ĐỊNH LƯỢNG ADN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG

Nguyên tắc chung:

 Dựa vào sự hấp thụ mạnh của base purin và pyrimidin trong vùng ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
260nm (do tương tác giữa photon và electron của vòng purin+pyrimidin của base nitơ).
 Tính tỉ lệ OD260/OD280 giúp ước lượng độ tinh khiết của dung dịch acid nucleic.
 Polysaccharide hấp thu cực đại tại bước sóng 230nm  đối với ADN thực vật cần xác định thêm tỉ
lệ OD260/OD230

Cắn ADN có thể gồm những thành phần gì?

ADN, Protein tạp (đỉnh hấp thu 280nm), ARN tạp, Phenol (đỉnh hấp thu 270nm), Polysaccharide (đối với
TB thực vật, đỉnh hấp thu 230nm). Tạp gây sai số khi định lượng.

Ý nghĩa của tỉ lệ OD260/OD280? Tỉ lệ OD260/OD230?

Tỉ lệ OD260/OD280 giúp ước lượng độ tinh khiết của dung dịch acid nucleic.

 1,8 – 2 : dung dịch acid nucleic được xem là sạch.

 <1,8 : nhiễm protein (nồng độ protein cao) hay phenol  xử lý bằng PCI (phenol : chloroform :
isopropanol =25:24:1).
 >2 : dung dịch acid nucleic bị nhiễm ARN, xử lý bằng enzym phân hủy RNAse.
 =2 : mẫu ARN tinh sạch

Tỉ lệ OD260/OD230 xác định độ tinh khiết đối với ADN thực vật (vì có thể bị nhiễm
polysaccharide), <1,6 khi mẫu lẫn tạp polysaccharide.

Mỗi đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ:

 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi

 40 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đơn
 30 μg/ml oligonucleotide sợi đơn (tới 70 base)

Không dùng cuvet thủy tinh để định lượng ADN bằng pp đo quang do?

Cuvet hấp thu ánh sáng ở vùng tử ngoại  Sử dụng cóng đong = thạch anh

Đặc điểm của phương pháp đo quang: biết kích thước, cấu dạng ADN, độ chính xác ko cao, ko loại đc ảnh
hưởng của tạp chất.

Nguyễn Thanh Huy - D21

 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

Nguyên tắc chung

 Điện di: kỹ thuật sử dụng điện trường để phân tách hỗn hợp ADN, ARN hoặc protein trên 1 giá
thể có cấu trúc 3 chiều dựa trên các đđvl (m, điện tích âm).
 ADN và ARN tích điện âm không đổi nhờ khung phosphat, khi được đặt trong dòng điện một
chiều sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương.
 Các phân tử acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy cellulose acetate,
gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide.
 Nếu ADN được đặt vào một mạng lưới gel (như gel agarose), tốc độ di chuyển về cực dương của
ADN sẽ phụ thuộc vào kích thước và cấu dạng của đoạn ADN đó.
 Các đoạn ADN kích thước và cấu dạng khác nhau sẽ được phân tách ra khỏi nhau sau một thời
gian di chuyển.
 Để phát hiện ADN, người ta dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang dưới tia UV là EtBr hoặc
Safeview™.
 Cần lựa chọn thông số: nồng độ gel agarose, hiệu điện thế, thời gian chạy… thích hợp để phân
tách các đoạn ADN một cách hiệu quả.

Safe view là gì ? Là chất nhuộm huỳnh quang:

 Gắn với ADN hay ARN và hấp thu ánh sáng UV ở bước sóng 290 – 320nm
 Phát huỳnh quang xanh ở bước sóng 515nm  xác định vị trí băng ADN trên gel agarose hay
polyacrylamide.
 Các thuốc nhuộm này chèn vào chuỗi ADN một cách không thuận nghịch, do đó cần lưu ý cẩn
thận khi thao tác vì dễ gây ung thư (phải đeo bao tay).

Đệm tải (LB):

 Chứa glycerol  tăng tỷ trọng giúp ADN lọt vào giếng (nạp mẫu) dễ dàng.
 Có bromophenol blue (chất màu) để đánh dấu (nhuộm) đỉnh di chuyển của ADN trong quá trình
điện di.
 Giúp ADN bền hơn.
 Đệm tải thường dùng là đệm 6X hoặc 10X.

Thang chuẩn ADN 1 Kb :

 Là hỗn hợp các đoạn ADN đã biết kích thước.

 Được chạy điện di song song với ADN khảo sát để đối chiếu kích thước ADN.
 So sánh để xác định kích thước tương đối của trình tự ADN.

Nồng độ từ 0,5 – 2% agarose

 Nồng độ cao : mắt lưới nhỏ  di chuyển chậm.

 Nồng độ thấp : mắt lưới lớn  di chuyển nhanh.

Vai trò dung dịch đệm chạy điện di:

 Cung cấp các ion, tạo môi trường dẫn điện.

Nguyễn Thanh Huy - D21

  Ổn định pH, duy trì điện tích âm của acid nucleic.
 Ức chế các nuclease, ngăn cản phân hủy acid nucleic trong quá trình điện di.

Hai loại đệm chạy phổ biến:

 TAE (Tris-acetat-EDTA): phân tích các ADN có kích thước lớn và tinh chế ADN dùng trong tạo
dòng.
 TBE (Tris-borat-EDTA) :
o Thành phần borat có thể ức chế 1 số enzym cắt nối AND.
o Có độ phân giải cao hơn khi phân tích các acid nucleic kích thước <2kb.
o Có khả năng đệm tốt hơn TAE  dùng khi quy tình điện di có time kéo dài.

Tại sao dung bromophenol blue để đánh dấu đỉnh di chuyển của ADN trong quá trình điện di?

Vì vận tốc di chuyển của bromophenol blue tương ứng với vận tốc di chuyển của ADN kích thước khoảng
300bp, và có màu (màu đệm tải).

Tại sao lại gọi là điện di trong gel, nhúng chím theo phương ngang?

Vì ADN được đặt trong gel. Điện di được triển khai theo phương ngang, gel được nhúng chìm trong đệm
chạy.

ADN có màu gì? Trắng, không trong suốt.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả điện di (tốc độ di chuyển của ADN)?

Kích thước/cấu dạng ADN, nhiệt độ, nồng độ gel agarose, nồng độ dung dịch đệm, dung dịch điện di, đệm
tải, hiệu điện thế.

Gel agarose:

 Trơ về mặt lý hóa. Kích thước các lỗ gel phụ thuộc nồng độ agarose  phân tách được các acid
nucleic có kích thước khác nhau.
 Thể tích gel chuẩn bị không nên lớn hơn 1/3 thể tích bình chứa  tránh agarose trào ra ngoài khi
đun chảy.
 Đặt gel vào bể điện di theo chiều các giếng nằm ở cực âm

Môi trường điện di được thiết lập khi: xuất hiện bọt khí ở 2 cực.

Ưu điểm điện di trên gel agarose:

 Có thể thu hồi được ADN sau khi phân tích

 Đơn giản, rẻ tiền
 Phân tích ADN kích thước nhỏ
 Định lượng chính xác nồng độ ADN

Độ phân giải của gel agarose phụ thuộc: nồng độ gel (kích thước ADN quyết định nồng độ)

Sau điện di, cấu dạng di chuyển nhanh nhất: siêu xoắn

Xác định kích thước plasmid căn cứu vào kích thước của cấu dạng: thẳng.

Nguyễn Thanh Huy - D21

So sánh với agarose gel, polyacrylamide gel có các ưu nhược điểm?
Ưu điểm:

 Khả năng phân giải cao: phân biệt đến từng nucleotid.
 Khả năng dung nạp mẫu lớn

Nhược điểm:

 Khoảng kích thước có thể phân tích nhỏ (1 – 500 bp) so với agarose có thể phân tích ADN từ 50
bp đến vài megabase.
 Khó thao tác, chi phí cao hơn.

Nguyễn Thanh Huy - D21