BÀI 4: PHẢN ỨNG PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION


1. Nguyên tắc:
PCR là phản ứng nhân bản 1 đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chương
trình nhiệt.
2. Thành phần phản ứng PCR:
- dNTP (deoxy nucleotide triphosphate): Là đơn vị để có thể tổng hợp được các
bản sao của DNA đích. dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn
một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine (d TTP) hay Cistone (dCTP)
hay Guanine (dGTP), ở carbonse số 1 (C1).
- Enzyme DNA polymerase (Taq): Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các
nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp.
- MgCl₂: Nồng độ có thể dao động từ 0,5-5 mM. Chính ion Mg²⁺ gắn liên kết
dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. Nồng độ MgCl₂
cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl₂ quá thấp sẽ không
tạo sản phẩm PCR.
- Mồi (primer): Là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn
primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
- Nước khử ion: Không chứa ion nào, không chứ DNAase, RNAase, enzyme
cắt giới hạn... Nói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác.
- DNA mẫu (DNA template): là mẫu DNA mà chúng ta sẽ khuếch đại. Có thể
là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu.
DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao, tránh lẫn tạp chất. Phản ứng PCR tối ưu
xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với
đoạn DNA dài tối đa khoảng 1500 bp.
3. Hóa chất và thiết bị
3.1 Hóa chất:
- PCR Master Mix
- Nước khử ion
- Primer
3.2 Thiết bị:
- Máy ly tâm
- Máy PCR
4. Quy trình thực hiện:
4.1) Thực hiện phản ứng:

(2)- Primer A(10uM)

(1) Master Mix 1.25ul
12.5ul - Primer D(10uM)
1.25ul

(3)Nước khử ion 9

(4) DNA mẫu 1 ul
ul

TỔNG: 25 ul
4.2) Cài đặt chu trình luân nhiệt cho máy PCR: