Multiplex realtime pcr – Giới thiệu

1. Introduction
- Virus SARS-Cov-2
 Virus SARS-CoV-2 là một loại virus gây nên bệnh viêm đường hô hấp cấp.
Phương thức lây truyền của Virus SAR-CoV-2 có thể từ động vật sang
người hoặc từ người sang người.
 The SARS-CoV-2 virus is a virus that causes acute respiratory infections.
The mode of transmission of the SAR-CoV-2 Virus can be from animals to
humans or from person to person.
 SARS-CoV-2 là một loại vi rút sợi RNA dương ((+) ssRNA). Bộ gen của nó
bao gồm 29,900 nucleotide bao gồm các vùng: khung đọc mở (ORFs);
ORF1ab polyprotein (P), glycoprotein tăng đột biến (S), protein
nucleocapsid (N), protein vỏ (E) và protein màng (M). Do đó, một số gen
virus có thể bị nhắm làm mục tiêu để phát hiện SARS-CoV-2 bởi phương
pháp RT-PCR. Những gen này bao gồm: gen RdRP và S, gen N và S, và gen
E.
 SARS-CoV-2 is a positive-sense single-stranded RNA ((+) ssRNA) virus. Its
genome consists of 29,900 nucleotides enclosing five open reading frames
(ORFs); ORF1ab polyprotein (P), spike glycoprotein (S), nucleocapsid
protein (N), envelope protein (E), and membrane protein (M). Therefore,
several viral genes could be targeted for the detection of SARS-CoV-2 by
RT-PCR methods. These genes include such as RdRP and S genes, N and S
genes, and E gene.

Cấ
u trúc của virus SARS-Cov-2
 - Origin – Nguồn gốc

Sự bùng phát của Betacoronavirus mới, SARS-CoV-2, xuất hiện lần đầu tiên vào
tháng 12 năm 2019, trong đợt bùng phát đại dịch COVID-19 ở thành phố Vũ Hán,
Trung Quốc và bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau đó trở thành một đại dịch toàn cầu.
Tính đến ngày 10 tháng 3 năm 2021, khoảng 135 triệu người đã được xác nhận là
nhiễm SARS-CoV-2 và ba triệu người chết.

The outbreak of novel Betacoronavirus, SARS-CoV-2, which began in Wuhan, China

in December 2019, has spread rapidly to multiple countries as a global pandemic. As
of March 10, 2021, about 135 million people were confirmed with SARS-CoV-2
infection, and three million were died.

 Sự gia tăng số lượng ca nhiễm trên toàn thế giới đòi hỏi nhu cầu về một công cụ
chẩn đoán ít xâm lấn, đáng tin cậy và nhanh chóng. Để đạt được mục tiêu này,
một số nghiên cứu đã giải quyết thách thức này và những nỗ lực này đã mang
lại một số bộ dụng cụ chẩn đoán. Nhiều phương pháp đã được đề xuất để phát
hiện virus SARS-CoV-2 trong dịch mũi họng như Multiplex RT-PCR,
CRISPR / Cas12, và CRISPR-Cas3, xét nghiệm miễn dịch dòng chảy bên , cảm
biến phân tử sinh học dựa trên giấy, thử nghiệm SHERLOCK trong một nồi,
DNA aptamer, đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp khuếch đại (LAMP), v.v ...
Mỗi phương pháp này đều có điểm mạnh và điểm yếu riêng về độ nhạy và độ
đặc hiệu. Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (rRT-
PCR) là kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất trong việc phát hiện virus. Tuy
nhiên, các kết quả âm tính giả và dương tính giả có thể tạo ra những hậu quả sai
lệch, do đó cần phải cải tiến các phương pháp hiện có. Nghiên cứu này, nhằm
mục đích phát triển một phương pháp chẩn đoán rRT-PCR đa hợp để phát hiện
SARS-COV-2, phương pháp này nhắm mục tiêu đồng thời hai gen virus (RdRP
và E) và một gen người (RP).
 The increasing number of infections worldwide necessitates the need for a less-
invasive, reliable, and fast diagnostic tool. To achieve this goal, several studies
have tackled this challenge and these efforts have yielded several diagnostic
kits. Many approaches have been proposed to detect SARS-CoV-2 virus in
nasopharyngeal fluids such as multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12, and
CRISPR-Cas3, lateral flow immunoassay, paper-based biomolecular sensors,
SHERLOCK testing in one pot, DNA aptamer, loop-mediated isothermal
amplification (LAMP), etc. Each of these methods has its own strong and weak
points in terms of sensitivity and specificity. The real-time reverse transcription
polymerase chain reaction (rRT-PCR) is the most used technique in virus
detection. However, possible false-negative and false-positive results produce
misleading consequences, making it necessary to improve existing methods. In
the present study, it is aimed to develop a multiplex rRT-PCR diagnostic
 method for the detection of SARS-COV-2, which targets two viral genes (RdRP
and E) and one human gene (RP) simultaneously.

- Multiplex PCR

 Kỹ thuật Multiplex PCR là kỹ thuật phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu
bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng 1 tuýp phản ứng.
 Multiplex PCR is the simultaneous detection of multiple target in a
single reaction well, with different pair of primers for each target.
 Quá trình này khuếch đại DNA trong các mẫu bằng cách sử dụng nhiều
mồi và DNA polymerase qua trung gian nhiệt độ trong một chu trình
nhiệt.
 This process amplifies DNA in samples using multiple primers and a
temperature-mediated DNA polymerase in a thermal cycler.
 Multipex-PCR lần đầu tiên được mô tả vào năm 1988 như một phương
pháp để phát hiện sự mất đoạn trong gen dystrophin.
 Năm 2008, multiplex-PCR đã được sử dụng để phân tích các tế bào vi
mô và SNP.
 Vào năm 2020, multiplex real time PCR được thiết kế để kết hợp nhiều
gen mục tiêu từ Trung tâm Kiểm soát và Bệnh tật trong một phản ứng
duy nhất để tăng khả năng tiếp cận và thông lượng xét nghiệm phân tử
cho chẩn đoán SARS-CoV-2.
 Multipex-PCR was first described in 1988 as a method to detect
deletions in dystrophin gene.
 In 2008, multiplex-PCR was used for anlysis of microsatellites and
SNPs.
 In 2020, Real Time PCR multiplex assays were designed that combined
multiple gene target from the Center for Diseases and Control in a
 single reaction to increase molecular testing accessibility and
throughput for SARS-CoV-2 diagnostics.

- Difference between Traditional PCR and Multiplex PCR – Sự khác biệt giữa kỹ
thuật PCR truyền thống và kỹ thuật Multiplex PCR

Trong kỹ thuật PCR truyền thống, một trình tự duy nhất được khuếch đại trong
một ống phản ứng duy nhất. Ngược lại, multiplex PCR cho phép khuếch đại
đồng thời nhiều trình tự đích trong một ống duy nhất bằng cách sử dụng các bộ
mồi cụ thể kết hợp với các đầu dò được đánh dấu bằng các fluorophores khác
biệt về phổ.
In traditional PCR, a single target is amplified in a single reaction tube. In
contrast, multiplex PCR allows for simultaneous amplification of multiple
target sequences in a single tube using specific primer sets in combination with
probes labeled with spectrally distinct fluorophores.