Professional Documents
Culture Documents
CHƯƠNG VIII
ỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ
GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN
ĐOÁN
I. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế
phẩm sinh học
1. Sản xuất insulin tái tổ hợp
1.1 Lược sử nghiên cứu insulin
- Do các tế bào beta của tuyến tụy sản
xuất, đóng vai trò chuyển hóa đường
- Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt
insulin.
- Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy
bò và lợn để điều trị tiểu đường
- Cấu trúc phân tử insulin người được phát
hiện vào năm 1926. Năm 1955 Sanger và
cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid
amin
- 1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng
con đường hóa học đắt, không phù hợp
- 1967, phát hiện cấu trúc proinsulin
- 1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc
- 1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong
E.coli
- 1982, insulin được phép lưu hành ở châu
Ậu. Bán ở Mỹ năm 1983
1.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở
người
• Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST
số 11, trên cánh ngắn (11p)
• Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen
ký hiệu I, II và III
• Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp.
Trong vùng mã có 2 intron.
• Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân
tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader),
chuỗi B, chuỗi C và chuỗi A
Preproinsulin
is difficult for E.coli
to produce
Contains a signal
sequence
+ A,B, C sections of
protein
Signal sequence is
removed after targeting
to RER
Translation continues
on RER (forming
proinsulin)
Removal of 33 amino
acids at Golgi
Insulin
Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total
A chain = 21 amino acids
B chain = 30 amino acids
In reality both chains are present in
the same protein
1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái
tổ hợp
Nguyên lý chung bao gồm:
- Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã
hoá preproinsulin
- Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược
- Sử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã
hóa chuỗi C, tách dòng riêng từng đoạn
gen mã hóa chuỗi A và B
- Tạo vector biểu hiện gen đoạn A và B
- Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coli
- Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A-
lacZ và B-lacZ
- Thu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản
ứng cắt với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng
của insulin và a.a của -galactosidase
- Tách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn
hợp chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và
thu insulin thành phẩm
Sản xuất insulin tái tổ hợp
Human Insulin Production by Bacteria
Screening bacterial cells to learn which contain the human insulin gene is the
hard part.
Route to the Production by Bacteria of Human Insulin
The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the
insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.
Route to the
Production by
Bacteria of
Human Insulin
Overview of gene
Cloning animati
cloning. on
2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái
tổ hợp
2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởng
- Hormon sinh trưởng người (hGH – Human
Growth Hormone) phát hiện năm 1920. Năm
1950 đã tách chiết hGH từ tuyến yên người.
- 1956, hGH tách từ não bò, cừu, … dùng để
chữa bệnh lùn ở trẻ em.
- 1972, cấu trúc phân tử của hGH được xác định
- 1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH
có tên Protropin.
• Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu
sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen. Có
nhiều sản phẩm thương mại giúp điều trị bệnh
hay giúp cho phát triển cơ bắp.
• hGH là protein nhỏ, có 191 a.a. Trong phân tử
có 2 liên kết disulfit
• Các gen mã hóa hGH của người, bò… chuyển
vào động vật như cá, lợn,…tạo động vật chuyển
gen phát triển nhanh.
Human Growth Hormone (HGH)
(somatotropin)
• HGH promotes overall body growth
by increasing amino acid uptake by cells, protein synthesis and fat
utilization for energy
Insufficient production of HGH by the pituitary gland = dwarfism
– Chubby face
– “Baby fat” around waist
– Unusual body properties as an adult
– ~ 4 feet tall only
– IQ = Normal
HGH helps undersized children reach their normal height and size
http://www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.jpg
2.2 Cấu trúc gen mã hóa hormon
sinh trưởng người
• Họ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài
NST thứ 17, kích thước 66 kb
• Gen mã hóa hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn
đến thiếu hụt hormon sinh trưởng, gây hội
chứng lùn bẩm sinh
• Gen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuổi peptid
tín hiệu không tương thích promoter của E.coli,
do đó biểu hiện gen hGH tái tổ hợp trong E.coli
rất yếu hoặc không hoạt động
2.3 Công nghệ sản xuất hormon
sinh trưởng người TTH
Bao gồm các bước
- Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước
tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược
- Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24
a.a của chuỗi peptid tín hiệu
- Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp
- Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối,
tách chiết và tinh sạch hGH
- Tế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế
bào trứng chuột
Pressure to use HGH to stimulate growth
in youngsters who have no deficiency
but whose parents want them to grow up tall.
cells
(Other stimuli:
exogenous ds RNA,
LPS, bacterial
components)
How Does It Prevent Viral
Replication?
virus
interfero
n
How Does it Prevent Viral
Replication?
No replication
virus
Inhibitor
y
proteins
3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế
sinh IFN
• Trong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22
gen nằm trên cánh ngắn của NST số 9,
gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2
• Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12,
gồm 4 exon. Sản xuất trong tế bào lympho
T
Vai trò của IFN trong trị bệnh do
nhiễm virus
• Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều
trị ung thư
Tuberculosis susceptibility genes
P2X7
Y VDR IFN
IFNR1
Y
IFNR2
STAT1
NRAMP1
iNOS
IL-12R2
Y
IL-12R1
Y Y
MBL HLA-DR2 IL-1
TNF T cell/NK cell
IL-12
IL-10
Infected Macrophage
Shown to be linked or associated with TB in more than one population
Conflicting studies –both +ve and –ve associations with TB reported
Single study shows association with TB
Negative studies not shown – mostly not published!
3.3 Công nghệ sản xuất interferon
tái tổ hợp
• Sản xuất IFN-α: gây nhiễm nhân tạo virus
vào tế bào bạch cầu. Sử dụng một số loại
virus như Sendal, Newcastle, λ
• Sản xuất IFN-β: từ nguyên bào sợi
4. Sản xuất yếu yếu tố VIII và IX tái
tổ hợp
• Các chất có ảnh hưởng đến sự đông máu:
từ I đến XII. Trong đó yếu tố VIII và IX
đóng vai trò quan trọng.
5. Sản xuất vaccin tái tổi hợp và
vaccin DNA
5.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng
- Năm 1780 Edward Jenner phát hiện
phương pháp phòng bệnh đậu mùa bằng
chủng đậu với virus ựgây bệnh đậu bò giảm
độc lực
- Luis Pasteur phát minh vaccin chữa bệnh
dại
- Có thể chia vaccin làm 2 nhóm: truyền
thống và tái tổ hợp
Smallpox - đậu mùa
Vaccination
• Jenner 1796 :
Cowpox/Swinepox
• 1800’s Compulsory
childhood vaccination
• 1930’s Last natural UK case
• 1940’s last natural US case
• 1958 WHO program
• October 1977: Last case
(Somalia)
Smallpox
• No animal reservoir
• Lifelong immunity
• Infectivity does
not precede overt symptoms
• Effective vaccine
Hepatitis B S-antigen
mRNA
vaccine
cDNA
raised in yeast
Express
plasmid
S-antigen
mRNA
protein
5.2.2 Vaccin tái tổ hợp chống bệnh
sốt rét
• 300-500 nhiễm bệnh hàng năm, tử vong 1-3
triệu người. Kí sinh trùng do 4 loài có vòng đời
và quá trình lây nhiễm phức tạp
• Vaccin từ gen kháng nguyên Pfs-25 đang được
thử nghiệm. Gen Pfs-25 được tách dòng từ
Plasmodium falciparum mã hóa cho protein có
TLPT 25 kDa
• Đã sử dụng vaccin phòng chống viêm não, cúm
gà. Đang phát triển vaccin phòng chống sốt xuất
huyết, HIV/AIDS
5.3 Vaccin DNA
5.3.1 Lược sử nghiên cứu và vai trò của vaccin
DNA
- 1990 Wolff và cs thử nghiệm gắn một đoạn DNA
vào vector biểu hiện, sau đó đưa trực tiếp vào tế
bào sống Mở ra triển vọng mới phòng chống
bệnh truyền nhiễm
- Bệnh Gumboro do virus gây bệnh trên gà. Năm
1996 nhiều nghiên cứu TTH gen kháng nguyên
VP2 hoặc đoạn gen VP3, VP4 tạo vaccin DNA.
- Vaccin DNA gồm 2 loại: vaccin tập hợp
gen kháng nguyên và vaccin tập hợp gen
sinh kháng thể
- Vaccin có nhiều ưu điểm: dễ dàng thiết kế,
sản xuất, bảo quản
DNA Vaccines and HIV
• HIV could be prevented www.wellesley.edu
• Envelope gene
-A specific gene of HIV that could be used to
create a DNA Vaccine for HIV.
4
II. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn
đoán và điều trị
1. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán
và điều trị ung thư do virus
- Ung thư vòm họng do virus RBV (Epstein-
Barr virus)
- Phát hiện 6 loại virus gây viêm gan nguyên
phát (HAV, HBV, HCV, HDBV, HEV và
HGV)
1.2 Kỹ thuật gen và ứng dụng trong
điều trị ung thư
• Phương pháp phổ biến điều trị ung thư dùng
vector liệu pháp gen từ Paramyxovirus và kết
hợp xạ trị
• Hơn 50% trường hợp ung thư ở người liên quan
đến hoạt tính gen p53
• Gen p53 có kích thước 23 kb, nằm trên NST 17.
• Gen p53 sản xuất protein có TLPT 53 kDa, điều
hòa quá trình phân chia tế bào và kích hoạt hiện
tượng chết theo chu trình (apoptosis)
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic
Retrovirus/Lentivirus Protein
Target
Naked DNA
Cell
2. Chẩn đoán một số bệnh nhiễm
trùng bằng PCR
• Chẩn đoán sớm ký sinh trùng sốt rét:
Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale
và P.malariae.
• Chẩn đoán nhiễm vi khuẩn lao
Mycobacteria tuberculosis
• Chẩn đoán virus Dengue gây sốt xuất
huyết
4. Sử dụng kỹ thuật microarray
trong chẩn đoán bệnh
• Mảng (thủy tinh, nhựa) có kích thước nhỏ
chứa mẫu dò (300 ngàn – hàng triệu) cho
phép chẩn đoán nhanh các bệnh liên quan
vật chất di truyền (DNA, RNA)
Experimental approaches
DNA microarray
Principle:
Application
to signaling:
Fibroblasts
stimulated
with serum:
8600 genes.
5. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn
đoán bệnh nhiễm trùng ở vật nuôi
• Chẩn đoán một số bệnh thường gặp trên
tôm: bệnh đốm trắng do WSSV, còi do
MBV, đầu vàng (YHV)
The Asian pandemic
WSSV
1993
1993
1991/2
1993
1999
1993
1994
6. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn
đoán bệnh cây trồng và thực phẩm
chuyển gen
• Bệnh héo xanh do Xanthomonas
• Phát hiện bắp, ngô chuyển gen