ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN THI ̣HIỀN

TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A

TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


TRẦN THI ̣HIỀN

TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A

TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Đoàn Duy Tiên

Hà Nội - 2011

 MỤC LỤC

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
BẢNG
HÌNH
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN......................................................................................3
1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp. ............................................................3
1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn .................3
1.1.2 Chlorophyll ..............................................................................................10
1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) .............................14
1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam ..........................................................................14
1.2.2 Cấu tạo tế bào ..........................................................................................16
1.2.3 Phân loại ..................................................................................................16
1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn .....................................................................................17
1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế .......................18
1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a .......................................................................19
1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a ...........................................................................20
1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic .......................................................20
1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen) ...................................................21
1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol).................................22
1.5.4 Đƣa ion Mg2+ vào hệ thống vòng ............................................................24
1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward .......................................25
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM................................................................................27
2.1 Mục tiêu thực nghiệm .....................................................................................27
2.2 Xác định các tính chất vật lý. ..........................................................................27
2.2.1 Sắc kí bản mỏng ......................................................................................27
2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................27
 2.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ....................................................................27
2.2.4 Phổ khối (MS) .........................................................................................27
2.2.5 Phổ tử ngoại .............................................................................................27
2.3 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................27
2.3.1 Nội dung 1 ...............................................................................................27
2.3.2 Nội dung 2 ...............................................................................................29
2.3.3 Nội dung 3 ...............................................................................................30
2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến,
phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và phổ khối. ............................................................31
2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a .......................................................................31
2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a ..........................................................32
2.4.3 Cấu trúc của chlorin e6 – trimetylester ....................................................33
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................34
3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a. ........................34
3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a. .38
3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin – e6 trimetylester ................42
CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN.......................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
 CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN

PS : Hệ thống quang hợp

IR : Phổ hồng ngoại
UV – VIS : Phổ tử ngoại và khả kiến
MS : Phổ khối lượng
1
H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H.
MPP : Metyl pheophobide a
PP : Pheophytin a
ATP : Adenosin Triphotphat
NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat
LHC : Phức hợp thu nhận ánh sáng
 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau.......................................... 11
Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của pheophytin a....................................... 35
Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của metyl pheophobide a .......................... 39
Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của chlorin e6 - trimetylester .................... 44

HÌNH
Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ ................... 3
Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp ......................................................................... 4
Hình 1.3: Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía ……………………....................5
Hình 1. 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật ………....................6
Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp………….………………………...............6
Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas
virdis ...................................................................................................... 7
Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid ...................................... 8
Hình 1.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson. ................................ 9
Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C4 ......................................................... 10
Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a .................................................... 11
Hình 1.11. Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena .................................................... 15
Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên ............................... 18
Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang.............. 20
Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-CoA ........ 21
Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic .................................................... 21
Hình 1.16: Quá trình tổng hợp vòng pyrol ............................................................. 22
Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol.......................................................................... 22
Hình 1.18: Quá trình đóng vòng của tetrepyrol ...................................................... 23
Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX ...................................................... 23
Hình 1.20: Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[10,30,33] ............................... 24
Hình 1.21: Tổng hợp chlorophyll a theo Woodward. ............................................. 25
Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a ..................................... 28
Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a ........................ 29
Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam ........... 30
Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester ............. 31
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của pheophytin a ......................................................... 36
Hình 3.2: Phổ UV – VIS của Pheophytin a ......................................................... 36
Hình 3.3: Phổ khối của pheophytin a.................................................................... 37
Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của pheophytin a ............................................................ 37
Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của metyl pheophobide a ............................................ 40
Hình 3.6: Phổ UV – VIS của metyl pheophobide a .............................................. 40
Hình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a ....................................................... 41
Hình 3.8: Phổ 1H – NMR của pheophobide a ....................................................... 41
Hình 3.9: Phổ UV – VIS của chlorin e6 - trimetylester ........................................ 45
Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trimetylester........................................ 45
Hình 3.11: Phổ khối của chlorin e6 – trimetylester ................................................. 46
Hình 3.12: Phổ 1H – NMR của chlorin e6 - trimetylester ....................................... 46
 MỞ ĐẦU

Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh
của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất
màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter,
nhà hóa học người Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời
và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919, ông đã
giải thích được chức năng của hợp chất hấp thụ năng lượng mặt trời chính là
Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và
chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất
hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyển năng lượng
ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra
các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử).
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn
và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm
bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện
tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp và các nghiên cứu y dược.
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y
học và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ
bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chữa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin
phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng,
aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng để
tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất chữa vết thương và khử mùi hôi.
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã
bị hư hại và ngăn cản tác hại của các chất gây ung thư. Chlorophyll còn có lợi cho
hệ tiêu hóa và có tác dụng dưỡng da.
Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào
ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị

1
liệu. Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm
mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh cao tuổi.
Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c,
d,…), trong đó chlorophyll a phổ biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong
hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp. Trong thực vật
bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll
khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp.
Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn
giản nên việc phân lập dễ dàng hơn. Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển
hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học của
mình. Mục tiêu của luận văn là tìm ra qui trình tách chiết chlorophyll a một cách
hiệu quả ở qui mô phòng thí nghiệm và chuyển hóa chúng để thu được các hợp chất
làm trung gian cho quá trình tổng hợp các hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp
quang, các chất màu thực phẩm, tổng hợp các hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng
cho pin mặt trời và các sensor.

2
 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn
Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Chlorophyll hấp thụ
năng ánh sáng mặt trời và chuyển quang năng thành hóa năng bởi trung tâm phản
ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn và thực vật dưới dạng NADPH và ATP được
sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1).

Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ
Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao.
Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm
phản ứng chia thành PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi
khuẩn tía đều bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản
ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon. [3,5]

3
 Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp.[28]
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên
kết với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai. Trung tâm phản ứng được bao
quanh bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1). Các electron được chuyển vào trung
tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt).
Trong PSII gồm protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với
các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn. Năng lượng ánh sáng
được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll
CP43 và CP47. Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức hợp của mangan
để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển.
Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII.
Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2
và một ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy từ
plastocyanin (PC) ở bên trên lumen và chuyển đến sắt sunfua (FeS) ở phía trên
stroma để khử NADP+ thành NADPH [28].

4
 Hệ thống ăng ten (hình 1.3 và hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng
bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới
trung tâm phản ứng là nơi phản ứng quang hoá diễn ra. Cấu tạo của ăng ten LH1
bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và hai phân tử chlorophyll a hoặc b. LH2
bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b. Các
sắc tố khác như caroten (hình 1.5) không hoạt động hoá học nhưng có chức năng
như một ăng ten.

Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía.[29]

Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng số lượng sắc tố
để hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm. Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời
thấp, mỗi phân tử chlorophyll chỉ hấp thụ một vài photon trong một giây. Bằng
cách kết hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao
nhất.[1,4,7,12,15,26,27,29]

5
 Hình 1. 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật [15]

ß-Carotene

OH

Zeaxanthin
HO
OH
O

O Violaxanthin
HO
OH

Lutein
HO

Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp.

Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và
một cặp chlorophyll có tổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo này mà sự chuyển dời điện
tích xảy ra để thực hiện phản ứng khử NAD+ thành NADPH. Phản ứng ở trung
tâm phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng
loại II oxy được tạo thành.
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn
tiểu đơn vị protein (hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có
tổ chức đặc biệt, hai phân tử pheophytin, phân tử quinon QA, phân tử quinon QB và

6
một ion sắt (Fe). Chuỗi chuyển dời điện tích bắt đầu từ Chlorophyll monome phía
bên trái qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên
phải rồi qua pheophytin phía bên phải tới Quinon A sang Fe và chuyển về
pheophytin phía bên trái và trở về Chlorophyll monome ban đầu. Năng lượng kích
thích của electron đã được sử dụng để tổng hợp ATP cao năng từ ADP. Đó chính là
cơ sở và bản chất của quá trình quang hợp.

Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp
của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis .[6]

7
 Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông
qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng
lượng thấp một cách điều hòa để nâng cao hiệu quả sử dụng năng lượng (hình 1.7).
Trong chuỗi vận chuyển điện tử của màng thylakoid bao gồm các enzym khử sắt,
plastoquinon oxidoreductase và enzym ATP syntase. Dòng electron tách ra từ phân
tử nước tới NADP dưới tác dụng của PS. Chuỗi vận chuyển proton thực hiện qua
màng thylakoid và được sử dụng để tổng hợp ATP. Khi các electron di chuyển vào
chuỗi vận chuyển, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phóng ra proton đi vào
trong màng thylakoid. Nếu không có chuỗi vận chuyển điện tử từ trạng thái năng
lượng cao đến trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng xảy ra quá
nhanh dẫn đến các tế bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp.

Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid

Cacbohydrat được tổng hợp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy
cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc
NADPH theo chu trình Calvin-Benson C6 (hình 1.8) hoặc chu trình C4 (hình 1.9).

8
 Hình 1.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson
Cố định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C6 xảy ra trong stroma
của lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau. Pha đầu là phản ứng của dẫn xuất
đường 5 ribulose-1,5-bisphotphat với CO2 và phân cắt dẫn xuất đường 6 thành hai
phân tử 3-photphoglyxerat. Pha hai là quá trình tái tạo cơ chất ribulose-5-photphat
còn pha ba là phản ứng của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1,5-
bisphotphat. Quá trình cố định CO2 xúc tác bởi enzym ribulose-1,5-bisphosphat
cacboxylase oxygenase (RuBisCO), phản ứng của RuBisCO với O2 hoặc CO2 phụ
thuộc vào nồng độ tương đối của chúng. Trong tất cả các sinh vật, CO2 là chất nền
ưu tiên, nếu nồng độ CO2 trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thì sự hô hấp
xảy ra ở mức độ đáng kể.

9
 Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C4
Ở một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định CO2 là
phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C4. Tỷ lệ sử dụng ATP cho cố định CO2
trong thực vật theo chu trình C4 cao hơn so với chu trình C6.
1.1.2 Chlorophyll
1.1.2.1 Cấu tạo và tính chất của chlorophyll
1.1.2.1.1 Cấu tạo
Có 5 loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c,
chlorophyll d, chlorophyll e. Ở thực vật bậc cao chỉ có 2 loại chlorophyll a và b; còn
chlorophyll c, d, e có ở vi sinh vật, rong, tảo, vi khuẩn.

10
 Về công thức cấu tạo, phân tử chlorophyll a chia ra hai phần: nhân chlorophyll
và đuôi phân tử chlorophyll.

N N
Mg
N N

MeOOC O
O
O phytyl 1

chlorophyll a

phytyl = E R R

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a

Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll c1 Chlorophyll c2 Chlorophyll d

Công thức
C55H72O5N4Mg C55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg C35H28O5N4Mg C54H70O6N4Mg
phân tử
Nhóm C3 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO
Nhóm C7 -CH3 -CHO -CH3 -CH3 -CH3
Nhóm C8 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3
-CH2CH2COO- -CH2CH2COO- -CH2CH2COO -
Nhóm C17 -CH=CHCOOH -CH=CHCOOH
Phytyl Phytyl Phytyl
Liên kết
Đơn Đơn Kép Đơn Kép
C17-C18
Các loại tảo Các loại tảo Vi khuẩn lam
Tần suất Phổ biến Đa số thực vật
khác nhau khác nhau (cyanobacteria)

Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau

Nhân chlorophyll là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp lục, gồm 1
nguyên tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của 4 vòng pyrol trong đó có

11
2 liên kết phối trí. Phần nhân chlorophyll bao gồm 4 vòng pyrol liên kết với nhau
qua liên kết metylen, do có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả năng hấp
thụ ánh sáng rất mạnh.
Đuôi phân tử chlorophyll là gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon. Đuôi
chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll trên màng
quang hợp thilakoit có tính lipit.
1.1.2.1.2 Tính chất của chlorophyll
 Bản chất hoá học của chlorophyll
Chlorophyll không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Khi
muốn chiết xuất chlorophyll ra khỏi lá xanh phải dùng các dung môi như este,
axeton, rượu, benzen.
Chlorophyll là este của axit chlorophyllic với hai rượu là phytol và metanol
nên chúng có các phản ứng đặc trưng của một este là phản ứng xà phòng hoá khi tác
dụng với kiềm để tạo nên muối chlorophylat vẫn có màu xanh.

N N N N
+ CH3OH
Mg Mg
+2NaOH
N N N N

MeOOC O NaOOC O + C20H39OH

COO Phytyl COONa

Chlorophyll a

Chlorophyll tác dụng với axit để tạo nên hợp chất pheophytin có kết tủa màu
nâu, trong đó nhân Mg bị thay thế bới 2H. Pheophytin không hoạt động huỳnh
quang như diệp lục. Điều đó chứng tỏ nguyên tử Mg có vai trò rất quan trọng quyết
định tính chất quang hóa của diệp lục.

12
 N N NH N
Mg +2H+
N N N HN + Mg2+

MeOOC O MeOOC O
COO Phytyl COO Phytyl

Chlorophyll a Pheophytin a

Pheophytin có thể tác dụng với một kim loại khác và kim loại này sẽ đẩy 2H
để thay thế vào vị trí của Mg trong phân tử chlorophyll tạo nên hợp chất có màu
xanh rất bền. Trong môi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy
phân liên kết este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide.
Sự mất màu của diệp lục: Chlorophyll ở trong tế bào khó bị mất màu vì nằm
trong phức hệ với protein và lipit. Trong dung dịch, có ánh sáng và O2, chlorophyll
sẽ mất màu do phản ứng quang oxi hoá.
 Tính quang học của diệp lục
Tính huỳnh quang: Khi quan sát ánh sáng phản xạ từ dung dịch chlorophyll
thấy dung dịch có màu huyết dụ, nếu tắt nguồn sáng thấy dung dịch có màu xanh
như cũ.
Tính lân quang: cũng gần tương tự như huỳnh quang nhưng chỉ khác là khi tắt
nguồn sáng thì ánh sáng màu huyết dụ còn lưu lại một thời gian ngắn nữa.
1.1.2.1.3 Vai trò của chlorophyll trong hệ quang hợp
Hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng của phân tử
chlorophyll mà nó có thể hấp thụ năng lượng ánh sáng với hiệu suất cao.
Vận chuyển năng lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp
thu ánh sáng cho đến trung tâm phản ứng của quang hợp phải qua một hệ thống cấu
trúc trong màng thilakoid gồm rất nhiều phân tử chlorophyll khác nhau. Năng lượng
ánh sáng phải truyền qua các phân tử chlorophyll để đến được trung tâm phản ứng.
Tham gia biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học tại trung
tâm phản ứng.

13
1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria)
1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam
Vi khuẩn lam có sức sống rất dẻo dai, chúng phân bố rộng rãi trong tất cả các
môi trường. Đại bộ phận sống trong nước ngọt, ở các ao hồ có nhiều chất hữu cơ và
góp phần hình thành hệ sinh vật nổi (plankton) của các thủy vực; một số phân bố
trong nước mặn hoặc nước lợ, bùn lầy hay đất ẩm ướt, trên đá, trên vỏ cây ẩm, ngay
cả những nơi có điều kiện rất khắc nghiệt như trong tuyết và ở những suối nước
nóng đến 69°C.
Vi khuẩn lam thuộc loại ưa nhiệt, có tính bền vững với nhiệt độ. Nhiều loài có
thể phát triển ở nhiệt độ cao, cả trong các suối nước nóng (70 - 80°C). Tảo lam có
thể chịu được nhiệt độ cao như vậy là nhờ trạng thái keo đặc biệt của chất nguyên
sinh. Mặt khác, một số vi khuẩn lam cũng có khả năng tồn tại ở nhiệt độ thấp
(những vi khuẩn sống trong băng tuyết, hay ở Nam cực, nhiệt độ tới -83°C vẫn tìm
thấy một lượng lớn vi khuẩn Nostoc).
Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao (vào các tháng nóng trong năm). Với
các vi khuẩn nước ngọt, nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°C.
Khi sinh trưởng phát triển mạnh, vi khuẩn gây nên hiện tượng “nước nở hoa”.
Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Oscillatoria lại gây “nước nở hoa” trên băng ở
nhiệt độ gần 0°C. Khi có hiện tượng “nước nở hoa” do vi khuẩn lam gây ra thì nước
không sử dụng được vì khi đó sinh khối của tảo đạt tới mức khá lớn (tối đa tới 450-
500g/m3) mà trong đó rất ít loài có thể dùng làm thức ăn cho các sinh vật khác, sau
đó chúng chết hàng loạt và phân hủy. Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm
phân hủy của chúng khi chết đều gây hại.
Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm
nguyên thủy nhất. Di tích hóa thạch của các vi khuẩn lam dạng sợi phát hiện được
cách nay khoảng 3,5 tỷ năm. Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phức tạp so với các
vi khuẩn khác nhưng nó vẫn là đại diện có vai trò quan trọng ở các hệ sinh thái. Vi
khuẩn lam là sinh vật quang hợp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào
đầu tiên có hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại I và II) và giải

14
phóng O2. Nhiều loài vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển Nitơ trong khí
quyển từ thể tự do sang dạng Nitơ sử dụng được như amoni ( NH 4 ), amino axit và
một loạt hợp chất nitơ khác.
Vi khuẩn lam chưa có nhân điển hình, không có màng nhân, vật chất di truyền
được tập trung trong chất nhân (nucleoid), không có lưới nội sinh chất, ty thể, thể
golgi, lạp thể và không mang roi, chỉ chứa chlorophyll, sắc tố liên kết với protein
thường làm cho chúng có màu lam (có khả năng tự dưỡng). Chúng cũng chưa có sự
sinh dục hữu phái.
Về tổ chức cơ thể, vi khuẩn lam có cấu tạo đơn giản, một số có dạng đơn bào,
phần lớn dưới dạng tập đoàn hay đa bào hình sợi, hình chuỗi hạt đơn hay phân
nhánh.
Đại đa số tế bào vi khuẩn lam dạng sợi – chuỗi hạt thường có tế bào dị hình (dị
bào). Dị bào là những tế bào đặc biệt, lớn hơn các tế bào bình thường khác, có màng
đôi, dày, trong suốt, không có oxy và không có hệ thống quang II do đó không sản
xuất ra oxy trong quá trình quang hợp. Dị bào có 1 hoặc 2 lỗ (ở đầu tiếp xúc với tế
bào dinh dưỡng) tùy theo vị trí ở đầu hay ở giữa sợi (đặc biệt trong phân loại) qua
đó lưu thông tế bào chất với các tế bào nằm cạnh nó. Khoảng cách của dị bào trên
sợi chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Dưới kính hiển vi quang học, chất tế
bào trông đồng nhất nhưng dưới kính hiển vi điện tử nó có một hệ thống màng,
thường có màu xanh vàng do có chlorophyll a và caroten nhưng thiếu phycoxyanin.
Dị bào có vai trò trong việc cố định đạm trong điều kiện hiếu khí.

Hình 1.11. Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena

15
 Trong sự phát triển của sợi, sợi có thể bị tách ra ở bên cạnh các dị bào này và
tạo thành một nhánh mới đi ra từ sợi chính. Đó là sự phân nhánh giả của sợi, phân
biệt với sự phân nhánh thật được bắt đầu từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của sợi
phân chia dọc và sau đó tế bào non mới hình thành tiếp tục phân chia tạo nhánh bên.
1.2.2 Cấu tạo tế bào
Màng tế bào vi khuẩn lam khá dầy, gồm 4 lớp, bên ngoài thường hóa nhầy, có
khi tạo thành bao chuyên hóa, bao xung quanh tế bào hoặc nhóm tế bào hay toàn bộ
sợi.
Chất nguyên sinh ở vi khuẩn lam được phân biệt thành 2 phần:
- Phần ngoài tập trung các phiến mỏng quang hợp (lamen), thể ri bô và các thể
hạt (hạt chất tế bào) khác.
- Phần trong chứa chất nhân (nucleoprotein). Ở giữa ranh giới giữa 2 phần
không rõ ràng chỉ nhận ra khi dùng phẩm Feulgen nhuộm trung bào chất chứa chất
nhân.
Các chất màu (sắc tố) phân bố trên các lamen ở phần ngoài nên phần này có
màu (xanh đen hoặc xanh lục).
Chất màu gồm có: chlorophyll a (có màu lục); phycoxyanin màu lam và
phycoerythrin màu hồng và các dẫn xuất của caroten, oxycaroten.
Chất dự trữ của tế bào là glycogen, volutin, không có tinh bột.
1.2.3 Phân loại
Ngành vi khuẩn lam có khoảng 1500 - 2000 loài, tập hợp thành một số bộ, họ
khác nhau. Hiện nay con số các bộ không thống nhất tuỳ theo tác giả. Có người chia
ngành này thành 3 lớp với nhiều bộ, có người lại chia thành 1 lớp với 4 bộ:
Bộ Chroococcales: Vi khuẩn đơn bào, đơn độc hay tập đoàn. Tế bào tròn
không phân biệt gốc và đỉnh, không có nội và ngoại bào tử.
Tế bào đơn độc hay tập đoàn nhưng không sắp xếp thành hàng hay sợi (họ
Chroococcaceae), thường gặp như: Chroococcus, Microcystis.
Bộ Dermocarpales: đơn bào.
Bộ Pleurocapsales: Vi khuẩn đa bào dạng sợi đơn, có phân nhánh hoặc không,

16
sinh sản cách phân chia tế bào hoặc nội bào tử.
Các chi điển hình: Cyanocystis, Pleurocapsa.
Bộ Hormogonales: đa bào dạng sợi lông, hoặc phân nhánh, thường có tế bào
dị hình, có khi sợi lại tập hợp thành tập đoàn.
Các chi điển hình: Nostoc, Anabaena, Aphanizomenon,...
Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạng đơn bàn hay
tập đoàn và Hormogonales với những dạng đa bào.
1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn
Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực
Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng của vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho
đất nhờ khả năng cố định đạm. Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 50 loài, phần
lớn thuộc họ vi khuẩn chuỗi (Nostocaceae) có khả năng này. Ðặc biệt đáng chú ý là
loài Anabaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu, một loại cây dùng làm phân
xanh và làm thức ăn gia súc có ý nghĩa kinh tế rất lớn ở nước ta.
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong
ruộng lúa mà hằng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy được thêm từ không khí
khoảng 15 - 50 kg nitơ, trung bình là 20 - 25 kg, đôi khi thu được đến 80 kg hay
nhiều hơn nữa.
Những năm gần đây, một số vi khuẩn lam có hàm lượng protein cao như
Spirulina maxima, S. platensis được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh
khối nhằm bổ sung nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người.
Vi khuẩn lam tích lũy ở đáy thủy vực, tham gia vào việc hình thành bùn
sapropen được dùng làm phân bón, thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than
cốc, khí hơi và dùng chữa bệnh...
Một số vi khuẩn lam được dùng làm thức ăn cho người như Nostoc commune,
Nostoc pruniforme. Ðây là một loại thực phẩm ngon và quí đối với người Trung
Quốc, giàu protein và vitamin.
Ngoài ra, cùng với vi khuẩn và các động vật nguyên sinh, vi khuẩn lam còn được
dùng làm sạch sinh học các nguồn nước thải ra từ sản xuất công nghiệp.

17
 Vi khuẩn lam cũng có những tác dụng tiêu cực: khi phát triển mạnh chúng gây
hiện tượng "nước nở hoa' làm giảm phẩm chất của nước, ảnh hưởng tới động vật
đáy và biến đổi hệ sinh thái thủy vực.
Vi khuẩn lam ít có ý nghĩa dinh dưỡng đối với động vật phù du, do chúng có
cấu trúc màng nhầy, động vật thường không sử dụng được và chúng thường sinh ra
độc tố. Chỉ có một số ít cá sử dụng một số vi khuẩn lam để ăn.
1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế
Quốc tế: Chlorophyll a được phân lập vào năm 1913 và cấu trúc hoàn chỉnh
đã được xác định vào năm 1940 bởi Hans Fischer. Sự phân lập chlorophyll a từ các
nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại hóa, đề
phytyl hóa, oxi hóa quang hóa, solvat hóa, allomerization và đề metoxycacbonyl
hóa. Chlorophyll a đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thống quang hợp do khả
năng hấp thụ ánh sáng và biến đổi quang năng thành hoá năng với hiệu xuất cao,
quá trình này xảy ra trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn
quang hợp.[11,18,19,31,32]
CHO CHO

N N N N N N
Mg Mg Mg
N N N N N N

MeOOC O MeOOC O MeOOC O

O O O
O phytyl 1 O phytyl 2 O phytyl 3
chlorophyll a chlorophyll b chlorophyll d

phytyl = E R R

Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó là một đối tượng rất hấp dẫn cho các
nghiên cứu lý thuyết hóa hữu cơ như cấu trúc điện tử, tính thơm, quá trình chuyển
dời điện tử, quang hóa và quá trình quang hợp. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp
chlorophyll a cũng đạt được những thành tựu to lớn .[11,18,19,32]

18
 Trong nƣớc: Hoá học chlorophyll là một lĩnh vực rất rộng lớn và lâu đời trên
thế giới do những tính chất hóa học và ứng dụng đặc biệt của nhóm hợp chất này.
Tuy nhiên vấn đề này còn rất mới mẻ ở Việt nam. Chlorophyll và các dẫn xuất của
chúng được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm,
[2,4,5]
công nghệ nano và điều trị ung thư . Vì vậy việc đặt nền móng cho Hoá học
Chlorophyll là vấn đề cấp thiết, nó có ỹ nghĩa lớn về mặt khoa học cũng như ứng
dụng thực tiễn rất phong phú và rất gần gũi với cuộc sống.
1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong các lĩnh vực khác
nhau như thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano và điều trị ung thư. Hàng ngàn tấn dẫn
xuất của chlorophyll có tên là Cu-Chlorophyllin được sử dụng trong ngành thực phẩm,
mỹ phẩm, kem đánh răng như là các chất màu hữu cơ. [4,11,28,29]
Quang trị liệu các bệnh ung thư là một ứng dụng quan trọng của các dẫn xuất
chlorophyll dựa trên sự khu trú có chọn lọc trên khối u và sản sinh ra oxy ở trạng
thái singlet để phá hủy các tế bào ung thư. Chlorophyll và các dẫn xuất của nó hấp
thụ ánh sáng có bước sóng khoảng 650 nm nên ánh sáng dễ dàng xuyên qua các tế
bào mô. Khi được chiếu xạ, các dẫn xuất chất này chuyển lên trạng thái kích thích
triplet (Năng lượng kích thích với chlorophyll a, E = 29 kcal / mol) sau đó năng
lượng này được chuyển sang cho oxy để sản xuất oxy ở trạng thái kích thích singlet
(E = 22,5 kcal / mol). Oxy ở trạng thái singlet là một chất oxy hoá hiệu quả dẫn đến
sự hình thành các thành tố rất hoạt động như anion gốc, gốc hydroxyl và
hydroperoxide, các gốc hoạt động này sẽ đi vào phản ứng trực tiếp với các phân tử
hữu cơ của các tế bào ung thư. Các gốc tự do phản ứng dây chuyền để phân huỷ
màng lipit của các tế bào dẫn đến phá hủy các tế bào ung thư. Một số chlorin rất
quan trọng được sử dụng cho quang trị liệu bao gồm chlorin-e6 và các muối natri,
monoaspartylchlorin-e6 và photochlorin. Liệu pháp quang đã được sử dụng để điều
trị các khối u ác tính của da, tuyến vú, màng nhầy của các khoang miệng, lưỡi, môi
dưới, thanh quản, dạ dày, phổi, ruột non, bàng quang và trực
tràng .[11,13,14,16,17,22,23,24,25,34]

19
 O C5H11

NH N NH N NH N

N HN N HN N HN

COOH COOH
O
COOH O
COOH HN 5
COOH 4 COOMe 6
COOH
HOOC
chlorin e 6 mono L-aspartyl chlorin e 6 photochlorin

NH NH N
NH N N

N N N HN
HN HN

COOMe
MeOOC O MeOOC O COOMe
COOMe 9
COOMe 7 COOH 8
C35H36N4O5 C37H42N4O6
C36H38N4O5

606.72 592.69
chlorin e6 - trimethylester
metyl pheophobide a pheophobide a

Hình1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang
1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a
Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll trải qua 4 giai đoạn:
 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic.
 Sinh tổng hợp vòng pyrol từ axit 5-aminolevulinic.
 Tổng hợp hệ 4 vòng tetrapyrol.
 Quá trình đưa Mg2+ vào hệ thống vòng.
1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic
 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và succinyl-CoA

20
 Sử dụng phản ứng của glyxin với succinyl-CoA dưới tác dụng của enzim axit
5-aminolevulinic xảy ra trong động vật, nấm men và một số vi khuẩn.
O
CH-NH-Pyridoxal-P COOH
CH2NH2 COOH Enzyme CH2
COOH
CH2
glycine
CoA-SH COOH CO-S-CoA
Pyridoxal-P
CH Succinyl-CoA
2
Enzyme
CH2 H
COOH
COOH NH-Pyridoxal-P
CH2 O
CH2 COOH Enzyme
CH2
CH2
O
CH2NH2 O
CO2
H NH-Pyridoxal-P
ALA H

Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glycine và succinyl-CoA

 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ axit glutamic.
Cơ chất của quá trình sinh tổng hợp là glutamic xảy ra trong thực vật bậc cao,
rêu, khuẩn lam và nhiều vi khuẩn khác.
Đầu tiên, axit glutamic được hoạt hóa bằng cách gắn với ARNtGlu tạo thành
glutamyl-ARNt với sự có mặt của ATP và Mg2+. Sau đó, glutamyl-ARNt bị
đehiđro dưới tác dụng của NADP tạo thành glutamat-1-anđehit. Cuối cùng là quá
trình đeamin hóa tạo thành axit 5-aminolevulinic.

Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic

1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen)
Sinh tổng hợp chlorophyll từ axit 5-aminolevulinic đến uroporphyrinogen III

21
tới protoporphyrin IX tương tự như sinh tổng hợp hemoglobin ở người và chuột.
Liên kết C-C và C-N trong vòng pyrol được hình thành dưới tác dụng của
enzim, axit 5-aminolevulinic bị đehiđrat tạo ra liên kết không đối xứng và ngưng tụ
với nhau tạo thành porphobilinogen (PBG) (hình 1.16).
COOH COOH

COOH COOH

- axit 5 - aminolevulinic
NH+
dehidrat axit

N N
O H2
NH2 NH2
H2O
porphobilinogen
axit 5 - aminolevulinic

Hình 1.16: Sinh tổng hợp vòng pyrol

Sau đó, porpobilinogen bị đeamin hóa và 4 vòng pyrol kết hợp với nhau tạo
thành tetrepyrol hay hiđroximetylbilan (hình 1.17).

COOH COOH
COOH
HOOC

COOH I II
NH N
COOH

1. deamin HO NH HN
IV III
2. đóng vòng
COOH
N
COOH COOH
NH2
porphobilinogen COOH
PBG
hydroxy methylbilane

Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol

1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol)
Hình 1.18 mô tả quá trình đóng vòng của tetrapyrol. Nhóm metylen của vòng
pyrol I ngưng tụ với vị trí α của vòng pyrol IX và tạo thành uroporphyrinogen III.

22
 COOH COOH COOH COOH
COOH HOOC COOH
HOOC

I II H2O I II
NH N NH HN

HO NH NH HN
HN
IV III IV III
COOH COOH
HOOC
COOH COOH
COOH COOH COOH
hydroxy methylbilane uroporphyrinogen III

Hình 1.18: Đóng vòng tetrapyrol

Hình 1.19 cho ta thấy uroporphyrinogen III bị đecacboxyl hoá tạo thành
coproporphyrinogen III. Phân tử mới tạo thành tiếp tục bị đecacboxyl: chuyển nhóm
propionyl thành nhóm vinyl để tạo thành phân tử protoporphyrinogen IX. Phân tử
này lại tiếp tục bị oxi hoá tạo thành nối đôi liên hợp trong vòng protoporphyrin IX
và kết thúc quá trình đóng vòng của tetrapyrol.[2,21]

COOH COOH
HOOC COOH COOH
COOH
I II
NH HN
4CO2 NH HN
NH HN
IV III NH HN
COOH
HOOC

COOH COOH
uroporphyrinogen III COOH COOH
coproporphyrinogen III

O2 2H2O 2CO2 NH NH N
HN O2 2H2O

NH N HN
HN

COOH COOH COOH COOH

protopophyrinogen IX protoporphyrin IX

Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX

23
1.5.4 Đưa ion Mg2+ vào hệ thống vòng
Quá trình hình thành chlorophyll bằng việc đưa ion Mg2+ vào vòng
protoporphyrin IX (hình 1.20). Tiếp sau đó Magiê-protoporphyrin IX bị
monometyleste hóa bên nhóm propionic của vòng III để chuẩn bị cho phản ứng tạo
vòng V. Kết thúc quá trình là sự tạo vòng cacboxyclic V dưới tác dụng của enzym
cyclase sau đó là quá trình devinyl hóa, khử hóa chọn lọc và phytyl este hóa tạo
thành chlorophyll a.

I II
NH N
2+ N N N N
+Mg
Mg Mg
N N N N N
HN
IV III

COOH COOH COOH COOH COOH COOMe

Mg protoporphyrinogen IX
protoporphyrin IX Mg protoporphyrinogen IX monomethylester

NADPH
NADP + NADPH +
N N NADP N N
Mg Mg
enzym Cyclase - vinyl
N N N N

V V

MeOOC O MeOOC O
COOH COOH
divinyl protochlorophyllide a monovinyl protochlorophyllide a

phytyl PP I II
NADPH PPi N
NADP + N N N
Mg Mg
protochlorophyllide N
enzym oxidoreductase N N N
IV III

V V

MeOOC O MeOOC O
COOH COO phytyl
chlorophyllide a chlorophyll a

Hình 1.20: Quá trình hình thành chlorophyll a[10,30,33]

24
1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward
Woodward tổng hợp chlorophyll vào năm 1960 là một sự đóng góp vô giá
trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ. Quá trình này chỉ được áp dụng cho chlorophyll a
mà không phải là phương pháp chung cho tổng hợp các hợp chất tương tự vì vậy bài
toán tổng hợp toàn phần chlorophyll a vẫn còn là một trong những bài toàn khó
khăn nhất của Hóa hữu cơ.
NHAc NH2
NC CN S N

H Et Et
A B B H
A HN
NH HN NH NH HN
10 12 CH2Cl
OHC
NH N NH N
NH C
D HN D O O
C

CO2Me CO2Me
11 13 CO2Et 14 15
MeO2C CO2Me MeO2C MeO2C 16 CO2Me
NHAc NHAc

Et
Et NH N
NH N
NH N

N HN N HN
N HN
Me

CO2Me O
CO2Me MeO
O
MeO2C 17 CO2Me 18 COOMe 19
MeO2C CO2Me

NH N N
N
Mg
N N N
HN

COOMe
MeO2C O
COOMe 9 COOMe
O O phytyl 1

Hình 1.21: Woodward tổng hợp chất chlorophyll a.

Chlorin e6- trimetylester được tạo thành bởi 46 bước từ các pyrol khác nhau.
Con đường tổng hợp đặc thù từ liên kết giữa hai nửa của bicyclic pyrol AD 14 và
BC 15 để hình thành porphyrin 17. Tiếp theo là phản ứng khử chọn lọc của một
nhánh axit prôpionic tạo ra dẫn suất acrylic metylester 17. Porphyrin 17 chuyển
thành purpurin 18 và sau đó là isopurpurin-5-methyl ester 19, một tiền chất cho sự

25
hình thành của chlorin e6- trimetylester 9. Sự hoán chuyển giữa porphyrin-chlorin
17-18 là phản ứng chính cho sự hình thành chlorin trong quá trình tổng hợp, đó là
quá trình đồng phân hóa giữa porphyrin thành chlorin duy nhất được quan sát cho
đến ngày nay.
Các bước cuối cùng cho việc tạo thành chlorophyll a từ chlorin e6-
trimetylester lần đầu tiên được tiến hành nghiên cứu bởi H. Fisher và đã được cải
thiện bởi K.M.Smith, P. Hynninen và F.-P. Montforts.
Cuối cùng là đưa ion Mg2+ vào hệ thống vòng được tìm ra bởi Eschemoser.

26
 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu thực nghiệm

Xây dựng quy trình tách chiết chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hoá
thành các dẫn xuất của chlorophyll a.
2.2 Xác định các tính chất vật lý.
2.2.1 Sắc kí bản mỏng
Được thực hiện với các bản mỏng Silicagel 60F254 tráng trên lá nhôm của hãng
Merk ( Đức).
2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại của các chất ở dạng ép viên với KBr trên máy Impact 410 -
Nicolet hoặc được đo trên máy GX - Perkin Elmer - USA tại các đơn vị: Viện Hoá
học - thuộc viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, khoa Hoá học trường đại học
khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội.
2.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker Ultrashield
TM 500 tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, trường đại học khoa học tự nhiên
TP HCM. Dung môi là CDCl3, chất chuẩn nội là TMS.
2.2.4 Phổ khối (MS)
Phổ khối của các hợp chất được đo trên máy LC - MS ( OBBITRAP - XL -
USA) tại khoa Hóa học trường đại học khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội
và tại Viện Khoa học & công nghệ Việt Nam.
2.2.5 Phổ tử ngoại
Phổ tử ngoại của các hợp chất được đo trên máy UV-2450 của Nhật với dung
môi THF (tetrahyđrofuran), tại khoa Hoá học trường đại học khoa học tự nhiên -
Đại học quốc gia Hà Nội.
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1

27
 Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và
thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a và metyl
pheophobide a.
2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a (PP)

3 4 5
7
2 6 8

N N 1 NH N 9
21 22
Mg 20 10
24
Vi khuẩn lam
a H+ 23
N N 19 N HN 11
b
12
18 16 14 13
17 15
MeOOC O O
MeOOC
COO Phytyl COO Phytyl
C55H72N4O5Mg C55H74N4O5
893.50
871.22
Chlorophyll a
Pheophytin a
a: Axeton, reufux 2h
b: H2SO4

Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a

2.3.1.1.1 Xây dựng qui trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam
Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu 1lit, sau đó thêm vào hỗn hợp 400ml
axeton rồi đem đun hồi lưu 2h trong bóng tối. Hỗn hợp sau phản ứng được lọc lấy
dịch bằng giấy lọc băng xanh, rửa bằng axeton. Dịch lọc có chứa chlorophyll a được
cô quay để loại bỏ dung môi. Khi đó phần cặn thu được bao gồm chlorophyll a,
caroten, phycoxyanin và bẩn.
2.3.1.1.2 Phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a.
 Quy trình
Phần chất rắn thu được sau khi cô quay được đem thực hiện phản ứng để loại
bỏ ion Mg2+ trong chlorophyll a như sau: Thêm vào bình cầu chứa chất rắn 100ml
dung dịch axeton, 5ml dung dịch H2SO4 1M rồi đêm khuấy hỗn hợp phản ứng 1h
trong bóng tối. Trong quá trình khuấy, kiểm tra tiến trình phản ứng bằng sắc kí bản
mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/Acetone = 10:0,4.
Hỗn hợp sau khuấy được đổ vào 300ml nước, chiết bằng 200ml CH2Cl2. Cô

28
quay dịch chiết để loại bỏ dung môi. Làm khô phần rắn thu được và tách bằng sắc
kí cột (Silicagen, CH2Cl2/Axetone = 10:0,4 ). Sản phẩm được kết tinh bằng
CH2Cl2/n-pentan.
2.3.1.2 Phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a (MPP)

N N NH N
Mg
a b
Vi khuẩn lam N N N HN

MeOOC O
MeOOC O
COO Phytyl
COOMe

chlorophyll a metyl pheophobide a

a: Axeton, reufux 2h
b: CH3OH/H2SO4 5%

Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a

 Quy trình 1
Thực hiện quá trình như 2.3.1.1 để thu được hỗn hợp cặn chứa chlorophyll a.
Làm khô cặn và cho vào bình cầu 500ml. Tiếp đó, thêm 100ml CH3OH, 5ml H2SO4
đặc. Đem khuấy hỗn hợp trong bóng tối 20h. Sau đó hỗn hợp sau phản ứng được
thêm 200ml CH2Cl2 , 300ml nước, 60ml NaHCO3 10% . Sau đó chiết với CH2Cl2.
Dịch chiết được rửa lại bằng H2O (3 x 200ml), sau đó được cô quay để loại bỏ dung
môi, làm khô cặn thu được.
Cặn được hoà tan trong 10ml CH2Cl2 để sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/Acetone = 10:0,1)
tách được metyl pheophobide a. Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/CH3OH.
2.3.2 Nội dung 2
Nghiên cứu quá trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển
hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và chuyển vị
este một giai đoạn.

29
 5 7
3 4
6 8
2

1 NH 21 N 9
22
20 10
24
Vi khuẩn lam 19 N
23 11
HN
18 12
16 14
17 15 13

MeOOC O
COOMe

metyl pheophobide a

Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metylpheophobide a

từ vi khuẩn lam
 Quy trình 2
Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu dung tích 500 ml. Thêm vào đó 300ml
CH3OH, 15ml H2SO4 đặc, khuấy hỗn hợp trong bóng tối 3-5h. Sau đó đem lọc hỗn
hợp bằng giấy lọc băng xanh, rửa hỗn hợp bằng CH2Cl2. Dịch lọc thu được được
thêm 200ml CH2Cl2, 500ml H2O, 180ml NaHCO3. Sau đó đem chiết với CH2Cl2.
Dịch chiết được rửa lại bằng H2O (3x 300ml), rồi đem cô quay để loại bỏ dung môi
và làm khô chất rắn thu được.
Hoà tan chất rắn bằng 10ml CH2Cl2 để đem sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/
/Axetone = 10:0,1) tách được mety pheophobide a. Sản phẩm được kết tinh bằng
CH2Cl2/ CH3OH.
2.3.3 Nội dung 3
Nghiên cứu phản ứng chuyển hóa metyl pheophorbide a thành chlorin-e6-
trimetylester bằng phản ứng mở vòng cacboxyclic.

30
 5 7
3 4
6 8

NH 2
N +MeOH 1 NH 21 N 9
20 22
10
MeOK/MeOH 24
N 23 11
HN 19 N HN
12
18 16 14 13
17 15
COOMe
MeOOC O
COOMe
COOMe COOMe
metyl pheophobide a chlorin e6 - trimethylester

Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester
 Quy trình
Lấy 151,6 mg Metylpheophobide hoà tan trong 10ml THF. Sau đó thêm
100ml CH3OH, 2ml hỗn hợp dung dịch CH3OK/ CH3OH 30-35%. Khuấy hỗn hợp
trong bóng tối trong vòng 3h, trong quá trình khuấy kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng
(CH2Cl2/EtOAc = 7:1).
Sau đó, thêm 400ml H 2O, chiết với 200ml CH2 Cl2 , rồi rửa lại dịch chiết
bằng H2 O (4x 200ml). Dịch chiết được cô quay để loại bỏ dung môi và làm khô.
Sản phẩm được tinh chế bằng sắc kí cột (CH2Cl2/EtOAc = 7:1) và kết tinh
bằng Axetone/CH3OH.
2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến,
phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và phổ khối.
2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a
Rf: 0,58
IR (KBr):~ = 3402.29 cm-1 (w, N-H), 2931.15 (m), 2867 (w), 1737.30 (s, br,
C=O, este), 1694.16 (s, C=O, este), 1615.96 (w, C=C, vòng thơm), 1451.48 (w),
1349.0 (w), 1160.26 (m, br, C-O-C), 1000 (w), 971.51 (w), 731.53 (w), 610.19 (w).-
UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 410 (120.58), 667.5 (56.29).-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3):  132R [132S] = - 1.61 ppm [- 1.43] (s, br, 1H,

31
NH), 0.57 (s, br, 1H, NH), 0.78 - 0.88 (br, 12H, 4CH3, chuỗi phytyl ), 1.20 - 1.30
(br, 21H, CH, CH2, chuỗi phytyl), 1.69 (s, 3H, CH3-CH=, chuỗi phytyl), 1.72 (t, 3J
= 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.81 (d, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 181), 2.10 - 2.60 (m, 4H,
2CH2, 171 và 172), 3.26 (s, 3H, CH3, 71), [3.38] 3.41 (s, 3H, CH3, 21), [3.68] 3.71 (s,
3H, CH3, 121), 3.70 (q, 3J = 7.50 Hz, 2H, CH2, 81), 3.90 (s, 3H, CH3, 132), 4.20 -
4.25 (m, 1H, CH, 17), 4.4 - 4.49 (m, 3H, CH, CH2, CH2-CH=C-CH3, chuỗi phytyl
và 18), 5.14 (t, 3J = 6.00 Hz, 1H, CH, CH2-CH=C-CH3, chuỗi phytyl), 6.20 (d, 3J =
11.50 Hz, cis - vinyl, 1H, =CH2, 32 ), 6.28 (s, 1H, CH, 132), 6.31 (d, 3J = 17.50 Hz,
trans - vinyl, 1H, =CH2, 32), 8.00 (dd, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 3J = 17.50 Hz,
trans - vinyl, 1H, =CH, 31), [8.48] 8.55 (s, 1H, meso proton), [9.35] 9.41 (s, 1H,
meso proton), [9.49] 9.53 (s, 1H, meso proton). -
MS : M+=871.
2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a
Rf : 0,57
IR (KBr):~ = 3376.54 cm-1 (w, N-H), 2930.19 (w), 2859.35 (w), 1743.82 (s,
C=O, este), 1790.92 (s, C=O, este), 1618.52 (m, C=C, vòng thơm), 1437.52 (w),
1214.76 (s, C-O-C, este), 1164.63 ( s, br, C-O-C, este), 980.85 (w), 897.31 (w),
746.95 (w).-
UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 410 (106.05), 610.0 (7.87), 667.5 (48.86).-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3):  132R [132S] = - 1.61 ppm [- 1.43] (s, br, 1H,
NH), 0.54 [0.86] (s, br, 1H, NH), 1.8 (t, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.82 (d, 3J =
7.50 Hz, 3H, CH3, 181), 2.10 - 2.70 (m, 4H, 2CH2, 171 và 172), [3.20] 3.25(s, 3H,
CH3, 71), 3.39 (s, 3H, CH3, 21), 3.59 (s, 3H, CH3, 121), 3.66 (q, 3J = 6.50 Hz, 2H,
CH2, 81), 3.70 (s, 3H, CH3, 174), [3.84] 3.89 (s, 3H, CH3, 153), 4.21 (m, 1H, CH, 17),
4.46 (q, 3J = 5.5 Hz, 1H, CH, 18), 6.20-6.28 (d, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, =CH2, 32),
6.28 (s, 1H, CH, 132), 6.30 (d, 3J = 17.50 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH2, 32), 7.98 (dd,
3
J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 3J = 17.50 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH, 31), [8.52] 8.59 (s,
1H, meso proton), [9.35] 9.41 (s, 1H, meso proton), [9.49] 9.54 (s, 1H, meso
proton).-

32
 MS: 607 [M + H]+
2.4.3 Cấu trúc của chlorin e6 – trimetylester
Rf : 0,59
IR (KBr):~ = 3295 cm-1 (w, N-H), 2953.53 (m, C=CH), 2860.79 (w), 1718.83
(s, br, C=O, este), 1595.96 (m, C=C, vòng thơm), 1437.98 (m), 1236.12 (m, br, C-
O-C), 1165.90 (m), 1063.51 (m), 893.82 (w), 845 (w),729.99(w).-
UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 401 (123.51), 666 (42.44).-
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3):  = - 1.47 ppm (s, br, 1H, NH), -1.29(s, br, 1H,
NH), 1.71 (t, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.77 (d, 3J = 7.30 Hz, 3H, CH3, 181), 2.18 -
2.22 (m, 4H, 2 CH2, 171 và 172), 3.29 (s, 3H, CH3, 71), 3.46 (s, 3H, CH3, 21), 3.57 (s,
3H, CH3, 121), 3.63 (s, 3H, CH3, 174), 3.78 (q, 3J = 7.50 Hz, 2H, CH2, 81), 4.26 (s,
3H, CH3, 153), 4.44 (q, 3J = 7.00 Hz, 1H, CH, 18), 5.25 (d, 1H, 2J = 19.00 Hz, CH2,
151), 5.33 (d, 1H, 2J = 19.00 Hz, CH2, 151), 6.15 (d, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 1H,
=CH2, 32 ), 6.36 (d, 3J = 18.00 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH2, 32), 8.08 (dd, 3J = 11.50
Hz, cis - vinyl, 3J = 17.50 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH, 31), 8.74 (s, 1H, meso proton),
9.56 (s, 1H, meso proton), 9.87 (s, 1H, meso proton), 9.69(s, 1H, meso proton).
MS: M+= 638

33
 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a.

 Phƣơng trình phản ứng

N N NH N
Mg +2H+
N N N HN + Mg2+

MeOOC O MeOOC O
COO Phytyl COO Phytyl

chlorophyll a pheophytin a
Sau khi thực hiện quá trình chuyển hoá từ 100g vi khuẩn lam thu được 0,5g
pheophytin a (hiệu suất 0,5%).
Chlorophyll a là một chất rất không bền, trong môi trường axit, liên kết N
– Mg – N bị phá vỡ, ion Mg2+ bị H+ đẩy ra và thế chỗ, tạo thành chất mới
pheophytin a có màu đen ánh.
Nếu thực hiện phản ứng trong môi trường axit mạnh đặc và đun nóng thì
pheophytin a có thể bị thủy phân liên kết este với rượu phytol tạo thành hợp chất
pheophorbide a. Vì vậy khi tiến hành phản ứng chỉ dùng axit loãng và khuấy ở nhiệt
độ phòng.
Phổ hồng ngoại xuất hiện các pic đặc trưng ~ = 3402.29 cm-1 (w, N-H),
1737.30 (s, br, C=O, este), 1694.16 (s, C=O, este), 1615.96 (w, C=C, vòng thơm),
1160.26 (m, br, C-O-C),...
Trên phổ UV-VIS xuất hiện hai dải hấp thụ cường độ cao rất đặc trưng cho
các hợp chất chlorin là soret-band ở 410nm (ε =120580) và Q-band ở 667nm
(ε =56290).

34
 Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng và rõ ràng của
các proton.
Trên phổ khối thấy xuất hiện pic có M = 871 trùng với pic phân tử khối của
chất.
Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ 1H – NMR của pheophytin a

 (ppm) Tín hiệu đặc trưng

-1.61 s, br, 1H, NH
-0.57 s, br, 1H, NH
1.69 s, br, 3H, CH3 – CH = (chuỗi phytyl)
2.10-2.60 m, 4H, 2CH2 (171 và 172)
4.40-4.49 m, 3H, CH, CH2 – CH=C – CH3 (18 và
chuỗi phytyl)
3 4 5
7
2 6 8 5.14 t, 3J=6.00Hz, 1H, CH,
1 NH N 9 CH2 – CH = C – CH3
21 22
10
20 24
23
6.20 d, 3J=11.50Hz, cis-vinyl, 1H, =CH2 ( 32)
19 N 11
HN
6.31 d, 3J=17.50Hz, trans-vinyl, 1H, =CH,
12
18 16 14
17 15 13 (32)
MeOOC O 8.00 dd, 3J=11.50, cis-vinyl, 1H, =CH (31) .
COO Phytyl 3
J=17.50Hz, trans-vinyl, =CH (31)
8.55 s, 1H, meso proton
9.41 s, 1H, meso proton
9.53 s, 1H, meso proton

35
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của pheophytin a

Hình 3.2: Phổ UV – VIS của pheophytin a

36
Hình 3.3: Phổ khối của pheophytin a

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của pheophytin a

37
3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a.
 Phƣơng trình phản ứng

N N NH N
Mg
a b
Vi khuẩn lam N N N HN

a. Axeton MeOOC O
MeOOC O
b. CH3OH/H2SO4 5% COO Phytyl COOMe
chlorophyll a metyl pheophobide a

N NH NH N
N N
+2H+ +CH3OH
Mg
N N HN
N -Mg2+ N HN - phytyl

MeOOC O MeOOC O
MeOOC O
COO Phytyl COOMe
COO Phytyl

chlorophyll a pheophytin a metyl pheophobide a

Trong môi trường axit, nhân Mg bị đẩy ra khỏi phân tử chlorophyll a, thế vào
đó là nguyên tử H. Hai nhóm este trong phân tử chlorophyll a, nhóm -
COOphytyl kém bền với axit dễ xảy ra phản ứng thuỷ phân và chuyển vị este với
CH3OH để tạo thành nhóm -COOCH3.
Với quy trình 1, kết quả thu được 680mg tinh thể metyl pheophobide a (Hiệu
suất 0,68%).
Với quy trình 2 thu được 530,4mg metyl pheophobide (Hiệu suất 0,5304%).
Rf : 0.57 (Alox, CH2Cl2/Acetone = 10:0,4)
Phổ hồng ngoại xuất hiện các pic đặc trưng ~ = 3376.54 cm-1 (w, N-H),
1743.82 (s, C=O, este), 1790.92 (s, C=O, este), 1618.52 (m, C=C, vòng thơm),
1214.76 (s, C-O-C, este), 1164.63 ( s, br, C-O-C, este),...

38
 Trên phổ UV-VIS xuất hiện hai dải hấp thụ cường độ cao rất đặc trưng cho
các hợp chất chlorin là soret-band ở 410nm (ε =106050) và Q-band ở 667nm
(ε =48860).
Phổ 1H – NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu như đã chứng minh.
Trên phổ khối xuất hiện pic có M=607 tương ứng pic phân tử khối của phân tử
[M+H]+
Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ 1H – NMR của metyl pheophobide a
 (ppm) Tín hiệu đặc trưng
-1.61 S, br, 1H, NH
0.54 s, br, 1H, NH
1.80 t, 3J=7.50Hz, 3H, CH3 ( 82)
1.82 d, 3J=7.50Hz, 3H, CH3 (181)
2.10-2.70 m, 4H, 2CH2 ( 171 và 172)
3.25 s, 3H, CH3 (71)
5 7
3 4
6 8 3.39 s, 3H, CH3 (21)
2

3.59 s, 3H, CH3 (121)

1 NH 21 N 9

20
22
10 3.66 q, 3J=6.50Hz, 2H, CH2 (81)
24
23
19 N HN
11 3.70 s, 3H, CH3 ( 174)
18
16 14
12 3.89 s, 3H, CH3 (153)
17 15 13
4.21 m, 1H, CH (17)
MeOOC O 4.46 q, 3J=5.50Hz, 1H, CH(18)
COOMe
6.20-6.28 d, 3J,=11.50Hz, cis-vinyl,1H,=CH2(32)
6.30 d, 3J= 17.50Hz, trans-vinyl, 1H, =CH2
(32)
7.98 dd, 3J=11.50Hz, cis-vinyl, 3J=17.50Hz,
trans-vinyl, 1H, CH (31)
8.59 s, 1H, meso proton
9.41 s, 1H, meso proton
9.54 s, 1H, meso proton

39
 Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của metyl pheophobide a

Hình 3.6: Phổ UV – VIS của metyl pheophobide a

40
 Hình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a

Hình 3.8: Phổ 1H – NMR của metyl pheophobide a

41
  Đánh giá hai phƣơng pháp
Theo quy trình 1 chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a, hiệu
suất thu được cao hơn so với quy trình 2 (tách chiết chlorophyll a và chuyển trực
tiếp thành metyl pheophobide một giai đoạn). Ở quy trình 1, chlorophyll a được
tách ra cùng các chất màu khác trong vi khuẩn lam bằng dung môi axeton, loại bỏ
được các cặn bã vi khuẩn, đo đó sự tiếp xúc va chạm với các tác nhân phản ứng cao
hơn, phản ứng xảy ra dễ dàng và hiệu quả. Trong khi ở quy trình 2, do phản ứng
trực tiếp với chlorophyll a trong vi khuẩn, sự tiếp xúc không cao và chậm; thời gian
phản ứng không vì thế mà kéo dài. Nếu thực hiện phản ứng quá lâu thì sẽ tạo ra
nhiều sản phẩm phụ không mong muốn.
3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6 - trimetylester
 Phản ứng hoá học

NH N NH N NH
+MeOH N

N HN N - MeOO
HN N HN

V
O COOMe COOMe
OMe O
MeOOC O COOMe COOMe
COOMe COOMe COOMe
metyl pheophobide a chlorin e6 - trimethylester

Từ 151,6 mg metyl pheophobide a chuyển hoá được thành 108,9 mg chlorin e6

– trimethylester ( hiệu suất 68,27% %).
Phản ứng được thực hiện trong môi trường kiềm mạnh MeOK/CH3OH. Nhóm
MeO- sẽ tấn công vào vòng V và thực hiện phản ứng mở vòng cacboxylic, chuyển
sang dạng trung gian và cuối cùng được sản phẩm là chlorin e6 - trimetylester.
Methyl pheophorbide a và chlorin e6-trimetylester kém hòa tan trong methanol
ở nhiệt độ thấp, điều này ngăn cản phản ứng đồng nhất, vì vậy cần một dung môi
thứ 2 để giữ cho phản ứng xảy ra đồng nhất. Với mục đích này, dung môi thứ hai

42
được dùng là THF (tetrahidrofuran).
Trong phản ứng metanol phân, để ngăn chặn allomerization, nên tránh oxi mặc
dù metanol phân xảy ra nhanh hơn allomerization [2].

NH N NH N NH N
O2
base
N N HN N
HN HN

O MeOOC OH
MeOOC
7 COOMe 20
MeOOC O O OH 21
COOMe COOMe

NH N NH NH
MeOH N -H2O N

N HN N N
HN HN

O COOH O
MeO
OH HO MeO O O
COOMe
COOMe COOMe COOMe COOMe COOMe
22 23 24

Allomerization của methyl pheophorbide a trong methanol

Về mặt lý thuyết và thực tế, phản ứng metanol phân không thể tiến hành hoàn
toàn do có phản ứng ngược lại, vì vậy hỗn hợp phản ứng luôn luôn có chứa chlorin
e6-trimetylester và lượng nhỏ methyl pheophorbide a. Thời gian lưu của
methylpheophorbide a và chlorin e6-trimetylester trên silicagel hoặc ôxít nhôm là
khá tương tự khó có thể tách rời một cách rõ ràng bởi sắc ký hoặc HPLC. Do đó vệc
kết tinh chlorin e6-trimetylester rất quan trong để cho được sản phẩm sạch tinh khiết.
Phổ hồng ngoại xuất hiện các pic đặc trưng ~ = 3295 cm-1 (w, N-H), 2953.53
(m, C=CH), 1718.83 (s, br, C=O, este), 1595.96 (m, C=C, vòng thơm), 1236.12 (m,
br, C-O-C), …
Trên phổ UV-VIS xuất hiện hai dải hấp thụ cường độ cao rất đặc trưng cho
các hợp chất chlorin là soret-band ở 401 (ε =123510) và Q-band ở 666nm

43
(ε =42440).
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng và rõ ràng của
các proton.
Kết quả trên phổ khối cho thấy pic có M = 638 trùng với pic phân tử khối của
phân tử.
Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ 1H – NMR của chlorin e6 - trimetylester
 (ppm) Tín hiệu đặc trưng
-1.47 s, br, 1H, NH
-1.29 s, br, 1H, NH
1.71 t, 3J=7.50Hz, 3H, CH3 (82)
1.77 d, 3J=7.30Hz, 3H, CH3 (181)
2.18-2.22 m, 4H, 2CH2, (171 và 172)
3.29 s, 3H, CH3, (71)
3.46 s, 3H, CH3, (21)

5
3.57 s, 3H, CH3, 121
7
3 4
6 8 3.63 s, 3H, CH3, (174)
2
1 NH 21 N 9 3.78 q, 3J=7.50Hz, 2H, CH2, (81)
22
20
24
10
4.26 s, 3H, CH3, (153)
23 11
19 N HN 4.44 q, 3J=7.00Hz, 1H, CH, (18)
12
18 16 14 13 5.25 d, 1H, 2J=19.00Hz, CH2, (151)
17 15
COOMe 5.33 d, 1H, 2J=19.00Hz, CH2, (151)
COOMe 6.15 d, 3J=11.50Hz, cis-vinyl, 1H, =CH2, (32)
COOMe
6.36 d, 3J=18.00Hz, trans-vinyl, 1H,
=CH2, (32)
8.08 dd, 3J=11.50Hz, cis-vinyl,
3
J=17.50Hz, trans-vinyl, 1H, =CH, (31)
8.74 s, 1H, meso proton
9.56 s, 1H, meso proton
9.87 s, 1H, meso proton
9.69 s, 1H, meso proton

44
Hình 3.9: Phổ UV – VIS của chlorin e6 - trimetylester

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trimetylester

45
 Hình 3.11: Phổ khối của chlorin e6 – trimetylester

Hình 3.12: Phổ 1H – NMR của chlorin e6 - trimetylester

46
 CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN

Từ vi khuẩn lam, bằng dung môi axeton đã tách chiết được chlorophyll a và
chuyển hoá thành pheophytin a.
Từ vi khuẩn lam, xây dựng hai quy trình chuyển hoá chlorophyll a thành metyl
pheophobide a: con đường tách chiết chuyển hoá gián đoạn và con đường chuyển
hoá trực tiếp một giai đoạn.
Từ metyl pheophobide a chuyển hoá thành chlorin e6 - trimetylester bằng
phương pháp mở vòng cacboxylic.
Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm thu được bằng các phương pháp phổ cho thấy
chất tinh khiết.

47
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Adams .D. B, Adams. W. W, Ann. Rev, (1992), “ Plant Physiol plant Mol Biol”,
Plant Physiol. Plant Molec. Biol, 43, pp. 599.
2. Armstrong.G , Apel. K, (1998), “Molecular and genetic analysis of light-
dependent hlorophyll biosynthesis, Photosynthesis”, Molecular biology of
energy capture. Eds., Academic Press, San Diego, CA. pp. 237- 244.
3. Blankenship. R. E, (2002), Molecular Mechanisms of Photosynthesis, Eds.,
Blackwell Science, pp. 42-126.

4. Cogdell . R. J, Lindsay. J. G, (2000), “The structure of photosynthetic complexes in

bacteria and plants: an illustration of the importance of protein structure to
the future development of plant science”, Tansley New Phytologist, 145, pp.
167-196.
5. Campbell. N, Reece. J, (2005), “San Francisco: Benjamin Cummings”,
Biology 7th.
6. Deisenhofer. J, Huber. R, Michel. H, (1988), “The determination of the three-
dimensional structure of a photosynthetic reaction center”, The Nobel Prize
in Chemistry .
7. Frank. H. A, Cua. A, Chynwat. V, Young. A, Gosztola. D, Wasielewski. M. R,
(1994), Photosynth. Res, 41, pp. 389.
8. Gregory. R. P. F, (1971), Biochemistry of Photosynthesis, Eds., Belfast:
Universities Press.
9. Govindjee, (1975), Bioenergetics of Photosynthesis, Eds., New York: Academic
Press .
10. Govindjee, Beatty. J. T, Gest. H, Allen. J. F, “Discoveries in Photosynthesis”,
(2005), Advances in Photosynthesis and Respiration, Eds., Springer , 20.
11. Hynninen. P. H, (1991), “Chemistry of Chlorophylls: Modification in
Chlorophylls”, Chlorophylls, H. Scheer, Eds., Boca Raton Ann Arbor

48
 Boston London , 1, pp. 145-209.
12. Kühlbrandt .W, Wang. D. N, Fujiyoshi. Y, (1994), “Atomic model of plant
light-harvesting complex by electron crystallography”, Nature, 367, pp. 614.

13. Kessel. D, Woodburn. K, Gomer .C. J, Jagerovic .N, Smith. K. M, (1995) ,

J. Photochem. Photobiol. B : Biol, 28, pp. 13-18.
14. Kusch .D, Meier. A, Montforts F. P, (1995), “Synthesis and Characterization of
Amphiphilic Chlorins for Photodynamic Tumor Therapy”, Liebigs Ann. Chem,
pp. 1027-1032.
15. Liu. Z, Yan. H, Wang. K, Kuang. T, Zhang . J, Gui. L, An . X, Chang. W,
(2004), “ Crystal structure of spinach major light-harvesting complex at
2.72 Angstrom resolution”, Nature , 428, pp. 287.
16. Li. L, Kodama. K, Saito. K, Aizawa. K, (2000), “ Photosensitization with
derivatives of chlorin p6”, J. Photochem. Photobiol. B : Biol., 67, pp. 51-56.
17. Ma. L, Bagdonas. S, Moan .J, (2001), J. Photochem. Photobiol. B : Biol, 60, pp.
108-113.
18. Montforts. F.-P, Glasenapp-Breiling. M, (2002), “Naturally Occurring
Tetrapyrroles” in Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Eds.,
Springer, Wien/ New York , 84, pp. 1-51.
19. Montforts. Glasenapp-Breiling. F.-P, M, (1998), Prog. Heterocycl. Chem, 10,
pp. 1-24.
20. Michalle, Sean. P. N, Barry. D. C, Michael. W, (2002), Journal of
antimocrobial chemotherapy , 50, pp. 857-864.
21. Malkin. R, Niyogi. K, Buchanan. B. B, Gruissem. W, Jones. R, (2000),
“American Society of Plant Physiologists” Biochemistry and Molecular
Biology of Plants., Eds., Rockville, MD , pp. 575-577.
22. Murugesan .S, Shetty .S. J, Srivastava .T. S, Samuel. A. M, Noronha .O. P. D,
(2002), J. Photochem. Photobiol. B : Biol., 68, pp. 33-38.
23. Montforts .F.-P, Gerlach .B, Haake. G, Höper .F, Kusch .D, Meier. A,
Scheurich .G, Brauer .H. D, Schiwon. K, Schermann. G, (1995), Proc. SPIE -

49
 Int. Soc. Opt. Eng, 2325, pp. 29-39.
24. Montforts .F.-P, Kusch .D, Höper. F, Braun. S, Gerlach. B, Brauer .H.-D,
Schermann .G, Moser .J. G, (1996), Proc. SPIE - Int. Soc. Opt. Eng, 2675,
pp. 212-221.
25. Oertel. M, Schastak .S. I, Tannapfel. A, Hermann . R, Sack. U, Mössner. J, Berr .
F, (2003), J. Photochem. Photobiol. B : Biol, 71, pp. 1-10.
26. Olso. J. M, Blankenship. R. E, (2004), Photosynth. Res, 80, pp. 373-86.
27. Phillip. D, Ruban .A. V, Horton. P, Asato. A, Young .A, (1996), J. Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA, 93, pp. 1492.
28. Rhee. H, Morris. E. P, Barber. J, Kühlbrandt. W, (1998), Nature, 396, pp. 283-
286.
29. Roszak. A. W, Howard. T. D, Southall. J, Gardiner. A. T, Law. C. J,
Isaacs. N. W, Cogdell. R. J, (2003), Science , 302, pp. 1969-1972.
30. Rabinowitch. E, Govindjee, (1969), Photosynthesis, Eds., New York: John
Wiley & Sons, Inc.
31. Scheer. H, (1991), “Chemistry of Chlorophylls: Structure and occurrence of
chlorophylls”, Chlorophylls, H. Scheer, Eds., Boca Raton Ann Arbor
Boston London, 1, pp. 3-30.
32. Schmidt. W, Montforts. F.-P, (1997), Synlett, pp. 903-904.
33. Stern, Kingsley. R, Jansky. S, Bidlack. J. E, (2003), Introductory Plant Biology,
Eds, McGraw Hill .
34. Webber. J, Leeson. B, Fromm. D, Kessel. D, (2005), J. Photochem. Photobiol.
B : Biol. 78, pp. 135-140.

50
PHỤ LỤC

51
52
PHỔ KHỐI

53
54
55
56
PHỔ HỒNG NGOẠI

57
58
59
60
PHỔ UV – VIS

61
Phổ UV – VIS của Pheophytin a

1
Phổ UV- VIS của metylpheophobide a

2
Phổ UV – VIS của chlorin e6- trimethylester

3
PHỔ 1H – NMR

1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11