BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

TRẦN MINH ĐỨC

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN

P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH
TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ
HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

TRẦN MINH ĐỨC

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN

P24 CỦA VIRUS HIV – 1 CRFO1_AE LƯU HÀNH
TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ
HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -1- Trần Minh Đức

MỞ ĐẦU
Đại dịch HIV/AIDS đang là một vấn đề nan giải và là mối hiểm họa đối với
nhân loại. Kể từ khi ca nhiễm bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1981 cho đến
nay đại dịch HIV/AIDS đã gây ra cái chết cho hàng triệu người mỗi năm. Theo báo
cáo của tổ chức phòng chống AIDS toàn cầu (UNAIDS) thì tính đến hết năm 2009
trên thế giới có khoảng 33,3 triệu người vẫn đang sống chung với HIV, và riêng
trong năm 2009 có khoảng 1,8 triệu người tử vong do các bệnh liên quan đến
HIV/AIDS [36].
HIV/AIDS không những là nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao ở người mà
còn tác động tiêu cực tới sự phát triển kinh tế xã hội mỗi quốc gia, nhất là các nước
đang phát triển. Với cơ sở hạ tầng, trang thiết bị kỹ thuật y tế còn nhiều yếu kém thì
việc chăm sóc và điều trị bệnh nhân HIV/AIDS ở các nước này gặp rất nhiều khó
khăn. Vì vậy, công tác phát hiện và kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh được coi là
giải pháp phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới.
Theo báo cáo của Bộ Y tế thì tính đến ngày 30/9/2010, cả nước có 180.312 người
đang sống chung với virus chết người này, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và
tổng số người chết do AIDS đã được báo cáo là 48.368 người. Số lượng người
nhiễm HIV cao sẽ là gánh nặng với xã hội và nền kinh tế [10].
Hiện nay, vấn đề sản xuất thuốc điều trị và vaccine phòng ngừa HIV/AIDS
vẫn là một bài toán hóc búa đối với nền y học thế giới. Mặc dù các nghiên cứu trong
những năm gần đây đã mang lại nhiều kết quả tích cực xong vẫn chưa có vaccine
phòng chống HIV. Trong bối cảnh diễn biến tình hình dịch bệnh ở nước ta hiện nay
ngày càng phức tạp, việc chẩn đoán sớm để có các biện pháp phòng ngừa hữu hiệu
là rất cần thiết.
Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện rất nhiều loại Kit chẩn đoán HIV
nhưng đa phần là nhập ngoại, các loại Kit này thường có giá thành cao và có thể
không phù hợp với các phân type HIV đang lưu hành tại Việt Nam. Do đó, việc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -2- Trần Minh Đức

nghiên cứu phát triến các bộ Kit chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao trên cơ
sở các kháng nguyên có nguồn gốc từ các chủng virus đang lưu hành trong nước có
ý nghĩa rất lớn cả về mặt khoa học cũng như thực tiễn.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu:
“Tách dòng, biểu hiện gen mã hóa protein P24 của virus HIV-1 phân type
CRF01_AE lưu hành tại Việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn
đoán”.
Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Vi sinh Vật học Phân tử – Viện
Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -3- Trần Minh Đức

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency
virus – HIV)
1.1.1. HIV là gì?
HIV (Human Immunodeficiency Virus) - virus gây suy giảm miễn dịch ở
người, là loại virus khi xâm nhập vào cơ thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc
phải (AIDS), dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh nhân dễ mắc
phải ưng thư và những tác động do chính HIV gây ra [1].
HIV chủ yếu lây nhiễm các tế bào quan trọng trong hệ thống miễn dịch của
người như là tế bào T trợ giúp (đặc biệt là T CD4+), các đại thực bào và các tế bào
đuôi gai. Lây nhiễm HIV dẫn đến sự giảm số lượng tế bào T CD4+ theo 3 cơ chế
chính sau: Một là, các tế bào nhiễm bị giết chết trực tiếp bởi virut; hai là, tăng tỉ lệ
tế bào chết theo chương trình; ba là, sự giết chết tế bào T CD4+ bị nhiễm bởi tế bào
lympho gây độc CD8. Khi số lượng tế bào T CD4+ suy giảm xuống dưới một mức
nhất định thì quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào bị mất, cơ thể dễ mắc các
bệnh nhiễm trùng cơ hội [54].
1.1.2. Đặc điểm của virus HIV
1.1.2.1. Giới thiệu chung
Về nguồn gốc của virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở người thì vẫn là
một câu đố đối với các nhà khoa học kể từ khi trường hợp mắc bệnh đầu tiên được
phát hiện đầu những năm 80 của thế kỷ trước.
Ngày nay thì mọi người đều đồng ý rằng HIV có quan hệ họ hàng với virus
gây suy giảm miễn dịch ở khỉ - SIV (simian immunodeficiency virus). Đặc biệt là
công bố vào năm 1999 của một số nhà nghiên cứu tại Đại học Alabama, họ nhận
thấy rằng HIV-1(một type HIV) rất giống SIV tinh tinh (SIVcpz). Nguồn gốc động

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -4- Trần Minh Đức

vật, thời gian và địa điểm chính xác của sự lây truyền hiện vẫn chưa rõ và là đề tài
cho các cuộc khảo sát và tranh luận [21].
HIV thuộc nhóm Lentivirus và thuộc họ Retroviridae.
Lentivirus (lenti có nghĩa là chậm), loài virus đặc trưng bởi thời gian dài ủ
bệnh. Lentivirus có thể truyền thông tin di truyền của mình vào DNA tế bào chủ và
loài duy nhất trong các Retrovirus có khả năng tái bản mà không thông qua phân
chia tế bào [61].
HIV có những đặc trưng của retrovirus:
• Là một loại virus RNA, nhưng có một enzyme phiên mã ngược, mà bản
chất là DNA polymerase phụ thuộc RNA. Với enzyme phiên mã ngược này cho
phép tổng hợp một DNA kép trong tế bào chủ mà retrovirus xâm nhập .
• DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác
nhau được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định
trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus). Tiền virus
này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi có sự phân bào,
hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein của virus để hình thành
một virus hoàn chỉnh.
HIV có các đặc trưng của một Lentivirus :

 Phát triển chậm.

 Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu huỷ tế bào.

 Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [1], [6].

1.1.2.2. Phân loại HIV
HIV là loại virus có tính biến đổi cao và dễ xảy ra đột biến. Điều này có nghĩa
là sẽ có nhiều chủng HIV khác nhau, thậm chí chúng có thể cùng lây nhiễm vào một
cá thể [39].
Dựa vào sự tương đồng về mặt di truyền người ta có thể phân loại các chủng
virus HIV thành các type, các nhóm và phân type. Có 2 type HIV: HIV-1 và HIV-2.
Cả 2 type này đều lây truyền qua đường tình dục, qua máu, từ mẹ sang con và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -5- Trần Minh Đức

chúng đều là nguyên nhân dẫn đến triệu chứng lâm sàng bệnh AIDS nhưng khó
phân biệt được là do type nào gây ra. HIV-1 thì có mức độ lây lan rộng, còn HIV-2
khó lây nhiễm hơn, thời kì ủ bệnh cũng dài hơn [40].
HIV-1 đã được Luc Montagnier và các cộng sự ở viện Pasteur Paris phát
hiện vào năm 1983 [48]. HIV-1 được chia ra làm 4 nhóm: Nhóm M (major), nhóm
O (outlier), 2 nhóm mới N và P (hình 1.1) [40].

Hình 1.1: Sơ đồ các phân type HIV-1 và HIV-2[40]

 Nhóm O thì chỉ xuất hiện giới hạn ở khu vực Tây-Trung phi.
 Nhóm N - một chủng được phát hiện năm 1998 ở Cameroon thì lại rất
hiếm xuất hiện.
 Nhóm P - một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm
miễn dịch ở khỉ được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009
[39].
 Nhóm M chiếm hơn 90% HIV-1 gây đại dịch trên toàn thế giới. Trong
nhóm M lại chia ra thành các phân type: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J và K.
Đôi khi có hiện tượng 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau, cùng hiện diện
trong tế bào người nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1
virus lai mới. Nhiều virus thuộc chủng mới này có khả năng sống sót không
cao, nhưng chủng nào lây nhiễm được sẽ gọi là CRF (Circulating
Recombinat Forms). CRF A/E được coi là sự lai tạo giữa phân type A và 1
phân type gốc là E. Tuy nhiên, vì chưa tìm thấy được phân type E ở dạng
riêng rẽ nên hầu hết người ta coi CRF A/E là phân type E. (trên thực tế tên
gọi đúng hơn là CRF01_AE) [40].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -6- Trần Minh Đức

HIV-2 được phát hiện ở các bệnh nhân ở Cameroon vào năm 1985 và thường
chỉ thấy xuất hiện ở tây phi, rất ít gặp ở nơi nào khác [49]. HIV-2 cũng được chia
thành 8 phân type là A, B, C, D, E, F, G, H (hình 1.1) [34,42].
Trong giới hạn của luận văn này, tôi chỉ tìm hiểu loại HIV-1 là loại virus gây
ra đại dịch HIV/AIDS trên thế giới.
1.1.2.3. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của HIV
HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 – 120nm. Về cấu tạo thì HIV gồm 3
phần chính là lớp vỏ, lớp protein nền và lõi capsid (hình 1.2) [1].
 Lớp vỏ (Envelope): Vỏ ngoài có cấu tạo từ lớp lipid kép với các gai
glycoprotein. Mỗi gai có hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng
41kDa là gp41 cắm xuyên màng và glycoprotein có khối lượng
120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160.
 Lớp Protein nền (Matrix protein): Nằm ngay sau lớp vỏ là lớp protein
nền có khối lượng phân tử 17kDa (p17).
 Lõi capsid: Có dạng hình trụ lệch tâm, được cấu thành bởi các protein
có khối lượng 24kDa (p24). Bên trong là hai sợi RNA đơn, protein lõi
(p7 và p9) và enzyme phiên mã ngược [1].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của virus HIV[50]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -7- Trần Minh Đức

1.1.2.4. Cấu trúc hệ gen HIV

Genome của HIV bao gồm hai chuỗi RNA đơn, giống nhau. Mỗi chuỗi có
kích thước khoảng 9200bp, gồm có 9 gen với 2 nhóm chính: nhóm gen cấu trúc
(gag, pol, env) và nhóm gen điều hòa (tat, rev, nef, vif, vpr, vpu) (hình 1.3) [50].
 Nhóm gen cấu trúc
 Gag (group-specific-antigen): mã hoá các kháng nguyên đặc hiệu
nhóm bao gồm các gen mã hóa tổng hợp protein nền, lõi capsid và các
cấu trúc protein lõi (nuclecapsid protein).
 Pol (polymerase): mã hóa tổng hợp protease, enzyme phiên mã
ngược và intergrase.
 Env (envelope): mã hóa tổng hợp kháng nguyên bề mặt gp160 với hai
tiểu phần là gp41 và gp120.
 Nhóm gen điều hòa
 Tat (Trans Activator of Transcription – yếu tố hoạt hóa phiên mã).
Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hòa (kể cả
gen tat). Gen tat mã hóa tổng hợp protein Tat, có 102 amino acid, protein
này chịu trách nhiệm hoạt hóa phiên mã virus thông qua việc tạo ra vị trí gắn
cho RNA pol 2 và các protein khác của tế bào.
 Rev (Regulator of Expression of Virion proteins – yếu tố điều hòa
sự biểu hiện các protein hạt virus) : Gen rev có chức phận điều chỉnh quá
trình nhân lên của virus thông qua gen tat và nef, mã hóa tổng hợp cho
protein Rev. Rev bao gồm 117 amino acid, protein này có chức năng chuyển
mRNA ra tế bào chất.
 nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa âm): mã hóa cho
protein Nef, ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và
loại tế bào. Trong các tế bào nhiễm, Nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển
endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở
bề mặt tế bào nhiễm. Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm
HIV khỏi sự giám sát miễn dịch.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Luận văn thạc Sỹ -8- Trần Minh Đức

 Vif (Virion Infectivity Factor - yếu tố lây nhiễm của virus): mã hóa
protein Vif, làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và
giúp ngăn chặn sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ ngăn cản sự tái bản
virus vào các virion mới hình thành.
 Vpu (Viral Protein U - protein U của virus): mã hóa protein Vpu, có
tác dụng tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện
của CD4, MHC I trên bề mặt tế bào.
 Vpr (Viral Protein R - protein R của virus): mã hóa protein Vpr, có
tác dụng tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là protein liên
kết với virion, ngăn cản pha G2/M, là tín hiệu định vị nhân [43], [44], [46].

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome HIV[44]

1.1.3. Chu trình virus HIV
HIV có khả năng xâm nhập rất nhiều loại tế bào: tế bào lympho T hỗ trợ (TH)
có thụ thể CD4, tế bào đơn nhân, đại thực bào và các tế bào tương tự như: tế bào tua
(ở da và niêm mạc (Langerhans), ở hạch lympho), tế bào thần kinh đệm (microglia)
của hệ thần kinh trung ương. Nhưng xét về sinh bệnh học, tế bào lympho T có CD4
và hệ thống đại thực bào đơn nhân là tế bào đích chính của HIV. CD4 là protein tiếp
nhận, giúp cho HIV gắn với tế bào [1], [17].
Sự xâm nhập và nhân lên của virus HIV có thể chia làm bốn giai đoạn chính:
Gắn kết và xâm nhiễm vào tế bào; phiên mã ngược và cài xen; sao chép và dịch mã;
lắp ráp và trưởng thành (hình 1.4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn