QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM

MTB ĐỊNH DANH VÀ KHÁNG RMP XPERT

1. Mục đích
Quy trình này mô tả các bước kỹ thuật xét nghiệm phát hiện Mycobacterium
tuberculosis và tính kháng Rifampicin trên hệ thống GeneXpert.

2. Phạm vi áp dụng
Quy trình này áp dụng cho bộ phận xét nghiệm của các cơ sở y tế có chẩn đoán lao
bằng kỹ thuật Xpert

3. Trách nhiệm
Xét nghiệm viên được phân công thực hiện kỹ thuật.
Giám sát viên và quản lý phòng xét nghiệm

4. Định nghĩa, thuật ngữ và các chữ viết tắt

4.1. Định nghĩa, thuật ngữ
GeneXpert Dx là hệ thống tự động có chức năng tách chiết mẫu, khuếch đại acid
nucleic và phát hiện trình tự đích dựa trên phản ứng real-time PCR phiên mã ngược và
phản ứng real-time PCR (tùy đối tượng chẩn đoán).
Xpert® MTB/RIF (Xpert MTB/RIF) là kit chẩn đoán in vitro trên hệ thống
GeneXpert giúp xác định vi khuẩn lao và tính kháng Rifampicin từ bệnh phẩm.
4.2. Các chữ viết tắt
ADN: Acid deoxyribonucleic
CSDL: Cơ sở dữ liệu
MTB: Mycobacterium tuberculosis
PCC (Probe check control): Đối chứng kiểm tra mẫu dò
PCR (Polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp/ Phản ứng nhân gien
RMP, RIF: Rifampicin
SPC (Sample processing control): Đối chứng quá trình xử lý mẫu
5. Nguyên lý
Kit xét nghiệm Xpert MTB/RIF dựa trên phản ứng hemi-nested real-time PCR với
đích là đoạn trình tự 192bp của gien ropB. 5 mẫu dò dạng beacon phân tử (molecular
beacon) được thiết kể để bao phủ vùng điểm nóng về đột biến liên quan đến tính kháng
Rif (81bp) giúp xác định vi khuẩn lao và tính kháng Rifampicin. 5 mẫu dò được gắn với
một chất nhuộm huỳnh quang có màu khác nhau, ký hiệu A, B, C, D, E.

Hình 5.1: Vùng xác định tính kháng Rif 81bp trên gien rpoB

Sinh phẩm xét nghiệm Xpert MTB/RIF bao gồm cartridge và hóa chất xử lý mẫu.
Trong cartridge chứa các hóa chất cần thiết cho việc phát hiện vi khuẩn lao và tính kháng
Rif. Đồng thời, cartridge có các quy trình đối chứng: Đối chứng xử lý mẫu (Sample
processing control-SPC) và Đối chứng kiểm tra mẫu dò (Probe check control-PCC). SPC
bao gồm bào tử Bacillus globigii dạng đông khô không lây nhiễm có vai trò đảm bảo gien
đích được nhân lên trong điều kiện thích hợp và không có các chất ức chế phản ứng PCR.
PCC được hệ thống thực hiện trước khi bắt đầu quá trình nhân gien. Hệ thống đo lường
tín hiệu huỳnh quang của các mẫu dò để kiểm tra sự hòa tan các hóa chất đông khô, quá
trình làm đầy tuýp PCR, sự toàn vẹn của các mẫu dò và sự ổn định của chất nhuộm huỳnh
quang. Hai quá trình này sẽ làm tăng độ tin cậy của kết quả.

6. Thiết bị và vật tư
6.1. Thiết bị
- Máy GeneXpert
- Máy tính được cài sẵn phần mềm GeneXpert Dx
- Máy quét mã vạch 2D
- Bộ lưu điện
- Đồng hồ bấm giờ
- Máy li tâm tuýp 50ml (cho một số loại bệnh phẩm)
- Tủ an toàn sinh học cấp II (cho xử lý bệnh phẩm cần ly tâm)
- Máy vortex (không bắt buộc)
- Máy in (không bắt buộc)
6.2. Vật tư/vật liệu
6.2.1. Dụng cụ
 - Pi-pét nhựa vô trùng chia vạch
- Thùng rác thải vật liệu sinh học có nắp đậy
- Giấy thấm/khăn
- Giá cắm tuýp
- Găng
- Bô can
6.2.2. Hóa chất, sinh phẩm
- Cartridge
- Dung dịch xử lý SR
- Nước cất tiệt trùng
- Cồn 70%
- Dung dịch sát khuẩn
6.2.3. Mẫu bệnh phẩm
- Bệnh phẩm đờm nhầy mủ, không lẫn quá nhiều máu, không lẫn dị vật (thức ăn,
mảnh thuốc lá…), thể tích 1- 4 ml.
- Bệnh phẩm dịch dạ dày, dịch soi phế quản tối thiểu 5 ml.
- Bệnh phẩm dịch não tủy tối thiểu 1 ml.

7. Kiểm tra chất lượng

- Có thiết bị cung cấp điện dự phòng như UPS. Đảm bảo mỗi mẻ chạy hoàn thiện và
không bị hỏng do bị gián đoạn về điện.
- Nhiệt độ phòng ổn định và không quá 30oC khi máy GeneXpert vận hành.
- Đảm bảo điều kiện bảo quản sinh phẩm Xpert MTB/RIF từ 2-28oC, nơi khô ráo.
- Bệnh phẩm đạt yêu cầu về chất lượng, thể tích, đựng trong tuýp falcon 50ml với
đầy đủ và chính xác thông tin người bệnh. Tuýp đựng bệnh phẩm không bị rò rỉ
hay nứt vỡ.
- Tham gia và có kết quả đạt các vòng ngoại kiểm
- Trả kết quả hoặc có phương án báo kết quả cho PXN chuyển gửi chính xác trong
vòng 24- 48 giờ tính từ khi nhận mẫu tùy theo công suất thực tế. 4 mẫu/module
hoạt động/ngày trả sau 24h. Trên 4 mẫu/module hoạt động/ngày trả sau 48h.
- Đảm bảo máy tính không bị nhiễm virus, không cài đặt các phần mềm khác gây ra
xung đột
 o Không được sử dụng máy tính cho các mục đích khác
o Phải có tài khoản (ID) trên máy
o Không điều chỉnh các cài đặt
o Không kết nối mạng
o Không sử dụng USB đã qua sử dụng
- Lưu ý: chứng đã được nhà sản xuất đưa vào sẵn trong từng cartridge. Lỗi xảy ra
bất kỳ trong quá trình chạy đều được cảnh báo “invalid” hoặc “error” như mô tả
ở mục 11.1.

8. An toàn
- Bảo hộ cá nhân thích hợp theo qui định
- An toàn về thao tác kĩ thuật tránh lây nhiễm và nhiễm chéo: thao tác nhẹ nhàng khi
mở hoặc đậy nắp tuýp bệnh phẩm, mỗi thời điểm chỉ mở nắp một bệnh phẩm
- Phải thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II (với bệnh phẩm dịch cần ly tâm) hoặc
tại khu vực xét nghiệm có quạt hút trao đổi không khí 6 lần/ giờ.
- An toàn về hóa chất: Xpert MTB/RIF catridge chứa chất gây cháy, gây ăn mòn da,
và có độc tính nếu nuốt phải
- An toàn về điện.

9. Nội dung thực hiện

9.1. Chuẩn bị
- Trước khi xử lý mẫu, cần kiểm tra: Nếu có hiện tượng rò rỉ do đậy nắp chưa chặt,
vặn chặt nắp và lau sạch phía ngoài tuýp bằng dung dịch sát khuẩn (lưu ý không
lau mất thông tin ghi trên thân tuýp)
- Ghi số xét nghiệm, vào sổ/ máy tính
9.2. Các bước thực hiện
9.2.1. Xử lý mẫu bệnh phẩm
9.2.1.1. Bệnh phẩm đờm
1. Bổ sung SR (dung dịch đi kèm kít) với tỉ lệ theo thể tích 1 đờm: 2 SR
2. Lắc đều 10-20 lần hoặc vortex ít nhất 10 giây
3. Để đứng 5 phút
4. Lắc/ vortex lần 2
5. Để đứng 10 phút
9.2.1.2. Cặn đã qua xử lý (khử nhiễm/ly tâm)
1. Bổ sung SR với tỉ lệ theo thể tích 1 cặn: 3 SR
2. Thực hiện tiếp từ bước 2 →5 như mục 9.2.1.1
9.2.1.3. Bệnh phẩm dịch dạ dày, dịch phế quản
1. Bổ sung một ít bột NALC (50-100 mg bột cho 50 ml dịch) nếu bệnh phẩm nhầy
nhớt
2. Thêm dung dịch nước cất đến vạch 40 ml
3. Li tâm 3000 xg trong 15 phút
4. Chắt bỏ hết nước nổi, giữ lại khoảng 0.5 ml cặn
5. Bổ sung SR với tỉ lệ theo thể tích 1 cặn: 3 SR
6. Thực hiện tiếp từ bước 2 →5 như mục 9.2.1.1
9.2.1.4. Bệnh phẩm dịch não tủy
- Thể tích trên 5 ml: Xử lý như mục 9.2.1.3
- Thể tích 1-5 ml:
1. Bổ sung SR với tỉ lệ theo thể tích 1 dịch: 1 SR
2. Thực hiện tiếp từ bước 2 →5 như mục 9.2.1.1
- Thể tích 0,1 -1 ml:
1. Thêm dung dịch xử lý vào tuýp đựng bệnh phẩm đến 2ml
2. Thực hiện tiếp từ bước 2 →5 như mục 9.2.1.1
Chú ý:
- Bảo quản bệnh phẩm trước và sau xử lý với dung dịch SR
 Đờm hoặc cặn sau xử lý (khử tạp/ly tâm) có thể bảo quản tối đa 10 ngày ở 2-8ºC.
Tại nhiệt độ phòng (tối đa 35ºC), bảo quản tối đa 3 ngày.
 Bệnh phẩm đã xử lý với SR giữ ở 2-8oC tối đa 12 giờ, tại nhiệt độ phòng tối đa 5
giờ.
 Cartridge đã tra mẫu giữ được tại nhiệt độ phòng tối đa 4 giờ. Không giữ
cartridge đã tra mẫu trong tủ lạnh.
9.2.2. Cho mẫu vào cartridge
1. Mở gói cartridge Xpert MTB/RIF sau khi xử lý mẫu
2. Ghi số xét nghiệm bên cạnh cartridge. Không viết lên phần mã code.
3. Mở nắp cartridge, cho ≥ 2ml huyền dịch mẫu vào cartridge, đóng chặt nắp
 4. Đưa cartridge về khu vực đặt máy GeneXpert
Chú ý:
- Không thả hết dung dịch trong pipét tránh tạo bọt gây lỗi
- Không chạm vào phía sau của cartridge, phần ống PCR
- Không dùng cartridge đã qua sử dụng
- Đảm bảo thời gian xử lý mẫu tối thiểu 15 phút. Nếu mẫu chưa tan hoàn toàn sau 15
phút, lắc đều để thêm thời gian.
- Không được sử dụng SR thừa trong lọ cho mẫu khác tránh nhiễm chéo
9.2.3. Cho mẫu vào máy GeneXpert
1. Bật công tắc máy GeneXpert (ở phía sau của máy)
2. Bật máy tính
3. Đăng nhập, nhập mật khẩu
4. Kích đúp vào biểu tượng GeneXpert trên màn hình “Desktop”
5. Truy cập vào phần mềm bằng tên và mật khẩu
6. Khi máy thông báo bạn có muốn “Perform Database Management Tasks” như lưu
trữ hay kiểm tra dữ liệu, chọn “Yes” (có) hoặc “No” (không).
 Nếu chọn “Yes” (có), xem mục ở phần Bảo trì/Lưu trữ dữ liệu
 Nếu chọn “No” (không), vào màn hình chính, máy sẽ báo lại khi đóng phần mềm.
 7. Chọn “Create Test” trên thanh công cụ chính
8. Hộp thoại “Please scan Cartridge barcode”
(Quét mã ID của cartridge) sẽ hiện ra. Khi
quét mã trên cartridge, điều chỉnh dấu “+”
vào giữa khu vực mã và giữ máy quét cho
đến khi nghe thấy tiếng bíp. Có thể chọn
“Manual entry” và nhập mã bằng cách đánh
mã ID vào máy (dãy số một bên barcode,
nhập từ dưới lên và dãy ngoài vào trong). Hình 9.1. Mã code
Sau đó chọn OK. trên cartridge

9. Phần mềm sẽ tự động cập nhật các mục “Reagent lot ID”, “Cartridge
SN”, “Expiration date”, “Select Assay”, “Assay veSRion number”, “Test
Type” và “Sample type”.
10. Chọn “Start Test”
11. Hộp thoại yêu cầu nhập mật khẩu xuất hiện,
nhập lại mật khẩu và ấn “Enter”
12. Đèn sẽ nháy xanh một module trống của máy.
Mở cửa đang nháy đèn và đặt cartridge vào
khoang module.
13. Đóng chặt cửa, nghe tiếng “cạch” là được.
Hình 9.2. Đặt cartridge
14. Sau một vài giây đèn ngừng nháy, phản ứng
vào khoang module
được bắt đầu.
15. Khi kết thúc, ánh sáng xanh sẽ tắt và cửa tự động mở đẩy cartridge ra
ngoài.
16. Lấy cartridge ra và bỏ vào thùng chất thải vật liệu sinh học nguy hiểm.

16.1.1. Xem kết quả

1. Chọn biểu tượng “View results” trên thanh công cụ chính
2. Chọn “View test” ở thanh công cụ dưới cùng của bảng.
3. Muốn xem kết quả bằng cách kích vào vùng tên bệnh nhân, biểu tượng sẽ được
đánh dấu.
4. Chọn “OK” và màn hình kết quả sẽ xuất hiện. Có các tình huống kết quả như sau:

Hình 9.3. Hiển thị kết quả

 Lưu ý: Hướng dẫn cách xem mã lỗi khi kết quả báo error
Trên cửa sổ hiển thị kết quả, chọn “Errors” để chuyển từ chế độ xem kết quả “Test
result” sang chế độ xem cụ thể mã lỗi.

Hình 9.4. Xem mã lỗi

16.1.2. Xuất kết quả
- Ở màn hình kết quả, chọn “Report” ở cuối thanh công cụ.
- Ở cửa sổ Report, chọn kết quả muốn xem bằng cách tích vào hộp ở bên cạnh
“sample ID” sau đó chọn “OK”.
- Chọn “Preview PDF” Kết quả sẽ định dạng PDF. Chọn “Save a copy”.
- Mở đường dẫn đến thư mục “Result”.
- Chọn “Save”.
- Đóng cửa sổ lại bằng cách chọn “X” ở góc trên cùng tay phải và tiếp tục xem kết
quả của xét nghiệm khác.

Hình 9.5. Báo cáo kết quả

10.Diễn giải và báo cáo kết quả

10.1. Diễn giải kết quả
Bộ kit Xpert MTB/RIF cho hai thông tin: sự có mặt vi khuẩn lao và tính kháng RIF.
10.1.1. Có vi khuẩn lao (MTB detected)
Máy phát hiện được ADN của vi khuẩn lao, nồng độ ADN sẽ hiển thị ở các mức: cao
(high), trung bình (medium), thấp (low) và rất thấp (very low). Tín hiệu của đối chứng
SPC có thể không xuất hiện khi các có các tín hiệu nhân gien của vi khuẩn lao.
- Có vi khuẩn lao và kháng RIF (MTB detected, rifampicin detected): Phát hiện được
 đột biến trên gien rpoB, các giá trị đều nằm trong ngưỡng phát hiện của kỹ thuật.
- Có vi khuẩn lao và không kháng với RIF (MTB detected, rifampicin resistance not
detected): Không phát hiện thấy đột biến trên gien rpoB.
- Có vi khuẩn lao và không xác định tính kháng với RIF (MTB detected, rifampicin
resistance indeterminate): Nồng độ của vi khuẩn lao thấp và không xác định được
tính kháng RIF.
10.1.2. Không có vi khuẩn lao (MTB not detected)
Không phát hiện được ADN của vi khuẩn lao.
10.1.3. Không diễn giải được kết quả
- INVALID: Không xác định được có vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm hay không.
Đối chứng SPC có các giá trị không nằm trong ngưỡng tiêu chuẩn. Nguyên nhân có
thể là có lỗi trong quá trình xử lý mẫu hoặc phản ứng PCR bị ức chế. Lặp lại xét
nghiệm.
- ERROR: Kết quả báo lỗi ERROR khi bước kiểm tra các mẫu dò không đạt và xét
nghiệm bị dừng vì các điều kiện cho phản ứng không đạt như: việc hòa tan các hóa
chất đông khô trong cartridge không đạt, mẫu chưa được hòa tan hoàn toàn gây tăng
áp lực trong quá trình hút mẫu, lỗi module của máy…Lặp lại xét nghiệm.
- NO RESULT: Phần mềm không thu thập đủ dữ liệu để xử lý. Tình trạng này xảy ra
khi phần mềm bị mất kết nối với máy GeneXpert bị dừng khi đang trong thời gian
chạy. Lặp lại xét nghiệm.
10.2. Báo cáo kết quả

Máy báo trên ô “Test Result” Trả kết quả trên phiếu xét nghiệm
MTB not detected Đánh “X” vào cột “Âm tính”

MTB detected, RIF resistance Đánh “X” vào cột “Có MTB & kháng
detected RMP”
MTB detected, RIF resistance not Đánh “X” vào cột “Có MTB & không
detected kháng RMP”

MTB detected, RIF indeterminate Đánh “X” vào cột “Có MTB & không xác
định kháng RMP”
Error/ Invalid/ No result Ghi cụ thể mã lỗi vào cột “Lỗi”

11.Lưu ý (cảnh báo)

11.1. Các lỗi thường gặp và cách xử lý
 Mô tả Nguyên nhân Xử lý
5006/ 5007/ 5008: - Mẫu quá nhầy mủ Tăng thời gian xử lý, cho hỗn
Lỗi PCC và xét - Thể tích mẫu cho hợp vào cartridge đúng thể
nghiệm dừng trước vào cartridge không tích (2-4ml). Lặp lại xét
khi có phản ứng đúng nghiệm, sử dụng cartridge
khuếch đại - Có vấn đề khi làm khác
đầy tuýp PCR (có
bóng khí)
- Probe bị hỏng
5011: Mất tín hiệu Sai áp lực tuýp PCR Lặp lại xét nghiệm, sử dụng
trên đường cong do tuýp không chặt cartridge khác
khuếch đại hoặc van của
cartridge hoạt động
bị lỗi
2008: Áp lực hút Mẫu quá nhầy mủ Tăng thời gian xử lý và lặp lại
mẫu vượt quá áp xét nghiệm, sử dụng cartridge
lực tối đa cho phép khác
2127: Mất kết nối Có vấn đề về nguồn - Tháo và cắm lại dây kết nối
giữa phần mềm với điện (nguồn chính (Ethernet cable) giữa máy
module hoặc UPS) tính và máy GeneXpert
- Tháo và cắm lại dây kết nối
giữa bảng mạch chủ (gateway
board) và máy GeneXpert
- Kiểm tra UPS
- Lặp lại xét nghiệm, sử dụng
cartridge khác.
2037: kiểm tra sự Áp lực bên trong Lặp lại xét nghiệm, sử dụng
đồng nhất của cartridge từ giai cartridge khác.
cartridge đoạn đầu của xét
nghiệm không phù
hợp do cartridge
không kín
2014/3074/3075/10 - Do nhiệt độ cao Lặp lại xét nghiệm, sử dụng
01/1002: Lỗi nhiệt trong module cartridge khác. Nếu lỗi xảy ra
độ hoặc bộ phận gia - Lỗi bộ phận gia liên tục (≥ 3 lần) trên cùng
nhiệt nhiệt module, cần kiểm tra nhiệt độ
- Hỏng quạt các module
- Màng lọc quá (Maintenance\Module
Reporters), kiểm tra quạt gió
 Mô tả Nguyên nhân Xử lý
nhiều bụi và màng lọc. Module hỏng bộ
phận gia nhiệt cần được thay
thế.
Invalid: SPC lỗi Phản ứng PCR bị ức Cần kiểm tra kỹ bệnh phẩm
chế do dị vật (thức trước khi xử lý. Với các bệnh
ăn, máu…) trong phẩm đã xử lý, tránh hút cặn
mẫu thức ăn ở đáy tuýp cho vào
cartridge. Lặp lại xét nghiệm,
sử dụng cartridge khác.
No result: Xét - “Treo” máy tính Kiểm tra nguồn điện, khởi
nghiệm không hoàn - Mất điện động lại máy tính và lặp lại
thành, dữ liệu - Sử dụng chức xét nghiệm với cartridge khác
không phù hợp năng “Stop test”

Liên hệ với đầu mối Hỗ trợ kỹ thuật khi có bất cứ sự cố nào liên quan cần được hỗ
trợ.
11.2. Trích xuất báo cáo khi có sự cố
Khi có sự cố về máy GeneXpert cần được hỗ trợ về kỹ thuật từ xa, cần cung cấp các
tài liệu sau:
- Chứng nhận cài đặt (Installation Qualification): Trên phần mềm máy GeneXpert, vào
“Report”, chọn “Installation Qualification”.
- Nhật ký máy (System log): Trên phần mềm máy GeneXpert, vào “Report”, chọn
“System log”.
- Sao lưu các kết quả kết quả (Archive test) trong vòng 1-3 tháng tùy lượng xét nghiệm
trong tháng.

12.Lưu trữ hồ sơ
- Sổ giao nhận mẫu
- Sổ xét nghiệm Mycobacteria tuberculosis định danh và kháng RMP Xpert
- Nhật ký sử dụng thiết bị liên quan

13.Tài liệu liên quan

STT Tên tài liệu Ghi chú
 1 Quy trình xét nghiệm MTB định danh và kháng RMP Phụ lục
Xpert
2 Các lỗi, sự cố thường gặp và cách xử lý xét nghiệm Phụ lục
MTB định danh và kháng RMP Xpert

14.Tài liệu tham khảo

1. Cepheid. Xpert MTB-RIF. CGXMTB/RIF-50. Package insert. 301-0976 Rev.B,
May 2012.
2. Cepheid. GeneXpert DX System, Operation Manual, software version 4.8, 2016
3. Cepheid. Xpert MTB/RIF, two hours detection of MTB and reisistance to
rifampicin, 2009.
4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from
occupationally acquired infections: approved guideline, 2005.
5. FIND, Cepheid. XpertTMMTB evaluation studay: Evaluation of the FIND/Cepheid
XpertTMMTB assay for the detection of the pulmonary TB in sputum of symptomatic
adults. Protocol version 3.0, 2008.
http://www.stoptb.org/wg/gli/documents.asp?xpand=2
6. Quyết định về việc ban hành hướng dẫn Quy trình triển khai kỹ thuật GeneXpert.
Số 4921/QĐ-BYT 26/12/2011.
7. Stop TB Partnership. GLI training package available in link:
http://www.stoptb.org/wg/gli/TrainingPackage_Xpert_MTB_RIF.asp
8. World Health Organization. Xpert MTB/RIF manual implementation: Technical
and operational “how-to”: practical consideration. 2014.
9. World Health Organization. Anti-tuberculosis resistance in the world: fourth
global report, 2008.
10. World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification
technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin
resistance: Xpert MTB/RIF system, policy statement, 2011.
11. World Health Organization. Prerequisites to country implementation of Xpert
MTB/RIF and key action points at country level. Checklist. 2011.
12. World Health Organization. Rapid implementation of the Xpert MTB/RIF
diagnostic test, technical and operational “How-to” practical considerations, 2011.
13. 510(k) Substantial equivalence determination decision summary.
https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/k143302.pdf
14. Stop TB Partnership. GLI Standard Operating Procedure. Specimen processing of
CSF, lymph nodes and other tissues for Xpert MTB/RIF.