Chuyên ngành Huyết học

LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG (Fluorescence in situ hybridization - FISH)

Quy trình kỹ - Lai DNA đích trong nhân TB hoặc NST ở giai đoạn metaphase/interphase của người bệnh (đã được cố định trên
thuật FISH lame kính) với các đầu dò acid nucleic (probe) đã gắn đánh dấu huỳnh quang.
- Giúp phát hiện những bất thường về cấu trúc và số lượng ở mức độ tế bào.

Nguyên tắc

- Bệnh phẩm: tủy, máu, block paraffin

(1) Chuẩn bị  Máu, tủy: 2ml chứa trong ống chống đông tráng heparin 300UI
mẫu  Block paraffin: tiêu bản lát cắt mỏng nhất 4 µm, bảo quản không quá 6 tháng (bị trơ xử lý).
- Mẫu được vận chuyển đến PXN trong vòng 8h sau khi lấy ở 20 – 25oC và trong vòng 24h sau khi lấy ở 2 – 8oC.

- Đối với mẫu tủy, máu: phá một phần màng TB, bộc lộ nhân bằng dd nhược trương KCl 0.075M. Tiếp đến, cố
(2) Cố định tế
định các nhân TB bằng dd Carnoy (acid acetic phá vỡ các TB không nhân, methanol cố định nhân TB). Nhỏ
bào lên
mẫu lên lame (hotplate 50oC) và để khô.
lame
- Tiêu bản mô: khử paraffin bằng dd xylene, phá màng TB và các mô sợi bằng enzyme proteinase K.
(3) Biến tính - Điền thông tin probe cần lai
và lai hoá - Khảo sát và đánh dấu mặt sau vùng cần lai
- Nhỏ probe lên lame, đậy lamelle

1/6
 Chuyên ngành Huyết học
- Bao viền lamelle bằng keo dán (paper bond) để ngăn dịch tràn ra ngoài, giữ tiêu bản không bị khô
- Biến tính DNA
 Tiêu bản khô: sử dụng máy thermobrite (75oC/5 phút)
 Tiêu bản ướt: sử dụng formamide 70% bồn chứa dầu, sau khử nước bằng Ethanol 70%, 85% và 100%
- Cho tiêu bản vào hộp, giữ ẩm và ủ lai hoá ở 37oC/18 – 20h
- Gỡ bỏ viền keo dán và lamelle
- Rửa bằng dd muối (SSC: NaCl và sodium citrate), dd tẩy như xà phòng (NP-40), nhiệt
(4) Rửa sau lai
hoá:
Loại bỏ
những probe
dư/ không
*SSC là cắt những đoạn dò không bắt cặp đặc hiệu trong TB; nồng độ càng thấp  tác động càng mạnh.
đặc hiệu
**NP-40 có tác dụng giống như xà phòng, rửa trôi những probe không bắt đặc hiệu
***Nhiệt độ: làm tách mạch các probe không đặc hiệu.

(5) Nhuộm - DAPI (4’, 6’ diamino-2-phenylindole) để nhuộm nền nhân TB  nhận diện các tín hiệu trong nhân là phù hợp
- PPD (P – phenylene – diamin) là một antifade (Fluorescence Mounting Medium)  chống phai màu tín hiệu
các probe

2/6
 Chuyên ngành Huyết học
- KHV huỳnh quang hoặc KHV đồng tiêu (confocal microscopy)
- Đếm trên nhiều TB, nhiều vi trường, tránh nhầm nhẫn với Fusion với tín hiệu chồng lấp (do TB không gian 3
chiều)
- Tùy theo yêu cầu của chỉ định (đặc điểm probe của NSX) mà có hình thức nhận định kết quả cho phù hợp (bình
thường/bất thường)
- Đánh giá tiêu bản:
Nền tiêu bản sạch, không có cặn probe tồn dư
Ranh giới nhân còn rõ
(6) Phân tích Các tín hiệu huỳnh quang rõ nét
kết quả Chọn vùng nhân đơn độc, ít chồng lấp để đánh giá (so sánh tín hiệu đơn chồng lấp với các tín hiệu rời khác
để nhận định)
- Quan sát trên từng kính lọc: gồm 5 vật kính
 Số 1: màu DAPI  cho thấy hình thái tế bào (TB hiện màu trắng)
 Số 2: kính lọc Green  hiện các tín hiệu màu xanh lá
 Số 3: kính lọc Red  hiện các tín hiệu màu đỏ
 Số 4: kính lọc Fusion  hiện cả tín hiệu xanh lá và đỏ, nếu có sự giao thoa màu sẽ hiện tín hiệu vàng
 Số 5: kính lọc Aqua  hiện các tín hiệu màu xanh dương
Các loại probe Phân loại theo Gene specific probes Repetitive sequence probes Chromosome painting probes
vị trí lai
Probe mang trình tự acid nucleic Probe gắn các vùng giàu trình tự Probe mang trình tự đặc hiệu
đặc hiệu đích trên các NST base lặp lại như các probe tâm cho mỗi NST. Sau khi lai hóa,
Nguyên (BAC/PAC/YAC) với nhiều kích động và các probe đầu tận. Các các NST “đích” sẽ phát huỳnh
lý thước thay đổi khác nhau. tâm động thường lặp lại giàu A- quang với màu sắc tùy thuộc
T; các đầu tận thường có trình tự theo kit NSX
lặp ngắn TTAGGG.
 Bất thường cấu trúc (mất  Probe tâm động: xác định  Xác định NST, NST vòng
Ứng
đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn), NST đánh dấu, bất thường  Chuyển vị NST
dụng
khuếch đại gen, lệch bội, hội số lượng NST.
chứng vi mất đoạn, lập bản đồ  Probe đầu tận và cận đầu

3/6
 Chuyên ngành Huyết học
gen. tận: xác định chuyển đoạn
NST
*BAC: bacterial artificial
chromosome
PAC: P1 artificial chromosome
YAC: yeast artificial
chromosome

Một số ví dụ DUAL – FUSION PROBE

về probe - PML/RARα với t(15;17)(q24;q21.1): 2 probe Red/Green nằm từ trước và sau của vị trí PML/RARα.
thường gặp - BCR/ABL với t(9;22)(q34;q11):
 2 probe Green nằm 2 đầu vị trí dễ đứt gãy của BCR (NST 22); 1 probe Red nằm trên đoạn chứa ASS và
ABL (NST 9)
 2 probe Green nằm 2 đầu vị trí dễ đứt gãy của BCR (NST 22); 1 probe Red nằm trên đoạn chứa ABL
(NST 9), 1 probe Aqua nằm trên đoạn ASS (NST 9)
SINGLE – FUSION PROBE
- E2A/PBX1 với t(1;19)(q23;p13.3): 1 probe Green nằm trên đoạn chứa TCF3 (NST 19) và 1 probe Red nằm
trên đoạn chứa PBX1 (NST 1)

BREAK – APART PROBE

- MLL/AF9 với t(9;11)  11q23: 1 probe Green nằm trước đoạn thường đứt gãy MLL, 1 probe Red nằm sau
đoạn thường đứt gãy MLL (NST 11)

DELETION PROBE
- TP53: 1 probe Red chứa p53 (100kb), 1 probe Green ở tâm động NST

ENUMERATION PROBE
- Phát hiện bất thường về số lượng NST và các hội chứng Trisomy, lệch bội.
 X: 1 pobe tâm động Xp11.1-q11.1 (DXZ1) Green
 Y: 1 pobe tâm động Yp11.1-q11.1 (DYZ3) Orange
 NST 18: 1 probe tâm động 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) Aqua

4/6
 Chuyên ngành Huyết học
 NST 13: 1 pobe gắn chuỗi duy nhất (13q14.2) Green
 NST 18: 1 probe gắn chuỗi duy nhất (21q22.13) Orange
Bệnh lý Đột biến thường gặp Kiểu hình bình thường Kiểu hình bất thường
Chuyển vị NST Ph chuẩn:
BC mạn dòng t(9;22)(q34;q11) NST 9: 2 Red – Aqua
1R + 1G + 2Y
tuỷ (CML) BCR/ ABL (NST Ph) NST 22: 2 Green

t(12;21)(p13;q22)
NST 12: 2 Red Chuyển vị t(12;21)(p13;q22):
ETV6 (TEL)/ RUNX1
NST 21: 2 Green 1R + 1G + 2Y
(AML1)
BC cấp dòng t(4;11)  11q23 Tái sắp xếp NST 11q23:
lympho (ALL) NST 11: 2 Yellow
MLL/ AF4 1R + 1G + 1Y
t(1;19)(q23;p13.3) NST 1: 2 Red Chuyển vị t(1;19)(q23;p13.3):
TCF3/ PBX1 NST 19: 2 Green 2R +1G +1Y

t(8;21)(q21.3;q22)
NST 8: 2 Red Chuyển vị t(8;21)(q21.3;q22):
AML1 (RUNX1)/ ETO
NST 21: 2 Green 1R + 1G + 2Y
(RUNX1T1)

BC cấp dòng tuỷ inv(16)(p13q22) hoặc NST 16 (CBFβ): 2 Red Tái sắp xếp 16q22:
(AML) t(16;16)(p13;q22)
NST 16 (MYH11): 2 Green 1R + 1G + 2Y
CBFβ/ MYH11

t(15;17)(q24;q21.1) NST 15: 2 Red Chuyển vị t(15;17)(q24;q21.1):

PML/ RARα NST 17: 2 Green 1R + 1G + 2Y

ĐỌC KẾT - Khảo sát và ghi nhận tín hiệu trên 200 tế bào.
QUẢ - Kết quả thể hiện: Phân tích 200 TB, phát hiện ...% có (loại bất thường) với kiểu tín hiệu … (tương ứng đi kèm với đặc điểm
của tín hiệu)
Ví dụ: Xét trên probe VYSIS LSI BCR/ABL, Es phát hiện t(9;22)(q34;q11)

5/6
 Chuyên ngành Huyết học
- Tỉ lệ chuyển vị NST Ph chuẩn t(9;22)(q34;q11) là …% (phân tích 100 TB)
- Phân tích 100 TB, phát hiện …% có chuyển vị t(9;22)(q34;q11) kèm mất đoạn gen ASS, ABL và BCR trên der(9).
- Phân tích 100 TB, phát hiện …% có chuyển vị t(9;22)(q34;q11) với kiểu tín hiệu: 1 (đỏ) tín hiệu NST 9q34, 2 (xanh lá) tín hiệu
NST 22q11, 1 (vàng) tín hiệu tổ hợp giữa NST 9q34 và 22q11.  Kết luận: Chuyển vị có mất đoạn gen BCR, ALB và ASS
trên der(9)
- Phân tích 100 TB, phát hiện …% có chuyển vị t(9;22)(q34;q11) với kiểu tín hiệu: 2 (đỏ) tín hiệu NST 9q34, 2 (xanh lá) tín hiệu
NST 22q11, 1 (vàng) tín hiệu tổ hợp giữa NST 9q34 và 22q11.  Kết luận: Theo dõi chuyển vị NST Philadelphia với 1 NST
thứ ba.

 Không thấy tín hiệu/ tín hiệu không đúng  kiểm tra lại filter/cài đặt lazer; các bước protocol; chất lượng và HSD probe
 Tín hiệu không đều giữa các vùng  do probe phủ không đều, tiêu bản bẩn, nhiễm bẩn từ dụng cụ
 Tín hiệu không đặc hiệu, auto – fluoresense  do phơi nhiễm với ánh sáng làm tan rã tín hiệu; rửa lame không đạt
MỘT SỐ LỖI
 Tín hiệu yếu hoặc nhuộm nền  dung dịch rửa pha không đúng; với mẫu block paraffin có thể do chưa được khử hết
KỸ THUẬT
paraffin
 Ít tín hiệu, tín hiệu yếu, dương tính nền với nhiêu filter  do bước tiêu protein chưa đạt; biến tính chưa đủ
 Một số tế bào mất tín hiệu, nhâ hình bánh donut, hình thái mô bị phá hủy, giảm hoặc mất DAPI

6/6