mặt cắt ngang của
French Press thiết bị đồng hóa
Manto-Gaulin
 Phân lập các enzyme hòa tan
 Phƣơng thức quan trọng để phân tách
enzyme hòa tan nhanh và hiệu quả sau khi
phá vỡ tế bào là làm lạnh, dùng dung dịch
đệm thích hợp, có sự hiện diện của các tác
nhân bảo vệ enzyme
 Các enzyme hòa tan có thể đƣợc thu thập
bằng phƣơng pháp lọc qua màng hoặc bằng
cách ly tâm
 Dung dịch enzyme hòa tan không yêu cầu xử
lý thêm ngoại trừ nồng độ (áp suất giảm hoặc
lọc màng) để sản xuất một dung dịch protein
đƣợc cô đặc (10-50% chất rắn).
 6. 2. Tinh sạch sơ bộ
Loại bỏ mảnh
vỡ tế bào

Lọc Tinh Ly
bằng
màng
sạch sơ tâm
bộ mẻ

Ly tâm dòng
chảy liên tục
 6. 2. Tinh sạch sơ bộ
 Thực hiện đối với những protein có giá trị ứng dụng cao
 Gồm các phƣơng pháp:
- Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào: ly tâm hoặc lọc
- Ly tâm mẻ: thích hợp với các dung tích ly tâm trong
khoảng từ nhỏ hơn 1 mL đến một vài lít, lực ly tâm
100.000 g
- Ly tâm dòng chảy liên tục: sử dụng cho quá trình tinh
sạch protein ở quy mô lớn để loại bỏ các chất dạng hạt.
Có ba kiểu ly tâm chính thích hợp hơn cả là: ly tâm
thùng rỗng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng
(multi-chamber) hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng
(basket).
- Lọc bằng màng: để gạn các dịch chiết tế bào. Do dịch
chiết có khuynh hƣớng sệt tự nhiên nên phải lọc dòng
chảy ngang (cross-flow) hoặc tiếp tuyến (tangential)
 6.3. Hệ phân tách hai pha nước
 Tiến hành: Trộn các dung dịch polyethylene
glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại
muối nhƣ potassium phosphate hoặc
ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng
biệt
 Nguyên lý: Các protein và mảnh vỡ tế bào có
khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha
 Hiệu quả: phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử
và điện tích của chúng, nồng độ của các
polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp
và sự hiện diện của các muối đa trị nhƣ
phosphate hoặc sulphate
 Ứng dụng: Dùng để hỗ trợ cho quá trình tinh
sạch enzyme ở quy mô lớn
6.4. Các phương pháp kết tủa
 Mục đích: giảm thể tích tổng số của dung
dịch enzyme, loại bỏ protease
 Các chất kết tủa: ammonium sulphate,
sodium sulphate, polyethyleneimine và
polyallylamine, hoặc các dung môi hữu cơ
nhƣ là isopropanol, ethanol và acetone.
 Phƣơng pháp:
- Kết tủa bằng ammonium
- Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ
- Kết tủa bằng các polymer khối lƣợng phân
tử cao
- Kết tủa bằng nhiệt
6.5. Các phương pháp sắc ký
 Là kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép
tách biệt các hợp phần khác nhau của một
hỗn hợp
 Nguyên tắc: dựa vào sự di chuyển khác
nhau trong một pha động của các chất hòa
tan đã đƣợc gắn trên một pha tĩnh ở trạng
thái rắn
 Áp dụng: Các sản phẩm có thể tích nhỏ và
giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn
đoán đặc hiệu
 Các kỹ thuật phân tách bằng sắc ký: trao
đổi ion, tƣơng tác kỵ nƣớc, ngăn chặn kích
thƣớc, ái lực và ái lực giả (sắc ký với phối
tử là thuốc nhuộm).
 6.5.1. Sắc ký lọc gel
 Nguyên lý: tách protein đƣợc dựa trên cơ sở
kích thƣớc phân tử
 Gồm 2 pha:
- Pha tĩnh: chứa các hạt gel (polymer) xốp có
những lỗ nhỏ li ti
- Pha động: dung môi chuyển động.
 Khi dung dịch chứa các protein chảy qua cột
thì các phân tử lớn của hỗn hợp có đƣờng
kính lớn hơn lỗ của hạt gel nên không thể
khuếch tán vào bên trong hạt (qua các lỗ nhỏ)
 chúng đi qua các kẽ hở của cột và bị rửa
khỏi cột trƣớc cùng với thể tích dịch rửa bằng
thể tích giữa các hạt gel
Cơ chế của sắc ký lọc gel
 Sắc ký lọc gel
Các loại sephadex Trọng lƣợng phân tử
G. 10 0 - 700
G. 15 0 - 1.50
G. 25 100 – 5000
G. 50 1500 - 30.000
G. 75 3.000 - 70.000
G. 100 4.000 - 150.000
G. 150 5.000 - 400.000
G. 200 5.000 - 800.000
 - Môi trƣờng lọc
gel lý tƣởng phải
trơ hoàn toàn.
- Gel: phải rắn
và có độ xốp
cao.
- Nguyên liệu:
Sephadex),
polyacrylamide

Sơ đồ của sắc ký lọc gel

 6.5.2. Sắc ký trao đổi ion
 Là phƣơng pháp sử dụng rộng rãi nhất, bao gồm cả
trao đổi cation và anion mạnh và yếu.
 Các protein và enzyme đƣợc hấp phụ ở lực ion thấp
hoặc ở các giá trị pH có điện tích ion tổng số đủ mạnh
để tƣơng tác với điện tích đối của nhựa trao đổi ion.
 Sự tách rửa protein: thực hiện bằng cách thay đổi pH
hoặc tăng lực ion của dung dịch rửa
 Nhựa trao đổi ion: là khung vật liệu rắn không hòa tan
có gắn với các nhóm ion hóa bằng liên kết đồng hóa trị.
Các nhóm mang điện tích này lại đƣợc liên kết với các
ion đối (opposite ions) và các ion đối lại có thể trao đổi
thuận nghịch với các ion trái dấu. Một khung có mang
các nhóm tích điện dƣơng và ion đối tích điện âm, đƣợc
gọi là nhựa trao đổi anion (anion exchange resin).
Ngƣợc lại, một nhựa trao đổi cation sẽ mang điện tích
âm.
 Sắc ký trao đổi ion
(Ion- exchange chromatography - IEC)

The principle of ion-exchange chromatography

(salt gradient elution)
Cơ chế trao đổi
Bản chất hóa học của các loại nhựa
trao đổi ion
 Một số nhựa trao đổi ion từ các dẫn
xuất của cellulose

Quá trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn:
-Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh sạch (và các
protein có điện tích gần giống) vào nhựa trao đổi ion.

-Khử hấp phụ các protein bằng cách:

(1) thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion
hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein hoặc
(2) tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh
Sơ đồ sắc ký trao đổi ion
6.5.3. Sắc ký ái lực (affinity chromatography)

 Nguyên lý: dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và
thuận nghịch của một protein với một phân tử
khác (phối tử), đã đƣợc gắn bằng liên kết đồng
hóa trị vào một chất mang không hòa tan chứa
trong cột sắc ký
 Hiệu quả: tinh sạch cao trong thời gian ngắn
 Yếu tố ảnh hƣởng: chất mang, phối tử, phƣơng
pháp gắn kết phối tử cũng nhƣ các điều kiện rửa
giải enzyme
Sơ đồ sắc
ký ái lực
 Tính chất của chất mang
Hoàn toàn
không hòa tan
trong pha di
động

Không có các Có độ bền về

tƣơng tác phi
đặc hiệu Chất hóa học và sinh
học

mang
Có độ cứng cơ
Có chứa nhiều học, có tính
nhóm chức có háo nƣớc và
khả năng biến tính thấm
đổi khi hoạt hóa
 Phối tử
 Phối tử thƣờng là những chất tƣơng tự cơ chất
của enzyme muốn tinh sạch, chất kìm hãm hoặc
cofactor.
 Phối tử nói chung phải đặc hiệu với protein và
phải có một ái lực trung bình với nó.
 Nồng độ phối tử: phải thích hợp và nếu thừa phối
tử sẽ gây ra những án ngữ không gian đáng kể.
 Trƣờng hợp khi phối tử là một phân tử nhỏ hoặc
khi phân tử enzyme quá lớn có thể gây ra sự
“cồng kềnh không gian” thì phối tử sẽ đƣợc nối
dài thêm bằng một đoạn “cánh tay đòn” để nó dễ
tiếp cận với tâm hoạt động của enzyme. Cánh tay
đòn thƣờng là một mạch carbohydrate nhị chức
dài từ 6-8 carbon.
 Hoạt hóa chất mang

 Phối tử (và cánh tay đòn) phải đƣợc

gắn lên chất mang.
 Chất mang trƣớc tiên phải đƣợc hoạt
hóa với cyanogen bromide (CNBr).
 CNBr sẽ phản ứng với các nhóm
hydroxyl của agarose, chẳng hạn để tạo
ra một imidocarbamate và
imidocarbamate dễ dàng tác dụng với
một amine bậc nhất của cánh tay đòn.
 Rửa giải
 Enzyme được rửa giải ra khỏi cột sắc ký nhờ phức hợp
của nó với phối tử có bản chất phi đồng hóa trị và
thuận nghịch.
 Dung dịch rửa giải thường phải có:
- (1) có chứa một phối tử tự do của enzyme có khả năng
cạnh tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với
enzyme
- (2) do pH của mình có thể gây biến tính thuận nghịch
enzyme do đó làm biến dạng tâm hoạt động của
enzyme.
 Có thể làm yếu tương tác đặc hiệu sinh học bằng cách
thay đổi lực ion.
 Phối tử cạnh tranh (hoặc dung dịch đệm làm biến tính)
sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tích.
6.5.4. Sắc ký tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước
 Ưu điểm
- Tập trung, cô đặc
- “Nhẹ nhàng”
- Năng suất tốt
- Nhanh
- Dễ nâng cấp trên quy mô lớn
 Nhƣợc điểm
- ‟Mẫu luôn luôn tách trong dung dịch muối
cao
- Phức tạp, protein dễ dàng lắng ở nồng độ
muối cao
 6.5.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high
performance liquid chromatographic techniques)-HPLC

 Nguyên lý: phân tách các chất bằng cách

dùng áp suất để đẩy nhanh dung dịch qua
cột sắc ký với một hiệu suất cao
 Quy mô: phòng thí nghiệm
 HPLC sử dụng một loại cột chứa các hạt
nhỏ rất đồng nhất, có tác dụng cải thiện sự
ổn định vật lý và hóa học và phân tách
nhanh hơn các gel mềm truyền thống
 6.5.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high
performance liquid chromatographic techniques)-
HPLC
 Cột sắc ký chứa các vật liệu đệm kín có độ phân giải cao
(8, 15 hoặc 40 µm) cho phép sản xuất các phân đoạn cô đặc
hơn.
 Các hạt nhỏ có sức bền cao đối với dòng chảy của chất
lỏng để thiết bị được thiết kế hoạt động ở áp suất tương đối
cao.
 Dung môi được phân phối vào cột bằng bơm với dòng
không có xung, không thay đổi ở áp suất ngược cao. Cột có
khả năng chịu đựng sự tăng áp suất.
 Đầu dò (detector) có thời gian phản ứng nhanh vì các
đỉnh protein có thể trải qua trong một vài giây.
 Ưu điểm: thời gian chạy nhanh
 Nhược điểm: đắt tiền, khó áp dụng ở quy mô lớn.
Injector
Hệ thống HPLC đơn giản

Column

Mobile phase

Detector
tM tR1 tR2 tR3 tR4
Start
Hệ thống HPLC
 6.6. Siêu lọc
 Siêu lọc đã trở thành một kỹ thuật tiêu
chuẩn của phòng thí nghiệm để cô đặc các
dung dịch protein dƣới các điều kiện rất ôn
hòa.
 Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trong
trƣờng hợp thẩm tách hoặc lọc gel để khử
muối hoặc trao đổi đệm.
 Bằng cách dùng các chất kết tủa ái lực để
tăng khối lƣợng phân tử của protein mong
muốn, phƣơng pháp này cũng có thể đƣợc
dùng nhƣ một kỹ thuật tinh sạch.
 6.6. Siêu lọc
 Hệ siêu lọc thƣờng sử dụng màng lọc có bề
mặt nhẵn hoặc màng lọc hệ sợi rỗng. Các sợi này
có đặc điểm tƣơng tự với các bề mặt nhẵn, nhƣng
đối với các quá trình ở quy mô lớn thì nó tạo ra
một diện tích bề mặt lớn hơn thể tích đã cho.
 Ở trƣờng hợp hoạt động ở quy mô pilot, hệ siêu
lọc thích hợp với diện tích màng lên tới 6,4 m2, cho
tốc độ siêu lọc lên tới 200 L/giờ, tùy thuộc vào
nồng độ của protein.
 Các hệ lớn hơn thích hợp với các tốc độ siêu lọc
của hàng trăm lít/giờ. Sử dụng phƣơng pháp này
có thể ứng dụng cho hầu hết mọi quy mô hoạt
động.
 6.7.Thiết kế các protein để tinh sạch

 Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một
trình tự promoter hiệu quả, thì một protein ngoại
lai có thể đƣợc biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ
10 tới 40% protein tổng số hòa tan của tế bào.
 Đối với các protein đƣợc biểu hiện trong một
dạng hòa tan, các kỹ thuật di truyền có thể đƣợc
dùng để hƣớng tới việc protein đƣợc tổng hợp
mới trong gian bào, hoặc thậm chí trong môi
trƣờng nuôi cấy  tăng sự ổn định của protein
và đơn giản hóa sự tinh sạch.
 6.7.1. Các thể vùi (inclusion)
 Các mức độ biểu hiện cao của protein, dẫn
đến xuất hiện các hạt không hòa tan được
gọi là các thể vùi.
 Hiện tượng này quan sát ở nhiều protein tái
tổ hợp, bao gồm urogastrone, interleukin-2,
prochymosin và các interferon.
 Sau khi phá vỡ tế bào, các hạt như thế có
thể được lắng xuống đáy với một lực ly tâm
(RCF) tương đối thấp, sản xuất nguyên liệu
không hòa tan chứa hơn 50% protein mong
muốn.
 6.7.1. Các thể vùi (inclusion)
 Nguyên nhân tạo thể vùi: chƣa đƣợc biết rõ.
 Các thể vùi đƣợc hòa tan trong urea hoặc
guanidinium chloride (thƣờng ở giá trị pH cao) và
chất tẩy rửa
 Khi hòa tan, protein phải đƣợc tái cuộn xoắn thành
một cấu hình tự nhiên.
 Để protein cuộn xoắn: sử dụng các phƣơng pháp:
pha loãng, oxy hóa và khử glutathione (nếu protein
chứa các cầu nối disulfide) hoặc các dung môi
(PEG, hoặccác chất tẩy rửa nhƣ Triton X-100,
Tween 20)
 Chaperonins là các protein cần để đảm bảo cuộn
xoắn chính xác các in vivo protein
 6.7.2. Các đuôi ái lực
 Đuôi ái lực được thiết kế với mục đích giúp cho
sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn
bằng cách biến đổi các tính chất của nó trong
một kiểu có thể dự đoán.

 Khó khăn: phải loại bỏ thành công đuôi ái lực

và các tác nhân được sử dụng

 Cách giải quyết: biến nạp di truyền các điểm

đặc hiệu cao cho protease hoặc cho sự cắt bỏ
các liên kết acid không bền ở chỗ nối của
protein tái tổ hợp và đuôi ái lực.
 Các phương pháp loại bỏ các đuôi ái lực

Phương pháp phân

Trình tự liên kết Các điều kiện
cắt
-Asn-Gly- Hydroxylamine pH 9; 45oC
10% acetic acid;
-Asp-Pro- Acid
55oC
CNBr 70% formic acid;
-Met-Xxx-
20oC
-Xxx-(Arg)n- CarboxypeptidaseB pH 8; 37oC
-Xxx-(His)n- CarboxypeptidaseA pH 8; 37oC
-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg- pH 7-8; 37oC
Thrombin
Xxx-
-Ile-Glu-Gly-Arg-Xxx- Factor Xa pH 7-8; 37oC
-Asp-Asp-Asp-Lys-Xxx- Enterokinase pH 8; 37oC
-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln- PreCission Protease
pH 7; 5oC
Gly-Pro-
Các phương pháp tinh sạch protein bằng đuôi ái lực
Các điều kiện
Các điều kiện
Đuôi ái lực Phối tử/khuôn tách rửa
liên kết

Oligo arginine S-Sepharose pH 4-8 NaCl gradient

Iminodiacetate- pH 7-8 ± Đệm imidazole
Oligo histidine Sepharose (Ni2+) guandinium hoặc giảm pH gradient
chloride ± guandinium chloride
FlagTM Anti-Flag 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA,
antigenic antibody- 1 mM CaCl2, pH 7,4
peptide Sepharose pH 7,8
1,6 M NaCl, 0,1 M sodium
β-galactosidase TPEG-Sepharose
pH 7 borate
Chloramphenic
ρ-
ol 0,3 M NaCl, 5mM
minochloramphenicol-
acetyl pH 7,8 chloramphenicol
Sepharose
transferase
Protein A IgG-Sepharose pH 7,6 0,5 M acetic acid
Glutathione- Glutathione- Glutathione
pH 7,3
Stransferase Sepharose
CÂU HỎI ÔN TẬP
CHƢƠNG 6
Câu hỏi: Em hãy trình bày cấu trúc của phân tử protein?.
- Protein là đại phân tử đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc đa phân với
các đơn phân là axit amin
+ Các axit amin kết hợp với nhau thành mạch dài nhờ liêt kết
peptid (chuỗi polypeptide)
+Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp nếp theo nhiều cách
khác nhau để tạo nên cấu trúc không gian khác nhau và quyết định
nên chức năng của protein
- Protein là một chất đại phân tử đƣợc tạo thành từ rất nhiều các
đơn phân là các axit amin
+ Axit amin đƣợc cấu tạo bởi 3 phần: nhóm amin (-NH2),
nhóm cacboxyl (-COOH) và nguyên tử cacbon trung tâm đính với
một nguyên tử hydro và nhóm biến đổi R - quyết định tính chất của
axit amin
+ Protein có tính đa dạng do có 20 axit amin trong thành
phần
- Cấu trúc hóa học của protein
+ Là hợp chất hữu cơ gồm 4 nguyên tố cơ bản C, H, O, N thƣờng
có thêm S và đôi lúc có P
+ Thuộc loại đại phân tử, đơn phân là các axit amin
+ Có 20 loại axit amin
+ Mỗi axit amin có kích thƣớc trung bình 3Ao
+ Các axit amin liên kết với nhau bằng liên kết peptid tạo nên
chuỗi polypeptide. Liên kết peptide đƣợc tạo thành do nhóm
cacboxyl của axit amin này liên kết với nhóm amin của axit amin
tiếp theo và giải phóng một phân từ nƣớc
+ Mỗi phân tử protein có thể gồm một hay nhiều chuỗi
polypeptide cùng loại
+ Từ 20 loại axit amin tạo nên vô số protein khác nhau
+ Mỗi loại protein đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng - thành phần trật
tự sắp xếp của các axit amin trong phân tử tạo nên tính đa dạng
hay đặc thù của protein đó
- Cấu trúc không gian của protei
Protein có 4 cấu trúc cơ bản nhƣ sau:
a. Cấu trúc bậc 1:
+ Là trình tự sắp xếp các axit amin và vị trí liên kết hóa trị trong chuỗi liên kết
polypeptide (chủ yếu là liên kết disulfite)
+ Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là
nhóm cacboxyl của axit amin cuối cùng
+ Vai trò của cấu trúc bậc 1 của protein: vai trò quan trọng vì trình tự các axit
amin trong chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tƣơng tác giữa các phần trong chuỗi
polypeptide. Từ đó, tạo nên hình dạng lập thể của protein, do đó quyết định
tính chất chức cũng nhƣ vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp
của các axit amin có thể dẫn đến sƣ biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.
b. Cấu trúc bậc 2 (cấu trúc thứ cấp):
-Biểu thị cấu trúc thông thƣờng của một chuỗi polypeptide.
- Chuỗi popypeptide thƣờng không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc
xoắn α, gấp nếp ß và các xoắn hay vòng hình chữ U nhờ liên kết hydro giữa các
axit amin ở gần bên nhau.
c. Cấu trúc bậc 3:
- Là cấu trúc bậc 2 tiếp tục co xoắn trogn không gian tạo thành
cấu trúc không gian hình cầu đặc trƣng cho mỗi loại protein
nhờ các liên kết disulfua (S=S), liên kết ion, liên kết tĩnh điện,
liên kết hydrogen, liên kết Vander Waals… giúp làm tăng tính
bền vững của phân tử protein.

d. Cấu trúc bậc 4:

- Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau theo một cách nào đó tạo
nên cấu trúc bậc 4 của protein. Tức là do nhiều cấu trúc bậc 3 kết
hợp thành khối cầu.
- Hai hay nhiều chuỗi polypeptide xoắn trong không gian tạo hình
cầu nhờ các liên kết yếu nhƣ liên kết hydro
- Protein chỉ thực hiện đƣợc chức năng khi chúng ở cấu trúc không
gian tức là khi ở cấu bậc 3 hoặc bậc 4.
Câu hỏi: Em hãy trình bày các quá trình tách chiết và tinh sạch
protein?.
Tùy thuộc cấu trúc, đặc điểm sinh hóa của protein khác nhau mà
các protein khác nhau sẽ có quá trình tách chiết và tinh sạch khác
nhau. Tuy nhiên quá trình tách chiết và tinh sạch protein gồm các
bƣớc chính nhƣ sau:
1. Thu hồi
-Yêu cầu giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein
1.1. Thu hồi các protein ngoại bào: dễ thu hồi và tinh sạch; thu hồi
protein từ dịch nuôi và tách khỏi tế bào nuôi bằng ly tâm hoặc lọc.
(0,25 điểm)
1.2. Thu hồi các protein nội bào: từ nguồn động thực vật thì mô phải
được phá vỡ để giải phóng protein ra.
1.2.1. Phá vỡ tế bào:
a. Nguyên lý chung
+ Làm khô mô để ổn định và phá vỡ tế bào động - thực vật
đƣợc dễ dàng hơn.
+ Làm khô mô trong điều kiện chân không hoặc trong không khí, hoặc kết tủa
bằng dung môi trộn với nƣớc. Sau đó, thu dịch chiết enzyme từ nguyên liệu khô
bằng cách hydrate hóa trở lại nguyên liệu trong một dung dịch đệm thích hợp.
+ Phá vỡ bằng cơ học: nghiền đồng thể
+ Với tế bào vi sinh vật: do tế bào có thành tế bào dai hơn thành tế bào
động và thực vật và kích thƣớc tế bào nhỏ nên có thể dùng dung môi không trộn
nƣớc hoặc phƣơng thức vật lý: siêu âm là kỹ thuật thích hợp nhất; dùng áp suất
cao (ở quy mô lớn)
- Có 3 phƣơng pháp chính để giải phòng các protein nội bào là:
phƣơng pháp enzyme, hóa học và vật lý.
b. Phƣơng pháp enzyme:
+ Sử dụng lysozyme, tuy nhiên giá thành đắt, khó áp dụng trên quy mô lớn.
c. Các phƣơng pháp hóa học để phân giải tế bào:
+ Xử lý kiềm;
+ Xử lý bằng chất tẩy rửa (chú ý đến nồng độ sử dụng do có thể làm biến
tính protein, ảnh hƣởng đén bƣớc tinh sạch tiếp theo…)
d. Các phƣơng pháp vật lý để phân giải tế bào:
+ Shock thẩm thấu; + Nghiền
+Trƣợt rắn: đẩy tế bào đã đông lạnh qua một lỗ hẹp ở áp suất cao và một
nhiệt độ thoát ra ngoài khoảng -20oC
+ Trƣợt lỏng: các tế bào trong dịch huyền phù đƣợc chuyển qua một lỗ hẹp
nén dƣới áp suất cao; quy mô nhỏ dùng thiết bị French Press và quy mô lớn-
thiết bị đồng hóa (homogenizer); Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein
phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng độ và tiền
xử lý.
1.2.2. Phân lập các enzyme hòa tan: Sau khi phá vỡ tế bào cần
phải:
+ Làm lạnh
+ Dùng dung dịch đệm thích hợp
+ Có sự hiện diện của các tác nhân bảo vệ enzyme nhƣ
mercaptoethanol
- Các nhân tố ức chế protein phải đƣợc bổ sung để làm giảm ảnh hƣởng phân
hủy của protease.
- Các enzyme hòa tan có thể thu thập bằng phƣơng pháp lọc qua màng hoặc ly
tâm
- Các chất ổn định nhƣ ammonium sulphate có thể đƣợc bổ sung nếu cần thiết
2. Tinh sạch sơ bộ
- Chỉ áp dụng với protein có giá trị ứng dụng cao;
- Quy mô của quá trình tinh sạch sẽ quyết định sự lựa chọn kỹ thuật phân tách
2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào
- Sau phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch protein nội bào cần
loại bỏ các mảnh vỡ tế bào bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc
2.2. Ly tâm mẻ - dùng cho lượng dung tích nhỏ
2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục: sử dụng cho quy mô lớn để loại bỏ các chất
dạng hạt với 3 dạng chính là
+ Ly tâm thùng rỗng
+ Ly tâm đĩa
+ Ly tâm thúng- đó là các bộ lọc ly tâm
2.4. Lọc bằng màng: cần phải có màng lọc có diện tích lớn do có hiện tượng lỗ
màng bị bít. Có thể khắc phục bằng cách dùng phương pháp lọc dòng chảy (cross
– flow) hoặc tiếp tuyến (tangential)
-Trong thực tế: do hạn chế của phương pháp ly tâm ở quy mô lớn nên kỹ thuật
lọc màng và ly tâm được phối hợp để đảm bảo dịch chiết thật sự sạch cho bước
sắc ký tiếp theo.
3. Hệ phân tích hai pha nƣớc (hay chất lỏng-chất lỏng)

- Các hệ hai pha nƣớc đặc trƣng đƣợc tạo ra bằng cách trộn các dung dịch
polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc PEG và các loại muối nhƣ
potassium phosphate hoặc ammonium sulphate để tạo thành hai pha riêng
biệt.
- Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai
pha, vì thế kỹ thuật này có thể đƣợc dùng cho cả hai trƣờng hợp: phân
tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia protein trong suốt quá
trình tinh sạch.
-Sự phân chia chính xác của một protein tùy thuộc vào các thông số nhƣ
khối lƣợng phân tử và điện tích của chúng, nồng độ và khối lƣợng phân tử
của các polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của
các muối đa trị nhƣ phosphate hoặc sulphate.
4. Phƣơng pháp kết tủa
-Các enzyme/protein có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc
phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate,
polyethyleimine và polyallylamine hoặc với các dung môi hữu cơ
như là isopropanol, ethanol, và acetone.
-Các streptomycin sulphate, polyetheleneimine và các polyamine
khác có thể kết tửa các chất có tính chất như axit nucleic và các
nucleoprotein.
- Kết tủa đơn giản giúp loại bỏ protease và giảm thể tích hoạt động
tổng số, thường bằng một thừa số của 20. Thay đổi pH và nhiệt độ
cũng có thể tạo ra kết tủa chọn lọc và loại bỏ các protein không
mong muốn.
+Kết tủa bằng ammonium
+ Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ
+ Kết tủa bằng các polymer khối lượng phân tử cao
+ Kết tủa bằng nhiệt
5. Các phƣơng pháp sắc ký
Nguyên lý: cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp.
Phép phân tích sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động
của các chất hòa tan đã đƣợc gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Tƣơng
tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tƣơng tác hấp thụ, tƣơng tác ion
(trao đổi ion), tƣơng tác kỵ nƣớc, tƣơng tác kiểu rây phân tử hoặc tƣơng tác
đặc hiệu sinh học.
5.1. Sắc ký lọc gel: sự phân tách protein đƣợc dựa trên cơ sở kích thƣớc
phân tử. Pha tĩnh chứa các hạt gel (polymer) xốp có những lỗ nhỏ ly ty đƣợc
bao quanh bởi pha dung môi chuyển động.
- Khi dung dịch chứa các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn của hỗn hợp
có đƣờng kính lớn hơn lỗ của hạt gel nên không thể khuếch tán vào bên trong
hạt (qua các lỗ nhỏ) và vì thế chúng đi qua các kẽ hở của cột và bị rửa khỏi cột
trƣớc cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel Vo.
-Các phân tử nhỏ hơn sẽ đi qua các lỗ nhỏ để khuếch tán vào trong các hạt gel
và đƣợc rửa khỏi cột sau, thể tích dịch rửa của chúng bằng tổng thể tích của
cột Vt.
- Cần lƣu ý không có sự tƣơng tác giữa khuôn và chất hòa tan, vì thế môi
trƣờng lọc gel lý tƣởng phải trơ hoàn toàn. Để sức chứa cực đại hạt gel phải
rắn và có độ xốp cao.
5.2. Sắc ký trao đổi ion:
- Được sử dụng rộng rãi nhất, có thể bao gồm cả trao đổi cation và anion mạnh và yếu. Các
protein và enzyme nói chung được hấp phụ ở lực ion thấp hoặc ở các giá trị pH trong đó điện
tích ion tổng số
đủ mạnh để tương tác với điện tích đối của nhựa trao đổi ion. Sự tách rửa protein được thực
hiện dễ dàng bằng cách thay đổi pH hoặc tăng lực ion của dung dịch rửa
- Nhựa trao đổi ion là một khung vật liệu rắn không hòa tan có gắn với các nhóm ion hóa bằng
liên kết đồng hóa trị. Các nhóm mang điện tích này lại được liên kết với các ion đối (opposite
ions) và các ion đối lại có thể trao đổi thuận nghịch với các ion trái dấu. Một khung có mang
các nhóm tích điện dương và ion đối tích điện âm, được gọi là nhựa trao đổi anion (anion
exchange resin). Ngược lại, một nhựa trao đổi cation sẽ mang điện tích âm.
- Các protein của một hỗn hợp cần phân tích thường có các nhóm bên ion hóa khác nhau, do đó
có pH khác nhau. Ở một giá trị pH nhất định các protein sẽ có một điện tích không giống nhau,
do đó chúng được giữ nhiều hay ít bằng tương tác ion trên một nhựa trao đổi ion đã cho và với
một pha di động đã cho.
- Quá trình phân tách trên cột bao gồm hai giai đoạn:
- Hấp phụ thuận nghịch protein cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống) vào nhựa
trao đổi ion.
- Khử hấp phụ các protein bằng cách: (1) thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn đến thay đổi độ ion
hóa và do đó thay đổi điện tích tổng của protein, hoặc (2) tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối
cạnh tranh. Các protein nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và
ngược lại. Khi sử dụng gradient lực ion hoặc/và gradient pH thường làm tăng chất lượng của
phép phân tách protein.
5.3. Sắc ký ái lực
- Phƣơng pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một
protein với một phân tử khác (phối tử), đã đƣợc gắn bằng liên kết đồng hóa trị
vào một chất mang không hòa tan chứa trong cột sắc ký. Khi cho một hỗn hợp có
chứa protein cần làm sạch đi qua thì chỉ có protein quan tâm bị giữ lại, còn tất cả
các protein khác không tƣơng tác đƣợc với phối tử (ligand) sẽ bị rửa trôi ra khỏi
cột. Tiếp đó, protein sẽ bị rửa giải ra bằng các phƣơng pháp khác nhau.
- Phƣơng pháp sắc ký ái lực rất hiệu quả trong việc tinh sạch các enzyme, cho
phép thu đƣợc enzyme có độ sạch cao (hơn sắc ký trao đổi ion khoảng 10 lần) chỉ
bằng một giai đoạn và trong một thời gian ngắn.
- Các nhân tố nhƣ chất mang, phối tử, phƣơng pháp gắn kết phối tử cũng nhƣ
các điều kiện rửa giải enzyme đều có vai trò quan trọng trong sắc ký ái lực.
- Chất mang (pha tĩnh): phải có một số tính chất sau:
+Hoàn toàn không hòa tan trong pha di động.
+ Có độ bền về hóa học và sinh học.
+ Có độ cứng cơ học, có tính háo nƣớc và tính thấm.
+ Không có các tƣơng tác phi đặc hiệu.
+ Có chứa nhiều nhóm chức có khả năng biến đổi khi hoạt hóa trong các
điều kiện nhẹ nhàng.
- Phối tử thường là những chất tương tự cơ chất của enzyme muốn tinh sạch, chất kìm
hãm hoặc cofactor. Phối tử nói chung phải đặc hiệu với protein và phải có một ái lực
trung bình với nó.
- Hoạt hóa chất mang
- Rửa giải: Sau khi loại bỏ các protein khác, enzyme cần tinh sạch có thể được rửa giải
ra khỏi cột sắc ký nhờ phức hợp của nó với phối tử có bản chất phi đồng hóa trị và
thuận nghịch. Dung dịch rửa giải thường phải có: (1) hoặc có chứa một phối tử tự do
của enzyme có khả năng cạnh tranh với phối tử đang ở trạng thái liên kết với enzyme,
(2) hoặc do pH của mình có thể gây biến tính thuận nghịch enzyme do đó làm biến
dạng tâm hoạt động của enzyme.
5.4. Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc:
Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước của protein bề mặt như là một
đặc điểm để chọn lọc. Loại phân tách này thích hợp khi được tiến hành tiếp theo bước
kết tủa ammonium sulphate, và không cần thiết phải loại bỏ muối trước khi thực hiện
bước sắc ký này.
5.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid
chromatographic techniques)-HPLC
-Đây là phương pháp phân tách các chất bằng cách dùng áp suất để đẩy nhanh dung
dịch qua cột sắc ký với một hiệu suất cao.
Ngoài ra, còn có thể áp dụng các phương pháp phân tách protein khác như siêu lọc
(sau khi thẩm tích hoặc lọc gel để khử muối hoặc trao đổi đệm
Tài liệu tham khảo
 Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn công nghệ sinh học. Nhà
xuất bản Đại học Huế.
 Tài liệu trang web/google
 CHƢƠNG 7
CÁC ỨNG DỤNG TRONG
NÔNG NGHIỆP
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
 Mở đầu
 Đây là lĩnh vực công nghệ sinh học có nhiều đóng góp quan
trọng. CNSH tạo ra một cuộc cách mạng sâu sắc trong lĩnh vực
giống cây trồng, vật nuôi và chế biến thực phẩm, mang lại giá trị
kinh tế cao
 Các hướng chính:
- Chọn lọc và biến đổi di truyền cây trồng để có đƣợc các đặc
điểm mong muốn (năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi với
các điều kiện ngoại cảnh bất lợi...),
- Nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh giống cây trồng,
- Sản xuất các kháng thể đơn dòng để phục vụ chẩn đoán các
bệnh thực vật và động vật,
- Thụ tinh trong ống nghiệm và cấy chuyển phôi ở vật nuôi,
- Cải thiện năng suất và chất lƣợng của động vật, nuôi trồng thủy
sản, chế biến thực phẩm...
II. Cải thiện và nhân nhanh
giống cây trồng
 Chọn
dòng tế
bào biến
dị soma

Nhân giống Nhân

Lai vô và cải thiện giống
giống cây trong ống
tính trồng nghiệm

Sản xuất
cây đơn
bội
 1. Nhân giống vô tính
 Trong kĩ thuật trồng trọt có nhiều loài cây cần phải nhân
giống vô tính ở qui mô lớn
 Trong những năm 1930, việc tái sinh lại chồi và toàn bộ cây
trồng đã đƣợc tiến hành một cách thuận lợi nhờ xây dựng đƣợc
kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thành công
Ƣu điểm
- Hệ số nhân giống lớn
- Sự đồng đều của cây giống ảnh hƣởng đến năng suất và chất
lƣợng sản phẩm
- Rút ngắn thời kỳ sinh trƣởng và sử dụng ƣu thế lai
• Hạn chế của kĩ thuật nhân
giống in vitro
- Chi phí cao so với các phƣơng pháp nhân giống
vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh
- Không phải bất cứ loại cây nào cũng có thể vi
nhân giống
- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân
giống in vitro
Nuôi cấy tế bào thực vật
 b1

b3
b2
b4

b6 b5

Quy trình công nghệ nuôi cấy mô tế bào

 1. Nhân giống vô tính
Cuộc cách mạng xanh từ những năm 1960-
1970

lúa lúa mì lúa miến ngô

Mục đích:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm
- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa và cây cảnh
không trồng bằng hạt.
-Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt
-Làm sạch bệnh, virus
-Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính
Rất cây trồng có thể đƣa vào nhân giống vô tính in
vitro với mục tiêu thƣơng mại hóa trên qui mô lớn
vd nhƣ:

Atiso Măng tây Củ cải đƣờng Khoai tây

Dâu tây Raspberry Kiwi

Nho
Lập ngân hàng gene thực vật
Ứng dụng nhân nhanh in vitro
 Duy trì và nhân nhanh các
kiểu gen quý làm vật liệu cho
công tác giống
Ví dụ: nhân giống cây trầm
hƣơng (Aquilaria crassna)
Ứng dụng nhân nhanh in vitro

 Nhân nhanh các

loài hoa, cây cảnh
khó trồng bằng hạt.
Ví dụ: nhân nhanh
hoa lan
Sản xuất cây giống sạch mầm bệnh
Việc nhân giống và khai thác cây chịu hạn

Jojoba Guayule Ocnothera spp

Từ trái qua: Atriplex nummularia, Atriplex

barclayama và Atriplex lentiformis
Nhân giống vô tính in vitro các cây rừng lấy gỗ
hay làm bột giấy

Chi bạch đàn (Eucalyptus)

Faidherbia

E. camaldulensis
 Nuôi cấy hạt phấn tạp cây đơn bội

Nuôi cấy bao

phấn (anther) và
hạt phấn (pollen)
Tạo cây đơn bội
trong chọn giống
 Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

 Giới thiệu Protoplast

 Dung hợp là quá trình hợp nhất 2 protoplast lại làm một
 2 giai đoạn chính của kĩ thuật protoplast
1. Giai đoạn tách và nuôi cấy protoplast
2. Giai đoạn dung hợp protoplast.
Ví dụ:
- Dung hợp protoplast có thể chọn giúp các dòng cà phê
kháng bệnh và các độc tố
- Lai giữa tế bào thực vật và vi khuẩn
- Dung hợp đƣợc các tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt
phấn)
Dung hợp
protoplast.
A: các protoplast.
B: hai protoplast dung hợp
trong một cặp.
C: các protoplast có thể dung
hợp trong thể 3 (bên phải
ảnh) hoặc nhiều hơn, có khi
tới 6 protoplast.
Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)
Cây lai giữa cà rốt và rau mùi, cam
và chanh, khoai tây với cà chua

Cây cà rốt-ngò Cây khoai - cà

 Chọn dòng biến dị soma
 3 mức độ chính: callus, tế bào đơn (single cell) và
protoplast
 Mục đích của chọn dòng tế bào:
- Chống chịu điều kiện bất lợi
- Kháng độc tố, kháng sinh…
- Sản xuất dƣ thừa các loại sản phẩm là amino acid
- Tế bào mang đặc điểm chỉ thị để nghiên cứu di truyền
 Cơ sở
- Tính toàn năng: từ các tế bào soma có thể tạo nên bất kì
bộ phận nào của cây
- Cơ sở khoa học của việc chọn giống đó là hiện tƣợng
biến dị soma
Sơ đồ chọn dòng kháng Helminthosporium
maydis ở ngô
Nhân giống bằng sản xuất hạt nhân tạo

 Tế bào thực vật có đặc trƣng là không chỉ trở

thành tế bào sinh dƣỡng mà còn trở thành tế bào
phôi mầm
 Cần thiết trong nông lâm nghiệp
 Tính ƣu việt
+ Dễ làm sạch hết virus
+ Cung cấp phân đạm cho cây
+ Bảo vệ cây khỏi bị sâu và cỏ dại phá hoại
+ Tạo ra các giống mới
 Chuyển gen vào cây trồng
 Có 2 con đƣờng tái tổ hợp DNA
+ Chuyển gene trực tiếp
+ Chuyển gene gián tiếp
 Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào
từng loài cây trồng
 Chuyển gen vào cây trồng

Ở cây lúa

Lúa tiết kiệm nƣớc ở Bangladesh

Lúa giàu chất dinh dƣỡng

ở Đồng bằng sông Cửu Long
Lúa chịu mặn ở Trung Quốc
Lúa thơm đột biến Basmati Giống lúa chất lƣợng cao
ở Sóc Trăng :Việt lai 24
 Lúa mì

Lúa mì giàu chất dinh

dƣỡng ở Mỹ và Israel

Lúa mì ngọt ở
Nhật Bản

Lúa mì chịu sƣơng giá

ở Australia
 Lúa mạch

Lúa mạch chuyển gen bar và gus A

chống bệnh lùn vàng
 Đậu tương

Đậu tƣơng biến đổi Đậu tƣơng biến đổi

gen kháng sâu gen chịu hạn
 Cây cà chua

Cà chua màu tím giàu chất

Cà chua ghép kháng bệnh ở Việt
Nam
dinh dưỡng ở Mỹ
 Cây bông Ở cây ngô

Cây bông chuyển Ngô biến đổi gen có thể

gen kháng sâu và giúp chống lại thiếu
chịu thuốc diệt cỏ hụt sắt ở Đức

Ngô chịu hạn năng suất cao ở

Việt Nam
Một số cây trồng chuyển
gen.
A: ngô kháng côn trùng.
B: lúa mạch kháng virus.
C: cà chua cho quả chín
muộn . D: khoai tây chống
chịu chất diệt cỏ.
Mía kháng thuốc trừ sâu

Mía kháng thuốc trừ sâu

Dung hợp protoplast
Cà phê kháng bệnh

Bacillus thuringiensis (Bt)

 Công nghệ chuyển gene cố định đạm
 . Các phương pháp kĩ
thuật khác nhau trong
việc cố định Nitơ
 qui trình Haber-Bosch
 vi khuẩn. Tảo lam Anabaena

Rhizobium
Công nghệ chuyển gene cố định đạm

 Chuyển gene sản xuất

nitrogenase (gene nif) từ vi
khuẩn cố định N2 sang E.
coli bằng con đƣờng kĩ
thuật gene.
 Kĩ thuật gene trong
chuyển operon nitrogen vào
chất nguyên sinh của cây
trồng mong muốn.

Mô hình biến nạp gen nif

 Ứng dụng trong
chăn nuôi và thú ý
 3 công nghệ chính:
1.Công nghệ cổ truyền trong việc
tạo giống vật nuôi
2.Công nghệ mới trong việc
chuyển phôi và thao tác phôi
3.Công nghệ sinh học trong việc
chuyển gene tạo giống vật nuôi
 Công nghệ cổ truyền trong việc tạo
giống vật nuôi
Nguyên tắc chung:
Vật liệu
thuần chủng Lai tạo Chọn lọc

Củng cố các tính trạng

Tạo dòng &
và làm “trong sạch”
dòng thuần nhân giống
Công nghệ cổ truyền trong việc tạo giống vật nuôi
Các phương pháp lai giống nhằm mục đích
tạo giống mới:
• Lai cải tiến

Bò Sahiwal:
Giống bò thịt
ngoại. Dùng
để lai cải tiến
giống địa
phương
Công nghệ cổ truyền trong việc tạo giống vật
nuôi
Các phương pháp lai giống nhằm mục đích tạo
giống mới:
• Lai cải tạo

Giống bò
Brahman thường
được dùng lai cải
tạo với giống bò
Vàng Việt Nam
để cải thiện tầm
vóc
 Công nghệ mới trong việc chuyển phôi và thao
tác phôi
Chuyển phôi (embryo transfer):
- Được sử dụng để tăng khả năng sinh sản của động vật cái.

Gia đình bò Gia đình bò chuyển phôi

chuyển phôi (ET family)

(ET family)
 Công nghệ mới trong việc chuyển
phôi và thao tác phôi
Chuyển phôi (embryo transfer):
- Có hai phƣơng pháp chuyển phôi:

• Phƣơng pháp không phẫu thuật

• Phƣơng pháp không phẫu thuật: sử dụng súng

chuyển phôi thu nhỏ xuyên qua cổ vào sừng tử
cung.
 Công nghệ mới trong việc chuyển
phôi và thao tác phôi
Chuyển phôi (embryo transfer):
- Thao tác phôi: chia tách phôi (embryo splitting)
- 2 phƣơng pháp chia tách phôi: dùng kim và
dùng dao cắt

Embryo splitting- chia

Embryos under
tách phôi bằng dao
the microscope
day 2 / day 3
 Công nghệ mới trong việc chuyển
phôi và thao tác phôi
Chuyển ghép nhân (nuclear transplantation):
- Tạo nên các dòng vô tính .
- Nguyên lí:

Thu nhận Tách khối tế bào

Siêu bài noãn Thụ tinh
phôi phôi dâu

Dung hợp Cấy vào tế bào trứng

Chuyển phôi
tế bào chưa thụ tinh
 Các phương pháp:

Chuyển gen bằng Chuyển gen bằng

xung điện vi tiêm
 Các phương pháp:

Vi tiêm DNA
vào tế bào
 Công nghệ sinh học trong việc
chuyển gene tạo giống vật nuôi

Các bước chính:

- Tách chiết, phân lập gene mong muốn và tạo tổ

hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật

- Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene

- Chuyển gene vào động vật

- Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm

- Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển

gene
Sơ đồ tạo động
vật chuyển gen
Chuyển gen động vật.
(a) Sinh sản của các động vật chuyển
gen bằng các phƣơng thức thao tác tế
bào ES. (b) Tiếp theo việc chuyển
DNA, các tế bào ES mang thể tái tổ
hợp tƣơng đồng có thể đƣợc chọn lọc
trƣớc khi đƣa vào trong túi phôi.
Công nghệ sinh học trong việc
chuyển gene tạo giống vật nuôi

Gia súc chuyển gene:

- Gia súc chuyển gene hormone sinh trưởng

- Gia súc chuyển gene cung cấp các dược
phẩm chữa bệnh
- Gia súc chuyển gene kháng bệnh
- Gia súc chuyển gene cho năng suất cao và
chất lượng sản phẩm tốt
- Gia súc chuyển gene hormone
sinh trưởng
- Gia súc chuyển gene cung cấp các dược
phẩm chữa bệnh

• a1- antitripsin và yếu tố làm đông máu IX

(Blood Clotting Factor IX)
• Chất hoạt hóa plasminogene
• Gene urokinase
• Protein C
- Gia súc chuyển gene kháng bệnh

- Gia súc chuyển gene cho năng suất cao và

chất lượng sản phẩm tốt
CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ PHÂN THẢI
CÁC TRANG TRẠI CHĂN NUÔI
 Xử lý bằng công nghệ sinh học: Sử dụng chế
phẩm Hóa – vi sinh
 Ưu điểm:
- Đầu tƣ thấp, vận hành đơn
giản, không chi phí thiết bị Bể lắng Bể lắng
1
cấp 3
- Thu hồi triệt để hữu cơ làm Nước thải +
phân thải
cấp 2

phân bón 2

- Rút ngắn thời gian xử lý do

3
dùng chế phẩm vi sinh Hệ thống bể lắng
cấp 1
Nước thải rửa
 Nhược điểm: chuồng

- Cần diện tích rộng

- Cần chất độn hữu cơ
- Cần đầu ra cho phân hữu cơ
 Yêu cầu: Cần hệ thống chế
phẩm hóa – vi sinh chuẩn và
hiệu quả cao
 Phân bón sản xuất theo công nghệ trên đạt chất lƣợng cao làm tăng
năng suất cây trồng từ 8,1-13,8% và tăng hiệu quả kinh tế từ 1,78 –
4,08 triệu đồng/ha.
 Tăng năng suất cây trồng từ 10-15%, nâng cao chất lƣợng nông
sản, cung cấp và bổ sung các vi sinh vật hữu ích, làm tăng độ tơi
xốp của đất.
 Ứng dụng trong
Chế biến thực phẩm
 Sản xuất sữa
Chế biến tinh bột
(sữa chua, phomat)

Công nghệ
sinh học

Sản xuất nước

Các sản phẩm
uống lên men
chứa protein
(bia, rượu trắng, Chế biến rau quả
rượu vang)
Sản xuất sữa
1. Sản xuất sữa chua
Sữa chua :
- Là loại đồ uống từ sữa,
có giá trị dinh dƣỡng cao
- Đƣợc tạo ra do hoạt
động của vi khuẩn ax
lactic, nấm men, và vi
khuẩn acetic trong sữa
và nấm Kefir
 Lên men
Nguyên liệu Cấy giống tạo sữa
- Sữa chua
S. thermophilus,
-Tiệt trùng 85- L.bulgaricum, - Đông tụ sữa
90oC trong 15- L.acidophilum, - Giai đoạn
L.delbrueckibulgaricus
20 phút giữ chín sữa
chua

Quy trình chung để sản xuất

sữa chua
Quy trình sản xuất sữa chua
Một số hình ảnh về “nấm” kefir trong
sản xuất sữa chua
Một số nhóm vi sinh vật thường gặp trong “nấm” Kefir
 2. SẢN XUẤT PHOMAT
• Phô mai một dạng thức ăn giàu dinh dưỡng được chế
biến từ sữa và cũng là một phương pháp để bảo quản
sữa.
• Phô mai là sản phẩm đặc hay bán lỏng dạng tươi hay
chín được làm từ việc đông tụ sữa bằng rennet hay
các chất gây đông tụ khác rồi làm ráo nước.
• Phomai được làm từ khoảng năm 7000 – 4000 tr. CN.
• Được làm nhiều ở các nước La Mã, Anh.
• Ngày nay phomai được sản xuất hơn 10 triệu tấn mỗi
năm với 500 loại khác nhau.
• Một bước ngoặt trong công nghệ sản xuất phomat là
sử dụng enzym (rennet) để kết tủa protein.
 Rennet đƣợc chiết từ mô ruột của động vật bằng dung
dịch NaCl 10% và bảo quản trong NaCl 20% có bổ sung
benzoate natri hoặc propionate natri.
 Rennet bò có chất lƣợng tốt, chứa 90% chymosin + 10%
pepsin. Chymosin là một peptit có phân tử lƣợng 35,6
kDa, chứa 320 aa. Rennet bò chứa 3 dạng chymosin là
A, B, C với hoạt tính tƣơng đối là 100, 120 và 50 RU/mg.
 Do việc hạn chế giết mổ gia súc  cần tìm kiếm nguồn
sản xuất rennet thay thế  công nghệ enzyme tái tổ hợp
 Có thể cải biến để thích ứng tốt hơn cho công nghệ
sản xuất phomat
Nguyên lý hoạt động của enzyme chymosin trong quá trình
đông tụ sữa
Quy trình sản xuất rennet theo công nghệ truyền thống
 Phân loại phomat
• Theo FAO/WHO: có các dạng chính như sau:
- Phomat muối và làm chín
- Phomat làm chín bằng nấm
- Phomat không làm chín hoặc phomat tươi
• Dựa vào lượng béo trong sản phẩm: có thể chia
phomat thành các dạng:
 Béo cao (độ béo > 60%)
 Đầy béo (45-60%)
 Béo vừa (25 – 45%)
Béo thấp ( 10 – 25%)
 Không béo (< 10%)
Công nghệ sản xuất phomat
Gồm các bước như sau:
 1. Thanh trùng pasteur
 2. Sử dụng giống khởi động để sản xuất axit lactic từ lactose –
lên men lactic
 3. Bổ sung các chất đông tụ sữa

 4. Cắt gel
 5. Khuấy trộn ban đầu
 6. Rút nước ban đầu
 7. Gia nhiệt và nấu
 8. Khuấy trộn lần cuối
 9. Loại bỏ nước trong (whey) và xử lý phomat tươi
 10. Nén phomat
 11. Muối phomat
 12. Làm “chín” phomat
 Chế biến tinh bột
 Sử dụng nấm men bánh mì Sac. cerevisiae để lên men
 Thủy phân tinh bột bằng α-amylase và Amyloglycosidase 
sản phẩm có DE (mức độ thủy phân tinh bột thành đƣờng
glucose) cao
 Hiện nay, ngƣời ta đã tạo đƣợc một số chủng vi khuẩn,
trong đó có Bacillus licheniformis và Bac. amyloliquefaciens,
có khả năng tổng hợp α-amylase chịu nhiệt hoạt động đƣợc ở
nhiệt độ tới 100oC.
 Sản phẩm glucose đƣợc sử dụng làm nguyên liệu lên men
- Các loại nƣớc uống lên men có cồn nói
chung đều đƣợc sản xuất từ nguyên liệu chứa
đƣờng.
- Quá trình tạo ethanol bằng lên men của các
chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces
là quá trình chung
 Sản xuất bia

Quy trình sản

xuất bia
 Rƣợu trắng
 2 phƣơng pháp: lên men vi sinh vật và hóa học
 Lên men vi sinh vật: chủ yếu, là quá trình lên men rƣợu
của nấm men (Saccharomyces cerevisiae - chính) và
một số vi sinh vật khác trong điều kiện yếm khí. Phƣơng
trình tổng quát:

 Các bƣớc:
- Chế biến nguyên liệu thành dịch đƣờng
- Lên men biến đƣờng thành rƣợu: đƣờng đạt 90- 120 g/L
và pH = 4,5-4,8. Thời gian lên men từ 65-72 giờ
- Chƣng cất
- Tinh chế ethanol
 Phương pháp hóa học
Sản xuất rượu vang

Quy trình sản

xuất rƣợu vang
Các giai đoạn sản xuất rƣợu vang (3)

Giai đoạn
II. Giai đoạn
I. Giai đoạn hình phát triển rượu III. Giai đoạn
thành rượu: vang chín
- Thu “rượu non”
- Thời gian: tính và tiếp tục lên - Rượu non đã
từ lúc cấy giống men để phân hủy
đến khi dịch lên lượng đường còn đủ thành phần
men hết sủi bọt nhưng vẫn còn
mạnh lại “sống”  hạ
- Là giai đoạn nấm - Mùi vị: Rượu thổ ở nơi mát
men hoạt động chuyển từ mùi để đạt chất
mạnh nhất chua gắt sang
chua nhẹ dễ chịu lượng tốt
Các sản phẩm chứa protein
Thực phẩm lên men truyền thống
giàu protein: giò chả, xúc xích, cá
ƣớp

Protein đơn bào (single cell protein-

SCP)

Protein từ nguồn carbohydrate

Protein từ vi khuẩn lam cố định

đạm và vi tảo
 Chế biến rau quả

Enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase,

amylase, và protease.
 Tài liệu tham khảo
 Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình nhập môn
công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Huế.
 Tài liệu trang web/google
 CHƢƠNG 9
CÁC ỨNG DỤNG TRONG
MÔI TRƢỜNG
Giảng viên: GS. TS. NCVCC. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
ĐT: 091 534 3660; 02 4 379 11059;
Email: ddhong60vn@yahoo.com; ddhong@ibt.ac.vn; ddhong@tlu.edu.vn

TLU, 3.2020
I. Mở đầu

Môi trường
đang ô
nhiễm nặng

Giải
pháp???

Con trai một ngƣời nông dân
đang dùng tay xua đuổi bầy
châu chấu trên cánh đồng nhà
tại làng Katitika (Kenya)
Trẻ em ở Rahimyar (Pakistan)
đang chơi đùa giữa bầy châu
chấu

Châu chấu sa mạc bay rào rào ở khu bảo

tồn Nasuulu, miền Bắc Kenya ngày
 I. MỞ ĐẦU
Vấn đề bảo vệ môi trường được giải quyết theo ba
hướng sau:
1) Phân hủy các độc chất vô cơ và hữu cơ;
2) Phục hồi các chu trình trao đổi chất của C, N, P và S
trong tự nhiên;
3) Thu nhận các sản phẩm có giá trị ở dạng nhiên liệu
hoặc các hợp chất hữu cơ.

 2 vấn đề cơ bản
1) Giải quyết tiêu hủy một khối lƣợng khổng lồ các loại
chất thải mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng.
2) Vô hiệu hóa các loại chất độc sinh ra trong quá
trình phân hủy các loại chất thải công nghiệp

 Ứng dụng CNSH để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi

trƣờng là biện pháp hiệu quả, an toàn và thân thiện với
môi trƣờng
 ĐẶC ĐIỂM VẬT LÝ
& NGUỒN GỐC CỦA NƢỚC Ô NHIỄM
Nguồn: Wastewater Engineering: treatment, reuse, disposal, 1991

Màu Nƣớc thải sinh hoạt hay công

nghiệp, thƣờng do sự phân hủy
của các chất thải hữu cơ.
Mùi Nƣớc thải công nghiệp, sự phân
hủy của nƣớc thải
Chất rắn Nƣớc cấp, nƣớc thải sinh hoạt và
công nghiệp, xói mòn đất.
Nhiệt Nƣớc thải sinh hoạt, công nghiệp
 ĐẶC ĐIỂM VẬT LÝ
& NGUỒN GỐC CỦA NƢỚC Ô NHIỄM
Nguồn: Wastewater Engineering: treatment, reuse, disposal, 1991

Carbohydrate Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp

Dầu, mỡ Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp
Thuốc trừ sâu Nƣớc thải nông nghiệp
Phenols Nƣớc thải công nghiệp
Protein Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp
Chất hữu cơ Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp
bay hơi
Các chất nguy Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp
hiểm
Các chất khác Do sự phân hủy của các chất hữu cơ trong
nƣớc thải trong tự nhiên
Tính kiềm Chất thải sinh hoạt, nƣớc cấp, nƣớc ngầm
Nguồn: Wastewater Engineering: treatment, reuse,
 ĐẶC ĐIỂM VẬT LÝ
& NGUỒN GỐC CỦA NƢỚC Ô NHIỄM
Chlorides Nƣớc cấp, nƣớc ngầm
Kim loại Nƣớc thải công nghiệp
nặng
Nitrogen Nƣớc thải sinh hoạt, công nghiệp
pH Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp
Phosphorus Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp;
rửa trôi
Sulfur Nƣớc thải sinh hoạt, thƣơng mại, công nghiệp;
nƣớc cấp
Hydrogen Sự phân hủy của nƣớc thải sinh hoạt
sulfide
Methane Sự phân hủy của nƣớc thải sinh hoạt
Oxygen Nƣớc cấp, sự trao đổi qua bề mặt tiếp xúc
Nguồn: Wastewater Engineering: treatment, reuse,
không khí - nƣớc
disposal, 1991
 Ô NHIỄM NƢỚC - ĐẶC ĐIỂM VẬT LÝ
& NGUỒN GỐC

Động vật Các dạng chảy hở và hệ thống

xử lý
Thực vật Các dạng chảy hở và hệ thống
xử lý
Eubacteria Nƣớc thải sinh hoạt, hệ thống
xử lý
Archaebacteri Nƣớc thải sinh hoạt, hệ thống
a xử lý
Viruses Nƣớc thải sinh hoạt, hệ thống
xử lý
Nguồn: Wastewater Engineering: treatment, reuse, disposal, 1991
 TẢI LƯỢNG NƯỚC THẢI SINH HOẠT TÍNH
TRÊN ĐẦU NGƯỜI

Tác nhân gây ô nhiễm Tải lượng

Chất rắn lơ lửng (SS) (g/ngđ) 200
BOD5 (g/ngđ) 45 ÷ 54
COD (g/ngđ) 1,8
Tổng Nitơ (g/ngđ) 6 ÷ 12
Tổng Photpho (g/ngđ) 0,8 ÷ 4,0
Dầu mỡ (g/ngđ) 10 ÷ 30
Tổng Coliform (cá thể) 106 ÷ 109
Fecal Coliform (cá thể) 105 ÷ 106
Trứng giun sán 103
Giá trị tới hạn các thông số và nồng độ các chất
gây ô nhiễm trong nƣớc thải công nghiệp
(TCVN 5945-1995)
T Thông số Đơn vị Giá trị tới hạn
T A B C
1 Nhiệt hóa oC 40 40 45
2 pH 6  9 5,5  9 5 9
3 BOD5 (20oC) mg/L 20 50 100
4 COD mg/L 50 100 400
5 Chất rắn lơ mg/L 50 100 200
lửng (SS)
6 Arsen mg/L 0,05 0,1 0,5
7 Cadmi mg/L 0,01 0,02 0,5
 ĐÁNH GIÁ ĐỘ Ô NHIỄM

 DO là lượng ô xy hòa tan trong nước cần thiết cho sự hô

hấp của các sinh vật nước, thường được tao ra do sự
hòa tan từ khí quyển hoặc do quang hợp của tảo.
 Khi nồng độ DO thấp, các loài sinh vật nước giảm hoạt
động hoặc bị chết. Do vậy, DO là một chỉ số quan trọng
để đánh giá sự ô nhiễm của các thủy vực.
 Độ nhiễm bẩn của nước thải đánh giá qua:
 DO
- Ôxy sinh hóa (BOD)
- Nhu cầu ôxy hóa học (COD)
- Chất rắn tổng số
- Chất rắn huyền phù
 Nhu cầu ôxy sinh hóa (BOD – Biochemical Oxygen Demand)
- Là một chỉ tiêu được sử dụng rộng rãi nhằm đo chất lượng nước
- BOD là lượng ôxy hòa tan cần thiết để vi sinh vật ô xy hóa các chất
hữu cơ. BOD có ý nghĩa biểu thị lượng các chất thải hữu cơ trong
nước có thể bị phân hủy bằng các vi sinh vật
- Nước càng nhiều chất hữu cơ dễ bị ôxy hóa thì BOD càng cao
- Đơn vị: mg O2/l
 Nhu cầu ôxy hóa học (COD – Chemical Oxygen Demand)
- Là lượng ôxy cần thiết để ôxy hóa các hợp chất hóa học trong nước
bao gồm cả vô cơ và hữu cơ.
- COD là lượng ô xy cần để ô xy hóa toàn bộ các chất hóa học trong
nước, trong khi đó BOD là lượng ô xy cần thiết để ô xy hóa một phần
các hợp chất hữu cơ dễ phân hủy bởi vi sinh vật.
- Sử dụng tác nhân ôxy hóa mạnh là Kalibicromat (K2Cr2O7) hoặc
Kalipermanganat (KMnO4)
- COD càng lớn thì mức độ ô nhiễm hữu cơ càng cao
 Chất rắn tổng số (TS – Total solid)
Là toàn bộ lƣợng chất rắn ở dạng hòa tan và lơ lửng có
trong nƣớc thải. TS đƣợc tính bằng khối lƣợng chất
khô còn lại sau khi bốc hơi hết nƣớc trong nƣớc thải

Chất rắn lơ lửng

(Total suspended solid,
Tổng các chất TSS)
rắn (Total solid,
TS) Chất rắn hòa tan
(Total dissolved solid,
TDS)
Chất rắn huyền phù (SS- suspended solid)
Là lƣợng vật chất có kích thƣớc nhỏ lơ lửng trong nƣớc, đƣợc
xác định bằng các lọc qua giấy lọc tiêu chuẩn, sấy ở 103 –
105oC đến khối lƣợng không đổi rồi đem cân.
 II. Xử lý nƣớc thải
 Mục đích của xử lý nƣớc thải: loại bỏ chất hữu cơ, tác nhân
gây bệnh cho ngƣời và các chất hóa học độc hại.
 Phƣơng pháp
- Hóa học
- Lý học
- Vi sinh vật học
 Ở các nƣớc phát triển, hệ thống xử lý nƣớc thải gồm 3
bƣớc:
- Xử lý cấp 1: Phân tách lý học nhằm giảm nhu cầu ôxy
- Xử lý cấp 2: Quá trình phân hủy sinh học của các VSV để
giảm nồng độ chất hữu cơ trong nƣớc thải
- Xử lý cấp 3: Sử dụng phƣơng pháp hóa học để loại bỏ các
hợp chất vô cơ
 Sơ đồ các công đoạn trong xử lý nƣớc thải. Vi sinh vật
phân hủy chất thải ở giai đoạn thứ hai  Ứng dụng CNSH
 2.1. Xử lý hiếu khí bằng hệ
thống bùn hoạt tính
- Ưu điểm: Công suất lớn hơn nhiều so với
xử lý bằng bộ lọc thấm.
- Nhược điểm: do cường độ sử dụng lớn
hơn, nên mức tiêu thụ năng lượng để
khuấy trộn không khí cũng như số
lượng sinh khối được tạo ra lớn hơn
- Ứng dụng: xử lý nước thải cho các điểm
dân cư đông đúc, vì nó chiếm ít diện ích
hơn so với hệ thống xử lý theo công nghệ
lọc thấm.
Việc xác định thành phần và nồng độ các chất
trong nước thải  rất quan trọng
Các VSV quan trọng nhất là nhóm vi khuẩn tự
dưỡng chất hữu cơ như: Achromobacter,
Flavobacterium, Pseudomonas và Moraxella.
Nước thải có hàm lượng chất vô cơ cao, thì cần sự
có mặt các loại vi khuẩn như: Thiobacillus,
Nitrosomonas, Nitrobacter và Ferrobacillus, chịu
trách nhiệm oxy hóa S, NH3 và Fe.
Phƣơng pháp bùn hoạt tính: làm giảm từ 10 – 15% chỉ
số BOD, làm giảm tác nhân gây bệnh (Salmonella,
Escherichia coli – 90-99%)
Sơ đồ hệ thống bùn hoạt tính
Nguyên tắc quá trình bùn hoạt
tính
Liên kết với các quá trình
khác
Tích hợp các quá trình bùn hoạt
tính
Các ứng dụng trong thực tế
Phương pháp xử lý nước thải bằng
biện pháp sinh học
 2. Xử lý yếm khí
3 nhóm vi khuẩn:
- Nhóm vi khuẩn chịu trách nhiệm thủy phân và lên
men.
- Nhóm vi khuẩn tạo H2 và acetic acid.
- Nhóm vi khuẩn tạo khí methane tự dưỡng sử dụng
H2
 Giống: hoàn thiện các loại giống, chủng vi
khuẩn lên men yếm khí bằng biện pháp chọn lọc tự
nhiên hoặc nhờ phương pháp công nghệ DNA tái tổ
hợp  nâng cao hiệu suất lên men.
 Đặc biệt cần chú ý khắc phục các yếu tố giới hạn
tốc độ phân hủy cơ chất có mặt trong chất thải như
cellulose, tinh bột... và tốc độ tạo khí methane.
 Bể kỵ khí
 Là những bể lên men lớn đƣợc thiết kế cho quá trình hoạt
động liên tục trong điều kiện kỵ khí
 Chỉ dùng cho quá trình lắng đọng bùn trong nƣớc thải và xử lý
loại nƣớc thải công nghiệp có BOD rất cao.
 Bể chứa lƣợng lớn các chất hữu cơ lơ lửng, vi khuẩn. Số
lƣợng vi khuẩn cao, 109-1010/ml
 Quá trình gồm 2 bƣớc:
- Chất hữu cơ (Sk vi sinh vật)  acid béo +CO2+H2
- Sản sinh metan: 70% metan + 30 % CO2, sinh khối VSV + chất
cặn bã không thể phân hủy sinh học
 Bể kỵ khí tạo ra nguồn nhiên liệu thiết thực
 Các dạng bể kỵ khí điển hình:
- Bể metan cổ điển
- Bể lọc kỵ khí (Anaerobic filter)
- Bể xử lý kỵ khí với dòng chảy ngƣợc qua lớp đệm bùn hoạt
tính (UASB – Up flow anaerobic sludge blanket)
Phân hủy kỵ khí

Các giai đoạn

của phân hủy
kỵ khí
 Phân hủy kỵ khí
 Nhóm sinh vật methane hóa liên kết với
nhóm sinh vật acetate hóa

 Vi khuẩn methane chuyển hóa H2, CO2

thành methane
Bể phân hủy kỵ khí
BỂ XỬ LÝ KỴ KHÍ
1. Ống nắp chất thải
2. Bể phân hủy
3. Vòm chứa khí
4. Bể thải
5. Bể chứa chất thải
6. Áp kế
 So sánh hiệu quả các quá trình xử lý
nước thải khác nhau
Thông số Xử lý hiếu khí Xử lý yếm
khí
Bùn hoạt tính MBR UASB

BOD còn lại Thấp Rất thấp Cao

N & P còn lại Thấp Thấp Cao

Sản xuất bùn Cao Rất thấp Rất thấp

Năng lƣợng Cao Cao Thấp

Diện tích đáy Lớn Rất nhỏ Rất nhỏ

Độ tin cậy Phần lớn là bùn Thô Nổi hạt nhỏ

Chú thích: MBR: Bể phản ứng sinh học màng (membrane bioreactor)
UASB: Bể phản ứng kiểu lớp phủ bùn thải yếm khí chảy lên (Upflow anaerobic sludge blanket reactor)
 3. Thu hồi nước (water recycling)
 Thực trạng: Thiếu nước ngày càng trở nên trầm trọng 
việc sử dụng lại nước thải sau khi được xử lý sẽ là một hướng
ưu tiên.
 Ở các nước thuộc thế giới ba: tái sử dụng nước thải thô của
chăn nuôi để tưới trực tiếp cho cây trồng lương thực  lây
nhiễm virus gây bệnh hoặc prion
 Mục tiêu: sản xuất nước tưới an toàn vệ sinh mà không loại bỏ
các chất có thể sử dụng làm phân bón như là N và P  phân
hủy yếm khí là rất có triển vọng.
 Đặc trưng: là một hệ thống các quy trình sản xuất nước chất
lượng cao từ nước thải của quá trình sản xuất. Quy trình này
thường phối hợp các xử lý sinh học ở giai đoạn đầu và các xử
lý hóa-lý ở bước cuối cùng.
Nước sau khi xử lý: được dùng để Hình 9.3. Sơ đồ
rửa, tẩy sạch, tẩy trắng, nhuộm và in.
dòng chảy xử lý
Xử lý sinh học kết hợp với xử lý
hóa-lý để đạt được sự tinh sạch cần trong công nghiệp
thiết. dệt.
Một số mô hình bể xử lý nƣớc thải
 III. Phân hủy bùn hữu cơ
 Thực trạng: Sản xuất các loại bùn hữu cơ (bùn thải, phân
động vật) đang tăng lên, chúng thường được sử dụng một
cách tùy tiện;
 Phương pháp xử lý: phân hủy yếm khí trong các bể phản
ứng được trộn đều (completelymixed reactor) là tốt nhất.
 Sản phẩm: 50% chất rắn được biến đổi thành biogas + phần
còn lại được ổn định.
 Sản lượng biogas: tăng bằng cách đồng phân hủy (co-
digesting) phân động vật hoặc bùn thải với 10-20% các chất
thải rắn từ công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp
 Yêu cầu: Chất hữu cơ dạng hạt phải được hòa tan trước khi
chúng biến đổi yếm khí, thời gian ít nhất là 20 - 60 ngày
hoặc lâu hơn.
Nhiệt độ cao giúp cải thiện được hiệu suất do tốc
độ thủy phân của các chất dạng hạt tăng lên;
Phương pháp kết tủa thông qua điều chỉnh pH bằng
vôi là giải pháp hữu hiệu giúp loại bỏ ammonium.
 Các công nghệ như ổn định yếm khí hoặc hiếu khí,
nghiền đất (land disposal) và đốt các bùn thải hữu
cơ cung cấp các phương thức làm mất nước (làm
khô) bùn thải từ 2-5% tới 25-40% chất khô.
Thách thức chính đối với CNSH môi trường là :
- Phát triển các enzyme,
- Các sản phẩm và phương thức xử lý cho phép làm
mất nước của sinh khối vi sinh vật (bùn dư)
tới mức thích hợp.
 Các thông số thiết kế cho các loại bể phản ứng
yếm khí
Bể phản ứng Bể phản ứng
Bể phản ứng
Thông số được trộn trạng thái
UASB
đều rắn
Các chất thải
Chất lỏng đƣợc xử lý Nƣớc thải Bùn hữu cơ
rắn

Nồng độ chất rắn trong bể

<50 50-100 200-400
phản ứng (g/l)

Tốc độ nạp (kg CHC/m2.

10 - 30 2-5 20 - 40
ngày)

Thời gian giữ nƣớc (ngày) 0,3 - 1 20 - 40 10 - 20

Thời gian giữ chất rắn
> 20 20-40 10-20
(ngày)
 IV. Xử lý chất thải rắn
Phương pháp: chôn trong đất (landfilling) hoặc đốt.
- Chôn trong đất: ít được lựa chọn do chúng khó thu
hồi các sản phẩm có thể tái chế, năng lượng (biogas)
và gây ô nhiễm môi trường (mùi).
- Đốt: không thu hồi đượcnguyên liệu nhưng có thể thu
hồi năng lượng từ chất thải. Hạn chế: giá thành cao
Thiết bị phân tách và sản xuất phân ủ: Là thiết bị rất
lớn và phức tạp, có năng suất cao (100.000 tới
300.000 tấn chất thải/năm), được thiết kế một hệ phân
tách vật lý để thu hồi các vật liệu khác nhau từ các vật
bỏ đi (Cát, sỏi, kim loại, giấy, plastic, chất hữu cơ…)
Phân đoạn hữu cơ của chất thải rắn đô thị
được dùng làm phân bằng phương pháp
hiếu khí hoặc yếm khí.
 Các hệ phân hủy yếm khí cho chất thải rắn yêu cầu :
- Nồng độ chất rắn trong bể phản ứng: 50 - 400 g/L.
- Nhiệt độ thích hợp: 35oC - 55oC.
- Số giai đoạn lên men (một hoặc hai).
 Quá trình DRANCO (dry anaerobic composting) : dùng nhiệt
độ cao (55oC) ở nồng độ chất rắn lớn (200-400 g/L) trong
lên men một giai đoạn.
- Các tốc độ phản ứng rất cao: có thể hoàn thành quá trình
phân hủy trong hai tuần thay cho 20 năm ở trong đất.
- Bản chất : nhiệt độ cao và cường lực phối trộn thông qua sự
tuần hoàn khép kín cho phép tốc độ phản ứng cao hơn nhiều và
cung cấp chất rắn trực tiếp vào trong bể phản ứng không cần
bổ sung nước pha loãng.
- Sản phẩm: đất mùn
Sơ đồ dòng chảy của hệ sản xuất
phân trộn yếm khí
 V. Xử lý khí thải
1. Loại bỏ các hợp chất vô cơ dễ bay hơi (volatile organic
compoundsVOCs)
Các phương pháp xử lý hóa-lý truyền thống tạo ra khí thải
công nghiệp gây ô nhiễm
Ví dụ:
- Để đốt cháy các khí này (với nồng độ gây ô nhiễm là 100
mL/m3) trong các lò đốt, ít nhất cần 50L methane/m3.
- Đối với bể phản ứng sinh học: oxy hóa các VOCs bằng cách
cho tiếp xúc khép kín với các vi sinh vật phân hủy, O2, H2O và
các chất dinh dưỡng.
 Các chất gây ô nhiễm có tốc độ phân hủy sinh học (PHSH)
khác nhau:
- PHSH nhanh: alcohols, ketones, aldehydes, các acid hữu cơ,
N hữu cơ.
- PHSH chậm: phenols, hydrocarbons, các dung môi
- PHSH rất chậm: các hydrocarbon đa halogen và đa nhân
thơm.
Hệ lọc sinh học và máy lọc hơi đốt sinh
học được dùng để loại bỏ VOCs khỏi khí
thải
Các ưu điểm của hệ lọc sinh học:
- Thiết kế đơn giản và rẻ tiền
- Diện tích mặt trong cao làm cho hệ lọc sinh học thích
hợp một cách lý tưởng để loại bỏ các chất ô nhiễm
kém hòa tan
- Có khả năng đưa vào các vi khuẩn thích nghi đặc biệt để
phá vỡ các hợp chất xenobiotic, chẳng hạn
chloromethane.
Nhược điểm lớn nhất của hệ lọc sinh học :
- Cần một không gian nền lớn
- Không có khả năng điều chỉnh các điều kiện của quá
trình
- Các vật liệu giá thể như phân ủ tự chúng sản sinh ra các
mùi.
Khắc phục: sử dụng máy lọc hơi đốt sinh học
(bioscrubber)
- Máy lọc hơi đốt sinh học là loại thích hợp
nhất cho các dòng chảy khí lớn do áp
suất ngược thấp và kích thước nhỏ của
chúng  Dùng để loại bỏ các khí hòa tan
hoàn toàn
- Nếu nồng độ các chất nhiễm bẩn thu
được ở trong khí thải là quá cao máy
lọc hơi đốt sinh học thứ hai có bổ sung
các vi sinh vật được sử dụng.
- Các thiết kế hiện nay: tập trung phối hợp
sự hấp thụ khí trên bề mặt rắn (ví dụ:
than hoạt tính) và phân hủy sinh học các
hợp chất sorbic.
 2. Loại bỏ các hợp chất sulphur và
nitrogen từ khí ống khói bằng phương
pháp sinh học
Các nitrogen oxide (NOx) và sulphur oxide (SO2)
là các chất ô nhiễm không khí chính, là sản
phẩm của quá trình đốt than đá và dầu
Các kỹ thuật hóa-lý truyền thống: đắt hoặc
không hiệu quả.
Phương pháp sinh học: bền vững và hiệu quả
- Giai đoạn đầu: bể phản ứng thiếu oxygen trong
đó NO được biến đổi thành khí N2 trơ thông
qua quá trình khử nitrogen sinh học.

2FeII (EDTA) (NO) + chất cho điện tử 2Fe II (EDTA)

+ N2 + CO2 + H2O
 Trong hai giai đoạn tiếp theo, H2SO3 được khử
sinh học tuần tự thành H2S và cuối cùng oxy hóa
lại từng phần thành lưu huỳnh :

H2SO3 + 3H2 H2S + 3H2O

H2S + 1/2O2 So + H2O
 Phản ứng khử H2SO3 xảy ra trong bể phản ứng
UASB đã được kết hạt với các vi khuẩn khử
sulphate.
 Các polymer gây kết bông, chất dinh dưỡng
cần thiết, các đương lượng khử (ethanol hoặc
H2) cũng được bổ sung trong hệ thống.
Nước cũng được thu hồi liên tục.
 Quá trình sinh học mới đƣợc phát triển để đồng thời khử
sulfur hóa (desulphurisation) và loại bỏ NO khỏi các khí ống
khói đƣợcc sản xuất trong các thiết bị nhiệt
VI. Phân hủy chất rắn (solid remediation)

1. Kích thích sinh học (biostimulation) và tăng

sinh học (bioaugenzymetation)
 Các vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học
các chất gây ô nhiễm thường hiện diện sẵn trong
các đất nhiễm bẩn hoặc nước ngầm.
Biện pháp:
- Kích thích sinh học các vi sinh vật, nơi có chất
dinh dưỡng hoặc các nhân tố sinh trưởng cần
thiết khác của chúng.
- Đưa các quần thể vi sinh vật đặc hiệu (tăng sinh
học) vào trong các vị trí bị ô nhiễm nhất
định khi chất gây ô nhiễm là một phân tử phức
tạp chỉ có thể bị phá vỡ bởi một tổ hợp đặc biệt
của các vi sinh vật rất đặc hiệu (được gọi là
consortium).
 Các chất gây ô nhiễm: polyaromatic
hydrocarbons (PAHs), các hợp chất hữu cơ được
halogen hóa, các thuốc trừ sâu nhất định, thuốc
nổ TNT, polychlorobiphenyls (PCBs)...
 Các điều kiện và các chủng vi sinh vật thích hợp:
ảnh hưởng lớn đến sự phân hủy sinh học của các
hợp chất
 Sự tăng sinh học: được tiến hành nhờ các kỹ thuật
biến đổi di truyền vi sinh vật  giúp ngăn cản sự tạo
thành các sản phẩm trung gian độc gây mất ổn định
quần thể và ức chế các quá trình phân hủy sinh học.
Thách thức: tăng khả năng sống sót của các chủng
gây nhiễm.
 2. Các kỹ thuật phân hủy chất rắn
2.1. Phân hủy sinh học tại chỗ (in situ bioremediation)
- Sử dụng vi sinh vật và các chất dinh dưỡng để giải quyết các chất
thải nguy hiểm
- Ưu điểm: thực hiện tại chỗ, tránh phải vận chuyển và cất giữ các
chất thải nguy hiểm và độc hại.
- Có nhiều vi sinh vật khác nhau có khả năng phân hủy các chất ô
nhiễm công nghiệp đặc trưng.
2.2. Landfarming
- Kỹ thuật này được thiết lập trên cơ sở phân hủy vi sinh vật và có
thể được nâng cấp một ít bằng cách trộn đất với các gốc hữu cơ
mới (phân ủ).
- Nhiệt độ cao, hoạt tính và sự đa dạng của vi sinh vật giúp tăng tốc
độ phản ứng.
- Các hệ thống landfarming được tăng hiệu quả bằng cách tiền xử
lý yếm khí,
- Ứng dụng: khử sự nhiễm bẩn các vùng đất bị ô nhiễm
chloroethene và các chất thơm BTX (hỗn hợp của benzen, toluene
và xylene).
Mặt cắt ngang của hệ thống
landfarming
Xử lý chất thải rắn
2.3. Các bể phản ứng sinh học pha bùn (slurry-
phase bioreactors).
- Giúp làm sạch trong thời gian ngắn. Trong
trường hợp này, các đất khai quật bị ô nhiễm
được xử lý dưới các điều kiện tối ưu được kiểm
soát, đảm bảo sự tiếp xúc hiệu quả giữa chất
nhiễm bẩn và các vi sinh vật.
- Yếu tố ảnh hưởng: các lớp cát, đất bị ô nhiễm
mương (ống dẫn), lớp lót tháo ra được. Các chất
dinh dưỡng nuôi cấy đặc hiệu vi sinh vật thích
nghi.
- Hiệu quả: Tốc độ phân hủy trong phạm vi 0,2-2 g
dầu/kg đất/ngày, thời gian lưu của chất rắn là 30
ngày
 VII. Xử lý nước ngầm
1. Sự phục hồi hoạt động
 Phương thức phục hồi nước ngầm được ứng dụng
nhiều ở Mỹ và châu Âu là kỹ thuật “bơm và xử lý”
(pump-and-treat). Hướng này sử dụng chủ yếu các kỹ
thuật hóa-lý để loại bỏ các chất ô nhiễm trong các hệ
xử lý ở trên mặt
 Các kiểu thiết kế bể phản ứng sinh học mới đã được
phát triển để loại bỏ các dung môi được polychloro hóa
và các chất thơm.
 Phương thức “bơm và xử lý” không thể làm sạch
trong mọi trường hợp và thời gian làm sạch dài ngày.
Công nghệ phục hồi “bơm” và “ xử lý”
2. Sự phân hủy tự nhiên và sự giám sát (monitoring)
 Các kỹ thuật phân hủy thường không đáp ứng được mục
tiêu làm sạch thật sự  Đánh giá lại các mức độ ô nhiễm ban
đầu và tính toán lại việc sử dụng các điểm cuối (sau khi xử
lý) dựa trên sự rủi ro (risk-based end-points).
 Khái niệm mới về các điểm cuối dựa trên sự rủi ro đòi hỏi
phát triển các công cụ phân tích mới để đánh giá lại giá trị
sinh học (khái niệm nồng độ ô nhiễm tổng số).
 Các công cụ mới đặc trưng này dựa vào các xét nghiệm
sinh học bởi vì các phương pháp phân tích truyền
thống không thể phân biệt giữa các chất gây ô nhiễm là
những yếu tố có giá trị đối với các hệ thống sinh học và các
chất gây ô nhiễm là những yếu tố đang tồn tại trong các
dạng không có giá trị hoặc phức tạp hoặc trơ.
 Xét nghiệm sinh học dựa trên sự ức chế phát huỳnh quang sinh
học tự nhiên của sinh vật biển Photobacterium phosphoreum:
- Không đặc hiệu do sự ức chế ánh sáng sẽ xuất hiện khi tiếp xúc
với mọi chất độc  Khắc phục: sử dụng biosensor vi khuẩn mới
đặc trưng cho các loại chất độc nhất định.
Ví dụ: biosensor có thể phát hiện các kim loại có giá trị sinh học,
được xây dựng bằng cách gắn gen chỉ thị lux của Vibrio fischeri
với các gen kháng kim loại nặng trong vi khuẩn Alcaligenes
eutrophus. Các chủng tái tổ hợp khi được phối trộn với đất bị ô
nhiễm kim loại hoặc nước sẽ phát sáng tỷ lệ với nồng độ các kim
loại có giá trị sinh học đặc trưng.
 Nhược điểm của phân hủy sinh học: giá thành cao và tốc độ chậm
 Sự phân hủy tự nhiên (hoặc phân hủy sinh học nội tại-intrinsic
bioremediation): Dựa vào các quá trình tự nhiên để loại bỏ, cô lập
hoặc khử độc các chất gây ô nhiễm mà không có sự can thiệp của
con người.
 Sự phân hủy sinh học nội tại: như trường hợp nước ngầm bị
nhiễm bẩn các hydrocarbons. Phương thức này yêu cầu đơn
giản hóa việc giám sát từ xa (remote monitoring) để theo dõi các
nồng độ nhiễm bẩn lớp dưới bề mặt trong điều kiện in situ, sử
dụng radar nhìn xuyên qua mặt đất để kiểm tra sự phá vỡ ô
nhiễm trong lớp dưới bề mặt dựa trên cơ sở tăng độ dẫn của
dung dịch
 Sử dụng kỹ thuật biến đổi di truyền các VSV để phản ứng với
sự hiện diện của các chất nhiễm bẩn đặc biệt. Khi các VSV này
được gắn vào một tế bào quang điện kết nối với một con chip
sóng vô tuyến (radio chip), thì các tín hiệu ánh sáng được biến
đổi trong các sóng vô tuyến được phát hiện ở một khoảng cách
xa. Các bộ cảm biến (sensor) này có thể được rải khắp các địa
điểm bị ô nhiễm để giám sát tiến triển của sự phá vỡ các chất
gây ô nhiễm.
 Tài liệu tham khảo
 Nguyễn Hoàng Lộc (2007). Giáo trình
nhập môn công nghệ sinh học. Nhà
xuất bản Đại học Huế.
 Tài liệu trang web/google