CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG Nguyễn Minh Công

NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT Hoàng Ngọc Huyền

Hà Trọng Nghĩa
PROTEIN
NỘI DUNG
Tổng quan
Các Phương pháp trong nghiên cứu
Các Phương pháp trong sản xuất
TỔNG QUAN
Định nghĩa
Đối tượng nghiên cứu
PROTEIN LÀ GÌ?
Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ
hơn được gọi là các acid amin. Hiện nay
đã phát hiện ra hơn 20 loại acid amin
khác nhau. Mỗi phân tử protein bao
gồm rất nhiều các acid amin, được sắp
xếp theo một trình từ ngẫu nhiên, từ đó
tạo ra hàng trăm hàng nghìn các phân
tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu
hết các protein là các phân tử lớn có thể
chứa hàng tram acid amin được sắp xếp
trong các ngành và các chuỗi (Georgia C.
Luritzen)
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Protein đơn giản
 Albumin
 Collagen
 Keratin

Protein cấu trúc

 Enzyme
 Kháng thể và kháng thể đơn dòng
 Tương đương sinh học
 Vaccine và dược sinh học
 Protein tái tổ hợp

…
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chiết, tách và tinh sạch protein
Định lượng protein tổng số
Phân tích protein (proteomics)
Phát hiện protein đặc hiệu
Phân tích cấu trúc, tính năng và tương tác protein
Giải trình tự protein
Kỹ thuật protein tái tổ hợp (protein engineering)
Tin sinh trong nghiên cứu protein
CHIẾT, TÁCH VÀ TINH SẠCH
PROTEIN
PHÁ TẾ BÀO VÀ CHUẨN BỊ DỊCH
CHIẾT (1)
Kit nghiền mẫu
Sample Grinding Kit (GE)
Ứng dụng: Nghiền mô nhỏ và mẫu tế
bào để chiết protein tổng số
Đặc điểm:
 Gồm: ống chứa chất nghiền (abrasive grinding
resin), que nghiền
 Dùng máy ly tâm loại bỏ resin và xác tế bào
 Thời gian: 10 phút
 Lượng mẫu tối đa lên tới 100 mg
PHÁ TẾ BÀO VÀ CHUẨN BỊ DỊCH
CHIẾT (2)
Đệm chiết protein tế bào động vật có vú
Mammalian Protein Extraction Buffer
(GE)
Ứng dụng: Chiết protein từ tế bào động
vật có vú sử dụng chất hoạt động bề
mặt nhẹ.
Đặc điểm: Buffer là chất hữu cơ không
gây biến tính protein
PHÁ TẾ BÀO VÀ CHUẨN BỊ DỊCH
CHIẾT (3)
Đệm chiết protein tế bào nấm men
Yeast Protein Extraction Buffer (GE)
Ứng dụng: Chiết protein từ tế bào nấm
men.
Đặc điểm:
 Dùng zymolyase ly giải tế bào, chất hoạt động
bề mặt nhẹ không gây biến tính protein
 Gồm: 100 mL Yeast protein extraction buffer;
15 mL Yeast Suspension buffer; 2 × 0.5 mL
Longlife Zymolyase (1500 U/mL)
PHÁ TẾ BÀO VÀ CHUẨN BỊ DỊCH
CHIẾT (4)
Kit tách protein
Illustra triplePrep Kit (GE)
Ứng dụng: Tách và chiết cùng lúc gDNA,
RNA tổng số, protein tổng số từ mô
động vật và tế bào động vật có vú.
Đặc điểm:
 Thời gian nhanh: <1 h, tiết kiệm 70% thời gian
quá trình so với sử dụng các kit chỉ tách được
gDNA hoặc RNA tổng số hoặc protein tổng số
 Tách RNA không lẫn DNA nhờ có Dnase
PHÁ TẾ BÀO VÀ CHUẨN BỊ DỊCH
CHIẾT (5)
Đệm tách protein
2-D Protein Extraction Buffer
Ứng dụng: Chiết protein từ tế bào và
mô sử dụng buffer với nhiều chất hoạt
động bề mặt
Đặc điểm:
 Có 6 loại buffer khác nhau để lựa chọn buffer
tốt nhất cho từng loại mẫu
 Có kit thử
THẨM TÍCH
Kit thẩm tích
Dialysis kit (GE)
Ứng dụng: Thẩm tích với lượng mẫu
nhỏ
Đặc điểm
 Lượng mẫu tối thiểu 10 uL, tối đa 2 mL
 Sử dụng microtube được gắn màng thẩm tích
trên nắp, đáy ống hình nón
 Thời gian: từ 2 giờ đến qua đêm
LY TÂM (1)
Cô đặc protein và tế bào biểu hiện mong muốn bằng lực ly tâm
Tách các protein có trọng lượng phân tử khác nhau
LY TÂM (2)

Phân loại
Theo Theo
Theo tốc độ Theo mẻ
nhiệt độ rotor
Siêu ly Ly tâm
Ly tâm Ly tâm Ly tâm
Ly tâm Ly tâm Siêu ly tâm Ly tâm hiệu Rotor Rotor
tốc độ tốc độ theo
lạnh thường tâm phân liên tục năng góc văng
thường cao mẻ
tích cao
CENTRIFUGE (3) – EPPENDORF
Non-refrigerated Refrigerated
MinSpin / MiniSpin plus
5418 5418 R
5424 5424 R
5427 R
5430 5430 R
5702 5702 R / 5702 RH
5804 5804 R
5810 5810 R
5920 R
Concetrator plus
 CENTRIFUGE (4) – BECKMAN
COULTER (1)
Các dòng máy ly tâm chính của Beckman Coulter
Benchtop Centrifuges High Speed Centrifuges Ultracentrifuges Analytical Centrifuges

Avanti J-15 Avanti J-15 Optima XPN Optima AUC

Avanti J-15R Avanti J-15R Optima XE Proteome Lab
Allegra 64R Avanti JXN-30 Optima MAX-XP …
Allegra 25R Avanti JXN-26 Optima MAX-XL
… … …
CENTRIFUGE (4) – BECKMAN
COULTER (2)
Ly tâm liên tục

CF-32 Ti

JCF-Z
CENTRIFUGE (4) – BECKMAN
COULTER (3)
Siêu ly tâm phân tích
Theo dõi thời gian thực
Phát hiện chất ở nồng độ thấp
Hạn chế tối thiểu lượng đệm cần thiết
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(1)
Định nghĩa Phân loại
Sắc ký: Kỹ thuật phân tách protein dựa Size-exclusive chromatography (SEC)
trên tính chất vật lý khác nhau của
protein Ion exchange chromatography (IEX)

Sắc ký tinh sạch protein nhanh (FPLC): Affinity chromatography (AC)

Kỹ thuật sắc ký dựa trên áp suất nhỏ, Hydrophobic Interaction
tốc độ dòng chảy lớn, với mục đích Chromatography (HIC)
chính là tinh chế protein
Reversed-phase Chromatography (RPC)
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(2)

SEC IEX AC HIC

RPC
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(3)
Sắc ký lọc gel Nguyên lý
Superdex
Superose
Sephacryl
Sephadex
…
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(4)
Sắc ký trao đổi ion Nguyên lý
Anion exchange: Q, DAEA, ANX
Cation exchange: S, SP, CM
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(5)
Sắc ký ái lực Nguyên lý
Tagged proteins: histidine-tagged (his-
tagged), glutathione S-transferase
(GST)-tagged, maltose binding protein
(MBP)-tagged, Strep II-tag tagged.
Antibodies / antibody fragments:
Protein A, Protein G, Protein L
SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(6)
Sắc ký tương tác kỵ nước Nguyên lý
Base matrix
 Sepharose Fast Flow
 Sepharose High Performance
 SOURCE

Ligand
 Phenyl
 Butyl
 Butyl-S
 Octyl
SẮC KÝ TINH SẠCH
PROTEIN NHANH
(7)
• Các tiêu hao sử dụng tinh sạch protein mà
không cần sử dụng máy sắc ký
• Phương pháp sử dụng: MultiTrap plate SpinTrap PD column
• Ly tâm
• Lực trọng trường
• Từ trường

GraviTrap column HiTrap column Magnetic bead

SẮC KÝ TINH SẠCH PROTEIN NHANH
(8)
Tinh sạch tự động

AKTA start AKTA pure AKTA avant

LỌC (1)
Định nghĩa: Là hình thức loại bỏ tạp
chất, cô đặc hay tinh chế chất mong
muốn dựa trên sự khác nhau về kích
thước qua màng lọc
Phân loại:
 Dead-end filtration: Dòng chảy vuông góc với
bề mặt lọc
 Cross-flow filtration: Dòng chảy song song với
bề mặt lọc
LỌC (2)
Lọc tiếp tuyến Nguyên lý
Kích thước lọc:
 Ultrafiltration (3 kDa – 100 kDa)
 Microfiltration (0,2 – 0,65 µm)

Ứng dụng:
 Thu hoạch tế bào
 Làm trong dịch protein (loại bỏ mảnh vỡ tế
bào)
 Phân đoạn sản phẩm protein
 Cô đặc sản phẩm protein
…
LỌC (3)
Các hình thức lọc tiếp tuyến

Hollow fiber
Cassette Ceramic cartridge
cartridge
LỌC (4)

AKTA flux s AKTA flux 6 AKTA crossflow

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ (1)
SpectraMax QuickDrop (MD) BioPhotometer (Eppendorf)
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ (2)
Bradford: Định lượng protein dựa trên sự bám của các phân tử protein với chất
nhuộm Coomassie. Tạo ra sự đổi màu từ nâu (465 nm) thành màu xanh (610 nm).
Kết quả được đọc ở 595 nm
Lowry: Định lượng dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
phosphomalipden – phosphowonlframate (thuốc thử Folin – Ciocalteau) với phức
hợp đồng – protein. Kết quả đọc ở 675 nm
BCA: Cơ chế tương đương phản ứng Lowry, phản ứng giữa protein và thuốc thử
BCA tạo màu đỏ tím. Kết quả đọc ở bước sóng 562 nm
=> Cần các hệ máy đọc đĩa có khả năng đọc được đĩa 96/384 giếng
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ (3)
SpectraMax Plus 384 Microplate
Reader (MD)
Cell viability, proliferation, and cytotoxicity
ELISAs and immunoassays
Endotoxin detection
Enzyme assays
Micro volume applications
Microbial growth
Nucleic acid (DNA) quantitation
Phosphotases/kinases
Protein quantitation
Reporter gene assays
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ (4)
SpectraMax i3x (MD)
Ứng dụng: Đo quang phổ hấp thụ, huỳnh quang, hóa phát quang
Đo nồng độ nucleic, protein, đo mức độ sinh trưởng của vi sinh vật
Đọc ELISA
Đọc Bradford/BCA/Lowry
Western Blot
Hình ảnh tế bào: Cell toxicity, proliferation, and viability…
Fast kinetics: ATP assays, dual luciferase…
Nhận biết tín hiệu AlphaScreen and AlphaLisa, HTRF, TRF, FP
(Fluorescence Polarization)
Sàng lọc quy mô lớn của hợp chất và đích trong nghiên cứu thuốc
PHÂN TÍCH PROTEIN
ĐIỆN DI (1)
Nguyên lý: Dựa trên sự khác biệt về kích
thước và điện tích để phân tách protein
dưới tác dụng của điện trường.
Phân loại:
 Điện di đứng
 Điện di ngang
 Điện di mao quản
ĐIỆN DI (2)
Điện di không biến tính và SDS-PAGE GE Healthcare Life Sciences
Điện di không biến tính: Không sử dụng
hóa chất để phá cấu trúc protein
SDS-PAGE: Nhuộm điện tích âm cho
protein với tỉ lệ 1.4g SDS/1g protein, SE 250 / SE 260 SE 400 SE 600
duỗi protein về cấu trúc bậc 1

* Tách protein dựa trên khối lượng phân

tử
Mini VE Ettan DALTsix
ĐIỆN DI (3)
Điện di đẳng điện và điện di 2 chiều GE Healthcare Life Sciences
Điện di đẳng điện (IEF): Phân tách
protein dựa trên điểm đẳng điện của
protein
Điện di 2 chiều: Chiều phân tách thứ
nhất theo điện tích (IEF), chiều thứ hai
tách theo kích thước phân tử (SDS-
PAGE)
Nguyên lý Ettan IPGphor 3 IEF
ĐIỆN DI MAO QUẢN
Điện di mao quản
•Đường kính ống mao quản 50 µm, chiều
dài 0,5 – 1 m
•Tăng độ phân giải và độ nhạy so với
điện di thông thường
•On-line detection

Nguyên lý PA800 Plus (ABSciex)

HIGH-PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
MASS SPECTROMETRY
PHÁT HIỆN PROTEIN ĐẶC HIỆU
WESTERN BLOT
THIẾT BỊ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH (1)
CCD Laser
camera scanner
Amersham
ImageQuant
Typhoon 5
LAS 500
series

Amersham
Imager 600
series

Amersham
Imager 680
series
THIẾT BỊ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH (2)
ImagerQuant LAS 500
THIẾT BỊ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH (3)
Amersham Imager 600/680 series:
 AI 600/680
 AI 600/680 UV
 AI 600/680 RGB
 AI 600/680 QC

Hệ thống phân tích hình ảnh cho mẫu

protein hoặc DNA trên gel hoặc trên
màng Blotting theo 3 kiểu: hóa phát
quang, huỳnh quang, màu nhìn thấy
Định lượng chính xác gel nhuộm ( AI
600 QC, AI 600 RGB)
THIẾT BỊ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH (4)
AI 600 AI 600 UV AI 600 QC AI 600 RGB
AI 680 AI 680 UV AI 680 QC AI 680 RGB
Chemiluminescence
X X X X
Epi white
UV Fluorescence
O X X X

Calibrated OD measurement
O O X X

RGB Fluorescence
O O O X
THIẾT BỊ PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH (5)
ELISA (1)
ELISA (2)
Máy đọc đĩa đa năng
Máy đọc đĩa quang phổ hấp thụ
Máy đọc đĩa huỳnh quang
Máy đọc đĩa hóa phát quang
ELISA (3)
Gemini EM Microplate Reader SpectraMax L Microplate Reader
ELISAs and immunoassays Aequorin assays
Nucleic acid (DNA) quantitation ATP detection
Protein quantitation Bioluminescence resonance energy transfer
(BRET)
Reporter gene assays
Cell viability, proliferation, and cytotoxicity
Cell Viability, proliferation, and cytotoxicity
ELISAs and immunoassays
Enzyme assays
Enzyme assays
Transporter assays
Mycoplasma detection
Phosphotases/kinases
Reporter gene assays
Microbial growth
ELISA (4)
Multiwash+ AquaMax
Máy Multiwash+ rửa đĩa 96 giếng theo từng strip/ lần Có khả năng rửa 96/ 384 giếng cùng lúc
Xét nghiệm ELISA Ứng dụng của AquaMax Microplate Washer
Xét nghiệm huỳnh quang miễn dịch- FIA (Fluorescent Immuno Assay) Có thể thay đổi 96- and 384-well Plate Wash Heads
Xét nghiệm phát quang miễn dịch- LIA (Luminescent Immuno Assay)
Xét nghiệm sinh hóa (ELISA…)
Cytotoxicity assay
Xét nghiệm trên tế bào (bao gồm các tế bào bám dính)
Agglutination assay
Các xét nghiệm cần rửa vi sinh
Protocol & chế độ rửa
Phần mềm:
Bảng điều khiển bằng cảm ứng + 20 protocol rửa khác nhau
Giao diện cảm ứng
Lên tới 8 cycle/ protocol
Có hơn 100 chương trình khác nhau, mỗi chương trình có thể chứa
Điều chỉnh được tốc độ, lực hút, thể tích, thời gian tới 50 bước
Điều chỉnh được thời gian ủ Giảm thời gian rửa
3 chế độ lắc
SÀNG LỌC MIỄN DỊCH
Threshold Immunoassay System (MD)
Ứng dụng: Định lượng nhanh các sản
phẩm sinh dược (vaccine, kháng thể
đơn dòng,…), nucleic acid, tạp chất của
quá trình lên men và tinh chất, kiểm
soát chất lượng
Độ nhạy tương đương hoặc cao hơn
phân tích phóng xạ, cao hơn 10 lần so
với ELISA
Độ nhạy nhận biết DNA lên tới 2 pg
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, TÍNH NĂNG
VÀ TƯƠNG TÁC PROTEIN
IMMUNOFLORESCENCE
DeltaVision (GE)
X-RAY CRYSTALLOGRAPHY
Tạo tinh thể protein: từ từ hạ độ tan của Tín hiệu khúc xạ tia X thu được cho phép
protein trong dung dịch trong điều kiện tính bond-length một cách chính xác
tối ưu. nhất
 Scanning Electron Microscope; SEM
Light Microscope Electron Microscope

 Scanning sample
 Surface topography and composition
 ~ 1nm resolution or better

Transmission Electron Microscope; TEM)

Resolution: Resolution:
50-100 nm 0.001 nm
 Transmit through an thin-sample
800,000 X  Inner and outer structural information
 Atomic resolution
NMR
Nuclear: quá trình xoay quanh hạt nhân (1H, 13C, 15N, 17O, 19F)
Magnetic: cần có từ trường
Resonance: hấp thụ năng lượng ở tần suất xác định

Aqueous sample
Sử dụng dung môi không chứa hạt nhân
sử dụng cho NMR.
VD: 1H-NMR: C6D6 , CCl4
Protein function

Co-IP
Yeast-2-hybrid
FRET
Biacore
ChIP
gel shift (EMSA)
RadioLigand-binding assay
Invitro kinase activity assay
Enzymatic assays
IMMUNOPRECIPITATION (1)
Tách protein cần quan tâm không cần dựa
vào gel
Điều kiện không biến tính
Có thể dùng Sepharose (agarose) bead hoặc
Magnetic bead
Phân tách được các protein kiềm (pI > 11),
các protein acid (pI < 3), các protein lớn
(MW > 100kDa), các protein nhỏ (MW <
20kDa), các protein rất khó hoặc không thể
phân tách được trên 1-D gel hoặc 2-D gel
Đặc biệt được ứng dụng trong phân tách
protein màng
IMMUNOPRECIPITATION (2)
Protein A/G Mag Sepharose

Kháng thể IgG được gắn với các hạt Mag Sepharose nhờ pr A hoặc pr G

NHS Mag Sepharose

Hạt từ được gắn phối tử N-hydroxysuccinimide cho khả năng gắn cao của những phân tử sinh học có nhóm amine tự do

TiO2 Mag Sepharose

TiO2 có khả năng gắn cao với phosphopeptides >> thu lại hiệu quả cao phosphopeptides trong hỗn hợp mẫu

Streptavidin Mag Sepharose

Để thu lại những protein gắn biotin

Protein G / protein A HP Spin Trap

Là cột ly tâm (spin column) chứa protein G Sepharose >> tinh sạch đơn giản, quy mô nhỏ của kháng thể hoặc thu lại protein đặc trưng

Ít hơn 20 phút

Albumin and IgG depletion Spintrap

Cột chứa sepharose được gắn anti HAS và protein G

>> Loại bỏ Albumin và IgG từ human serum and plasma

Protein-Protein Interaction

Co-IP

Products: IP + Western Blot

Protein-Protein Interaction

Y2H system

Xây dựng plasmid, chuyển gene, đọc huỳnh quang

Protein-Protein Interaction

FRET

Xây dựng plasmid, chuyển gene, đọc huỳnh quang

ChIP:
SURFACE PLASMON RESONANCE
(1)
SURFACE PLASMON RESONANCE
(2)

Molecules
• Antibodies
• Proteins Information
• Peptides
• Affinity
• Compounds and fragments
• Kinetics
• Ion
• Screening
• Virus
• Specificity
• Concetration
• Epitope binning
• Immunogenicity
• Thermodynamics
 SURFACE PLASMON RESONANCE
(3)
Affinity – How strong? Kinetics – How fast? Concentration – How much? Specificity – How specific? Comparison – How similar?

Affinity reflects Kinetics Qualitative and Is the molecule Similar to

the binding determine how quantitative specific for its reference
strength fast/slow a determination of target? product or not?
complex forms active analyte
or dissociates concentration
SURFACE PLASMON RESONANCE
(3)

X100 T200 S200 8k

Protein sequencing

• Conceptual translation (NGS, NEB-Illuminate)

• Peptide sequencing: Edman degradation (+ Sắc ký)

Protein engineering

 Site-directed mutagenesis: dùng PCR để tạo đột biến mong muốn

 Recombinant protein: peptide tag, fusion protein
• Đơn giản hóa quá trình tinh sạch
• Tăng độ tan
• Tăng hoạt tính sinh học
• Tăng độ bền (kháng proteolytic activity)
• Giảm tính kháng nguyên
HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN (1)

Prokaryotes Eukaryotes Cell-free

Mammalian: Human: Insect: Sf9,

Bacteria: E.
CHO, Myeloma HEK293, Sf21, High Yeast Fungi Algae
coli
/ Hybridoma PER.C6,… Five, D.mel
HỆ THỐNG BIỂU
HIỆN PROTEIN (2)
Computational biology:
• Molecular dynamics: chủ yếu dựa vào kết quả X-ray crystallography và NMR
• Structure prediction: dựa vào trình tự aminoacid, xác định cấu trúc bậc cao của
protein (α-Helix, β-sheet, Loop, coils…)
• Alignment (so sánh trình tự protein)
• Ontology (chú giải gene)
CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG SẢN
XUẤT
Upstream
Downstream
QC
UPSTREAM (1)

Bioreactor

Small vessel

Small Incubator
UPSTREAM (2) – INCUBATOR
Shaking incubator CO2 Incubator
UPSTREAM (3) – SMALL VESSEL

CellRoll CellSpin
UPSTREAM (4) – BIOREACTOR
Fementor Bioreactor Biofuel bioreactor

Photo bioreactor Solid state bioreactor Hairy root bioreactor

UPSTREAM (5) – SINGLE-USE
BIOREACTOR

WAVE 25 Xcellerex Xcellerex MO Mixer

UPSTREAM (6) – CELL CULTURE
MEDIA
Microbial
Mammalian cell: CHO, HEK293, PERC6,…
Inscect cell: Sf9, Sf21, High Five,…
Hydridoma / Myeloma cell
Stem cell
Others
DOWNSTREAM (1) – LY TÂM
Ly tâm <xem các phần trước>
DOWNSTREAM (2) – LỌC TIẾP
TUYẾN

UniFlux 10 UniFlux 30 UniFlux

120/400
DOWNSTREAM (3) – SẮC KÝ

AKTA pcc AKTA pilot AKTA process

END!