BỆNH VIỆN Mã số:QT. SHPT.

Phiên bản số:

VIỆT NAM - THỤY ĐIỂN UÔNG BÍ
Ngày ban hành:
KHOA HÓA SINH Số trang: 06

QUY TRÌNH
TÁCH CHIẾT RNA TỪ MẪU BỆNH PHẨM
(Phương pháp phenol - Chloroform)

Chức danh
Người viết Người xem xét Người phê duyệt

Chữ ký

Họ và tên

Ngày ký

Ngày ban hành: Lần ban hành: Trang: 1/ 6

 Khoa Hoá Sinh Mã số: QT. SHPT
Quy trình tách chiết RNA (Phenol-chloroform) Phiên bản:

THEO DÕI VÀ SỬA ĐỔI TÀI LIỆU

Phiên Vị trí Ngày sửa đổi/ Người sửa đổi/

bản/xem Nội dung sửa đổi/xem xét
xét sửa đổi xem xét xem xét

Ngày ban hành:05/01/2018 Lần ban hành: 01 Trang: 2/ 6

 Khoa Hoá Sinh Mã số: QT. SHPT
Quy trình tách chiết RNA (Phenol-chloroform) Phiên bản:

1. Mục đích

Quy định thống nhất các bước tiến hành tách chiết RNA cho phản ứng real-time
PCR từ mẫu bệnh phẩm.
2. Phạm vi áp dụng
Áp dụng cho kít hóa chất phenol/chloroform tách chiết RNA, công ty Việt Á tại
Khoa Hóa sinh - Bệnh viện Việt Nam - Thụy Điển, Uông Bí.
3. Trách nhiệm
Tất cả nhân viên trong Khoa Hóa sinh khi tiến hành xét nghiệm có trách nhiệm
thực hiện đúng theo quy trình này. Nếu có kết quả bất thường phải thông báo với
Trưởng phòng xét nghiệm, bác sỹ phụ trách hoặc Trưởng khoa để có hướng xử trí.
Kỹ thuật viên trưởng có trách nhiệm giám sát việc thực hiện của các nhân viên.
4. Thuật ngữ và từ viết tắt

4.1. Giải thích thuật ngữ

- Acid Ribonucleic (ARN hay RNA): là một phân tử polymer cơ bản có nhiều vai
trò sinh học trong mã hóa, dịch mã, điều hòa và biểu hiện của gên. ARN là vật chất di
truyền của một số loại virus.

4.2. Từ viết tắt

- ARN hay RNA: Acid Ribonucleic
- Real-time PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp theo thời gian thực
5. Nguyên lý:
Bộ kit hóa chất Phenol - Chloroform dùng để phá vỡ màng tế bào, trích ly, thu
hồi các đoạn nhỏ RNA cho phản ứng Real Time PCR.
6. Thiết bị và vật liệu
6.1 Thiết bị

- Máy ly tâm dùng cho tube 0.2ml, 1.5ml, tủ thao tác vô trùng.
- Bể nhiệt, làm khô sản phẩm RNA.
- Máy vortex.
- Máy Spin down.
- Máy Realtime PCR

Ngày ban hành:05/01/2018 Lần ban hành: 01 Trang: 3/ 6

 Khoa Hoá Sinh Mã số: QT. SHPT
Quy trình tách chiết RNA (Phenol-chloroform) Phiên bản:

- Tủ an toàn sinh học cấp II

- Tủ lạnh 4oC
- Tủ lạnh -20oC
- Giá để ống
- Khay giữ lạnh
- Thùng rác đựng đầu côn và hoá chất
6.2. Vật liệu
6.2.1. Dụng cụ
- Ống đựng mẫu (sample cup)
- Pipet tự động
- Đầu côn vô trùng có màng lọc loại 10L, 50 - 100L và 200 - 1000L
- Găng tay không bột.
- Khẩu trang N95.
6.2.2. Hóa chất
- Bộ kit dùng cho tách chiết RNA bảo quản nhiệt độ 2 - 8C.
- Bộ kít có thời gian sử dụng là 12 tháng kể từ ngày sản xuất.
- Bộ đối chứng: chứng dương, chứng âm bảo quản nhiệt độ -20C
7. An toàn
- Mặc trang phục bảo hộ khi làm xét nghiệm.
- Tháo găng, trang phục bảo hộ và rửa tay bằng dung dịch rửa trước khi rời khỏi
khu vực làm việc.
- Tránh để hóa chất, thuốc thử tiếp xúc với da, mắt.
- Khi bị tràn, đổ vỡ, rơi vãi hay có nguy cơ phơi nhiễm với bệnh phẩm lây nhiễm
phải báo cáo người phụ trách phòng xét nghiệm, lập biên bản và lưu giữ hồ sơ về các
sự cố.
- Ống nghiệm sau khi làm xét nghiệm phải được xử lý theo quy định xử lý chất
thải chung của Bệnh viện nhằm phòng chống nhiễm khuẩn và lây truyền bệnh.
- Xử lý hóa chất theo quy định ngay lập tức khi có các vết máu từ mẫu xét
nghiệm vương vãi hoặc bám dính ra sàn nhà, các dụng cụ, máy móc.
- Vệ sinh sạch sẽ khu vực làm việc trước và sau khi kết thúc buổi làm việc.
8. Bệnh phẩm

Ngày ban hành:05/01/2018 Lần ban hành: 01 Trang: 4/ 6

 Khoa Hoá Sinh Mã số: QT. SHPT
Quy trình tách chiết RNA (Phenol-chloroform) Phiên bản:

8.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

+ Mẫu bệnh phẩm que tăm bông lấy bệnh phẩm:
- Cho 900µl ED5 vào ống chứa que tăm bông lấy bệnh phẩm
- Votex trong tối thiểu 30s
- Hút 100 µl sử dụng để tách RNA.
+ Mẫu bệnh phẩm dịch cơ thể/ Que tăm bông trong môi trường vận chuyển
- Đối với mẫu bệnh phẩm từ dịch cơ thể (huyết thanh; dịch não tủy…) hoặc que
tăm bông trong môi trường vận chuyển không qua bước xử lý bệnh phẩm. trộn
đều bằng votex trong 10 -15s, sử dụng trực tiếp mẫu bệnh phẩm để tách chiết.
8.2 Bảo quản bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được hủy sau khi kết quả được ký duyệt với những mẫu cho kết
quả âm tính. Đối với mẫu xét nghiệm cho kết quả dương tính, gửi mẫu ra CDC tỉnh
Quảng Ninh làm xét nghiệm khẳng định.
9. Tiến hành tách, chiết RNA

Bước 1: Để bệnh phẩm ở nhiệt độ phòng, giã đông đối với mẫu bệnh phẩm đã được
lưu ở - 800 C (hạn chế số lần giã đông).
Bước 2: Tra đối, đánh số thứ tự trên phiếu yêu cầu xét nghiệm và trên ống mẫu ống
1,5ml vô trùng (phòng XN quy ước).
Bước 3: Cho 100µl vào 1 tube vô trùng có sẵn 900µl pED1 votex 30s và để yên ở
nhiệt độ phòng 10 phút.
Bước 4: Thêm vào 200µl pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube chuyển
thành màu trắng đục (không được votex). Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 5: Thu 600µl dịch nổi chứa DNA vào 1 tube vô trùng có sẵn 600µl EX3. Trộn
đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 6: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng). Cho từ từ 900µl EX4 vào.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 7: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC trong 10-15 phút.
Bước 8: 100µl ED5 Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan
hoàn toàn.
Bước 9: Bảo quản mẫu ở -200C.

Ngày ban hành:05/01/2018 Lần ban hành: 01 Trang: 5/ 6

 Khoa Hoá Sinh Mã số: QT. SHPT
Quy trình tách chiết RNA (Phenol-chloroform) Phiên bản:

10. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả

Hiệu suất tách chiết thấp: có thể do các nguyên nhân sau: (1) do giai đoạn ly
giải, (2) điều kiện cho quá trình gắn không đúng.
Thoái hóa: Điều này cần quan tâm khi tách ARN. Chủ yếu khi tách ARN, sự
thoái hóa diễn ra do bảo quản mẫu không đúng cách hoặc quá trình lysis không tốt, cần
phải đảm bảo việc rửa giải bằng nước không chứa RNAase. Đối với tách chiết ADN,
sự thoái hóa không phải là một vấn đề lớn bởi vì đối với PCR, dù ADN bị đứt gãy thì
nó vẫn hoạt động tốt. Nhưng nếu bạn thấy ADN bị đứt gãy quá nhiều, có thể là do bạn
đã sử dụng bước ly giải quá mạnh.
11. Tài liệu tham khảo
- Hướng dẫn sử dụng kít hóa chất phenol/chloroform tách chiết RNA, công ty cổ
phần Việt Á.

Ngày ban hành:05/01/2018 Lần ban hành: 01 Trang: 6/ 6