2008 - ÁP DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRONG PHÁT HIỆN BẤT

THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC THỂ TẠI LABO BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG
Thứ 5, 27-01-2011

Đinh Thị Hồng Nhung, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Hoàng Thị Thanh Mộc, Nguyễn Thị
Phương Mai, Nguyễn Thị Mai Hương, Lý Thị Thanh Hà, Trần Thị Nga, Nguyễn Thanh
Liêm
Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Bất thường nhiễm sắc thể (NST) chiếm một vị trí quan trọng trong nguyên nhân của các bệnh di
truyền 30% (1). Bất thường NST bao gồm hai dạng chính là bất thường về cấu trúc và số
lượng. Mục tiêu: Áp dụng kỹ thuật FISH phát hiện bất thường cấu trúc NST trên 3 trường hợp
nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST trên công thức NST. Đối tượng và phương pháp : 03
bệnh nhân nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST trên công thức NST, được áp dụng kỹ thuật
FISH để xác định bất thường cấu trúc NST. Kết qủa: Phát hiện 1 ca mất đoạn 15q11-q13 trong
hội chứng (HC) PraderWilli, 1 ca mất đoạn Xq11-pter trong HC Turner, 1 ca mất đoạn 22qter
trong HC Trisomy 22. Kết luận: Áp dụng kỹ thuật FISH để xác định 3 trường hợp nghi ngờ có
bất thường cấu trúc NST trên công thức nhiễm sắc thể.

Từ khoá: FISH, Nhiễm sắc thể, bất thường cấu trúc NST.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ:

Tại Bệnh Viện Nhi TW trong 8 năm (1997-2004) có 3055 bệnh nhân mắc bệnh di truyền,
chiếm 1,6% tổng số bệnh nhân toàn viện (2). Trong đó bất thường nhiễm sắc thể (NST) chiếm
khoảng 30% (1). Bất thường của bộ NST bao gồm các bất thường về cấu trúc và số lượng. Trong
đó, bất thường về cấu trúc NST là những bất thường rất đa dạng, bao gồm mất đoạn, chuyển
đoạn, thêm đoạn. Đặc biệt, với những mất đoạn nhỏ, hoặc mất đoạn và chuyển đoạn phức tạp,
việc đánh giá các bất thường này ở mức độ karyotype là tương đối hạn chế. Kỹ thuật FISH là
một kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng những đầu dò đặc
hiệu được đánh dấu huỳnh quang cho từng vùng NST nghi ngờ có bất thường cấu trúc, và các tín
hiệu này được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang. Có hai dạng FISH là Interphase FISH và
Metaphase FISH.

- Iterphase FISH: Đựoc sử dụng để phát hiện nhanh các bất thường NST không qua nuôi
cấy. Cặp mồi được gắn trực tiếp vào nhân tế bào ở kỳ đầu của quá trình phân bào, do đó
interphase FISH không cho phép quan sát hình dạng của NST, và thường được sử dụng để phát
hiện các bất thường số lượng NST ở tế bào bào thai trong chẩn đoán trước sinh do ưu thế về thời
gian, sau 24-48h.

- Metaphase FISH: Cặp mồi được gắn vào các NST ở kỳ giữa, khi hình thái các NST được
nhận biết rõ ràng nhất. Metaphase FISH thường đựoc dùng để khẳng định các bất thường về số
lượng và cấu trúc NST khi nghi ngờ có bất thường NST trên công thức nhiễm sắc thể. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Metaphase FISH cho những bệnh nhân đã có nghi ngờ bất
thường NST trên karyotype.

Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu:

Áp dụng kỹ FISH nhằm phát hiện nghi ngờ bất thường cấu trúc nhiễm sẵc trên công thức
nhiễm sắc thể.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng và bệnh phẩm:

3 bệnh nhân có chỉ định làm công thức NST từ tế bào máu ngoại vi. Tế bào máu ngoại vi
được nuôi cấy trong môi trường RPMI (Gibco) với sự có mặt của PHA (Sigma) nhằm kích thích
sự phát triển của tế bào lympho T. Sau 72h nuôi cấy, tế bào sẽ được thu hoạch, tạo tiêu bản. NST
được nhuộm băng bằng Giemsa (Merk) và được phân tích dưới kính hiển vi.

Phân tích NST của 3 bệnh nhân này chúng tôi nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST.Chúng
tôi tiến hành kỹ thuật FISH nhằm xác định bất thường này. Cặn tế bào thu hoạch được sau khi
nuôi cấy NST được sử dụng để làm metaphase FISH.

2. Kỹ thuật FISH:

Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật được sử dụng để xác định sự có mặt của một NST hoặc một
vùng NST nào đó thông qua việc gắn một cặp mồi DNA đã được đánh dấu huỳnh quang vào
NST hoặc vùng NST cần được xác định.

- Tạo tiêu bản: Cặn tế bào đã qua nuôi cấy được phun trên lam kính sạch (BDH), để khô
trên hotplate (Thermo) 56ºC. Tiêu bản được kiểm tra trên kính hiển vi soi ngược (Leica) để đánh
giá mật độ tế bào trên vùng tiêu bản sẽ được tiếp xúc vơí đầu dò đặc hiệu. Số lượng yêu cầu
khoảng 10-15 tế bào/vi trường, hoặc 1-2 cụm nhiễm sắc thể/vi trường.

- Lai đầu dò đặc hiệu: Chúng tôi sử dụng 03 loại đầu dò khác nhau trong nghiên cứu tuỳ
vào từng trường hợp.

· Đầu dò RP11-540E20 (Italian) đánh dấu ở nhánh ngắn NST X đoạn Xp21.2 và đầu
dò RP11-114E9 (Italian) đánh dấu ở nhánh dài NST X đoạn Xq21 trong bất thường NST X.

· Đầu dò SNRPN đánh dấu ở nhánh dài NST 15 đoạn 15q11 và đầu dò PML đánh dấu
ở nhánh dài NST 15 đoạn 15q24 (Kreatech) trong HC Prader Willi.

· Đầu dò TUPLE đánh dấu ở nhánh dài NST 22 đoạn 22q11 và đầu dò ST đánh dấu ở
tận cùng NST 22 đoạn 22qter trong HC Trisomy 22.

Nhỏ 10µl đầu dò vào mỗi vùng tiêu bản tương ứng được đánh dấu, đậy lamme kích thước
18x18mm (BDH) lên trên vùng tiêu bản vừa tiếp xúc với đầu dò. Tiêu bản được biến tính ở 75ºC
trong 5 phút, và đựoc giữ ở 37ºC qua đêm.

- Rửa tiêu bản: Tiêu bản sau khi được lai với probe đặc hiệu, được rửa qua dung dich
SSC2X (Sigma) và SSC2X/0.3%NP40 (MP) ở 76ºC. Vùng lai probe được phủ bằng DAPI
(Sigma), cuối cùng được phủ bằng lamme 22x22mm (BDH).

- Phân tích dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang với phần mềm ISIS (Metasystem).
Tiêu chuẩn phát hiện dựa vào các tín hiệu của đầu dò:
 · Với đầu dò RP11-540E20, thể hiện 1 cặp tín hiệu đỏ ở nhánh dài và 1 cặp tín hiệu đỏ
ở nhánh ngắn NST X. Nếu không có bất thường NST, sẽ thể hiện 2 cặp tín hiệu đỏ. Nếu có mất
đoạn nhánh ngắn NST X, chỉ thể hiện 1 cặp tín hiệu của nhánh dài NST X.

· Với đầu dò SNRPN/PML cho NST 15, trong trường hợp không có bất thường NST,
sẽ thể hiện 2 tín hiệu xanh là tín hiệu kiểm chứng cho NST 15 vùng 15q24, và 2 tín hiệu đỏ của
vùng 15q11.2. Trong trường hợp của hội chứng PraderWilli, sẽ thể hiện 2 tín hiệu xanh và chỉ có
1 tín hiệu đỏ do mất đoạn vùng 15q11.2.

· Với đầu dò TUPLE cho NST 22, sẽ có 2 cặp tín hiệu xanh là tín hiệu kiểm chứng cho
NST 22 vùng 22qter, và 2 cặp tín hiệu đỏ là tín hiệu của vùng 22q11. Trong trường hợp không
có bất thường NST 22, sẽ thể hiện 2 cặp tín hiệu xanh và 2 cặp tín hiệu đỏ. Nếu có bất thường số
lượng NST 22 (Trisomy 22), sẽ thể hiện 03 cặp tín hiệu đỏ. Kết hợp nếu có bất thường cấu trúc ở
nhánh dài NST 22 (Mất đoạn tận cùng nhánh dài NST 22), sẽ thể hiện 2 tín hiệu xanh.

III. KẾT QUẢ:

1. Trường hợp 1:

Bệnh nhân: Lê Nhật M, Nam, 4 tuổi, Mã số WB080801, Địa chỉ: TP Lào Cai

Lý do khám bệnh: Béo phì. Tiền sử: Con đầu, sinh đủ tháng, sau đẻ khóc ngay, có biêủ
hiện nhược cơ lúc nhỏ, vận động chân tay yếu. Biết lẫy, bò chậm. Biết đi lúc 3 tuổi. Khám: Thể
trạng béo phì, nặng 23kg. Tầm vóc nhỏ. Chậm phát triển tinh thần, vận động so với trẻ cùng tuổi,
Ẩn tinh hoàn trái. Chẩn đoán: Theo dõi HC Prader Willi.

Xét nghiệm di truyền: Kết quả công thức NST từ tế bào máu ngoại vi: Nghi ngờ có mất
đoạn nhánh dài NST 15 trong hội chứng Prader Willi. Tiến hành kỹ thuật FISH với đầu dò đặc
hiệu cho đoạn 15q11.

Kết quả: Mất đoạn 15q11 trên một NST 15. Kết luận: Bệnh nhân có mất đoạn 15q11 gặp
trong hội chứng Prader Willi.
2. Trường hợp 2:

Bệnh nhân: Nguyễn Duy M, Nam 3 tuôi, Mã số WB080767, Địa chỉ: Hà nội.

Lý do khám bệnh: Bộ mặt bất thường. Tiền sử: Con thứ 2, con gái thứ nhất bình thường.
Đẻ dủ tháng. Khám: Trẻ có bộ mặt bất thường. Có hai vạt da thừa của hai tai. Tầm vóc nhỏ, cân
nặng 11kg, cao 85cm. Chưa nói rõ, chỉ nói được từng từ, chưa nói được thành câu. Chưa tự đi,
đứng vịn. Dương vật nhỏ, không thấy tinh hoàn bên phải. Chẩn đoán: Bộ mặt bất thường.

Xét nghiệm di truyền: Kết quả công thức NST từ máu ngoại vi: 47 NST và nghi ngờ có 03
NST số 22, trong đó có 01 NST số 22 nghi ngờ có mất đoạn ở nhánh dài. Tiến hành kỹ thuật
FISH với đầu dò đặc hiệu cho NST 22 đoạn 22qter.

Kết quả: Có 03 tín hiệu của NST 22, trong đó 02 NST 22 bình thường và 01 NST 22 có
mất đoạn tận cùng nhánh dài (qter).
3. Trường hợp 3:

Bệnh nhân: Nguyễn Thị T, Nữ 15 tuổi, Mã số WB080728. Địa chỉ: Thanh Hóa.

Lý do khám bệnh: Chậm phát triển dậy thì. Tiền sử: Con thứ 2, anh trai đầu khỏe mạnh.
Khám: Thể trạng nhỏ, tầm vóc thấp. Cân nặng 28kg, chiều cao. Chưa phát triển đặc tính sinh dục
phụ. Chưa có kinh nguyệt. Chẩn đoán: Theo dõi HC Turner.

Xét nghiệm di truyền: Kết quả công thức NST từ máu ngoại vi: Có 46 NST, trong đó chỉ
có 1 NST giới X, và 1 NST chưa xác định rõ nguồn gốc, nghi ngờ là một đoạn NST X đứt gãy.
Thực hiện kỹ thuật FISH với đầu dò cho nhánh ngắn NST X (Xp21.2) và nhánh dài NST X
(Xq21.1).

Kết quả: Có 2 cặp tín hiệu của nhánh dài của NST X, và chỉ có 1 cặp tín hiệu ở nhánh ngắn
của NST X. Kết luận: Mất đoạn nhánh ngắn NST X đoạn từ tâm đến tận cùng nhánh ngắn NST
X (Xpter).
IV. BÀN LUẬN:

Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật lai giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện các bất thường NST. Các đầu dò đặc hiệu được sử dụng cho
từng bất thường được nghi ngờ trên công thức NST hoặc cho các dạng bất thường cấu trúc NST
không phát hiện được ở mức độ di truyền tế bào.

Hội chứng Prader Willi là một trong các bệnh di truyền hiếm gặp. Tỷ lệ mắc là 1/12000 trẻ
đẻ sống (5). Do mất đoạn nhỏ ở nhánh dài NST 15 đoạn 15q11-q13. Với các dấu hiệu lâm sàng:
Nhược cơ, chậm phát triển vận động, béo phì, tầm vóc nhỏ, chậm phát triển dậy thì, chậm phát
triển trí tuệ. Xét nghiệm di truyền được sử dụng để chẩn đoán xác định hội chứng này, trong đó
tỷ lệ phát hiện bệnh của kỹ thuật FISH là 95%. Chúng tôi phát hiện một trường hợp mắc hội
chứng Prader Willi bằng kỹ thuật FISH. Kết quả này khẳng định nghi ngờ bất thường trên công
thức NST và hoàn toàn phù hợp với các dấu hiệu lâm sàng của bệnh nhân.

Hội chứng Trisomy 22 là một hội chứng bất thường số lượng NST hiếm gặp, có tên gọi là
Hội chứng Cat Eye. Tỷ lệ 1/74,000 trẻ đẻ sống (8). Trong HC này, trẻ có bộ mặt bất thường với
đặc điểm bất thường của mắt, vạt da thừa ở tai, có thể có các dị tật vùng hậu môn trực tràng,
hoặc các dị tật khác của tim. Trong nghiên cứu của chúng tôi, trên công thức NST, bệnh nhi nghi
ngờ có trisomy 22. Kỹ thuật FISH khẳng định ngoài 2 NST 22 bình thường, có 1 NST 22 nghi
ngờ mất đoạn vùng qter. Đây là một trường hợp rất hiếm gặp, có triệu chứng lâm sàng phù hợp
với những đặc điểm mô tả trong hội chứng Cat Eye.

Hội chứng Turner là một trong các hội chứng di truyền có bất thường về NST giới, do chỉ
có một NST X, công thức NST 45,XO. Với các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là chậm phát triển
dậy thì ở trẻ nữ. Trường hợp bệnh nhi trong nghiên cứu của chúng tôi có 46 NST, trong đó chỉ có
1 NST X và một NST chưa xác định rõ nguồn gốc, nghi ngờ là một đoạn đứt gãy của NST X.
Bệnh nhân cũng được làm xét nghiệm TDF để tìm yếu tố biệt hóa tinh hoàn trên NST Y, nhằm
loại trừ đoạn NST đó có nguồn gốc từ NST Y. Kết quả TDF (-). Chúng tôi tiến hành kỹ thuật
FISH cho phép đánh dấu cùng một lúc riêng biệt nhánh dài và nhánh ngắn của NST X để phát
hiện bất thường của NST này. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng, bệnh nhân có mất đoạn hoàn
toàn nhánh ngắn của NST X. Đây là thể đặc biệt do bất thường cấu trúc NST X trong hội chứng
Turner.

VI. KẾT LUẬN:

Triển khai thành công kỹ thuật FISH trong phát hiện bất thường cấu trúc NST, là một bước
tiến quan trọng trong chẩn đoán xác định các bất thường cấu trúc NST, đặc biệt với những bất
thường không phát hiện được ở mức độ NST thông thường. góp phần chẩn đoán, tiên lượng và tư
vấn đối với các bệnh lý di truyền có liên quan đến bất thường NST.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hoàng Thị Thanh Mộc, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Trần Thị Nga,
Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm. 2006. Phát hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể
trên bệnh nhi mắc bệnh di truyền tại bệnh viện Nhi trung ương. Tạp chí nghiên cứu y học (phụ
trương). 44(4): 14-19.
2. Ngô Diễm Ngọc, Hoàng Thị Thanh Mộc, Nguyễn Thị Phương Mai, Trần Thị Nga, Vũ
Chí Dũng, Nguyễn Thanh Liêm. 2007. Bất thường cấu trúc và số lượng Nhiễm sắc thể trên
bệnh nhi mắc bệnh di truyền được phát hiện tại bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí nghiên cứu y
học.
3. Feldman B. et al (2000) Routine prenatal diagnosis of aneuploidy by FISH studies in high
risk pregnacies. American Journal of Medical Genetics, 90:233– 238.
4. Roland A, Ventura, Jose I.Martin, Margaret Jones et al (2006) FISH analysis for the
deletion of Lymphoma associated chromosomal abnornalities. Journal of Molecular Diagnosis.
Vol 8, No 2.
5. Toth-Fejel. S, Olson. S, Gunter.K et al (1996) Prader Willi syndrome resulting from
chromosome translocation. Am. J. Hum. Genet. 58, 1008-1016.
6. Tekin. M, Jack-Cook.C, Buller. A (2000). Fluorescence in situ hybridization detectable
mosaicism for PraderWilli syndrome. Am. J. Hum. Genet. 95. 145-149.
7. Trask, B. J. (2002). Human cytogetics: 46 chromosomes, 46 years and counting. Nature Rev
Genet. 3. 769-778.
8. Mary Kugler. R.N et al (2007). Cat Eye syndrome: Cause by Genetic defect in chromosome
22. Med Rev.