CHƯƠNG 5

Tiềm năng sử dụng kĩ thuật gen trong

công nghệ sinh học
5.1 Ứng dụng trong nông nghiệp

5.2 Ứng dụng trong y học

5.3 Ứng dụng trong công nghiệp

5.4 Ứng dụng trong xã hội học

5.1 Ứng dụng trong nông nghiệp

1- Biến nạp gen lạ vào cây trồng

2- Làm bất hoạt các gen sẵn có

3- Thương mại hoá giống cây trồng chuyển gen

1- Biến nạp gen lạ vào cây trồng

Nhằm thay đổi đặc tính của cây trồng cung cấp cho cây mới.

Trong vòng 10 năm 1985-1995 đã có 34 nước thông báo về thử nghiệm

đồng ruộng đôi với cây chuyển gen. Số lượng đăng kí và thử nghiệm ở
Mỹ 1952,Canada 486, Anh 133 và Hà lan 113.

Các nhóm tính trạng được khảo nghiệm chủ yếu liên quan đến việc
tăng cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh
bất lợi như: tính kháng vius, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng côn
trùng, kháng chất diệt cỏ, kháng kim loại và chống băng giá
Các tính trạng liên quan đến chất lượng sản phẩm như tính chín chậm,
thay đổi hàm lượng protein cuat hạt, tăng hàm lượng bột của củ, tăng
hàm lượng sterol, giảm mùi hôi trong dầu ăn thực vật, biến đổi màu hoa

Các kĩ thuật biến nạp gen ở thực vật

- Biến nạp thông qua Agrobacterium tumerfaciens

- Biến nạp trực tiếp bằng hoá chất

- Biến nạp bằng xung điện

- Biến nạp bằng máy bắn gen

10 nhóm tính trạng được khảo nghiệm

+) Gen kháng bệnh hại cây trồng: Gen kháng vius, kháng nấm và kháng
vi khuẩn

+) Gen kháng sâu hại

+) Gen kháng chất diệt cỏ

+) Gen bất dục đực

+) Gen chống chín nhũn và làm chín chậm

+) Gen liên quan đến tính chịu lạnh

+) Gen chịu hạn

+) Gen chịu mặn

+) Gen liên quan đến tính chịu độc tố nhôm

+ Gen liên quan đến tính chịu ngập úng

Biến nạp gen kháng côn trùng

Thực vật bị xâm hại bởi các loại sinh vật như virut, vi khuẩn, nấm
mốc và các loài động vật. Nhưng đối với nông nghiệp vấn đề cần
được quan tâm nhiều đó là sự xâm hại của côn trùng. Để làm giảm
lượng côn trùng người ta thường dùng các loại thuốc và thông
dụng nhất là pyrethroid và organophotphat. Tuy nhiên những chất
này là chát độc cao không đặc hiệu và làm ảnh hưởng đến con người

Thuốc diệt côn trùng lí tưởng:

- Có tính đặc hiệu cao

- Không ảnh hưởng loại côn trùng khác, động vật và con người
- Phải bị phân huỷ sinh học
 ∂ Endotoxin của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis trong quá trình hình thành bào tử nó tạo ra các
tinh thể protoxin.

Protoxin có cấu trúc vững chắc không hoà tan. Tuy nhiên trong
đường ruột côn trùng khi pH rất kiềm enzym trong đường ruột côn
trùng thuỷ phân protoxin chuyển sang dạng hoà tan. Một trong
sản phẩm thuỷ phân là ∂ Endotoxin. Đây là chất độc đối với côn trùng

∂ Endotoxin phá vỡ chức năng của ruột làm cho các tế bào bị chết.
Các ấu trùng không thể ăn được. Độc tố của ∂ Endotoxin cao gấp
80.000 lần organophotphát
Bất hoạt gen

Có nhiều phương pháp dùng để làm bất hoạt gen nhưng phương
pháp hiệu quả và được sử dụng nhiều là kĩ thuật antisense

Trong kĩ thuật này gen cần bất hoạt lai với đoạn có hướng ngược
lại với gen bất hoạt

Promoter mARN

Promoter

antisense ARN
5.2 Ứng dụng trong y học

5.2.1 Chuẩn đoán bệnh

5.2.2 Sản xuất thuốc phòng chữa bệnh

5.2.3 Liệu pháp gen

5.2.1 Chuẩn đoán bệnh

- Chuẩn đoán rối loạn di truyền

- Chuẩn đoán bệnh: nhanh, hiệu quả

5.2.2 Sản xuất thuốc phòng chữa bệnh

- Thuốc kháng sinh

- Vaccin

- Các protein có hoạt tính sinh học

- Các kháng thể đơn dòng

I. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế phẩm sinh học
1. Sản xuất insulin tái tổ hợp
1.1 Lược sử nghiên cứu insulin
- Do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất, đóng vai trò
chuyển hóa đường
- Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt insulin.
- Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy bò và lợn để điều
trị tiểu đường
- Cấu trúc phân tử insulin người được phát hiện vào năm 1926. Năm
1955 Sanger và cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid amin
- 1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng con đường hóa học  đắt,
không phù hợp
- 1967, phát hiện cấu trúc proinsulin
- 1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc
- 1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong E.coli
- 1982, insulin được phép lưu hành ở châu Ậu. Bán ở Mỹ năm 1983
 1.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở người

• Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên cánh ngắn (11p)

• Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II và III

• Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã có 2 intron.

• Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader), chuỗi B, chuỗi
C và chuỗi A
 Preproinsulin
is difficult for E.coli
to produce

Contains a signal sequence

+ A,B, C sections of protein

Signal sequence is
removed after targeting to
RER

Translation continues on
RER (forming proinsulin)

Removal of 33 amino
acids at Golgi

and S-S joining of A

and B chains to form
insulin
 1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

Nguyên lý chung bao gồm:

- Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá
preproinsulin
- Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược
- Sử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã hóa chuỗi C,
tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và B
- Tạo vector biểu hiện gen đoạn A và B
- Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coli

- Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A-lacZ và
B-lacZ

- Thu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản ứng cắt
với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng của insulin và a.a
của -galactosidase

- Tách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp

chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và thu insulin
thành phẩm
Sản xuất insulin tái tổ hợp

6) join the plasmid and

human fragment

and cut with a restriction enzyme

 Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

One cell with the

recombinant plasmid

A fermentor used to grow

recombinant bacteria.
This is the step when gene cloning takes place.
The single recombinant plasmid replicates within a cell.
Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of
like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene.
 2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp
2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởng
- Hormon sinh trưởng người (hGH – Human Growth Hormone)
phát hiện năm 1920. Năm 1950 đã tách chiết hGH từ tuyến
yên người.
- 1956, hGH tách từ não bò, cừu, … dùng để chữa bệnh lùn ở
trẻ em.
- 1972, cấu trúc phân tử của hGH được xác định
- 1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH có tên
Protropin.
- Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu sản xuất bằng
phương pháp tái tổ hợp gen. Có nhiều sản phẩm thương mại
giúp điều trị bệnh hay giúp cho phát triển cơ bắp.
- hGH là protein nhỏ, có 191 a.a. Trong phân tử có 2 liên kết
disulfit
- Các gen mã hóa hGH của người, bò… chuyển vào động vật
như cá, lợn,…tạo động vật chuyển gen phát triển nhanh.
 2.2 Cấu trúc gen mã hóa hormon sinh trưởng người

• Họ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài NST thứ 17, kích
thước 66 kb

• Gen mã hóa hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn đến thiếu hụt
hormon sinh trưởng, gây hội chứng lùn bẩm sinh

• Gen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuổi peptid tín hiệu không
tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện gen hGH tái
tổ hợp trong E.coli rất yếu hoặc không hoạt động
2.3 Công nghệ sản xuất hormon sinh trưởng người tái
tổ hợp

Bao gồm các bước

- Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào người và thực hiện

kỹ thuật phiên mã ngược

- Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24 a.a
của chuỗi peptid tín hiệu

- Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli, nuôi cấy, thu sinh khối,
tách chiết và tinh sạch hGH

- Tế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế bào

trứng chuột
 3. Sản xuất interferon tái tổ hợp
3.1 Lược sử nghiên cứu interferon
- Năm 1930, phát hiện gia súc nhiễm bệnh do một loại virus này,
ít bị nhiễm loại virus khác. Isaacs và Linderman (1957) khi
nuôi cấy phôi gà đã phát hiện 1 loại protein mới gây ức chế
tái bản virus, gọi là interferon (IFN)
- Trước năm 1980, sản xuất IFN từ tế bào bạch cầu người, lây
nhiễm virus, sau đó nuôi trong phôi gà để tế bào bạch cầu
sinh IFN  Giá thành đắt
- Tháng 1 năm 1980 thành công sản xuất IFN bằng con đường
TTH trong E.coli
- Interferon là protein hoặc glycoprotein, TLPT – 16-45 kDa. Có
tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm
phát triển khối u.
- Interferon chia làm 2 nhóm:
 Nhóm 1: IFN α, IFN β, IFN ω
 Nhóm 2: IFN γ kém bền trong acid
 3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế sinh IFN

• Trong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22 gen nằm trên cánh
ngắn của NST số 9, gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2
• Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12, gồm 4 exon. Sản
xuất trong tế bào lympho T

Vai trò của IFN trong trị bệnh do nhiễm virus

• Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thư
 3.3 Công nghệ sản xuất interferon tái tổ hợp

• Sản xuất IFN-α: gây nhiễm nhân tạo virus vào tế bào
bạch cầu. Sử dụng một số loại virus như Sendal,
Newcastle, λ
• Sản xuất IFN-β: từ nguyên bào sợi
 4. Sản xuất yếu tố VIII và IX tái tổ hợp

• Các chất có ảnh hưởng đến sự đông máu: từ I đến XII. Trong
đó yếu tố VIII và IX đóng vai trò quan trọng.
 5. Sản xuất vaccin tái tổ hợp và vaccin DNA

5.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng

- Năm 1780 Edward Jenner phát hiện phương pháp phòng
bệnh đậu mùa bằng chủng đậu với virus gây bệnh đậu bò
giảm độc lực
- Luis Pasteur phát minh vaccin chữa bệnh dại
- Có thể chia vaccin làm 2 nhóm: truyền thống và tái tổ hợp
• Vaccin truyền thống: là vi khuẩn hoặc virus sống đã
làm giảm độc lực. Nhược điểm: thời gian bảo quản
ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lại

• Vaccin tái tổ hợp: protein kháng nguyên nhờ kỹ

thuật DNA. Ưu điểm: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi
chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan
do virus

• Vaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống

bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS,…)
 5.2 Vaccin tái tổ hợp

5.2.1 Vaccin TTH phòng chống viêm gan

- Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản

xuất trong nấm men S. cerevisae từ năm 1981. Bắt đầu
sử dụng từ năm 1986

- Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax

HB, Engeris B, Genhevac B,… được sản xuất trong tế
bào nấm men và vi khuẩn
• HBV vaccin sử dụng gen mã hóa protein vỏ. Protein
kháng nguyên HBsAg có khả năng tạo kháng thể miễn
dịch mạnh nhất.

• Gen mã hóa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1mã hóa chuỗi

peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 mã peptid có 55 a.a và gen
S mã hóa chuỗi peptid có 226 a.a

• Người ta tách riêng hoặc tổ hợp S, Pre-S1 và Pre-S2 để

tạo tổ hợp vaccin khác nhau

• Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV ở mức cao, viêm

gan cấp tính 37-49 %, xơ gan có HBV 47-87 %, ung thư
gan có HBV 57-80%
 5.2.2 Vaccin tái tổ hợp chống bệnh sốt rét

• 300-500 nhiễm bệnh hàng năm, tử vong 1-3 triệu người.

Kí sinh trùng do 4 loài có vòng đời và quá trình lây
nhiễm phức tạp

• Vaccin từ gen kháng nguyên Pfs-25 đang được thử

nghiệm. Gen Pfs-25 được tách dòng từ Plasmodium
falciparum mã hóa cho protein có TLPT 25 kDa

• Đã sử dụng vaccin phòng chống viêm não, cúm gà.

Đang phát triển vaccin phòng chống sốt xuất huyết,
HIV/AIDS
 5.3 Vaccin DNA

5.3.1 Lược sử nghiên cứu và vai trò của vaccin DNA

- 1990 Wolff và cs thử nghiệm gắn một đoạn DNA vào

vector biểu hiện, sau đó đưa trực tiếp vào tế bào sống
 Mở ra triển vọng mới phòng chống bệnh truyền nhiễm

- Bệnh Gumboro do virus gây bệnh trên gà. Năm 1996

nhiều nghiên cứu TTH gen kháng nguyên VP2 hoặc
đoạn gen VP3, VP4 tạo vaccin DNA.
- Vaccin DNA gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng
nguyên và vaccin tập hợp gen sinh kháng thể

- Vaccin có nhiều ưu điểm: dễ dàng thiết kế, sản xuất, bảo

quản
 II. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán và điều
trị

1. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán và điều trị ung

thư do virus

- Ung thư vòm họng do virus RBV (Epstein-Barr virus)

- Phát hiện 6 loại virus gây viêm gan nguyên phát (HAV,
HBV, HCV, HDBV, HEV và HGV)
 1.2 Kỹ thuật gen và ứng dụng trong điều trị ung thư

• Phương pháp phổ biến điều trị ung thư dùng vector liệu
pháp gen từ Paramyxovirus và kết hợp xạ trị

• Hơn 50% trường hợp ung thư ở người liên quan đến
hoạt tính gen p53

• Gen p53 có kích thước 23 kb, nằm trên NST 17.

• Gen p53 sản xuất protein có TLPT 53 kDa, điều hòa quá
trình phân chia tế bào và kích hoạt hiện tượng chết theo
chu trình (apoptosis)
 5.2.3 Liệu pháp gen

Hướng này mở ra những triển vọng rất lớn trong điều trị các
rối loạn di truyền. Hai chiến lược đề ra:

- Thay gen bệnh bằng gen lành cách này khó thực hiện

- Đưa thêm gen lành vào cơ thể để bù đắp cho gen bệnh. Cách này
khả thi hơn nhưng không làm chủ hoàn toàn kết quả cuối cùng vì
gen lành đưa vào không nằm đúng vị trí tự nhiên của nó trên bộ
gen và không chịu một sự điều hoà thích hợp.
 2. Chẩn đoán một số bệnh nhiễm trùng bằng
PCR

• Chẩn đoán sớm ký sinh trùng sốt rét: Plasmodium

falciparum, P. vivax, P. ovale và P.malariae.

• Chẩn đoán nhiễm vi khuẩn lao Mycobacteria

tuberculosis

• Chẩn đoán virus Dengue gây sốt xuất huyết

 4. Sử dụng kỹ thuật microarray trong chẩn đoán
bệnh

• Mảng (thủy tinh, nhựa) có kích thước nhỏ chứa mẫu dò

(300 ngàn – hàng triệu) cho phép chẩn đoán nhanh các
bệnh liên quan vật chất di truyền (DNA, RNA)
 5. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán bệnh
nhiễm trùng ở vật nuôi

• Chẩn đoán một số bệnh thường gặp trên tôm: bệnh đốm
trắng do WSSV, còi do MBV, đầu vàng (YHV)
 6. Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán
bệnh cây trồng và thực phẩm chuyển gen

• Bệnh héo xanh do Xanthomonas

• Phát hiện bắp, ngô chuyển gen
5.3 Ứng dụng trong công nghiệp

- Tăng năng suất sản phẩm: các sản phẩm của công nghiệp vi sinh
hình thành với sự tham gia của kĩ thuật gen gồm có các chất có phân
tử lượng thấp như vi tamin, axit amin,.. các chất có phân tử lượng cao
như enzym.

- Sản phẩm có thể là sinh khối tế bào để dùng trong công nghệ thuốc
trừ sâu vi sinh, trong công nghiệp lên men sữa, dùng làm nguồn
protein thực phẩm,....

- Giải quyết ô nhiễm môi trường: kĩ thuật gen cho phép tạo
ra các vi sinh vật chuyển gen mang các gen mã hoá cho các enzym
phân huỷ các chất thải từ sinh hoạt hay sản xuất. Các vi sinh vật này
được dùng ngày càng nhiều nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm hiện nay.
5.4 Ứng dụng trong xã hội học

Với sự phát triển mạnh mẽ của kĩ thuật gen càng ngày nó càng
đi vào mọi lĩnh vực của cuộc sống do vậy chúng ta cần phải đặt
ra vấn đề về mặt xã hội,,.... Chúng ta cần phải kiểm soát
được tác động của nghành này lên vốn di truyền của nhân loại
cũng như lên sinh thái môi trường. Đây là cần được quản lí chặt
chẽ vì nó có tinh hai mặt. Nếu được sử dụng một cách hợp lí nó
mang lại những triển vọng to lớn nhưng ngược lại nó có thể gây
ra những tác hại nghiêm trọng.