Phan Huy PE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Polyethylene là loại nhựa nhiệt dẻo đang được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp,
công nghiệp và cả trong cuộc sống hàng ngày của con người bởi những đặc tính đặc biệt.
Tuy nhiên, ô nhiễm gây ra bởi polyethylene (PE) cũng vô cùng nghiêm trọng. Với mục
đích của luận văn là phân lập hệ vi sinh vật trong ấu trùng bướm Galleria mellonella và
chứng minh khả năng phân hủy PE của chủng phân lập để góp phần tìm ra giải pháp phân
hủy rác thải từ PE giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Hệ tiêu hóa của ấu trùng bướm Galleria mellonella được tách và tăng sinh trong
môi trường LCFBM. Khi cho ấu trùng bướm tiếp xúc với tấm PE thì khối lượng PE giảm
3.68% so với ban đầu, tốc độ sử dụng PE của ấu trùng bướm Galleria mellonella là tương
đối chậm. Sản phẩm phân hủy PE của ấu trùng bướm Galleria mellonella được xác định
bằng phương pháp đo quang phổ FTIR. Kết quả cho thấy sản phẩm phân hủy PE là chất
có chứa nhóm –C=O của carbonyl, nhóm –OH của ethylene glycol và cả nhóm –CH của
polyethylene, chứng tỏ tấm PE đã xảy ra quá trình oxy hóa làm thay đổi cấu trúc của PE.
Kết thúc quá trình phân lập thu được 1 chủng có khả năng phân hủy PE là Enterobacter
cloacae. Enterobacter cloacae có thể sinh trưởng và phát triển trong môi trường có
nguồn carbon duy nhất từ PE. Ngoài ra, Enterobacter cloacae còn làm cho bề mặt tấm
PE bị biến đổi hình dạng tạo thành các hố sâu, rãnh, làm giảm lực liên kết giữa các
monomer trong PE dẫn đến độ bền kéo giảm 48.53% so với ban đầu. Do đó, có thể khẳng
định Enterobacter cloacae có khả năng phân hủy PE.
i
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1. Polyethylene ...................................................................................................... 3
1.1.1. Phân loại ..................................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất ..................................................................................................... 5
1.1.3. Giá trị kinh tế .............................................................................................. 7
1.1.4. Vấn đề xử lý và giảm thiểu rác thải Polyethylene ...................................... 7
1.2. Ấu trùng bướm Galleria mellonella .................................................................. 9
1.3. Những nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài ......................... 10
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 18
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 18
2.2. Vật liệu, môi trường, hóa chất và trang thiết bị. ............................................. 18
2.2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 18
2.2.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 18
2.2.3. Hóa chất .................................................................................................... 19
2.2.4. Trang thiết bị ............................................................................................ 19
2.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 20
2.3.1. Thí nghiệm tiền đề .................................................................................... 22
2.3.2. Phân lập hệ vi sinh vật .............................................................................. 23
2.3.3. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy PE của chủng phân lập ..... 27
2.3.4. Các phương pháp phân tích ...................................................................... 28
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 32
3.1. Kết quả thí nghiệm tiền đề .............................................................................. 32
3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng sử dụng PE của ấu trùng bướm Galleria
mellonella. .............................................................................................................. 32
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng phân hủy PE của ấu trùng bướm Galleria
mellonella. .............................................................................................................. 32
3.2. Kết quả phân lập vi sinh vật ............................................................................ 34
3.3. Chứng minh khả năng phân hủy PE của chủng phân lập ............................... 35
3.3.1. Khả năng phân hủy PE trong môi trường LCFBM của chủng phân lập .. 35
3.3.2. Sự phát triển của chủng phân lập trên tấm PE .......................................... 36
3.3.3. Sự thay đổi bề mặt PE sau khi ủ bằng chủng vi sinh vật phân lập ........... 37
ii
3.4. Kết quả định danh chủng vi sinh vật phân hủy PE.........................................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 42
PHỤ LỤC.................................................................................................................. 45
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2-1: Thí nghiệm sự phân hủy PE trong môi trường LCFBM........................................27
Bảng 2-2: Thí nghiệm sự hình thành vi sinh vật trên tấm PE...................................................28
Bảng 3-1: Lực kéo đứt của tấm PE (GPa)……………………………………………..38
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ethylene (Richard G. Jones và cộng sự, 2008)...................................................3

Hình 1.2. Các sản phẩm từ nhựa LDPE (Ceresana, 2014).................................................4
Hình 1.3. Mức độ phân nhánh của polyethylene (Wolfgang Kaiser, 2011)........................5
Hình 1.4. Mảnh nhựa được tách ra từ đường tiêu hóa của rùa biển (Sarah E. Nelms và
cộng sự, 2015)...................................................................................................................8
Hình 1.5. Ấu trùng bướm Achroia grisella và bướm Achroia grisella trưởng thành
(Sarefo, 2007).................................................................................................................... 9
Hình 1.6. Ấu trùng bướm Galleria mellonella (Kevin Kavanagh và cộng sự, 2018) và
bướm Galleria mellonella trưởng thành (Simon Hinkley, 2011).......................................9
Hình 1.7. Kết quả đo FTIR: (a) Tấm PE chưa được xử lý; (b) Tấm PE đã xử lý.............11
Hình 1.8. Sự phát triển của VSV trên tấm PE trong môi trường CFBAM........................ 12
Hình 1.9. Bề mặt của tấm PE sau khi ủ với chủng YT1 và YP1 dưới kính hiển vi điện tử
quét SEM (a;c;e) và kính hiển vi lực nguyên tử AFM (b;d;f) (Jun Yang và cộng sự, 2014)
13
Hình 1.10. Tấm PE trước và sau khi xử lý với vi khuẩn (Esperanza Huerta Lwanga và
cộng sự, 2017).................................................................................................................. 14
Hình 1.11. Mức độ phân hủy PE của ấu trùng bướm Galleria mellonella (Paolo Bombelli
và cộng sự, 2017)............................................................................................................. 15
Hình 1.12. Kết quả phân tích FTIR (Paolo Bombelli và cộng sự, 2017)..........................16
Hình 1.13. Kết quả đo FTIR (Liu Ren và cộng sự, 2019)................................................ 16
Hình 2.1. Ấu trùng được tách ra khỏi môi trường cũ....................................................... 22
Hình 2.2. Tấm PE tiếp xúc với ấu trùng bướm Galleria mellonella................................. 22
Hình 2.3. Quá trình lọc phân sâu...................................................................................... 23
Hình 2.4. Máy đo lực kéo đứt QC-50............................................................................... 31
Hình 3.1. Tấm PE sau khi cho ấu trùng bướm Galleria mellonella tiếp xúc với PE........32
Hình 3.2. Kết quả đo FTIR của phân ấu trùng bướm Galleria mellonella.......................33
Hình 3.3. Khuẩn lạc hình thành trên môi trường CFBAM............................................... 34
Hình 3.4. Chủng T1 dưới kính hiển vi............................................................................. 35
Hình 3.5. Thí nghiệm trong môi trường LCFBM............................................................. 35
Hình 3.6. Đĩa đối chứng không có chủng T1................................................................... 36
Hình 3.7. Cấy chủng T1 lên môi trường CFBAM............................................................ 36
Hình 3.8. Bề mặt tấm PE (đối chứng).............................................................................. 37
Hình 3.9. Vi khuẩn T1 ở độ phóng đại ×5000.................................................................. 37
Hình 3.10. Bề mặt tấm PE (đối chứng)............................................................................ 38
Hình 3.11. Bề mặt tấm PE ở độ phóng đại x3000............................................................ 38
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PE : Polyethylene
SEM : Scanning electron microscopy
LCFBM : Liquid carbon free basal medium
CFBAM : Carbon free basal agar medium
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
HDPE : High density polyethylene
UHMWPE : Ultra high molecular weight polyethylene
MDPE : Medium density polyethylene
LLDPE : Linear low density polyethylene
LDPE : Low density polyethylene
VLDPE : Very low density polyethylene
SLS : Sodium Lauryl Sulfat
vi
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi đất nước ngày một phát triển, dân số ngày một tăng dẫn đến nhiều hệ
lụy về môi trường. Cùng với sự đa công dụng của polyethylene mà các sản phẩm dùng
một lần như hộp xốp, ly, màng bọc thực phẩm, áo mưa hay túi nhựa,... các sản phẩm bao
bì đóng gói để phục vụ cho ngành công nghiệp thức ăn nhanh được tạo ra với số lượng
ngày một lớn. Chính vì vậy mà lượng rác thải ngày một tăng lên gây ra nhiều vấn nạn về
môi trường. Polyethylene là một loại nhựa nhiệt dẻo đã và đang được sử dụng rất phổ
biến trên thế giới với sản lượng hàng năm tiêu thụ khoảng 140 triệu tấn (Jun Yang, 2014).
Khi nhắc đến các sản phẩm của PE, không ai có thể phủ định tầm quan trọng của nó trong
thời đại công nghiệp hóa, hiện đại hóa như ngày nay. Cùng với sự phát triển của khoa học
kỹ thuật, các sản phẩm của PE ngày càng đa dạng và có nhiều tính năng hơn. Sở dĩ chúng
có nhiều ứng dụng như vậy là do PE có các đặc tính như không dẫn điện, không dẫn
nhiệt, có khả năng chống phân hủy sinh học, nhẹ và rẻ. Do đó, vấn đề xử lý rác thải từ
các sản phẩm của PE mà không gây ảnh hưởng đến môi trường đang là mối quan tâm
hàng đầu của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Việt Nam.
Bao nylon có thành phần chính là PE, được xem là một trong những chất thải khó
phân hủy nhất hiện nay. Trong môi trường tự nhiên một túi nylon phải mất từ 200 đến
500 năm mới phân hủy hết gây nên hiện tượng “Ô nhiễm trắng”. Ô nhiễm trắng là một
loại ô nhiễm do túi nylon gây ra (Đặng Kim Chi, 2018). Chúng làm tắc các cống dẫn
nước gây ra tình trạng ngập lụt dẫn đến ruồi, muỗi phát sinh lây truyền nhiều dịch bệnh.
Không những thế, việc xử lý rác thải như đốt hay chôn lấp cũng để lại nhiều hậu quả vô
cùng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Do đó, chúng ta cần phải tìm
ra biện pháp để có thể góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm trên cũng như tìm ra cơ chế
phân hủy sinh học của polyethylene một cách phù hợp nhất. Mặc dù polyethylene không
phải là chất dễ phân hủy sinh học, tuy nhiên vào đầu những năm 1970, các thử nghiệm về
phân hủy sinh học của PE đã được thực hiện trong điều kiện môi trường tự nhiên (P. H.
Jones, 1974).
Trong nghiên cứu của Jun Yang và cộng sự năm 2014 đã tiến hành phân lập hệ vi
sinh vật trong ấu trùng bướm Plodia interpuncella và đã thu được vi khuẩn Enterobacter
asburiae YT1 và Bacillus sp. YP1 có khả năng phân hủy PE. Theo nghiên cứu của Paolo
1
Bombelli và cộng sự (2017) thì ấu trùng bướm Galleria mellonella cũng có khả năng
phân hủy PE. Năm 2019, Liu Ren và cộng sự đã tiến hành phân lập hệ vi sinh vật trong
ấu trùng bướm Galleria mellonella và đã thu được vi khuẩn Enterobacter sp.D1 và chứng
minh khả năng phân hủy PE của vi sinh vật trong ấu trùng bướm Galleria mellonella. Để
góp phần tìm ra giải pháp giúp phân hủy rác thải từ PE, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Phân lập hệ vi sinh vật trong ấu trùng bướm Galleria mellonella và chứng minh khả
năng phân hủy polyethylene của chủng phân lập”. Chúng tôi mong muốn đề tài này
không chỉ mang tính chất nghiên cứu mà còn có thể áp dụng được vào thực tiễn.
Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm:
- Phân lập hệ vi sinh vật phân hủy PE có trong ấu trùng bướm Galleria mellonella.
- Chứng minh khả năng phân hủy polyethylene của chủng phân lập.
2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Polyethylene

Khái niệm
Polyethylene hoặc polythene (viết tắt: PE) là loại nhựa nhiệt dẻo phổ biến nhất.
Polyethylene được sản xuất từ ethylene, mà ethylene có thể được sản xuất từ các nguồn
tài nguyên tái tạo, nó chủ yếu được lấy từ dầu mỏ hoặc khí tự nhiên. Sản phẩm chính của
PE thường là các dạng bao bì (túi nhựa, phim nhựa, geomembranes,… vv). PE là một
hợp chất hữu cơ gồm nhiều nhóm ethylene -CH 2CH2- liên kết với nhau bằng các liên kết
hydro no và được điều chế bằng phản ứng trùng hợp các monomer ethylene (Roland
Geyer và cộng sự, 2017).
Hình 1.1. Ethylene (Richard G. Jones và cộng sự, 2008)


Lịch sử
PE lần đầu tiên được tổng hợp bởi nhà hóa học người Đức Hans Von Pechmann,
người đã tìm ra nó một cách tình cờ vào năm 1898 trong khi điều chế diazomethane
(H.Von Pechmann, 1898). Các đồng nghiệp của ông là Eugen Bamberger và Friedrich
Tschirner, 1900 đã mô tả đó là vật liệu sáp có màu trắng chứa chuỗi dài -CH 2CH2- và gọi
đó là polyethylene.
1.1.1. Phân loại
Polyethylene được phân loại theo mật độ và loại phân nhánh, cấu trúc tinh thể và
trọng lượng phân tử. Có một số loại polyethylene như:
 Polyethylene có trọng lượng phân tử cực cao (UHMWPE)
 Polyethylene có trọng lượng phân tử cao (HMWPE)
 Polyethylene có trọng lượng phân tử cực thấp (ULMWPE hoặc PE-WAX)
 Polyethylene clo hóa (CPE)
 Polyethylene liên kết ngang (PEX hoặc XLPE)
 Polyethylene liên kết chéo mật độ cao (HDXLPE)
3
 Polyethylene mật độ cao (HDPE)

 Polyethylene mật độ trung bình (MDPE)
 Polyethylene mật độ thấp tuyến tính (LLDPE)
 Polyethylene mật độ thấp (LDPE)
 Polyethylene mật độ rất thấp (VLDPE)
Trong số những loại nhựa PE trên thị trường thì HDPE, LLDPE và LDPE là những
loại PE được tiêu thụ nhiều nhất.

Polyethylen mật độ thấp (LDPE)
LDPE là chữ viết tắt của Low density polyethylene được biết đến với tỷ lệ sức bền
3
trên mật độ (sức bền/ mật độ ) ~0,910 đến 0,940 g/cm . Mức độ phân nhánh LDPE cao ở
cả chuỗi ngắn và chuỗi dài, điều đó có nghĩa là sự phân nhánh ở chuỗi không ảnh hưởng
đến cấu trúc tinh thể của LDPE. Do đó, lực liên kết phân tử của nó ít mạnh hơn đồng thời
lực hút lưỡng cực tức thời gây ra cũng ít hơn. Điều này dẫn đến độ bền kéo thấp và độ
dẻo tăng. LDPE được tạo ra bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do. LDPE được dùng làm
nguyên liệu sản xuất cả thùng cứng và các ứng dụng màng nhựa như túi nhựa và màng
bọc. Năm 2013, thị trường LDPE toàn cầu có khối lượng gần 33 tỷ USD (Ceresana,
2014). Mã số nhận dạng nhựa LDPE là “04”.
Hình 1.2. Các sản phẩm từ nhựa LDPE (Ceresana, 2014)

LDPE dễ dàng gia công so với phần lớn các loại nhựa polyethylene tỷ trọng thấp
(LLDPE). Dễ gia công đem lại giải pháp với chi phí tối thiểu cho các nhà sản xuất trong
nhiều hoạt động sản xuất khác nhau. LDPE đáp ứng được nhu cầu sản xuất đa dạng gồm
bao bì thực phẩm phức hợp tới các màng vệ sinh. Các loại sản phẩm điển hình khác bao
4
gồm: các lớp lót, túi tiêu dùng, bao tải nặng, màng trong, màng co, màng ghép, màng bảo
vệ, màng nông nghiệp, màng tráng, dây và cáp điện, ống dẫn và nhiều các sản phẩm lâu
bền khác. Trong các hoạt động sản xuất bao bì, nhựa LDPE đảm bảo tính thẩm mỹ học,
khả năng in ấn, độ bền, kháng xé và độ đàn hồi tốt.
Ngày nay loại nhựa này có thể được gia công trong những dây chuyền tốc độ cao để
để tạo ra những sản phẩm có kết cấu màng, màng ghép, màng tráng cũng như có thể pha
trộn dễ dàng với các loại nhựa polyethylene khác để có được đặc tính kĩ thuật như mong
muốn.

Cấu trúc phân tử của các loại PE khác nhau
Sự đa dạng của các loại polyethylene khác nhau có thể được giải thích bằng sự khác
nhau trong cấu trúc phân tử của chúng. Trọng lượng phân tử và độ kết tinh là hai yếu tố
có ảnh hưởng lớn nhất, sự kết tinh phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và mức độ phân
nhánh. Chuỗi polymer càng ít phân nhánh và trọng lượng phân tử càng nhỏ thì độ kết tinh
của PE càng cao (Wolfgang Kaiser, 2011). Độ kết tinh của LDPE từ 50-60% còn độ kết
tinh của LLDPE cao khoảng 90% (G.O.Moraes và cộng sự, 2015).
HDPE
PE-LLD
PE-LD
Hình 1.3. Mức độ phân nhánh của polyethylene (Wolfgang Kaiser, 2011)
1.1.2. Tính chất
Tính chất của PE có thể được chia thành các loại như: tính chất cơ học, hóa học,
điện, quang và nhiệt.

Tính chất cơ học của PE
Polyethylene có độ ổn định, độ cứng và độ ma sát thấp nhưng có độ dẻo và độ bền

va đập cao. Polyethylene có màu trắng, hơi trong, không dẫn điện và không dẫn nhiệt,
không cho nước thấm qua.
5

Tính chất nhiệt
Nhiệt độ hóa thủy tinh của PE là: Tg ≈ -100°C và nhiệt độ nóng chảy là: Tm ≈
120°C. Khả năng ứng dụng thương mại của PE bị giới hạn bởi điểm nóng chảy tương đối
thấp. Đối với các loại PE phổ biến trên thị trường là các dạng PE mật độ trung bình và
mật độ cao, điểm nóng chảy thường nằm trong khoảng 120 đến 180°C (248 đến 356°F).
Điểm nóng chảy của PE mật độ thấp thường là 105 đến 115°C (221 đến 239°F). Những
nhiệt độ này thay đổi tùy thuộc vào các loại PE.

Tính chất hóa học
Ở nhiệt độ cao hơn 70°C, PE hòa tan kém trong các dung môi như toluen, xilen,
amilacetat, tricloetylen, dầu thông, dầu khoáng,... Dù ở nhiệt độ cao, PE cũng không thể
hòa tan trong nước, trong các loại rượu béo, aceton, ete etylic, glycerin và các loại dầu
thảo mộc.
Polyethylene bao gồm các hydrocacbon không phân cực, bão hòa, trọng lượng phân
tử cao. Do đó, hoạt động hóa học của nó tương tự như parafin. Các phân tử riêng lẻ
không liên kết cộng hóa trị với nhau. Do cấu trúc phân tử đối xứng của chúng nên chúng
có xu hướng kết tinh, tổng thể PE là một phần tinh thể. Độ kết tinh cao làm tăng mật độ,
sự ổn định cơ học và hóa học trong PE. Hầu hết các loại LDPE, MDPE và HDPE có khả
năng kháng hóa chất, có nghĩa là chúng không bị acid mạnh hoặc base mạnh tấn công và
có khả năng chống lại các chất oxy hóa và chất khử nhẹ. Các mẫu tinh thể PE không hòa
tan ở nhiệt độ phòng. Polyethylene (trừ polyethylene kiểu liên kết ngang) thường có thể
được hòa tan ở nhiệt độ cao trong các hydrocacbon thơm như: toluene, xylene hoặc trong
các dung môi clo như: trichloroethane hoặc trichlorobenzene (Kenneth S.Whiteley và
cộng sự, 2005). PE có thể trở nên giòn khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Chúng cháy
chậm với ngọn lửa màu xanh, tỏa ra mùi parafin (tương tự như ngọn lửa nến). Vật liệu PE
tiếp tục cháy khi loại bỏ nguồn lửa và tạo ra một giọt keo (Boedeker Plastics, 2012).
Polyethylene không thể được in hoặc liên kết với chất kết dính mà không cần tiền xử lý.

Tính chất điện
Polyethylene là một chất cách điện tốt. Tuy nhiên, nó trở nên dễ dàng tích điện (có
thể giảm sự tích điện bằng cách bổ sung than chì, muội than hoặc chất chống tĩnh điện).

Thuộc tính quang học
6
Tùy thuộc vào tính chất nhiệt và độ dày, màng PE có thể nhìn thấy màu rõ ràng
(trong suốt), màu trắng đục hoặc mờ. Độ trong suốt bị giảm bởi các tinh thể nếu chúng
lớn hơn bước sóng của ánh sáng khả kiến (Paolo Bombelli và Christopher J. Howe,
2017).
1.1.3. Giá trị kinh tế
Khi nhắc tới thị trường hàng hóa lâu bền và lớp phủ bề mặt thì PE là loại nguyên vật
liệu không thể thiếu bởi độ bền, tuổi thọ và tính bền dai của chúng. Polyethylene còn
được sử dụng trong công nghệ bao bì thực phẩm và các sản phẩm chuyên dụng. Ngoài ra
PE còn có mặt trong các thị trường sản phẩm vệ sinh, y khoa và nông nghiệp. Cùng với
sự phát triển, nhu cầu thị trường ngày càng lớn của con người mà sản phẩm PE ngày càng
đa dạng và phức tạp hơn.
Tính đến năm 2017, hơn 100 triệu tấn nhựa PE được sản xuất hàng năm, chiếm 34%
tổng thị trường nhựa (Roland Geyer và cộng sự, 2017). Chính vì nhu cầu PE trên thị
trường quá lớn như vậy nên lượng rác thải PE ngoài môi trường cũng rất lớn. Dẫn đến
các vấn nạn về ô nhiễm môi trường.
1.1.4. Vấn đề xử lý và giảm thiểu rác thải Polyethylene
Polyethylene hiện đang rất được ưa chuộng bởi nhiều ưu điểm như: không thấm
nước, thẩm mỹ, nhẹ, bền, chắc hơn so với túi giấy. Chính vì vậy các sản phẩm từ PE sản
xuất ra ngày càng lớn, đồng nghĩa với việc lượng rác thải nhựa này ngày một tăng lên.
Rác thải PE với đặc tính khó phân hủy, kỵ nước nên chúng có khả năng hấp phụ trên bề
mặt một lượng lớn các chất ô nhiễm như: PCBs, PAHs, thuốc trừ sâu,.... (Rochman CM
và cộng sự, 2013). Những chất này khi được tích lũy trong cơ thể sinh vật sẽ gây ra
những tác hại đối với sinh vật, không những gây cản trở quá trình tiêu hóa của sinh vật
mà còn mang theo những chất độc hại vào trong cơ thể chúng. Việc sử dụng các loại hải
sản có chứa rác thải PE làm thực phẩm có thể dẫn đến những hợp chất độc hại hấp phụ
trên bề mặt PE tích lũy trong cơ thể người, qua thời gian dài có khả năng gây ra những
ảnh hưởng về sức khỏe (Đinh Văn Khương, 2016). Rác thải PE còn gây ra những hậu quả
nghiêm trọng cho hệ sinh thái biển, ảnh hưởng trực tiếp tới sự sống của các loài sinh vật
phù du (Matthew Cole và cộng sự, 2013), các loài rùa biển (Sarah E. Nelms và cộng sự,
2015) cũng như các loài chim biển (Parker L 2015).
7
Hình 1.4. Mảnh nhựa đƣợc tách ra từ đƣờng tiêu hóa của rùa biển
(Sarah E. Nelms và cộng sự, 2015)
Để giải quyết tình trạng này chúng ta cần phải tìm ra biện pháp xử lý vấn đề ô
nhiễm cũng như giảm thiểu ô nhiễm rác thải PE một cách phù hợp nhất mà không gây
ảnh hưởng đến sức khỏe con người cũng như môi trường xung quanh. Một số biện pháp
giúp giảm thiểu ô nhiễm rác thải PE như:
- Thay đổi thói quen sử dụng túi nylon khi đi chợ, siêu thị cũng như khi gói hàng.
Thay vào đó là sử dụng các túi xách, làn, giỏ,... làm từ vật liệu thân thiện hơn với môi
trường. Đây cũng có thể là một hướng nghiên cứu cho các nhà nghiên cứu vật liệu phát
triển các sản phẩm thân thiện với môi trường nhưng vẫn đảm bảo sự tiện lợi cho người
tiêu dùng. Có như vậy, yêu cầu thay thế dần việc sử dụng các sản phẩm từ nylon mới có
tính khả thi.
- Tuyệt đối không xả các chất thải PE ra biển (xa hơn là không xả tất cả các loại rác
thải một cách bừa bãi ra môi trường). Đặc biệt đối với các khách du lịch khi đi tắm biển.
Để thực hiện điều này thì sự giáo dục trong gia đình và nhà trường đóng vai trò đặc biệt
quan trọng trong việc hình thành thói quen bảo vệ môi trường và xả rác đúng nơi qui
định.
- Các nhà khoa học cần tiến hành các nghiên cứu đánh giá hiện trạng và tác động
của ô nhiễm rác thải PE đến hệ sinh thái biển và nguy cơ ảnh hưởng từ ô nhiễm rác thải
nhựa sức khỏe người dân thông qua sử dụng hải sản (Đinh Văn Khương, 2016).
Các loại chất thải nhựa như túi nylon, dùng làm bao bì khi thải bỏ, kể cả được thu
gom đưa đi chôn lấp, lẫn vào đất tồn tại hàng trăm năm sẽ làm thay đổi tính chất vật lý
của đất, gây xói mòn đất, làm cho đất không giữ được nước, dinh dưỡng, ngăn cản oxy đi
qua đất, ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây trồng. Nếu túi nylon bị vứt xuống ao, hồ,
8
sông ngòi sẽ làm tắc nghẽn cống, rãnh, kênh, rạch, gây ứ đọng nước thải và ngập úng,
dẫn đến sản sinh ra nhiều vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó việc xử lý rác thải từ nylon
như chôn lấp, hay đốt cũng dẫn đến việc ô nhiễm môi trường đặc biệt là ô nhiễm không
khí, vì khi đốt chúng sẽ tạo ra khí thải chứa dioxin và furan gây ngộ độc, ảnh hưởng đến
tuyến nội tiết, gây ung thư hay làm giảm khả năng miễn dịch của con người (Đặng Kim
Chi, 2018). Chính vì vậy vấn đề xử lý rác thải cũng rất quan trọng, hiện nay đã có nhiều
nghiên cứu về phân hủy PE theo hướng sử dụng vi sinh vật tiêu biểu như nghiên cứu của
Liu Ren năm 2019 đã phân lập vi sinh vật trong ấu trùng của loài bướm Galleria
mellonella có khả năng phân hủy PE.
1.2. Ấu trùng bƣớm Galleria mellonella

Ấu trùng bướm Galleria mellonella là một loài bướm đêm thuộc họ Pyralidae. Hai
loài được lai tạo thương mại là Achroia grisella và Galleria mellonella. Trong đó
Galleria mellonella phổ biến hơn.
Hình 1.5. Ấu trùng bƣớm Achroia grisella và bƣớm Achroia grisella trƣởng thành
(Sarefo, 2007)
Sự khác biệt về hình thái của hai loài Achroia grisella và Galleria mellonella chủ
yếu dựa vào đặc điểm ở giai đoạn đã tạo thành bướm, còn ở giai đoạn ấu trùng và nhộng
thì không có sự khác biệt nhiều. Bướm Galleria mellonella có kích thước chiều dài thân,
bề rộng cánh và độ dày cơ thể đều lớn hơn bướm Achroia grisella. Bướm Achroia
grisella có màu sắc cơ thể và cánh đậm hơn thường là màu bạc, xám hoặc màu be.
Hình 1.6. Ấu trùng bƣớm Galleria mellonella (Kevin Kavanagh và cộng sự, 2018) và
bƣớm Galleria mellonella trƣởng thành (Simon Hinkley, 2011).
9
Galleria mellonella còn được gọi là bướm sáp hoặc bướm đêm tổ ong, được tìm
thấy trên khắp thế giới (Atlas, 2017). Trứng G. mellonella được đẻ vào mùa xuân và
chúng trải qua 4 giai đoạn sống. Con đực có thể tạo ra các xung âm thanh siêu âm, cùng
với pheromone, được sử dụng trong giao phối. Ấu trùng của bướm Galleria mellonella
cũng thường được sử dụng như một sinh vật mẫu trong nghiên cứu. Ấu trùng bướm
Galleria mellonella đôi khi được bán làm thức ăn trong các cửa hàng thú cưng cho các
loài bò sát và chim cảnh.
1.3. Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về hƣớng của đề tài
Polyethylene không dễ phân hủy sinh học và do đó tích lũy trong các bãi chôn lấp.
Tuy nhiên, vẫn có một số loài vi khuẩn có khả năng làm suy giảm PE.

Năm 2005, D. Hadad và cộng sự đã nghiên cứu về vi khuẩn ưa
nhiệt Brevibacillus borstelensis (chủng 707) (được phân lập từ một mẫu đất) sử dụng
nguồn carbon duy nhất từ LDPE. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra vi sinh vật phân
hủy PE trong đất và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động phân hủy sinh học
của chúng. Trong điều kiện tự nhiên khi PE tiếp xúc với ánh sáng mặt trời sẽ bị thoái hóa
một phần (ví dụ: PE dùng để phủ mặt đất hoặc trong che phủ nhà kính) nên các nhà
nghiên cứu đã tiến hành cho PE tiếp xúc xen kẽ với tia UV tại bước sóng 312nm trong 60
giờ trước khi chuyển sang môi trường nuôi cấy lỏng không chứa carbon. Dựa trên cơ sở
giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, vi khuẩn được xác định là Brevibacillus borstelensis.
Tấm PE sau khi ủ 1 tháng với vi khuẩn Brevibacillus borstelensis đem đo trọng lượng
phân tử, kết quả giảm khoảng 11% - 30% so với trọng lượng tấm PE ban đầu. Nghiên cứu
cũng đã chỉ ra các yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt động phân hủy sinh học của vi khuẩn
như hàm lượng nitrogen (N) có trong môi trường hay việc chiếu tia UV vào PE trước các
thí nghiệm, Brevibacillus borstelensis có khả năng làm giảm PE trong điều kiện nồng độ
nitrogen thấp chứng tỏ nitrogen không có ảnh hưởng đáng kể đến việc phân hủy PE của
vi khuẩn. Chiếu tia cực tím vàoPE, đây được xem như một bước tiền xử lý oxy hóa để
phân hủy sinh học PE. Việc PE tiếp xúc với tia UV trong 60 giờ trước khi ủ với vi khuẩn
đã làm tăng sự phân hủy sinh học của B. borstelensis so với các mẫu PE không được
chiếu xạ khoảng 39%.
Những thay đổi trong cấu trúc của PE sau khi chiếu tia UV và sau khi ủ với vi khuẩn
được phân tích bằng phương pháp đo quang phổ FTIR. Hình 1.7.b có mũi hấp thụ 10
−1
tại bước sóng 1712 cm là đặc trưng cho sự hiện diện của nhóm carbonyl. Việc ủ tấm PE
đã chiếu tia UV bằng B. borstelensis trong 30 ngày cho thấy sự giảm đáng kể lượng
carbonyl (Hình 1.7.c). Lượng carbonyl giảm được ước tính theo chỉ số carbonyl, chỉ số
−1
carbonyl biểu thị tỷ lệ giữa đỉnh hấp thụ của carbonyl tại bước sóng 1712 cm và bước
−1
sóng 1462-1463 cm . Người ta nhận thấy rằng việc ủ LDPE đã chiếu tia UV với chủng
B. borstelensis 707 đã làm giảm chỉ số carbonyl khoảng 70%.
Hình 1.7. Kết quả đo FTIR: (a) Tấm PE chƣa đƣợc xử lý; (b) Tấm PE đã xử lý qua
UV; và (c) Tấm PE đƣợc chiếu tia UV sau đó ủ với chủng Brevibacillus
borstelensis 707 (D. Hadad và cộng sự, 2005).
 Năm 2012, Bhone Myint Kyaw và cộng sự đã nghiên cứu mức độ phân hủy
sinh học của LDPE của bốn chủng vi khuẩn Pseudomonas khác nhau là Pseudomonas
aeruginosa PAO1 (ATCC 15729), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15692),

Pseudomonas putida (KT2440 ATCC 47054) và Pseudomonas
syringae (DC3000 ATCC 10862). Nghiên cứu cho thấy sau 120 ngày ủ bệnh, tỷ lệ giảm
trọng lượng của các tấm PE ở từng chủng vi khuẩn là 20% ở Pseudomonas aeruginosa
(PAO1), 11% ở Pseudomonas aeruginosa (ATCC), 9% ở Pseudomonas putida và 11%
trong chủng Pseudomonas syringae. Việc giảm trọng lượng cho thấy có sự phá vỡ cấu
trúc PE khi ủ với chủng vi khuẩn Pseudomonas. Cả 4 chủng đều có khả năng hình thành
11
màng sinh học trên tấm PE, tuy nhiên chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa PAO1 lại
có khả năng tăng trưởng nhanh nhất. Sự thay đổi cấu trúc trong màng LDPE được phân
tích bằng FTIR xuất hiện đỉnh carbonyl ở bước sóng 1740 cm ¹ và mũi hấp thụ ở bước
sóng 1460 cm ¹. Các nhà nghiên cứu cũng đã xác định sự thay đổi hình thái bề mặt của
màng LDPE (sau khi rửa với SDS 2% trong 4 giờ) bằng kính hiển vi điện tử quét SEM
sau khi ủ tấm PE trong thời gian 40, 80 và 120 ngày. Kết quả phân tích thành phần hóa
học của màng LDPE thông qua phương pháp GC-MS cho thấy sự hiện diện của ankan,
hydrocarbon thơm, chlorocarbon, axit béo bão hòa cũng như axit béo không bão hòa và
các hợp chất chưa biết khác. Tuy nhiên cơ chế chính xác của sự phân hủy PE vẫn chưa
được xác định.

Năm 2014, Jun Yang và cộng sự cũng đã chứng minh sự phân hủy sinh học của PE
từ các chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa của ấu trùng Plodia interpunctella. Hai chủng vi
khuẩn có khả năng phân hủy PE được phân lập từ ruột của ấu trùng này là Enterobacter
asburiae YT1 và Bacillus sp. YP1. Tấm PE được ủ với cả 2 chủng vi khuẩn trong môi
trường không chứa carbon. Sau 21 ngày xuất hiện màng sinh học trên tấm PE và khả
năng kỵ nước của màng PE giảm. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét SEM và kính
hiển vi lực nguyên tử AFM, nhận thấy bề mặt tấm PE có sự thay đổi hình thái, xuất hiện
nhiều hố sâu và rãnh (độ sâu 0.3-0.4μm).
Hình 1.8. Sự phát triển của VSV trên tấm PE trong môi trƣờng CFBAM (Jun Yang
và cộng sự, 2014)
Sự phát triển của VSV trên tấm PE được theo dõi bằng cách đếm số lượng khuẩn
lạc trên tấm PE trong khi ủ 28 ngày. Kết quả cho thấy cả 2 chủng đã sinh trưởng và phát
triển trên tấm PE và hình thành màng sinh học trong vòng 3 giờ đầu tiên của quá trình ủ
1
2
(Hình 1.8 a - c). Mật độ màng sinh học của các chủng YT1 và YP1 tăng từ ngày thứ 3 đến
ngày 28.
Hình 1.9. Bề mặt của tấm PE sau khi ủ với chủng YT1 và YP1 dƣới kính hiển vi
điện tử quét SEM (a;c;e) và kính hiển vi lực nguyên tử AFM (b;d;f) (Jun Yang và
cộng sự, 2014)
Sự hình thành của các nhóm carbonyl đã được xác định bằng phương pháp đo
quang phổ quang điện tử tia X (XPS) và máy đo quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
(micro-ATR/ FTIR). Nuôi cấy huyền phù YT1 và YP1 (10⁸ tế bào/ mL) có thể làm suy
giảm khoảng 6,1 ± 0,3% và 10,7 ± 0,2% màng PE (100 mg) tương ứng trong thời gian ủ
60 ngày. Kết quả phân tích góc tiếp xúc của tấm PE sau khi ủ bằng 2 chủng YT1 và YP1
tương ứng là 69.3 ± 3.8° và 67.1 ± 1.6° (n = 5) so với mẫu PE đối chứng có góc tiếp xúc
là 97.2 ± 1.6° (n = 5). Vì góc tiếp xúc giảm chứng tỏ màng PE đã bị thoái hóa một phần,
dẫn đến tính kỵ nước của màng giảm. Mặc dù chưa xác định được cơ chế phân hủy PE
của 2 chủng YT1 và YP1, nhưng nghiên cứu đã cung cấp đầy đủ bằng chứng cho thấy có
sự phân hủy PE từ vi khuẩn.

Trong một nghiên cứu khác của Esperanza Huerta Lwanga và cộng sự năm 2017
cũng đã nghiên cứu về sự phân hủy PE của vi khuẩn trong ruột của giun đất
1
3
Lumbricus terrestris (Oligochaeta). Giun đất sau khi được xử lý và tách lấy ruột sẽ cho
vào ống nghiệm cùng với dung dịch đệm phosphate, trộn đều, ly tâm rồi cấy trải trên môi
trường thạch Tryptic Soy Broth agar (TSBA) ủ trong 7 ngày ở 20˚C. Xác định tất cả các
vi khuẩn được phân lập từ ruột của giun đất bằng phương pháp 16S rRNA từ các chủng
vi khuẩn phân lập đều là vi khuẩn Gram dương, thuộc về vi khuẩn Actinobacteria
(Microbacterium awajiense, Rhodococcus jostii, Mycobacterium vanbaalenii và
Streptomyces Fulvissimus) và Firmicutes (Bacillus simplex và Bacillus sp.). Đất cát với
hàm lượng carbon, nitrogen và phosphote thấp được rây và làm khô, sau đó đem khử
trùng bằng tia Gamma. Trộn 150μm các hạt LDPE với 20g đất cát đã chuẩn bị. Các vi
khuẩn phân lập được cấy vào hỗn hợp đất trên với nồng độ 10⁵ CPU/g đất cho mỗi
chủng. Kết quả cho thấy 60% LDPE trong 21 ngày bị phân hủy sau khi tiếp xúc với
chủng vi sinh vật được phân lập từ ruột giun đất (Hình 1.10.) còn với mẫu đất không có
vi khuẩn, không có sự phân rã nào diễn ra. Sự phân bố kích thước hạt LDPE cũng đã
giảm đáng kể.
Hình 1.10. Tấm PE trƣớc và sau khi xử lý với vi khuẩn (Esperanza Huerta Lwanga
và cộng sự, 2017)

Theo nghiên cứu của Paolo Bombelli và cộng sự năm 2017, ấu trùng của loài
bướm Galleria mellonella có khả năng bẻ gãy cấu trúc phân tử nhựa trong các túi nylon
cũng như các sản phẩm được sản xuất bằng polyethylene khác. Ấu trùng của loài bướm
Galleria mellonella, còn được biết tới là bướm sáp (wax moth). Loài côn trùng này đẻ
trứng vào trong tổ ong, ấu trùng sau khi thoát khỏi vỏ trứng sẽ ăn sáp ong để phát triển,
đó cũng là lý do tại sao chúng được gọi là bướm sáp. Thành phần của chiếc túi nylon
không khác biệt nhiều so với nguồn thức ăn tự nhiên của ấu trùng bướm Galleria
mellonella. Theo Bertocchini, 2017 cho biết: “ Sáp ong là một loại polymer, một dạng
14
nhựa có thành phần tự nhiên và có cấu trúc hóa học khá giống với polyethylene.” Paolo
Bombelli và cộng sự đã thực hiện một thí nghiệm theo thời gian dựa trên những quan sát.
Họ đã để gần 100 con sâu sáp vào một túi mua sắm nhựa. Sau 40 phút, các lỗ nhỏ bắt đầu
xuất hiện quanh cái túi, và 12 giờ sau đó, 92 mg khối lượng nhựa đã giảm xuống so với
khối lượng túi ban đầu. Phân tích trọng lượng của các mẫu sau khi bôi dịch của ấu trùng
bướm Galleria mellonella trong14 giờ. Kết quả khối lượng tấm PE giảm 13% so với các
tấm PE không được xử lý.
Hình 1.11. Mức độ phân hủy PE của ấu trùng bƣớm Galleria mellonella (Paolo
Bombelli và cộng sự, 2017)
Để kiểm tra xem tấm PE có bị biến đổi cấu trúc hóa học do tiếp xúc với dịch của ấu
trùng bướm Galleria mellonella hay không, các nhà khoa học đã tiến hành phân tích
−1
FTIR. Đỉnh hấp thụ ở bước sóng 2.921 và 2.852 cm là đặc trưng của nhóm carbonyl
trong PE (Hình 1.12., đường màu đen). Tuy nhiên, khi đầu dò chỉ trên mẫu sau khi được
bôi bằng dịch của ấu trùng bướm Galleria mellonella, một đỉnh hấp thụ mới xuất hiện tại
−1
bước sóng 3,350 cm (Hình 1.12.A, đường màu đỏ), đỉnh hấp thụ này tương ứng với
đỉnh hấp thụ của ethylene glycol. Ngoài ra, một đỉnh hấp thụ mới xuất hiện ở bước sóng
−1
1.700 cm (Hình 1.12.B) là đặc trưng của nhóm -C=O, dấu hiệu của ethylene glycol. Kết
quả này cho thấy rằng đã có sự biến đổi về mặt cấu trúc của tấm PE khi xử lý với dịch
của ấu trùng bướm Galleria mellonella.
15
Hình 1.12. Kết quả phân tích FTIR (Paolo Bombelli và cộng sự, 2017)

Năm 2019, Liu Ren và cộng sự đã tiến hành phân lập hệ vi sinh vật có trong ấu
trùng bướm Galleria mellonella, thu được vi khuẩn Enterobacter sp. D1 có khả năng
phân hủy PE. Phân tích sựu thay đổi trên bề mặt PE bằng kính hiển vi điện tử quét SEM
kết hợp với EDS (SEM-EDS) cho thấy tỷ lệ nguyên tử oxy trên tấm PE sau khi ủ với vi
khuẩn D1 trong vòng 31 ngày cao hơn so với tấm PE đối chứng, tỷ lệ phần trăm khối
lượng nguyên tử carbon đã giảm 1,98%, trong khi đó tỷ lệ phần trăm khối lượng nguyên
tử oxy đã tăng 1,98% khi so sánh với đối chứng. Những kết quả này chỉ ra rằng trên bề
mặt PE đã xảy ra phản ứng oxy hóa. Kết quả đo FTIR sau 31 ngày cho thấy một đỉnh hấp
−1 −1
thụ ở 1652 cm và 1075 cm tương ứng với các nhóm carbonyl (-C=O) và các nhóm
ether (-C-O-C-), tương ứng (Hình 1.13.)
Hình 1.13. Kết quả đo FTIR (Liu Ren và cộng sự, 2019)
Sự hiện diện của nhóm carbonyl và ether cho thấy sự phân tách hoặc hình thành của
chất mới, sự xuất hiện của các nhóm carbonyl trên quang phổ là một dấu hiệu cho thấy sự
phân hủy sinh học của PE. Có thể cấu trúc hóa học của PE đã bị suy yếu cho thấy quá
trình oxy hóa PE tăng cường tính ưa nước và tạo thuận lợi cho PE phân hủy sinh học .
16

Phân giải Polyethylene từ vi sinh vật đang là một hướng nghiên cứu mới ở Việt
Nam. Tuy nhiên, trong nước rất hạn chế các thông tin chính thống đến các tạp chí chuyên
ngành mà chỉ có ở các thông tin trên báo chí phổ thông. Một số nghiên cứu tiêu biểu như
nghiên cứu của Nguyễn Thị Pha và cộng sự năm 2017 về phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn có khả năng phân hủy polyethylene từ đất bãi rác ở tỉnh Vĩnh Long. Nghiên cứu đã
phân lập được 26 dòng vi khuẩn từ 5 mẫu đất ở bãi rác các huyện: Trà Ôn, Bình Minh và
Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long. Kết quả tuyển chọn từ 26 dòng vi khuẩn phân lập đã xác định
được 3 dòng (LH4, BM4 và BM5) có khả năng phân hủy PE tốt nhất, trong đó dòng BM5
phân hủy tốt hơn trên cả 2 loại vật liệu PE là LDPE và HDPE. Dòng vi khuẩn BM5 được
giải trình tự vùng gen 16S rDNA kết hợp một số phản ứng sinh hóa, xác định thuộc chi
Bacillus sp. và có quan hệ gần với loài Bacillus amyloliquefaciens. Nghiên cứu về vi sinh
vật phân hủy PE là rất cần thiết nhằm giảm sự tích lũy PE gây ô nhiễm môi trường.
Như vậy, việc xử lý các rác thải có cấu trúc từ PE không phải là không có cách giải
quyết. Nhìn chung, các nghiên cứu đều tập trung theo hướng sử dụng vi sinh vật để phân
hủy PE vì mỗi khi nhắc đến việc xử lý rác thải PE đó là cách ít gây ảnh hưởng nhất đến
con người và môi trường xung quanh. Tuy nhiên, tính đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có
chế phẩm sinh học nào hoàn thiện để có thể áp dụng vào thực tiễn trong việc phân hủy
PE. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới kể cả Việt Nam vẫn đang nghiên cứu để tìm
ra đáp án cho việc phân giải nhựa này. Chúng ta hi vọng một ngày không xa, vấn nạn về
rác thải PE sẽ có hướng được giải quyết.
17
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Tháng 1 năm 2019 đến tháng 6 năm 2019.

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Khoa Kỹ Thuật Hóa
học, Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM.
2.2. Vật liệu, môi trƣờng, hóa chất và trang thiết bị.
2.2.1. Vật liệu
- Mẫu phân lập: Ấu trùng bướm Galleria mellonella (Nhận dạng dựa vào đặc điểm
hình thái của ấu trùng bướm Galleria mellonella trong mô tả của Simon Hinkley, 2011).
- Polyethylene sử dụng là loại LDPE có độ dày 22.5µm, không có chất xúc tác hoặc
phụ gia. LDPE được cắt thành miếng hình vuông có kích thước 50mm×50mm để ủ trong
môi trường thạch, 3mm×3mm để ủ trong môi trường lỏng và 2 tấm PE (180mm×140mm)
có tổng khối lượng là 1.142g dùng để đánh giá khả năng sử dụng PE của ấu trùng bướm
Galleria mellonella..
2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng tăng sinh vi khuẩn: Môi trường LCFBM

KH₂PO₄ 0.7g
K₂HPO₄ 0.7g
MgSO .7H O 0.7g
NH₄NO₃ 1g
NaCl 0.005g
FeSO4.7H2O 0.002g
ZnSO4.7H2O 0.002g
MnSO4.H2O 0.001g
Nước cất 1000mL
PE (3mm×3mm) 1g
pH= 5.0- 5.5 (Jun Yang và cộng sự, 2014).

Môi trƣờng phân lập: Môi trường CFBAM
0.7g
KH₂PO₄
1
8
K₂HPO₄ 0.7g
MgSO .7H O 0.7g
NH₄NO₃ 1g
NaCl 0.005g
FeSO4.7H2O 0.002g
ZnSO4.7H2O 0.002g
MnSO4.H2O 0.001g
Agar 15g
PE (50mm×50mm) 0.11g
pH= 5.0- 5.5 (Jun Yang và cộng sự, 2014).

Môi trƣờng hỗ trợ sự phát triển của vi sinh vật: Môi trường NB
Tryptone 10g
Cao thịt 5g
NaCl 5g
pH = 7.2- 7.4 (Jun Yang và cộng sự, 2014).

Môi trƣờng hỗ trợ phân lập: Môi trường NA
Tryptone 10g
Cao thịt 5g
NaCl 5g
pH = 7.2- 7.4
2.2.3. Hóa chất

0
- Thuốc nhuộm: Crystal violet, Lugol, Ethanol 96 , Fuchsine, H2O2 30%, dầu soi
kính, nước muối vô trùng 0.9% .
- Hóa chất trong pha chế môi trường: Agar, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO .7H O, NH₄NO₃, NaCl, FeSO .7H O, ZnSO .7H O, MnSO₄.H₂O, Tryptone, NaCl.
2.2.4. Trang thiết bị
19

Dụng cụ: Que cấy thẳng, que cấy vòng, đèn cồn, đĩa Petri, erlen, becher các
loại, ống đong, Pipet các loại, Pipetman 10-100μm và 100-1000μm ống nghiệm, đũa thủy
tinh, cá từ, bao PE chịu nhiệt, giá đỡ ống nghiệm, kẹp, bông không thấm nước.

Thiết bị: Cân điện tử Sartorius CP2202 S, lò vi sóng, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng
Hirayma HV85, tủ ủ, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, máy vortex, kính hiển vi điện tử Olympus,
máy ly tâm Hettich zentrifugen Mikro 22R, máy lắc, bếp đun, tủ cấy,…
2.3. Nội dung nghiên cứu


Sơ đồ tổng quát và thuyết minh qui trình
2
0
2
1
2.3.1. Thí nghiệm tiền đề

2.3.1.1. Đánh giá khả năng sử dụng PE của ấu trùng Galleria mellonella

Cách tiến hành
- Thử nghiệm với 100 con ấu trùng bướm Galleria mellonella và 2 tấm PE
(180mm×140mm) có khối lượng là 1.142g. Ấu trùng bướm sau khi thu mua sẽ được tách
ra khỏi môi trường dinh dưỡng hằng ngày còn PE thì được rửa sạch với nước cất, sau đó
sấy khô.
Hình 2.1. Ấu trùng đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng cũ

- Để PE tiếp xúc với ấu trùng bướm Galleria mellonella trong 48 giờ, thu kết quả
dựa trên sự thay đổi bề mặt PE.
Hình 2.2. Tấm PE tiếp xúc với ấu trùng bƣớm Galleria mellonella

Chỉ tiêu theo dõi
- Bề mặt tấm PE
- Trọng lượng PE trước và sau thí nghiệm
2.3.1.2. Đánh giá khả năngphân hủy PE của ấu trùng bƣớm Galleria mellonella

Cách tiến hành
22
- 100 con ấu trùng bướm Galleria mellonella sau khi thu mua sẽ được tách ra
khỏi môi trường dinh dưỡng hằng ngày.
- Không cho ấu trùng ăn trong 24 giờ để ấu trùng thải hết phân của môi trường
dinh dưỡng cũ ra ngoài.
- Bao PE được rửa sạch với nước cất, rồi sấy khô.
- Sau đó cho PE vào làm nguồn dinh dưỡng duy nhất, để ấu trùng ăn PE cho đến
khi chuyển sang giai đoạn làm nhộng nhằm thu được lượng phân lớn nhất.
- Sau khi thu hồi được phân sâu tiến hành đem hòa tan và lọc nhiều lần với giấy
lọc (lỗ lọc có đường kính từ 10-15μm).
Hình 2.3. Quá trình lọc phân sâu

- Tiến hành lấy cặn đo quang phổ FTIR tại Viện Công Nghệ Hóa học, quận 1,
Tp.HCM.
2.3.2. Phân lập hệ vi sinh vật


Sơ đồ phân lập hệ vi sinh vật
23
2.3.2.1. Thuyết minh sơ đồ phân lập hệ vi sinh vật


Chuẩn bị môi trường
- Môi trường LCFBM

- Môi trường CFBAM
- Môi trường NA
- Môi trường NB
24
Các môi trường được khử trùng bằng cách hấp tiệt trùng ở 121 trong 1 giờ 30 phút.
Môi trường LCFBM sau khi hấp tiệt trùng, để nguội rồi mới cho 1g PE vào. Môi trường
CFBAM được hấp tiệt trùng, để nguội đến nhiệt độ khoảng 40-50 sau đó phân phối vào
cáo đĩa Pêtri, trang đều vi khuẩn trên môi trường CFBAM rồi mới phủ tấm
PE(50mm×50mm) lên trên bề mặt thạch.

Xử lý
Ấu trùng bướm Galleria mellonella (150 con) sau khi cho tiếp xúc với bao PE sẽ
được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm với ethanol 75⁰ trong 1 phút và sau đó rửa sạch 2
lần bằng nước muối vô trùng 0.9%. Tách lấy hệ tiêu hóa của ấu trùng bằng dao và kéo.
Hệ tiêu hóa của ấu trùng bướm Galleria mellonella được rút ra một cách cẩn thận để giữ
nguyên vẹn. Sau đó sẽ gộp chung vào một ống ly tâm có chứa sẵn 40mL nước muối vô
trùng, đem ly tâm trong 5 phút trên máy ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút.
Các vật liệu PE được rửa sạch với nước cất, sấy khô, sau đó đặt tấm PE vào trong tủ
cấy, khử trùng bằng tia UV trong 15 phút.

Tăng sinh
Màng PE được cắt thành các mảnh hình vuông nhỏ có kích thước 3mm×3mm. Cho
1g PE (3mm×3mm) vào erlenmeyer đã chứa 80mL môi trường dinh dưỡng LCFBM.
Dùng Pipetman hút cẩn thận dung dịch trong ống nghiệm đã được vortex cho vào bình
erlenmeyer cùng với PE và môi trường dinh dưỡng. Sau đó, bình erlenmeyer được ủ trên
máy lắc với vận tốc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 21 ngày, hỗn hợp trong bình
erlenmeyer được ly tâm trong 10 phút trên máy ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút. Các
mảnh PE được hoàn toàn loại bỏ và thu được lớp cặn màu trắng đục. Phần cặn thu được
sau ly tâm đem cấy trang trên môi trường NA. Tiến hành phân lập nhiều lần để tách riêng
từng loại khuẩn lạc.
Sử dụng môi trường NA để hỗ trợ phân lập hệ vi sinh vật, vì môi trường này chứa
hàm lượng dinh dưỡng chuẩn cho đa số các loài vi khuẩn. Vi sinh vật ủ trong môi trường
lỏng LCFBM tăng trưởng chậm (21 ngày) dẫn đến không đủ lượng tế bào để tiến hành
phân lập trên môi trường CFBAM. Chính vì vậy cần phải sử dụng môi trường NA để hỗ
trợ phân lập vi sinh vật.
25
Khuẩn lạc được tách từ môi trường NA sẽ được tăng sinh trong môi trường dịch
lỏng NB (40ml) trong 12 giờ, nuôi cấy lắc 120 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Môi trường
lỏng NB được sử dụng để tăng mật độ vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy trước khi sử
dụng để phân lập trên môi trường đặc hiệu CFBAM. Vi sinh vật sau khi tăng sinh trong
môi trường NB được ly tâm 5 phút với tốc độ 4000 vòng/phút. Loại bỏ dịch, lấy cặn.
Phần cặn vẫn còn chứa môi trường NB nên để loại bỏ hoàn toàn môi trường NB ra
khỏi vi khuẩn thì cần rửa tế bào với nước muối vô trùng 0.9% rồi ly tâm trong 5 phút với
tốc độ 4000 vòng/phút, quá trình này được lặp lại 3 lần. Mục đích của việc rửa tế bào là
để chắc chắn rằng VSV chỉ sử dụng nguồn carbon duy nhất từ PE khi phân lập trên môi
trường đặc hiệu CFBAM.

Phân lập
- Sử dụng phương pháp cấy trang để phân lập giống trên môi trường thạch CFBAM.
- Dùng Pipetman hút 500μL dịch mẫu cho vào đĩa Petri đã chuẩn bị sẵn môi trường
đặc hiệu CFBAM.
- Dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu trên mặt môi trường thạch rồi phủ thêm
lớp PE (50mm x 50mm) lên trên.
- Úp ngược đĩa, gói và ủ các đĩa Petri chứa mẫu ở 37
- Ủ trong máy ủ 21 ngày (Jun Yang và cộng sự, 2014).
- Tiến hành quan sát khuẩn lạc trên các đĩa thạch sau thời gian ủ 21 ngày.
- Sau 21 ngày tấm PE được chuyển vào ống ly tâm với 40mL nước muối vô trùng,
ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ phần nổi phía trên, thu dịch lỏng chứa vi
khuẩn phân hủy PE.

- Hình dạng, màu sắc vi sinh vật nằm dưới tấm PE

Định danh vi sinh vật
Định danh vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên cơ sở giải trình
tự đoạn gen 16S rRNA của chủng nghiên cứu. Quy trình PCR cho gen 16S rRNA chứa
các trình tự đặc hiệu loài giúp phân biệt giống và loài các vi sinh vật. Kết quả quả giải
trình tự được so chuỗi bằng chương trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu gen của NCBI.
Từ kết quả so chuỗi, chúng ta có được kết quả định danh vi sinh vật.
26
Chủng các vi sinh vật sẽ được gửi mẫu định danh tại Công ty TNHH Thương mại
và Dịch vụ Nam Khoa TPHCM.
2.3.2.2. Bảo quản chủng giống vi sinh vật
Các giống vi sinh vật sau khi định danh được bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu:
- Tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất.
- Pha dịch tế bào với glycerol 20% vô khuẩn.
- Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu, đóng nắp. Để mẫu ở nhiệt độ
phòng trong 3 phút để cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào.
- Mẫu đưa vào lạnh sâu với tốc độ hạ nhiệt ban đầu 1-3 phút để đạt tới -30 .
- Mẫu tiếp tục được làm lạnh với tốc độ 10-15 phút để đạt đến -70 .
- Bảo quản giống ở nhiệt độ -70 .
- Hoạt hóa mẫu: mẫu trong lạnh sâu được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới
mức có thể, thông thường cho vào tủ ấm 37 trong 40 - 60 giây. Với giống vi sinh vật
được bảo quản ở -70 thì 1 năm cấy chuyền lại một lần.
2.3.3. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy PE của chủng phân lập
2.3.3.1. Sự phân hủy PE trong môi trƣờng LCFBM của chủng phân lập
Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường LCFBM với 2 nghiệm thức ở hai chế
độ khác nhau (Bảng 2-1), sử dụng chủng vi sinh vật sau khi phân lập trên môi trường
CFBAM. Mật độ tế bào là 3.5 log CFU/mL (nồng độ pha loãng 10⁵).
Sau 21 ngày, quan sát màu sắc dung dịch, vị trí các tấm PE trong môi trường
LCFBM. Các tấm PE sau đó được rửa sạch, sấy khô để xác định độ giảm khối lượng.
Bảng 2-1: Thí nghiệm sự phân hủy PE trong môi trƣờng LCFBM
Chế độ Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2
Môi trường LCFBM (mL) 20
PE 3mm×3mm (g) 1
Mật độ tế bào (log CFU/mL) 0 3.5
Thời gian lắc ủ (ngày) 21
Nhiệt độ ( 37
Vận tốc lắc (vòng/phút) 120

27
- Màu sắc môi trường ở 2 nghiệm thức.

- Vị trí các mảnh PE trong môi trường LCFBM sau 21 ngày.
- Độ giảm khối lượng tấm PE
2.3.3.2. Sự hình thành vi sinh vật trên tấm PE
Chuẩn bị môi trường đặc hiệu CFBAM cho hai nghiệm thức. Nghiệm thức 1 dùng
để đối chứng nên chỉ phủ tấm PE lên trên môi trường CFBAM. Ở nghiệm thức 2 bổ sung
500μL chủng vi sinh vật sau khi tuyển chọn lên môi trường đặc hiệu CFBAM, sau đó đặt
tấm PE (50mm x 50mm) lên trên. Sau 21 ngày thu kết quả.
Bảng 2-2: Thí nghiệm sự hình thành vi sinh vật trên tấm PE
Chế độ Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2
Môi trường CFBAM +
Mật độ tế bào (log CFU/mL) 0 3.5
PE (50mm×50mm) +
Thời gian ủ (ngày) 21
Nhiệt độ ( 37

- Màu sắc phía trong tấm PE và phạm vi phía ngoài tấm PE.
- Hình dạng khuẩn lạc
- Chụp SEM (tại phòng Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia tp.HCM).
2.3.3.3. Sự thay đổi bề mặt PE sau khi ủ bằng chủng vi sinh vật phân lập.
- Tấm PE sau khi ủ với chủng phân lập trong 21 ngày và mẫu đối chứng (nghiệm
thức 1 ở bảng 2-2) được rửa với dung dịch SLS 2% trong 4 giờ để loại bỏ hoàn toàn
màng sinh học và vi khuẩn trên tấm PE rồi làm khô. Sau đó các mẫu PE được chụp SEM
tại phòng Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia tp.HCM với độ phóng đại ×5000 lần.

- Chụp SEM (tại phòng Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia tp.HCM).
- Độ bền kéo của tấm PE
2.3.4. Các phƣơng pháp phân tích

2.3.4.1. Phƣơng pháp nhuộm Gram
28
Các bước tiến hành

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy
24giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Tiếp theo nhỏ 1 giọt Crystal violet lên vết bôi, để trong 1 phút .
- Sau đó nhỏ thêm 1 giọt Lugal để trong 30 giây rồi đem đi rửa với nước.
- Nhúng nhanh tiêu bản vào cồn (3 lần).
- Rửa lại mới nước 1 lần nữa. Lúc này nếu là vi khuẩn Gram(+) thì vết bôi vẫn có
màu tím, còn vi khuẩn Gram(-) vết bôi sẽ không màu vì lớp peptidoglycan của vi khuẩn
- Tiếp tục nhỏ 1 giọt Fuchsine( màu hồng) lên mẫu để trong 1 phút. Rồi đem rửa và
sau đó là hong khô.
- Cuối cùng nhỏ giọt dầu soi kính vào mẫu, quan sát trên kính hiển vi với vật kính
x100.
Kết quả: Vi khuẩn Gram(+) bắt màu tím, Gram() bắt màu hồng.
2.3.4.2. Phƣơng pháp đo quang phổ FTIR
Máy đo quang phổ FTIR dùng để nghiên cứu dao động của các cấu trúc trong phân
tử, để xác định độ tinh khiết của chất, suy đoán về tính đối xứng của phân tử hay phân
tích định lượng (Vinagamma, 2016).
Ƣu điểm
• Ưu điểm vượt trội của phương pháp đo hồng ngoại so với các phương pháp phân
tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử,…) là sự cung cấp thông tin về
cấu trúc nhanh chóng, không đòi hỏi phương pháp tính toán phức tạp.
• FTIR có giao thoa kế Michelson, nguồn sáng là đèn Nerst/ đèn global phát ra bức
xạ hồng ngoại liên tục.
• Nhận dạng vật liệu và định lượng: hợp chất hữu cơ, cấu trúc, xác định vật liệu
đồng nhất.
• Khả năng phân tích: Hiệu suất kết dính, định lượng thiết bị đúc nhỏ, phân lớp vật
liệu, ăn mòn hóa học (Vinagamma, 2016).
Nhƣợc điểm
2
9
• Phương pháp này chỉ cho chúng ta biết được thành phần nguyên tố của mẫu phân
tích, mà không chỉ ra được trạng thái liên kết của nó ở trong mẫu.
• Độ chính xác của phép phân tích phụ thuộc vào nồng độ chính xác của thành phần
của dãy mẫu đầu vì các kết quả định lượng đều phải dựa theo các đường chuẩn của các
dãy mẫu đầu đã được chế tạo sẵn trước.
 Chất lượng điều khiển hiển thị: So sánh mẫu, cách thức định lượng, so sánh vật
liệu từ nhiều mẫu khác nhau.
2.3.4.3. Kính hiển vi điện tử quét (SEM)


Khái niệm
Kính hiển vi điện tử quét (tiếng Anh: Scanning Electron Microscope, thường viết
tắt là SEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề
mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề
mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích
các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật (Phạm Thanh Tâm,
2010).

Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong SEM
Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống như việc tạo ra chùm điện tử
trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử
(có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trường...), sau đó được tăng tốc. Tuy nhiên, thế tăng
tốc của SEM thường chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ
các chùm điện tử có bước sóng quá nhỏ vào một điểm kích thước nhỏ sẽ rất khó khăn.
Điện tử được phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm
Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ
các cuộn quét tĩnh điện. Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử
hội tụ, mà kích thước của chùm điện tử này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà
SEM không thể đạt được độ phân giải tốt như TEM. Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn
phụ thuộc vào tương tác giữa vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử. Khi điện tử tương tác
với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích
được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này (Phạm Thanh Tâm, 2010).
2.3.4.4. Phân tích sự thay đổi về lực kéo đứt của tấm PE
30
Độ bền kéo là đặc tính chịu được lực kéo đứt của vật liệu. Đơn vị GPa. Độ bền kéo
bao gồm cả lực kéo và ứng suất. Màng được dập khuôn. Cố định 2 đầu vào ngàm kẹp và
cho di chuyển ra xa dần với tốc độ kép 10mm/ phút cho đến khi đứt. Kết quả hiển thị trên
máy xác định lực kéo đứt.
Bằng chứng về phân hủy sinh học PE được xác định sơ bộ bằng cách mô tả sự thay
đổi về lực kéo đứt của tấm PE sau khi ủ 21ngày trên máy đo lực kéo đứt QC-50.
Hình 2.4. Máy đo lực kéo đứt QC-50

Máy đo lực kéo đứt được sử dụng cho việc kiểm tra độ bền kéo của các loại như:
bao bì PP, PE, bao bì cứng, màn phim, vật liệu da, giả da, vải, sợi, chỉ, các sản phẩm dạng
tấm từ cao su, nhựa…
Độ bền kéo được xác định tại Phòng thí nghiệm Khoa học vật liệu, trường đại học
Bách khoa TP HCM.
31
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO

LUẬN 3.1. Kết quả các thí nghiệm tiền đề
3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng sử dụng PE của ấu trùng bƣớm Galleria
mellonella.
Sau 48 giờ, khối lượng tấm PE giảm 3.68% so với khối lượng PE ban đầu, tốc độ sử
dụng PE là 0.875mg/giờ. Tạo thành các lỗ hổng trên bề nhựa, xung quanh đường viền của
tấm PE cũng bị xén nhiều.
Hình 3.1. Tấm PE sau khi cho ấu trùng bƣớm Galleria mellonella tiếp xúc với PE
Khả năng sử dụng PE của ấu trùng bướm Galleria mellonella là tương đối chậm
nhưng cũng mở ra một hướng đi mới cho sự phân hủy PE giúp giảm thiểu ô nhiễm môi
trường.
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng tiêu hóa PE của ấu trùng bƣớm Galleria
mellonella.
Bức xạ hồng ngoại là vùng bức xạ nằm giữa vùng ánh sáng nhìn thấy và không nhìn
thấy. Tần số hay bước sóng hấp thụ phụ thuộc vào khối lượng của các nguyên tử, các liên
kết và cấu trúc của phân tử. Vị trí các mũi hấp thụ trong phổ hồng ngoại thường được
biểu diễn dưới dạng số sóng (ν) với đơn vị được sử dụng hiện nay là cm ¹. Bước sóng (λ)
trước đây thường sử dụng đơn vị là micromet (µm = 10 ⁶ m) (Lê Hoàng Duy, 2016).
Số sóng là nghịch đảo của bước sóng: cm ¹ = 10⁴ /µm. Cường độ của các mũi hấp thụ có thể được biểu diễn bằng
hệ số truyền qua (trasmittance, T) hoặc hấp thụ (absorbance, A). Sự liên hệ giữa hai đơn vị này thể hiện qua biểu thức: A =
log (1/T).
32
Trục tung thể hiện cường độ hấp thụ của các mũi phổ, trục hoành là vị trí các mũi hấp thụ
được biểu diễn dưới dạng số sóng (cm ¹) (Lê Hoàng Duy, 2016).
Hình 3.2. Kết quả đo FTIR của phân ấu trùng bƣớm Galleria mellonella
Dựa theo kết quả đo FTIR của phân ấu trùng bướm Galleria mellonella được thể
hiện qua hình 3.2 ta thấy vẫn có sự hiện diện của nhóm -CH tại mũi hấp thụ có bước sóng
là 2921,79 cm ¹ và 2851,03 cm ¹. Ngoài ra còn có sự xuất hiện của các nhóm chức khác
như –OH của ethylene glycol (mũi hấp thụ ở 3444.7 và 3281.14 cm ¹), nhóm C=O của
carbonyl (mũi hấp thụ ở 1671.86 cm ¹). Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả đo
FTIR trong nghiên cứu của Paolo Brombelli và cộng sự năm 2017 khi cho dịch ấu trùng
bướm Galleria mellonella trải đều trên tấm PE.
33
Kết quả của thí nghiệm tiền đề dẫn đến hai giả thuyết, sự phân hủy PE có thể là do
enzyme có trong dịch tiêu hóa hay do vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của ấu trùng bướm
Galleria mellonella hoặc là các yếu tố khác. Nếu sự phân hủy PE nhờ vào enzyme có
trong dịch tiêu hóa của ấu trùng bướm hoặc là các yếu tố khác thì hướng đó khó có thể
ứng dụng vì ấu trùng bướm Galleria mellonella là một đối tượng gây hại đặc biệt cho
ngành ong, không đảm bảo về vấn đề về an toàn sinh học hay an toàn hệ sinh thái. Hơn
nữa, theo nghiên cứu của Liu Ren và cộng sự năm 2019 đã chứng minh vi sinh vật phân
lập từ ấu trùng bướm Galleria mellonella có khả năng phân hủy PE. Vì vậy các khảo sát
tiếp theo sẽ định hướng sự phân hủy PE từ VSV trong hệ tiêu hóa của ấu trùng bướm
Galleria mellonella.
Vậy qua kết quả của thí nghiệm tiền đề cho thấy ấu trùng bướm Galleria mellonella
có khả năng sử dụng PE, khối lượng PE giảm 3.68% so với ban đầu. Sản phẩm phân hủy
PE của ấu trùng bướm Galleria mellonella là chất có chứa nhóm C=O của carbonyl,
nhóm –OH của ethylene glycol và cả nhóm –CH của polyethylene.
3.2. Kết quả phân lập hệ vi sinh vật
Quá trình tuyển chọn được thực hiện trên môi trường đặc hiệu CFBAM. Sau khi ủ
21 ngày chỉ thấy xuất hiện 1 chủng vi sinh vật đặt tên là T1 có màu trắng đục, hình tròn
được thể hiện qua hình 3.3.
Hình 3.3. Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng CFBAM
34
Hình 3.4. Chủng T1 dƣới kính hiển vi

Sau khi quan sát dưới kính hiển vi, loại vi khuẩn này bắt màu hồng chứng tỏ thuộc
loại vi khuẩn Gram âm, về đặc điểm hình thái có hình que, riêng lẻ, kích thước ở khoảng
từ 0,3-0,6 μm x 0.8-2,0 μm.
3.3. Chứng minh khả năng phân hủy polyethylene của chủng phân lập
3.3.1. Khả năng phân hủy PE trong môi trƣờng LCFBM của chủng phân lập
Kết quả ở hai nghiệm thức có sự khác nhau đáng kể. Ở nghiệm thức 1 các mảnh PE
nổi lên trên bề mặt môi trường, môi trường LCFBM vẫn còn trong. Trong khi đó, các tấm
PE trong nghiệm thức 2 lại phân bố đều trong môi trường LCFBM, môi trường đục hơn ở
nghiệm thức 1.
Polyethylene sau khi rửa với SLS 2% trong 4 giờ và làm khô thì khối lượng giảm từ
1g xuống còn 0,84g. Vậy khối lượng PE đã giảm 16.4% so với khối lượng PE ban đầu.
Hình 3.5. Thí nghiệm trong môi trƣờng LCFBM
35
Do đó có thể suy ra rằng T1 đã thích nghi với điều kiện dinh dưỡng của môi trường
LCFBM (chỉ có nguồn carbon duy nhất từ PE) và sử dụng PE làm nguồn dinh dưỡng
trong thời gian ủ 21 ngày. Sự thích nghi của vi sinh vật với PE là yếu tố chính cho sự
phân hủy sinh học PE.
3.3.2. Sự phát triển của chủng phân lập trên tấm PE
Màu sắc: Dễ dàng nhận thấy trên đĩa đối chứng ở nghiệm thức 1 (Hình 3.6) tấm PE
vẫn còn trong và không có màu, trong khi đó đĩa ở nghiệm thức 2 chứa chủng T1 trên
môi trường CFBAM (Hình 3.7) tấm PE đã có màu đục hơn, trên đường viền xuất hiện rõ
các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường.
Hình 3.6. Đĩa đối chứng không có chủng T1
Hình 3.7. Cấy chủng T1 lên môi trƣờng CFBAM

Chủng T1 chỉ xuất hiện ở phía dưới bề mặt tấm PE, còn ở mặt ngoài môi trường đặc
hiệu CFBAM thì không có, chứng tỏ chủng T1 đã sử dụng nguồn carbon trong PE để
sống và phát triển.
Chụp SEM: Trên bề mặt tấm PE dùng làm đối chứng (Hình 3.8) không hề xuất hiện bất
cứ 1 loại vi khuẩn nào chứng tỏ thao tác thí nghiệm đúng và tấm PE không bị nhiễm 36
tạp khuẩn. Còn ở nghiệm thức 2, trên bề mặt tấm PE xuất hiện rất nhiều vi khuẩn (Hình
3.9)
Hình 3.8. Bề mặt tấm PE (đối chứng).
Hình 3.9. Vi khuẩn T1 ở độ phóng đại ×5000.

Vì vậy vi khuẩn T1 được cấy vào, chính chúng đã sử dụng nguồn C của PE để sinh
sôi và phát triển.
3.3.3. Sự thay đổi bề mặt PE sau khi ủ bằng chủng vi sinh vật phân lập
Kết quả sự thay đổi bề mặt PE sau khi ủ bằng chủng vi sinh vật phân lập được thể
hiện qua hình 3.11. So với mẫu đối chứng (hình 3.10) thì bề mặt PE (hình 3.11) có sự
thay đổi đáng kể, bề mặt PE không còn bằng phẳng như trước mà trở nên gồ ghề, xuất
hiện các hố, khoang.
37
Hình 3.10. Bề mặt tấm PE (đối chứng)
Hình 3.11. Bề mặt tấm PE ở độ phóng đại x3000

Kết quả trên chứng tỏ đã có sự tác động của vi khuẩn lên bề mặt PE hay nói cách
khác vi khuẩn T1 có khả năng phân hủy PE.
Độ kéo đứt của tấm PE được thể hiện qua bảng 3-1. So với mẫu PE đối chứng, độ
bền kéo của tấm PE sau khi ủ với vi khuẩn giảm 48.53%. Chứng tỏ vi khuẩn T1 đã làm
suy giảm cấu trúc của tấm PE, làm cho lực liên kết giữa các monomer giảm, dẫn đến độ
kéo đứt giảm.
Bảng 3-1: Lực kéo đứt của tấm PE (GPa)
Lực kéo đứt (GPa) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
PE đối chứng 32.32 32.40 32.38 32.37

PE sau khi ủ với vi khuẩn 15.67 15.72 15.75 15.71
Tỷ lệ giảm (%) 48.53 ( 0.12%)
38
Vậy chủng T1 có khả năng phân hủy PE, làm bề mặt PE bị biến đổi hình dạng tạo
thành các hố sâu, rãnh. Ngoài ra còn làm giảm lực liên kết giữa các monomer trong PE
dẫn đến độ bền kéo của tấm PE giảm 48.53%.
3.4. Kết quả định danh chủng vi sinh vật phân hủy PE
Từ kết quả phân lập vi sinh vật và những chứng minh về khả năng phân hủy PE của
chủng phân lập như: trọng lượng PE giảm sau khi ủ 21 ngày với chủng phân lập trong
môi trường LCFBM, sự phát triển của chủng T1 trên bề mặt PE, sự thay đổi cấu trúc bề
mặt PE hay độ bền kéo của tấm PE giảm sau khi ủ với chủng phân lập. Chứng tỏ chủng
T1 là chủng có tiềm năng phân hủy PE nên được gửi định danh tại Công ty TNHH
Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa TPHCM bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA và
đã xác định được chủng T1 là Enterobacter cloacae.
39

Sơ lƣợc về Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae là một loại vi khuẩn Gram âm hình que thuộc họ

Enterobacteriaceae. Kích thước của vi khuẩn này dao động trong khoảng 0,3- 0,6 μm x
0,8-2,0 μm (K.A Nishijima, 1999).
Trong nghiên cứu của Liu Ren và cộng sự năm 2019 đã phân lập được vi khuẩn
Enterobacter sp. D1 trong ấu trùng bướm Galleria mellonella có khả năng phân hủy PE.
Enterobacter cloacae và Enterobacter sp. D1 đều thuộc chi Enterobacter nên có nhiều
đặc điểm cũng như cơ chế hoạt động giống nhau. Cơ chế phân hủy sinh học PE rất phức
tạp và có sự tham gia của nhiều chất oxy hóa khác nhau.
Enterobacter sp. D1 được phân lập từ ruột của ấu trùng bướm Galleria mellonella.
Màng PE sau ủ với chủng D1 trong 14 ngày thì có sự xuất hiện khuẩn lạc ở phía dưới
màng PE. Sự thay đổi cấu trúc bề mặt tấm PE được quan sát bằng kính hiển vi điện tử
quét (SEM) và kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), bề mặt PE trở nên gồ ghề, nhiều hố,
rãnh sâu. Bằng phương pháp đo quang phổ FTIR cho thấy sự hiện diện của các nhóm
chức carbonyl và các nhóm ether trên màng PE sau khi được xử lý với chủng D1. Khi sử
dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) cũng cho thấy hàm lượng của một số
rượu, este và acid đã tăng lên sau khi xử lý PE với chủng D1. Chứng tỏ đã có phản ứng
oxy hóa xảy ra trên bề mặt màng PE. Những quan sát này đã chứng minh rằng
vi khuẩn D1 có khả năng phân hủy PE (Liu Ren và cộng sự, 2019).
4
0
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
- Ấu trùng bướm Galleria mellonella có khả năng sử dụng PE, khối lượng PE
giảm 3.68% so với ban đầu. Sản phẩm phân hủy PE của ấu trùng bướm Galleria
mellonella là chất có chứa nhóm –C=O của carbonyl, nhóm –OH của ethylene glycol
và cả nhóm –CH của polyethylene.
- Đề tài phân lập được 1 chủng, được định danh là Enterobacter cloacae.
- Bước đầu, đề tài đã chứng minh được khả năng phân hủy PE của chủng
• Khối lượng PE đã giảm 16.4% sau khi ủ 21 ngày với chủng phân lập
trong môi trường LCFBM.
• Sự phát triển của Enterobacter cloacae và sự thay đổi cấu trúc bề mặt
• Lực kéo đứt tấm PE sau khi xử lý bằng vi khuẩn Enterobacter cloacae
giảm 48.53 ( 0.12%).
Nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy PE là hướng đề tài rất có ý nghĩa trong cuộc
sống, giúp giải quyết và giảm thiểu vấn đề ô nhiễm môi trường do rác thải PE tạo ra,
đảm bảo cân bằng hệ sinh thái, môi trường sống cho các loài động, thực vật, kể cả con
người.

Kiến nghị
- Các thí nghiệm chứng minh vai trò của vi khuẩn phân lập được thăm dò với mật
độ đưa vào là 3.5 (log CFU/mL) nên cần khảo sát các mức trên và dưới.
- Thời gian nuôi cấy chủng Enterobacter cloacae khá dài (21 ngày) nên cần tìm
cách để rút ngắn thời gian.
- Đo góc tiếp xúc của tấm PE sau khi ủ 21 ngày với chủng Enterobacter cloacae.
- Xác định cơ chế phân hủy PE của chủng Enterobacter cloacae góp phần tìm ra
giải pháp phân hủy rác thải PE.
- Tìm hiểu cơ chế phân hủy PE của chủng Enterobacter cloacae nhằm làm sáng
tỏ sản phẩm sau quá trình phân hủy và liệu có ô nhiễm thứ cấp hay ko?
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước

[1] Lê Hoàng Duy, 2016. Các phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc hợp
chất hữu cơ.
[2] Đinh Văn Khương, 2016. Plastic pollution in the East Sea: current status and
recommendations.
[3] Nguyễn Thị Pha, Trần Thị Yến Nhi, Trần Đình Giỏi, 2017. Phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy polyethylene từ đất bãi rác ở tỉnh Vĩnh Long.
[4] Lê Xuân Phương, 2016. Thí nghiệm vi sinh vật học- Phần 2.
[5] Phạm Thanh Tâm, 2010. Phát xạ điện tử các ứng dụng của phát xạ điện tử.
[6] Nguyên liệu sản xuất túi nylon, 2018. Bao bì Tuấn Ngọc.
[7] Trung tâm nghiên cứu và triển khai công nghệ bức xạ Vinagamma, 2016.
Máy đo quang phổ hồng ngoại chuyển hóa.
Tài liệu nước ngoài
[8] Atlas, NBN. Retrieved 2017. Galleria mellonella: Wax Moth.
[9] Boedeker Plastics. Retrieved 2012. How to Identify Plastic Materials Using
The Burn Test.
[10] Bhone Myint Kyaw, Ravi Champakalakshmi, Meena Kishore Sakharkar,
Chu Sing Lim, Kishore R. Sakharkar, 2012. Biodegradation of Low Density Polythene
(LDPE) by Pseudomonas Species.
[11] CanadaWorld, 2014. WCI student isolates microbe that lunches on plastic
bags".
[12] Ceresana, 2014. Market Study: Polyethylene – LDPE (2nd edition).
[13] Ceresana Research, 2012. Market Study: Polyethylene – HDPE.
[14] Charles A. Kwadha, George O. Ong’amo, Paul N. Ndegwa, Suresh K.
Raina, Ayuka T. Fombong, 2017. The Biology and Control of the Greater Wax Moth,
Galleria mellonella.
[15] D. Hadad, S. Geresh, A. Sivan, 2005. Biodegradation of polyethylene by the
thermophilic bacterium Brevibacillus borstelensis.
42
[16] D. W. S. Wong, W. M. Camirand, A. E. Pavlath, J. M. Krochta, E. A.

Baldwin and M. O. Nisperos-Carriedo (eds.), 1994. Development of edible coatings
for minimally processed fruits and vegetables.
[17] Eug. Bamberger & Fred. Tschirner, 1900. Ueber die Einwirkung von
[18] Esperanza Huerta Lwanga, Binita Thapa, Xiaomei Yang, Henny Gertsen ,
Tamás Salánki, Violette Geissen, Paolina Garbeva, 2017. Decay of low-density
polyethylene by bacteria extracted from earthworm's guts: A potential for soil
restoration.
[19] Floyd B. Paddock, 1918. The Beemoth or Waxworm. Texas Agricultural
Experiment Stations.
[20] G.O.Moraes, A N. Geraldes, H A. Zen D. F. Parra and A. B. Lugão, 2015.
Comparing the grafting of styrene onto linear low density polyethylene and low
density polyethylene.
[21] Hayward G. Spangler,1984. Responses of the Greater Wax Moth, Galleria

mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) to Continuous High-Frequency Sound.
[22] H. Von Pechmann, 1898. Ueber Diazomethan und Nitrosoacylamine.
[23] Jun Yang, Yu Yang, Wei- Min Wu, Jiao Zhao and Lei Jiang, 2014. Evidence
of Polyethylene Biodegradation by Bacterial Strains from the Guts of Plastic-Eating
Waxworms.
[24] K.A Nishijima, 1999. Enterobacter cloacae.
[25] Karin van Dijk, Eric B. Nelson, 2000. Fatty Acid Competition as a
Mechanism by which Enterobacter cloacae Suppresses Pythium ultimum Sporangium
Germination and Damping-Off.
[26] Kenneth S. Whiteley, T. Geoffrey Heggs Hartmut Koch Ralph L. Mawer
Wolfgang Immel, 2005. Polyolefins.
[27] Kevin Kavanagh, Gerard Sheehan, 2018. The Use of Galleria mellonella
Larvae to Identify Novel Antimicrobial Agents against Fungal Species of Medical
Interest
[28] Liu Ren, Lina Men, Zhiwei Zhang, 2019. Biodegradation of Polyethylene by
Enterobacter sp. D1 from the Guts of Wax Moth Galleria mellonella.
4
3
[29] Matthew Cole, Pennie Lindeque, Elaine Fileman, Claudia Halsband, Rhys
Goodhead, Julian Moger, Tamara S. Galloway, 2013. Microplastic Ingestion by
Zooplankton.
[30] Paolo Bombelli và Christopher J. Howe, 2017. Polyethylene bio-

degradation by caterpillars of the wax moth Galleria mellonella.
[31] Parker L (2015) Nearly every seabird on Earth is eating plastic. (National
Geographic, Washington, D.C.)
[32] Plastics Europe. Retrieved 2018. Plastics: The Facts.

[33] P. H. Jones, D. Prasad, M .Heskins, M. H. Morgan, J.E. Guillet, 1974.
Biodegradability of photodegraded polymers.
[34] Richard G. Jones, Jaroslav Kahovec, Robert Stepto, Edward S. Wilks
Michael Hess, Tatsuki Kitayama, W. Val Metanomski. 2008. Compendium of Polymer
Terminology and Nomenclature.
[35] Rochman CM, Hoh E, Hentschel BT, & Kaye S, 2013. Long-term field
measurement of sorption of organic contaminants to five types of plastic pellets:
implications for plastic marine debris
[36] Roland Geyer, Jenna R. Jambeck, Kara Lavender Law, 2017. Production,
use, and fate of all plastics ever made.
[37] Sarah E. Nelms1, Emily M. Duncan1, Annette C. Broderick, Tamara S.
Galloway, Matthew H. Godfrey, Mark Hamann Penelope K. Lindeque, and Brendan J.
Godley, 2015. Plastic and marine turtles: a review and call for research
[38] Sarefo, 2007. Achroia grisella.jpg.
[39] Simon Hinkley & Ken Walker, Museum Victoria, 2011. Galleria mellonella
dorsal.jpg
[40] Wolfgang Kaiser, 2011. Kunststoffchemie für Ingenieure von der Synthese
bis zur Anwendung.
[41] www.porex.com. Retrieved 2017. PE Material: Porex Porous Polyethylene
for Plastic Filter Media.
4
4
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Nguyên liệu sản xuất túi nylon

Nguyên liệu sản xuất túi nylon là hạt nhựa, có rất nhiều loại, tùy thuộc vào chức
năng và mục đích sử dụng của từng loại bao bì mà lựa chọn loại hạt nhựa khác nhau.
Các túi nylon thường dùng để đựng thực phẩm, đóng gói và vận chuyển hàng hóa. Các
hạt nhựa dùng làm nguyên liệu để sản xuất túi nylon thường được lấy từ dầu mỏ hoặc
một số chế phẩm từ dầu mỏ để tạo thành hạt nhựa có màu sắc và tính chật hoá học
khác nhau. Hiện nay, túi nylon là bao bì rẻ, nhẹ và tiện dụng nhất được sử dụng để bao
gói hàng ngày.
Hình 1. Nguyên liệu sản xuất túi nylon (Tuấn Ngọc, 2018)
Các nguyên liệu sản xuất túi nylon thường gặp:
 Hạt nhựa HDPE làm túi nylon hàng chợ
Túi đựng hàng chợ thường được làm bằng polyethylene mật độ cao (HDPE).
Loại hạt nhựa này thường có màu trắng sữa hoặc bán mờ, có độ đục cao, độ thấm thấp,
khả năng chịu nhiệt, cứng hơn và chịu lực mạnh hơn LDPE / LLDPE nhưng cũng dễ
chảy nước hơn và có khuynh hướng nhăn. Hầu hết các túi siêu thị, tạp hóa và túi rác
đều được làm bằng loại nguyên liệu này. HDPE thường được lựa chọn vì độ bền cao
và giá rẻ.
 Polyethylene mật độ trung bình (MDPE)
Polyethylene tỷ trọng trung bình ít đục hơn HDPE nhưng không trong như
LDPE. Túi nhựa này thường chịu lực mạnh hơn LDPE nhưng độ bền kéo không cao.
Loại polyethylene này được sử dụng trên quy mô nhỏ hơn nhiều so với HDPE và
thường được sử dụng cho túi rác và bao bì cho người tiêu dùng.
4
5
PHỤ LỤC
 Polyethylene mật độ thấp (Hạt nhựa LDPE)
Polyethylene tỷ trọng thấp hoặc LDPE là một polyolefin rất phổ biến khác. Túi
bóng làm từ chất liệu này có màu trắng hoặc trong suốt. LDPE thường được chọn để
đóng gói hàng tiêu dùng. Túi được làm từ vật liệu này rất linh hoạt và dễ kéo căng.
 Polyethylene tuyến tính mật độ thấp (LLDPE)
Polyethylene có tỷ trọng thấp tuyến tính có các tính chất tương tự như LDPE và
ứng dụng cũng tương tự. Tuy nhiên, LLDPE có độ bền kéo và độ bền va đập cao hơn,
khả năng chịu nhiệt tốt hơn, trong khi LDPE thường dễ xử lý, có độ trong và độ bóng
cao hơn. Các ứng dụng của túi nylon làm từ LLDPE như: mua sắm, thực phẩm đông
lạnh, rác,tài liệu và túi thực phẩm chung.
 Polypropylene (PP)
Polypropylene (PP) là hạt nhựa nhiệt dẻo có độ trong, độ bóng, độ bền kéo cao,
khả năng chịu hóa chất và khả năng chịu nhiệt tốt. Polypropylene (PP) có điểm nóng
chảy cao hơn so với PE làm cho nó phù hợp cho các ứng dụng đòi hỏi phải khử trùng
ở nhiệt độ cao. PP thường được chọn làm túi đựng thực phẩm, túi kẹo, bánh quy, thảo
dược, các loại hạt và các loại bánh kẹo khác (Tuấn Ngọc, 2018).
Phụ lục 2: Đặc điểm sinh trƣởng, hình thái và nhu cầu dinh dƣỡng của
bƣớm Galleria mellonella.

Phân bố
Galleria mellonella lần đầu tiên được báo cáo là một loài gây hại ở châu Á, sau
đó chúng sinh trưởng và phát triển sang các miền bắc châu Phi, Anh, một số vùng của
châu Âu, Bắc Mỹ và New Zealand (Charles A. Kwadha, 2017). Hiện nay, Galleria
mellonella đã có mặt trên khắp các châu lục (NBN.Atlas, 2017) và đã được báo cáo ở
hai mươi bảy quốc gia châu Phi, chín quốc gia châu Á, năm quốc gia Bắc Mỹ, ba quốc
gia Mỹ Latinh, Úc, mười quốc gia châu Âu và năm quốc gia trên đảo. Dự kiến phạm
vi sinh sống của Galleria mellonella có thể lan rộng hơn, đặc biệt là do biến đổi khí hậu như ngày nay (Charles A. Kwadha, 2017).
 Môi trƣờng sống: G. mellonella có thể được tìm thấy ở những nơi nuôi
ong mật (Floyd B. Paddock, 1918).
46
PHỤ LỤC

Quá trình sinh trƣởng của ấu trùng bƣớm Galleria mellonella
Vòng đời của G. mellonella trải qua bốn giai đoạn: Trứng, ấu trùng, nhộng và
bướm trưởng thành. Bướm G. mellonella phát triển tối ưu ở nhiệt độ khoảng 29 đến
33°C và độ ẩm khoảng 29-33% (Charles A. Kwadha, 2017). Mặc dù các nghiên cứu ở
Kansas đã cho thấy sự phát triển của ấu trùng có thể lên tới 37°C (L.O. Warren, 1962).
Nhiệt độ trung bình cao hơn 45° C sẽ gây tử vong cho ấu trùng bướm Galleria
mellonella. Tuy nhiên, nhiệt độ thấp hơn ở 23°C thì chỉ một phần của vòng đời của
bướm G. mellonella được hoàn thành. Ở nhiệt độ dưới 0 °C, ngay cả phơi nhiễm ngắn
cũng giết chết ấu trùng và con trưởng thành (L.O. Warren, 1962).

Trứng
Trứng có dạng hình cầu, nhẵn, kích thước trứng dao động từ 0,4 đến 0,5 mm với
nhiều màu sắc như: hồng, kem, trắng (Rachna Gulati, 2004). Trong khoảng thời gian
từ 7,2 đến 21,8 ngày thì trứng sẽ nở (L.O. Warren,1962). Trứng được đẻ vào đầu mùa
xuân và được đặt trong các vết nứt và kẽ hở bên trong tổ ong, giúp giảm thiểu phát
hiện trứng. Các trứng tập hợp thành cụm với số lượng khác nhau tùy theo khu vực.
Điển hình như báo cáo ở Hoa Kỳ một cụm có khoảng 50-150 trứng (Charles A.
Kwadha, 2017), trong khi các báo cáo ở Ấn Độ một cụm có tới 300-600 trứng (Rachna
Gulati, 2004).
Hình 2. Trứng của bƣớm Galleria mellonella


Ấu trùng
Sau khi trứng nở, ấu trùng bướm Galleria mellonella có kích thước dài từ 3 đến
30 mm, có màu trắng hoặc xám bẩn. Chúng ăn sáp có trong tổ ong, vỏ của ấu trùng
ong, phấn hoa và một lượng nhỏ keo ong và mật ong (Floyd B. Paddock, 1918). Việc
ăn thịt đồng loại cũng đã được quan sát thấy trong tình trạng thiếu lương thực.
Trong khoảng thời gian từ 28 ngày đến 6 tháng ấu trùng trải qua 8 đến 10 giai đoạn lột
47
PHỤ LỤC
xác quay tơ. Ở giai đoạn cuối cùng, ấu trùng tự quay một cái kén tơ và bước vào giai
đoạn nhộng (Charles A. Kwadha, 2017).

Nhộng
Nhộng bất động, không cho ăn và ở trong kén trong 1 đến 9 tuần cho đến khi
trưởng thành (Charles A. Kwadha, 2017). Kích thước dao động từ 14 đến 16mm
(Rachna Gulati, 2004). Ấu trùng bắt đầu với màu trắng nâu, nhưng dần dần chuyển
sang màu nâu sẫm trước khi bước vào giai đoạn nhộng (L. O. Warren,1962).
Hình 3. Ấu trùng chuyển màu để bƣớc vào giai đoạn nhộng


Bƣớm G. mellonella
Bướm G. mellonella trưởng thành có màu nâu xám và dài từ 10 đến 18 mm
(Rachna Gulati, 2004). Sải cánh của bướm trưởng thành là 30 đến 41 mm. Loài bướm
đêm này bay từ tháng 5 đến tháng 10 ở các vùng ôn đới trong vùng phân bố của nó,
chẳng hạn như Bỉ và Hà Lan. Bướm cái lớn hơn và nặng hơn bướm đực. Con cái sống
trung bình 12 ngày, con đực sống trung bình 21 ngày (L. O. Warren,1962).
Loài bướm G. mellonella thực hiện hành vi giao phối bằng cách con đực kêu gọi
con cái bằng các xung âm thanh siêu âm thu hút con cái chưa giao phối trước đó và bắt
đầu tán tỉnh (Hayward G.Spangler, 1984). Một khi con cái đến gần hơn, con đực tạo ra
một pheromone tình dục để bắt đầu giao phối. Có nhiều loại pheromone giới tính được
biết đến bao gồm nonanal, decanal, hexanal, heptanal, undecanal, 6,10,14-
trimethylpentacanol và 5,11-dimethylpentacosane (Charles A. Kwadha, 2017).
48
PHỤ LỤC
Hình 4. Bƣớm Galleria mellonella (cái)
Phụ lục 3: Thiệt hại gây ra bởi G. mellonella và biện pháp ngăn chặn

Thiệt hại
G. mellonella gây thiệt hại kinh tế lớn trong ngành nuôi ong mật, mất hàng triệu đô
la mỗi năm. G. mellonell có mặt ở bất kỳ khu vực nào tại nơi nuôi ong. Sau khi trứng
được đặt trong tổ, ấu trùng đào qua tổ ong và gây ra sự phá hủy lớn. Ở miền Nam Hoa
Kỳ mất 4-5% lợi nhuận mỗi năm do ấu trùng của loài bướm này (Charles A. Kwadha,
2017).

Các biện pháp ngăn chặn
Để ngăn chặn, quản lý sự xâm nhập, người ta khuyến khích trồng trọt và duy trì các
điều kiện vệ sinh cho ong và tổ của chúng để có thể ngăn chặn G. mellonella xâm
nhập. Các vết nứt và kẽ hở cũng cần được bịt kín để G. mellonella trưởng thành không
thể đẻ trứng ở đó. Lược ong nên được thay thế thường xuyên và những lược bị nhiễm
G. mellonella nên được loại bỏ càng sớm càng tốt.
Dùng nhiệt độ có thể tiêu diệt G. mellonella ở tất cả các giai đoạn trong vòng đời
của nó. Xử lý nhiệt đối với lược và thiết bị nuôi ong ở 45- 80°C trong 1 đến 4 giờ,
hoặc trong nước nóng trong 3 đến 5 giờ (Charles A. Kwadha,2017). Tuy nhiên, làm
nóng ở nhiệt độ này có thể gây chảy xệ và biến dạng của sáp. Xử lý lạnh làm lạnh các
lược đến -15 đến -7°C trong 2 đến 4,5 giờ.
Chất khử trùng hóa học cũng có thể phá hủy tất cả các giai đoạn của G.
mellonella và thuận tiện về kinh tế. Cho đến nay, chỉ có CO2 được chấp thuận để điều
trị các lược bị nhiễm G. mellonella, các hóa chất khác để lại dư lượng trong mật ong
và gây rủi ro cho người xử lý (Charles A. Kwadha, 2017).
49
PHỤ LỤC
Phụ lục 4: Phổ hồng ngoại của một số hợp chất hữu cơ tiêu biểu
Nhóm hợp chất hữu cơ Khoảng hấp thụ (cm ¹) Cƣờng độ
A.Ankyl
C-H (co giãn) 2853 – 2920 Trung bình- mạnh
Isopropyl, -CH(CH3)2 1380 - 1385 và 1365 – Mạnh
Tert-Butyl -C(CH3)3 1370 Trung bình
1385 - 1395 và ~ 1365
B. Ankenyl
C-H (co giãn) 3010 – 3095 Trung bình
C=C (co giãn) 1620 – 1680 Có thể thay đổi tùy hợp chất
R-CH=CH₂ 985 - 1000 và 905 – 920 Mạnh
R₂C=CH₂ 880 – 900 Mạnh
cis-RCH=CHR 675 – 730 Mạnh
trans-RCH=CHR 90 -975 Mạnh
C. Ankinyl
≡C-H (co giãn) ~ 3000 Mạnh
C≡C (co giãn) 2100 - 2260 Có thể thay đổi tùy hợp chất
D. Aren
Ar-H (co giãn) ~ 3030 Có thể thay đổi tùy hợp chất
Nhân thơm có nhóm
thế 690 - 710 và 730 – 770 Rất mạnh
Một nhóm thế 735 – 770 Mạnh
Hai nhóm thế vị trí orto 680 - 725 và 750 -810 Mạnh và rất mạnh
Hai nhóm thế vị trí meta 790 - 840 Rất mạnh
Hai nhóm thế vị trí para
E. Ancol, Phenol, Axit
cacboxylic
OH (ancol, phenol, dd 3590 – 3650 Mũi nhọn, có thể thay đổi
loãng) tùy hợp chất
OH (ancol, phenol, có 3200 – 3550 Mũi bầu, mạnh
liên kết hiđro)
50
PHỤ LỤC
OH (axit cacboxylic, có 2500 - 3000 Mũi bầu, có thể thay đổi tùy
liên kết hiđro) hợp chất
F. Anđehit, Xeton, Este
và Axit cacboxylic
C=O (co giãn) 1630 – 1780 Mạnh
Anđehit 1690 - 1740 Mạnh
Xeton 1650 – 1730 Mạnh
Este 1735 – 1750 Mạnh
Axit cacboxylic 1710 - 1780 Mạnh
Amit 1630 - 1690 Mạnh
G. Amin N-H 3300 - 3500 Trung bình
H. Nitril C≡N 2220 - 2260 Trung bình
Phụ lục 5: Kết quả định danh chủng vi sinh vật phân hủy PE
51

Phan Huy PE

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Phan Huy PE

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

TÓM TẮT LUẬN VĂN

LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Ethylene (Richard G. Jones và cộng sự, 2008)...................................................3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Ethylene (Richard G. Jones và cộng sự, 2008)

1.1.1. Phân loại

 Polyethylene mật độ cao (HDPE)

Hình 1.2. Các sản phẩm từ nhựa LDPE (Ceresana, 2014)

1.1.2. Tính chất

Polyethylene có độ ổn định, độ cứng và độ ma sát thấp nhưng có độ dẻo và độ bền

1.2. Ấu trùng bƣớm Galleria mellonella

aeruginosa PAO1 (ATCC 15729), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15692),

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Tháng 1 năm 2019 đến tháng 6 năm 2019.

2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy

Môi trƣờng tăng sinh vi khuẩn: Môi trường LCFBM

2.2.3. Hóa chất

2.2.4. Trang thiết bị

2.3. Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Thí nghiệm tiền đề

Hình 2.1. Ấu trùng đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng cũ

Hình 2.3. Quá trình lọc phân sâu

2.3.2. Phân lập hệ vi sinh vật

2.3.2.1. Thuyết minh sơ đồ phân lập hệ vi sinh vật

- Môi trường LCFBM

2.3.2.2. Bảo quản chủng giống vi sinh vật

- Màu sắc môi trường ở 2 nghiệm thức.

2.3.4. Các phƣơng pháp phân tích

Các bước tiến hành

2.3.4.2. Phƣơng pháp đo quang phổ FTIR

2.3.4.3. Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Hình 2.4. Máy đo lực kéo đứt QC-50

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO

3.2. Kết quả phân lập hệ vi sinh vật

Hình 3.4. Chủng T1 dƣới kính hiển vi

Hình 3.5. Thí nghiệm trong môi trƣờng LCFBM

3.3.2. Sự phát triển của chủng phân lập trên tấm PE

Hình 3.6. Đĩa đối chứng không có chủng T1

Hình 3.7. Cấy chủng T1 lên môi trƣờng CFBAM

Hình 3.8. Bề mặt tấm PE (đối chứng).

Hình 3.9. Vi khuẩn T1 ở độ phóng đại ×5000.

Hình 3.10. Bề mặt tấm PE (đối chứng)

Hình 3.11. Bề mặt tấm PE ở độ phóng đại x3000

PE đối chứng 32.32 32.40 32.38 32.37

Enterobacter cloacae là một loại vi khuẩn Gram âm hình que thuộc họ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

[16] D. W. S. Wong, W. M. Camirand, A. E. Pavlath, J. M. Krochta, E. A.

[21] Hayward G. Spangler,1984. Responses of the Greater Wax Moth, Galleria

[30] Paolo Bombelli và Christopher J. Howe, 2017. Polyethylene bio-

[32] Plastics Europe. Retrieved 2018. Plastics: The Facts.

Phụ lục 1: Nguyên liệu sản xuất túi nylon

 Hạt nhựa HDPE làm túi nylon hàng chợ

 Polyethylene mật độ trung bình (MDPE)

 Polyethylene mật độ thấp (Hạt nhựa LDPE)

 Polyethylene tuyến tính mật độ thấp (LLDPE)

Hình 2. Trứng của bƣớm Galleria mellonella

Hình 3. Ấu trùng chuyển màu để bƣớc vào giai đoạn nhộng