Professional Documents
Culture Documents
HCM
KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN
PHÂN TÍCH THỰC PHẨM
1
MỤC LỤC
1. KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH ............ 5
3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol ....... 10
3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp
của TCA ......................................................................................................... 10
3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu
lipid ............................................................................................................. 10
3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử
............................................................................................................. 10
3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA ...... 10
2
4.2. Ưu điểm và hạn chế ........................................................................... 11
5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm ...... 13
3
8.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid
Chromatography – HPLC) ......................................................................... 18
4
Danh mục hình
Hình 1.phức hợp protein-đồng ................................................................................................... 9
Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm .................................................................................... 9
Hình 3. đo cường độ màu ở 750 nm ........................................................................................ 11
Hình 4. phản ứng nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 ....................................... 13
Hình 5. cột sắc ký lọc gel ......................................................................................................... 15
Hình 6. sắc ký trao đổi ion ....................................................................................................... 17
Hình 7. tương tác của protein với pha tĩnh và pha động .......................................................... 18
Hình 8. veggies cap .................................................................................................................. 20
Hình 9. quy trình của Phương Pháp Dumas............................................................................. 20
5
2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
2.1. Tổng quan
2.1.1. Lĩnh vực áp dụng
Phương pháp Kjeldahl là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích thực phẩm, nó
được sử dụng như một tham chiếu để so sánh với các phương pháp khác.
2.1.2. Ưu điểm và hạn chế
2.1.2.1. Ưu điểm
- Sai số không vượt quá 1%
- Khả năng lặp lại kết quả tốt.
- Dễ thao tác.
- Phân tích được tất cả các loại protein thực phẩm.
2.1.2.2. Hạn chế
- Yêu cầu lượng mẫu lớn.
- Thời gian phân tích dài.
- Độ phân giải thấp do tính chọn lọc không cao.
2.2. Nguyên tắc chung
Sự khác biệt chủ yếu giữ các phương pháp Kjeldahl là chất xúc tác được sử
dụng trong quá trình vô cơ hóa mẫu, kỹ thuật cất đạm và chuẩn độ. Tuy có sự
khác nhau nhưng chung nhất phương pháp Kjeldahl bao gồm năm bước:
a) Chuẩn bị mẫu và cân mẫu
b) Bổ sung chất phản ứng
c) Vô cơ hóa mẫu
d) Cất đạm
e) Chuẩn độ
Khối lượng mẫu được lấy có thể biến động từ 0,2 đến 2,0g, phụ thuộc vào
lượng protein trong mẫu đem kiểm nghiệm. Đối với mẫu lượng protein nằm trong
khoảng 5 – 25%, lượng mẫu tối ưu cần lấy là 0,5 – 1,0g.
Trong quá trình tiến hành cần thêm vào mẫu 3 nhóm chất với các chức năng
khác nhau trong quá trình vô cơ hóa mẫu:
a) Sulfuric acid: tác nhân oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H2O, bẻ
gãy và chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ thành khí NH3 tự do, sau đó liên
kết với NH3 tạo thành muối (NH4)2SO4.
6
b) Muối (K2SO4, Na2SO4): cần thiết cho quá trình nâng cao nhiệt độ trong
quá trình vô cơ hóa.
c) Các chất xúc tác đẩy nhanh quá trình oxy hóa: bao gồm các kim loại: Hg,
Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P2O5, TiO2; peroxide: Hg2O2; muối: CuSO4,
Hg2SO4.
Thủy ngân và oxide thủy ngân là chất xúc tác oxy hóa hiệu quả nhất tuy
nhiên, có thể gây ô nhiễm môi trường, nguy hiểm cho người và đặc biệt có thể
tạo phức hợp với NH3, gây khó khăn cho quá trình cất đạm sau này. Để phân
tách các phức hợp amoniac – thủy ngân, cũng như nitrate và nitrite, dung dịch
natri thiosulfate và salicylic được thêm vào. Tuy khả năng xúc tác kém hơn, và
quá trình vô cơ hóa mẫu chậm hơn so với thủy ngân nhưng đồng thân thiện
với môi trường nên chúng được sử dụng nhiều hơn (đã được phê duyệt bởi
ISO và AOAC). Hiệu quả nhất và thân thiện với môi trường là xúc tác CuSO4.
Qua trình vô cơ hóa mẫu được sử dụng để chuyển hóa nitơ trong hợp chất
hữu cơ thành ion amoni. Sự có mặt của sulfuric acid làm hạn chế nhiệt độ vô
cơ hóa (nhiệt độ sôi của sulfuric acid là 338oC, do đó muối K2SO4 hoặc
Na2SO4 được thêm vào nhằm tăng điểm sôi của hỗn hợp, giảm thời gian phân
hủy các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy những hợp chất khó vô cơ
hóa. Nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng gần như tuyến tính với tỷ lệ K2SO4/H2SO4
(g/mL), đạt 383oC vơi tỷ lệ 1:1, ở tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450oC. K2SO4 không
chỉ được thêm vào để tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp mà còn hấp thu bớt lượng
H2SO4 để tạo thành KHSO4.
Trong thực phẩm còn bào gồm các hợp chất kháng vô cơ hóa như nitrate,
nitrite, alkaloid, pyridine, chinoline derivative, triazole, pyrazolone,
aminopyrine và antipyrine. Để quá trình vô cơ hóa dễ dàng hơn, ta cần bổ
sung các chất như crom, kẽm, sắt (IV) sulfate, salicylic acid và đường sucrose.
Những mẫu có chất béo với protein sẽ khó vô cơ hóa và dễ tạo bọt hơn so
với các mẫu giàu protein, carbohydrate. Để ngăn chặn sự tạo bọt boiling rod
hoăc chip được sử dụng, thêm một vài giọt hydrogen peroxide hoặc octanol,
hoặc dùng chất tạo nhũ đặc biệt chống tạo bọt. Trong điều kiện bình thường,
chất chống tạo bọt có thể được bỏ qua khi áp dụng làm nóng hai giai đoạn. Ở
giai đoạn đầu, mẫu được đốt thành tro, phải tiến hành cẩn thận nâng nhiệt mẫu
lên đến 200oC. Giai đoạn hai, nâng nhiệt mẫu đến 420oC, bao gồm cả thời gian
7
cần thiết để mẫu được vô cơ hoàn toàn. Sau khi khoáng hóa hoàn thành, phải
làm lạnh nhiệt độ mẫu đến nhiệt độ phòng.
Theo nguyên tắc, protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng
và nitơ phi protein, từ đó tính được nitơ của protein. Định lượng được nitơ protein ta
nhân kết quả này với một hệ số nhất định (VD: 6,25 vì hàm lượng Nitơ trong protein
là 16% , hàm lượng khá cao và ổn định).
9
3.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: đơn giản, nhanh chóng
Hạn chế:
o Độ nhạy kém
o Dễ bị nhiễu khi mẫu protein chứa các thiol, DNA, saccharide hoặc chất
béo.
Phản ứng Biuret trải qua một số CẢI BIẾN sau.
3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol
Các thiol (β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, glutathione) có thể được
ngăn chặn trong hầu hết các trường hợp bằng cách thêm vào các chất phản ứng
Biuret là các chalate với EDTA. Tuy nhiên nếu mẫu có dithiothreitol (DTT), ta
cần thêm vào iodoacetamide trước khi thêm các chất phản ứng
3.4. Định lượng protein bằng phương pháp so màu với sự can thiệp của TCA
Phương pháp này dựa trên việc kết tủa protein bằng cách thêm vào
trichloacetic (nồng độ 5 – 25%) tùy thuộc vào thành phần protein, phân tách kết
tủa ra khỏi dịch mẫu bằng phương pháp lọc, giải kết tủa bằng dung dịch muối
hoặc KOH, xác định protein với phản ứng Biuret.
3.5. Định lượng protein bằng phương pháp so màu đối với mẫu giàu lipid
Mẫu với tỷ lệ lipid/protein hoặc phospholipid/protein cao có độ đục cao sẽ khó
tiến hành xác định so màu. Vì vậy trước khi tiến hành phản ứng so màu cần phải
tách lipid ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp trích ly (VD: acetone:petroleum ether 1:1).
Mẫu không chứa lipid sẽ được hòa tan vào muối natri deoxycholate 10% hoặc
NaOH. Sau đó xử lí mẫu với các chất phản ứng Biuret.
3.6. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt đường khử
Đường khử có khả năng làm gây trở ngại phản ứng Biuret. Do đó, H2O2 được
thêm vào để oxy hóa đường khử. Ngoài ra, tăng thêm 10 lần nồng độ của chất
phản ứng Biuret.
3.7. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt DNA
Độ hấp thu tia cực tím của phức hợp Protein – đồng trong dung dịch đồng
sulfate nhạy gấp 10 – 15 lần so với phản ứng Biuret tiêu chuẩn. Có thể định
lượng được xác định được protein trong dung dịch rất loãng (0,01 – 0,1 mg/mL).
Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấp thu của phức hợp protein – đồng ở
263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% và dung dịch NaOH 2N. sự lựa chọn bước
10
sóng trong trường hợp mẫu protein có chứa DNA bị giới hạn, do khả năng hấp
thu cao của DNA. Và do đó, Itzhaki và Gill (1964) phát triển thủ tục dựa trên đo
độ hấp thu ở 310 nm, nó an toàn khi sử dụng với mẫu ngay cả khi nồng độ DNA
đạt 0,7 mg/mL trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng.
4. PHƯƠNG PHÁP LOWRY
4.1. Nguyên tắc chung
Phương pháp được phát triển bởi Lowry (1951) dựa trên cơ sở phản ứng màu
của thuốc thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide trong protein, peptide và các acid
amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) trong môi trường kiềm thích hợp.
Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn cơ bản:
a) Phản ứng Biuret: ion đồng (Cu2+) sẽ tạo phức với protein có ít nhất hai liên
kết peptide.
b) Khử phosphomolybdic acid (thuốc thử Folin): khử Folin bởi phực hợp
protein đồng thành molybdenum blue có độ hấp thu cực đại ở 750 nm.
Thuốc thử Folin-Ciocalteau có phản ứng với một số chất hóa học khác như
amino acid tự do, các hợp chất thiol, saccharide, lipid, fatty acid, các amin,
EDTA,… . đây là nguyên nhân gây nhiễu cho quá trình định lượng bằng phương
pháp Lowry. Để loại bỏ hoặc hạn chế tác động của những chất gây nhiễu trên, kỹ
thuật phải trải qua các quá trình bổ sung bao gồm: nâng nhiệt trước và sau khi cho
thuốc thử Folin, thêm perhydrate, chloramine-T, SDS, trích với dung môi hữu cơ
để loại bỏ lipid.
4.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: độ nhạy rất cao (gấp 100 lần so với Biuret và gấp 10 lần so với đo
quang phổ).
11
Hạn chế: dễ bị nhiễu và không thể xác định các protein trong phân tử không
chứa vòng thơm.
5. PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING)
Kỹ thuật này được khuyến nghị chủ yếu dùng cho phân tích protein sữa và để
phân tích định kỳ các sản phẩm thực phẩm có hàm lượng protein rất thấp như: bia,
rượu vang, nước ép rau quả, ….
5.1. Nguyên tắc chung
Cơ sở của phương pháp, khi phản ứng, trong điều kiện cụ thể, với thuốc
nhuộm có chứa nhóm sulfunic acid (– SO3H), các nhóm chức năng đặt biệt là các
nhóm cơ bản trong các chuỗi bên của arginine, lysine, histidine tạo màu trong dung
dịch thuốc nhuộm, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong thực phẩm.
Thuốc nhuộm hữu cơ liên kết với protein bằng các liên kết ion, tĩnh điện, hoặc cả van
der Waals. Phản ứng này tối ưu trong môi trường acid mạnh, tạo ra các phức tan hoặc
không tan. Vì vậy nồng độ protein có thể dễ dàng xác định thông qua đo cường độ
màu của dung dịch thuốc nhuộm trước và sau khi thêm protein, hoặc sau khi tách
riêng phức hợp protein-thuốc nhuộm không tan bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm.
Một số thuốc nhuộm như: Amido Black 10B, Coomassie Brilliant Blue G-250,
Orange G, and Acid Orange 12 được sử dụng phổ biến trong phân tích thực phẩm.
Trong đó hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tích hàm lượng
protein trong thực phẩm là Bradford và Udy.
5.2. Phương pháp Bradford
5.2.1. Nguyên tắc
Được phát triển bởi Bradford (1976), thuốc nhuộm được sử dụng là Coomassie
Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein trong môi trường kiềm yếu. Có thể tạo kết
tủa ở nhiệt độ thấp (0oC) hoặc sử dụng TCA ở nhiệt độ phòng, hay dùng muối calci
phosphate để đông tụ protein.
12
Hình 4. phản ứng nhuôm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250
13
7. PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION)
7.1. Nguyên tắc chung
Các protein có chứa các acid amin thơm, đặc biệt là tyrosine và tryptophan thể
được kiểm nghiệm thành công với kỹ thuật hấp thu tia cực tím. Để hạn chế sự
hấp thu của các acid nucleic, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp để xác
định mật độ quang tại 260nm và 280nm.
o Kalcker (1947) đề xuất một công thức đơn giản để tính toán nồng độ
protein từ các xét nghiệm đo phổ, phương trình của ông có dạng:
Pc (mg/mL) = 1,45 D280 + 0,74 D260
o Whitaker và Graham (1980) đề xuất một phương pháp trực tiếp hơn để
định lượng protein dựa trên sự khác nhau về độ hấp thu, phương trình
có dạng:
Pc (mg/mL) = (A235 to A280) 2.51
Ưu điểm của phương pháp này là ít bị nhiễu do acid nucleotic.
14
8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY)
Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh sạch protein, sau đó protein được
tinh sạch được phân tích định lượng thông qua các phương pháp khác vi dụ
như đo qua phổ.
8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography)
Phương pháp sắc ký điện di được sử dụng thành công để phân tách trực tiếp
protein khỏi các thành phần khác trong dịch chiết thực phẩm. Nó được sử
dụng như một kỹ thuật giúp tiện lợi hơn cho việc phân đoạn sơ bộ các peptide
trước khi chúng được phân tích sâu hơn bằng cách lập bản đồ TLC (sắc ký
bản mỏng) peptide, sắc ký cột trao đổi ion, điện di mao quản và các phương
pháp khác.
8.1.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cở sở đặc điểm khác
nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Các hạt được sử dụng để
nhồi cột mang các lỗ có kích thước khác nhau. Những phân tử nhỏ có thể ở cả
bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên
ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh
hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào
được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi
qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. Các phân tử protein càng
nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy
qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn. Ngược lại, các phân tử protein
kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn.
15
Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắc ký được thu ở các nồng độ muối khác
nhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau để thu được từng loại protein được
quan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn có hoạt tính protein được quan tâm cao
nhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung.
8.1.2. Các bước tiến hành tổng quát
Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không
tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng
cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những
loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là
100µm (0.1mm).
Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đoạn protein được
chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không
đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong muốn nào đó dù quá trình
sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta thường phải áp dụng
một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn chứa một lượng
lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu.
8.1.3. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: phương pháp sắc kỹ lọc gel tương đối đơn giản, khi cột gel được
kết hợp dòng chảy qua quang phổ kế và hệ thống máy vi tính theo dõi quá
trình, phương pháp này sẽ thuận tiện và hữu ích.
Hạn chế: đối với phương pháp lọc gel, thời gian lưu của các acid amin,
protein có chứa vòng thơm trong cột sẽ kéo dài, mà không bị phân tách theo
thứ tự trọng lượng phân tử.
16
8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography)
17
dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose
(CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác
với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích
dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký
trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những
protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị
giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động,
những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích.
Hình 7. tương tác của protein với pha tĩnh và pha động
18
proton hóa các nhóm silanol còn lại của các chất hỗ trợ silic, và nhóm
carboxyl của các chất rửa giải, cũng như hình thành các cặp ion với các nhóm
amino mang điện tích của các chất được tách ra.
8.3.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: hiệu năng cao so với phương pháp sắc ký khí thể hiện rõ khi phân
tích các hợp chất hữu cơ. Các acid amin, peptide, protein chỉ cần hòa tan
trong dung môi thích hợp như dansyl chloride, 2,4-dinitrophenol,
fluorescamine, o-phthalaldehyde. Phân tích tiến hành ở nhiệt độ phòng,
không cần phân hủy hoặc chuyển hóa thành các dẫn xuất dễ bay hơi. Đối với
RFC, cho kết quả tách biệt hoàn toàn các chất , dung môi sử dụng ít độc hại.
Hiệu quả tách và tính chọn lọc rất cao.
Hạn chế: đối với phương pháp RFC, khó dự đoán thời gian lưu đối với các
hợp chất chưa xác định rõ ràng, nói chung thời gian lưu tăng theo kích thước
và độ kỵ nước của phân tử. Tuy nhiên đối với các peptide, protein óc kích
thước lớn hơn, số lượng và vị trí của các bản kị nước trên bề mặt phân tử trở
nên chiếm ưu thế.
8.4. Phương pháp sắc ký ái lực – hấp phụ (Affinity Chromatography)
Tách và tính chế các loại protein đặc thù thường tiêu tốn thời gian và không
hiệu quả. Phương pháp sắc ký ái lức không vấp phải những hạn chế đó. Nó là
quá trình rất cụ thể cho sự hấp phụ chọn lọc sinh học và sau đó phục hồi hợp
chất từ các phối tử cố định.
8.4.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học
chuyên biệt. trong thực hành, cột được điền đầy nhựa sắc ký ái lực, sau đó phủ
lớp protein lên, các thành phần có ái lực với nhựa sẽ bị giữ lại, trong khi các
thành phần đi kèm vượt qua cột mà không bị cản trở. Thành phần bị giữ lại do
tạo phức hợp sẽ được tách rửa bằng cách điều chỉnh độ pH hoặc thêm dung dịch
muối, cột này có thể tái sử dụng.
8.4.2. Ưu điểm và hạn chế
Có độ chuyên biệt cao như đã nói ở phần mở đâu, điều này là ưu điểm của
phương pháp, tuy nhiên không thể áp dụng với các chất chưa được xác định rõ
ràng.
19
9. PHƯƠNG PHÁP DUMAS
Baptiste Dumas (giữa thế kỹ 19) đề xuất phương pháp, phương pháp được hoàn chỉnh
(1980) với sự ra đời của máy phân tích nitơ (CNAs).
Lĩnh vực ứng dụng: Nhà máy sữa, nhà máy ngũ cốc, bột mỳ, thịt cá, thức ăn chăn
nuôi, thức ăn sẵn, nước uống, sản phẩm thuỷ sản…
9.1. Nguyên tắc
Tài liệu
Tương tự như phương tham
pháp khảophương pháp Dumas cũng trải qua giai đoạn vô cơ
Kjeldahl,
hóa mẫu trong buồng đốt (Mẫu được đốt cháy bởi Oxy tinh khiết và có xúc tác chromium
III oxide ) sẽ sinh ra CO2, H2O, N2, N2O,… . Bộ lọc Lecosorb để hấp thu CO2, bộ lọc
Anhydrone1)đểMethods
loại nước of
H2O. Cu ở nhiệt
Analysis of độ cao khử
Food NO2 thành N
Components 2. Dòng
and cuối cùng
Additives, chỉ
edited
có khí N2 vào hệ
bythống GC, được
Semih phát hiện
Ötles, đầu dò
Ege TCD
University, Department of Food
Engineering, Izmir, Turkey.
4) Kỹ Thuật sinh hóa, Phạm Thị Ánh Hồng, NXB Đại Học Quốc Gia
TP.HCM.
20
21