BÀI 5

MỘT SỐ KỸ THUẬT, XÉT NGHIỆM

SINH HỌC TẾ BÀO VÀ SINH HỌC
PHÂN TỬ
Mục tiêu

1. Trình bày được một số kỹ thuật, xét nghiệm sinh học tế

bào, sinh học phân tử.
2. Phân tích được ưu nhược điểm của một số kỹ thuật, xét
nghiệm sinh học tế bào, sinh học phân tử.
3. Giải thích được một số kết quả xét nghiệm sinh học tế
bào, sinh học phân tử.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
-> Chọn mẫu TB để nuôi cấy nhằm phát hiện NST
- Bạch cầu lympho
- Tế bào tủy xương; mô da, thận, phổi, gan; mảnh mô bào
thai, tế bào tua rau: pp trực tiếp, nuôi cấy ngắn hạn, nuôi
cấy dài hạn.
-Tế bào ối: phục vụ cho chẩn đoán trước sinh
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi
* Lấy mẫu vật:
Lấy máu theo quy định vô trùng từ tĩnh mạch hoặc đầu
ngón tay, hoặc gót chân đối với trẻ sơ sinh. Dùng heparin để
chống đông.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại
vi
Các bước của quá trình nuôi cấy
– Môi trường nuôi cấy gồm: môi trường Parker: 8 ml, huyết
thanh AB hoặc huyết thanh bê: 2 ml, 1 - 2 giọt PHA, 5 - 6 giọt
máu toàn phần.
– Đặt các tuýp nuôi cấy hoặc lọ nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời
gian 48h hoặc 72h.
– Cho dung dịch colcemid hoặc colchicin vào lọ cấy trước khi
thu hoạch 2h để làm dừng các tế bào đang phân chia ở kỳ giữa.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi
Các bước thu hoạch tế bào
– Ly tâm - dd nhược trương (KCl 0,075M) vào để phá vỡ màng tế bào.
– Ly tâm - Định hình bằng dung dịch carnoy (3 lần)
– Ly tâm - Tế bào thu được trộn đều và dàn lên tiêu bản.
– Tiêu bản có thể được nhuộm bằng giemsa theo phương pháp nhuộm
thông thường hoặc phương pháp nhuộm băng.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi
Phương pháp phân tích tiêu bản nhiễm sắc thể người -> phát hiện
ra đột biến
–Quan sát tiêu bản NST ở dưới kính hiển vi quang học với độ phóng
đại 1000 lần – đánh giá ít nhất 30 cụm ở kỳ giữa.
–Phát hiện và phân tích các rối loạn cấu trúc NST trong khi đếm số
lượng NST
–Lập karyotyp
–Tổng hợp các đánh giá ở kính hiển vi và các phân tích karyotype kết
hợp với các thăm khám lâm sàng, người phụ trách xét nghiệm cho kết
luận về bộ NST người được xét nghiệm.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi
- Lập karyotype
+ Chụp ảnh một số cụm kỳ giữa, in phóng ảnh, cắt rời từng chiếc
NST, sau đó xếp từng cặp NST theo quy định quốc tế. Phương pháp
xếp bộ NST như trên được gọi là phương pháp lập karyotype.
+ Phân tích karyotype ở kính hiển vi với phần mềm đặc hiệu của máy
vi tính.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi
- Lập karyotype
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Tiêu chuẩn để xếp bộ nhiễm sắc thể người
• Kích thước (chiều dài) của NST
• Chỉ số tâm:
p: chiều dài nhánh ngắn
q: chiều dài nhánh dài
• Chiều dài tương đối của NST
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Tiêu chuẩn để xếp bộ nhiễm sắc thể người
• Kích thước (chiều dài) của NST
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Tiêu chuẩn để xếp bộ nhiễm sắc thể người
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Tiêu chuẩn để xếp bộ nhiễm sắc thể người
• Chiều dài tương đối của NST
Tỷ lệ giữa chiều dài của một NST nào đó so với chiều dài
tổng cộng của bộ NST đơn bội có chứa NST X, tính theo
phần nghìn trên cùng một tế bào.
• Phần eo thắt thứ hai trên NST, có vệ tinh hay không, vị
trí của các băng trên NST
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người
- Nhóm A (1-3): kích thước lớn nhất
Cặp 1, 3: tâm giữa
Cặp 2: tâm lệch
- Nhóm B (4-5): kt lớn, tâm lệch
- Nhóm C (6-12, X): kt trung bình, tâm lệch
- Nhóm D (13-15): kt trung bình, tâm đầu
 1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người
-Nhóm E (16-18): kt ngắn
Cặp 16: tâm giữa
Cặp 17, 18: tâm lệch
-Nhóm F (19-20): kt ngắn, tâm giữa
- Nhóm G (21-22, Y): kt ngắn, tâm đầu có vệ tinh
NST Y: 2 chromatide xếp song song hơn, ko có
vệ tinh
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người

45,X
Hội chứng turner

Kết luận công thức karyotpe và tên bệnh, hội chứng

1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người

47,XXX
Hội chứng siêu nữ

Kết luận công thức karyotpe và tên bệnh, hội chứng

1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Các quy định quốc tế về xếp bộ NST người

47,XX,+21
Hội chứng Down

Kết luận công thức karyotpe và tên bệnh, hội chứng

1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc thể
• A-G : Các nhóm NST
• 1-22: Số của các NST
• X, Y: Các NST giới tính
• / : Ký hiệu để minh họa trạng thái khảm (vd: 46/47 mô tả cơ
thể ở trạng thái khảm với 2 dòng tế bào 46 và 47 NST.
• p : Nhánh ngắn của NST
• q : Nhánh dài của NST
• del : Mất đoạn (deletion)
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc thể
• dup: Nhân đoạn (duplication)
• inv: Đảo đoạn (inversion)
• Ins: Xen đoạn (insertion)
• t: Chuyển đoạn (translocation)
• ter: Đầu tận cùng (cũng có thể được viết pter hoặc qter để mô tả đầu
tận cùng của nhánh ngắn hoặc nhánh dài).
• + / -: Được đặt trước số NST , các ký hiệu này dùng để minh hoạ
hiện tượng thêm (+) hoặc bớt (-) của nguyên một NST nếu đặt trước
số NST. Nếu được đặt sau NST được dùng để mô tả hiện tượng thêm
hoặc bớt một phần của NST.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc thể
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Cách gọi tên băng nhiễm sắc thể
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Cách gọi tên băng nhiễm sắc thể

NST số 1, nhánh ngắn, vùng 3, băng 2, băng phụ 1, băng dưới phụ 2
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
thể
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
thể
* Rối loạn về cấu trúc
- 46,XX,del (1) (q21) hoặc 46,XX,del (1) (pter → q21:)
-> Mất đoạn cuối của NST số 1, với điểm đứt trong
vùng 2, băng 1 của nhánh dài.
- 46,X,i(Xq) hoặc 46,X,i(X) (qter → cen → qter)
-> NST đều nhánh dài của NST X.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
thể
* Rối loạn về cấu trúc
– 46,XY,inv (2) (p21q13) hoặc 46,XY,inv (2) (pter →
p21::q13 → p21::q31 → qter)
–> Đảo đoạn của NST số 2 giữa 2 điểm đứt vùng 2, băng 1
của nhánh ngắn và vùng 3, băng 1 của nhánh dài.
– NST hình vòng: 46,XY,r(2) (p21q13)
–> Hình vòng NST số 2 nối liền chỗ đứt ở vùng 2, băng 1
của nhánh ngắn với vùng 1 băng 3 của nhánh dài.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
* Rốithể
loạn về cấu trúc
– 46,XY,t(2;5) (q21; q31) hoặc 46,XY,t(2;5) (2pter → 2q21::5q31 →
5qter; 5pter → 5q31::2q21 → 2qter)
–> Chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 2 với NST số 5, đoạn đứt ở
vùng 2 băng 1 của nhánh dài NST số 2 và ở vùng 3 băng 1 của nhánh
dài NST số 5.
– 45,XX,t(13;14) (p11; q11) hoặc 45,XX,t(13;14) (13qter →
13p11::14q11 → 14qter)
–> Hòa nhập tâm cân bằng giữa NST số 13 và NST số 14. Đoạn đứt
rất gần với phần tâm nhánh ngắn NST số 13 và trên nhánh dài của
NST số 14.
 1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
thể mô tả bộ NST
•Kí hiệu/
1. 49,XXY,+13,+19
2. 46,X,i(Xq)
3. Người nữ, thể khảm với 2 dòng tế bào, dòng thứ nhất bình
thường, dòng thứ 2 có đột biến mất đoạn ở nhánh ngắn NST số 9,
lặp đoạn ở nhánh dài NST số 5.
4. Người nam, chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 5 với NST số
2, đoạn đứt ở nhánh dài NST số 2 và nhánh dài NST số 5.
1. Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ ở người
Những ký hiệu bộ nhiễm sắc
thể
•Kí hiệu/ mô tả bộ NST
1. 45,XXY,-1,-9,dup(13q)
2. 47,X,r(X),+21
3. Người nam, thể khảm với 3 dòng tế bào, dòng thứ nhất bình
thường, dòng thứ 2 có đột biến đảo đoạn ở nhánh dài NST số 12,
mất đoạn ở nhánh dài NST số 2, dòng thứ 3 có NST số 3 đều
gồm 2 nhánh ngắn.
1.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization: FISH

– Phát hiện các bất thường NST

– Có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì nó có thể
thực hiện trên nhân tế bào gian kỳ không cần qua
thời gian nuôi cấy (sau 24-48 giờ đã có kết quả)
–Mẫu tế bào có thể lấy sớm từ tuần 12 (số lượng
mẫu dịch ối 2-5 ml).
 1.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization: FISH

– Sử dụng trình tự chuỗi ngắn DNA sợi đơn (DNA dò)

– Các DNA dò sẽ được lai với DNA đích trên tiêu bản
NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ. Dưới kính hiển vi huỳnh
quang ta có thể phát hiện, định vị những chỗ DNA dò
lai với DNA đích.
–> phát hiện được những rối loạn số lượng và cấu trúc
NST
1.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization: FISH

* Các loại DNA dò:

– DNA dò phần tâm

– DNA dò đặc hiệu locus lai từng vùng của

1 NST

– DNA dò toàn bộ NST

1.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization: FISH
1.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization: FISH

* Ứng dụng kỹ thuật FISH

Trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down:

sử dụng DNA dò NST 21; nếu nhân tế bào gian kỳ
có 2 tín hiệu lai (2 NST 21; nếu có 3 tín hiệu lai (3
NST 21).
FISH: lai tại chỗ phát huỳnh quang
(fluorescence in situ hybridization).
 1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR

- Xét nghiệm sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

để chẩn đoán một số bất thường lệch bội nhiễm sắc
thể (NST) của thai từ tế bào ối.
- Sử dụng các cặp mồi gắn màu huỳnh quang để
khuếch đại các STR hoặc STS, và định lượng bằng
điện di mao quản trên hệ thống máy giải trình tự gen
ABI 3500.
 1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR

- STR là các trình tự lặp ngắn từ 2-3 bp của đoạn không mã

hóa trên ADN.
- STS là một chuỗi DNA là một chuỗi DNA ngắn (200 đến
500 cặp bazơ) có một lần xuất hiện duy nhất trong bộ gen.
- Sử dụng sàng lọc bằng PCR- Sử dụng sàng lọc
bằng PCR để phát hiện microdeletions trong
không còn tinhtrùng- Sử dụng sàng lọc bằng PCR để phát
hiện microdeletions trong không còn tinhtrùng (AZF) gen-
Sử dụng sàng lọc bằng PCR để phát hiện microdeletions
 1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR
• Lệch bội NST số 21 còn gọi là trisomy 21 gây hội
chứng Down.
• Lệch bội NST số 13 còn gọi là trisomy 13 gây hội
chứng Patau.
• Lệch bội NST số 18 còn gọi là trisomy 18 gây hội
chứng Edwards.
• Lệch bội NST giới tính X, Y gặp trong các hội
chứng như Turner, Klinefelter, Jacobs...
1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR
1.3. Kỹ thuật định lượng huỳnh quang QF-PCR
1.4. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen dựa trên microarray
Tách chiết DNA

B1: Giải phóng DNA ra khỏi màng

tế bào -> ly tâm loại bỏ mảnh vụn.
B2: Tách bỏ Protein trong tế bào –
proteinase K -> ly tâm loại bỏ phần
tủa của proteinase K
B3: Kết tủa DNA – Ethanol. DNA
tủa được để khô ở nhiệt độ phòng và
cho tan trong đệm TE (Tris, EDTA)
Tách chiết RNA

Giống DNA
Bước tiếp theo: + Ủ với DNAase ->
phân hủy DNA
+ Hòa tan dịch chiết
chứa RNA trong nước, thu RNA
toàn phần.
- Kiểm kiểm tra độ tinh khiết của
DNA bằng xác định tỉ lệ OD 260/
 2.2.2. Phản ứng chuỗi polymerase
(polymerase chain reaction: PCR)

KHÁI NIỆM
• Được phát minh bởi Kary Mullis
• Là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử
nhằm khuyếch đại một gen hay một đoạn DNA nhờ
enzyme polymerase.
Fig. 20-8 5′ 3′
TECHNIQUE
Target
sequence

Genomic DNA 3′ 5′

1 Denaturation 5′ 3′

3′ 5′

2 Annealing

Cycle 1
yields Primers
2
molecules

3 Extension

New
nucleo-
tides

Cycle 2
yields
4
molecules

Cycle 3
yields 8
molecules;
2 molecules
(in white
boxes)
match target
sequence
2.2.2 Phản ứng chuỗi polymerase
(polymerase chain reaction: PCR)

– Mục đích: phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần

trong ống nghiệm.
– Nguyên liệu:
⮚ Phân tử DNA ban đầu
⮚ Cặp DNA mồi (primers), mỗi mồi gồm
khoảng 20 base
⮚ 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
⮚ Taq polymerase (Thermus aquaticus)
 2.2.2. PCR
CÁC BƯỚC CƠ BẢN
- Biến tính (94oC): tách rời DNA mạch
đôi thành hai mạch đơn bằng nhiệt
- Bắt cặp (lai) (50-52oC): mồi bắt cặp
với bản mẫu
- Tổng hợp (kéo dài) (70-72oC): mạch
mới được nối dài từ mồi
Một chu kì gồm ba bước trên được lặp
đi lặp lại nhiều lần
 2.2.2. PCR
THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR

Enzyme dùng trong phản ứng PCR

Có nhiều enzym khác nhau được chọn tùy mục đích sử dụng:
⮚Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus)
⮚Stoffel DNA polymerase
⮚Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus
litoralis)
⮚Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus)
⮚Tth DNA polymerase
⮚UITma DNA polymerase
 2.2.2. PCR
Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR

Ống eppendorf “ thành mỏng” đầu típ có phin lọc

 2.2.2. PCR
ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM
⮚Ưu điểm:
- Độ nhạy cao
- Nhanh chóng, tiện lợi
⮚Nhược điểm:
- Giới hạn về kích thước của trình tự cần khuếch đại
- Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp
- Ngoại nhiễm cao
- Nhân bản không đặc hiệu
- Phụ thuộc rất lớn về thao tác
- Thiết bị đắt tiền
 2.2.2. PCR
ỨNG DỤNG
❖Y-sinh học:
- Phát hiện các bệnh di truyền
- Nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng
- Tạo dòng gene
-Xác định huyết thống…
 2.2.2. PCR
ỨNG DỤNG
* Khoa học hình sự:
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tội phạm chỉ từ
vệt máu khô, sợi tóc,…
* Thực phẩm – vi sinh:
- Phát hiện tác nhân VSV nhiễm trong mẫu
thực phẩm…
 2.2.2. PCR
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR
• RT-PCR
•Nested PCR/semi nested PCR
• Multiplex PCR
•Real- time PCR (2.2.6)
 2.2.2. PCR
Multiplex PCR
Sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng
PCR để phát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA
của một tác nhân hay nhiều tác nhân
 2.2.2. PCR
RT-PCR
⮚Là kỹ thuật PCR dùng để nhân bản RNA dùng enzyme
phiên mã ngược ( reverse transcriptase).
2.2.2.
PCR
RT-PCR
Real – time PCR
2.2.2. PCR

Real – time PCR

2.2.4. Kỹ thuật khuếch đại các đầu dò phụ thuộc ghép nối (MLPA)
• Là biến thể của phản ứng chuỗi polymeraseLà biến thể
của phản ứng chuỗi polymerase đa mồi cho phép khuếch
đại nhiều mục tiêu chỉ với một cặp mồi duy nhất .
• Xác định các loại bỏ hoặc sao chép có thể chỉ ra các đột
biến gây bệnh.
• MLPA là một công cụ chẩn đoán quan trọng được sử dụng
trong các phòng thí nghiệm bệnh lý lâm sàng trên toàn thế
giới.
2.2.4. Kỹ thuật khuếch đại các đầu dò phụ thuộc ghép nối (MLPA)
1. DNA mẫu bị biến tính , tạo ra DNA mẫu sợi đơn.
2. Các cặp mẫu dò được lai với ADN mẫu
3. Ligase được áp dụng cho DNA đã lai.
4. PCR khuếch đại tất cả các cặp đầu dò đã được nối thành công,
sử dụng mồi PCR được đánh dấu huỳnh quang.
5. Các sản phẩm PCR được định lượng bằng phương pháp điện
di (mao quản) .
2.2.4. Kỹ thuật khuếch đại các đầu dò phụ
thuộc ghép nối (MLPA)
Điện di gel agarose

–Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm,

trong điện trường có điện thế và cường độ thích
hợp DNA, RNA di chuyển từ cực âm đến cực
dương.
–Để kiểm tra và xác định tính chất của DNA,
cần điện di DNA trên thạch (gel). Phân tử DNA
càng nhỏ càng di động nhanh
Fig. 20-9
TECHNIQUE

Mixture of Power
DNA mol- source
ecules of – Cathode Anode +
different
sizes

Gel
1

Power
source
– +

Longer
molecules

2 Shorter
molecules

RESULTS
 Điện di trên gel agarose

- Nhược điểm: chỉ phân tách được các đoạn có kích thước
từ 500 đến 10000 Nu, độ phân tách không cao.
Điện di trên gel polyacrylamide

- Gel acrylamide cho

-

những lỗ nhỏ, thích

hợp để phân tách
những đoạn DNA sợi
đơn có kích thước dưới
500bp.
- Phân tách được khác
biệt tới 1 nucleotide
2.2.5. Điện di DNA trên gel

Phân loại

• Điện di trên gel polyacrylamide:

dưới 500 nu

• Điện di trên gel agarose: 500 – 10

000 nu
Điện di gel agarose

Ứng dụng

• Phân tách các đoạn acid nucleic có

kích thước, cấu hình khác nhau

• Dùng để kiểm tra kết quả tách chiết

DNA.
Điện di mao quản

Điện di mao quản ( CE ) là phương pháp phân

tách điện động học được thực hiện trong các
mao quản có đường kính dưới milimét và trong
các kênh vi lỏng và nano. chất phân tích di
chuyển qua các dung ) là phương pháp phân
tách điện động học được thực hiện trong các
mao quản có đường kính dưới milimét và trong
các kênh vi lỏng và nano. chất phân tích di
Điện di mao quản

Sơ đồ hệ thống điện di mao quản

Điện di mao quản
PP enzyme sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger

Nguyên tắc: dựa vào sự hoạt động của enzyme DNA-polymerase để

tổng hợp mạch bổ sung của trình tự cần xác định.

Phản ứng có sự tham gia của các dideoxynucletide (ddNTP)

 2.2.7.1. PP enzyme sử dụng các
dideoxynucleotide
của Sanger

⮚Các đoạn DNA cần xác định trình tự phải được tạo
dòng vào một vector để nhân thành nhiều bản sao
trong tế bào được chuyển vào (ví dụ: vi khuẩn).
⮚Tách chiết và tinh sạch các vector từ vi khuẩn. –
⮚Lượng DNA sau khi được tách chiết sẽ được cho vào
bốn ống nghiệm khác nhau để thực hiện phản ứng giải
trình tự
2.2.7.1. PP enzyme sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger

⮚vector có gắn chèn đoạn DNA cần xác định trình tự,
⮚đoạn mồi bổ sung đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí
chèn đoạn DNA,
⮚enzyme DNA polymerase,
⮚bốn loại dNTP
⮚1% mỗi loại ddNTP (được đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ 32P hay 35S).
2.2.7.1. PP enzyme sử dụng các dideoxynucleotide của
Sanger
PP enzyme sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger
2.2.7.2. Giải trình tự thế hệ mới bằng máy giải tự động
New generation sequencing (NGS)

⮚nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến.

⮚các ddNTP được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác
nhau cho mỗi loại ddNTP.
⮚hệ mao quản
⮚hệ chiếu sáng laser
⮚hệ nhận và xử lý tín hiệu.
⮚Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua
một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi
lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G.
2.2.7. Xđ trình tự nu trong pt DNA
(Sequencing)
2.2.7.2. Giải trình tự thế hệ mới bằng máy giải tự
động
New generation sequencing (NGS)