TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.

HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM
—ӂӂ—

TIỂU LUẬN MÔN

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA

VÀ GLUTEN TRONG BỘT MÌ

GVHD: ThS. Lê Hoàng Du

Sinh viên thực hiên:
̣
1/ Trần Thị Thuý An MSSV: 14116001
2/ Trần Thị Ngọc Linh MSSV: 14116085
3/ Phan Như Ngọc MSSV: 14116100
4/ Hoàng Thị Hạnh Nhân MSSV: 14116104
5/ Lâm Thị Thanh Trúc MSSV: 14116182

TPHCM, 2016
 MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU...................................................................................................1
1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN.......................................................................2
1.1. Phân loại và những nghiên cứu chung.................................................2
1.2. Vấn đề phân tích protein trong thực phẩm.........................................2
2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA...........................2
2.1. Các loại protein có trong sữa................................................................2
2.1.1. Casein.............................................................................................2
2.1.2. Whey protein..................................................................................3
2.1.3. Protein thiểu số...............................................................................3
2.2. Các phương pháp xác định protein trong sữa.....................................3
2.3. Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Lowry..................3
2.3.1. Nguyên tắc......................................................................................3
2.3.2. Cách tiến hành................................................................................3
2.3.2.1. Dụng cụ và thiết bị.................................................................3
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu và hóa chất......................................................3
2.3.2.3. Quy trình thực hiện................................................................4
2.3.2.4. Tính kết quả...........................................................................5
2.3.3 Ưu điểm và nhược điểm.................................................................5
2.4. Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Bradford (1976)..5
2.4.1. Nguyên tắc......................................................................................5
2.4.2. Cách tiến hành................................................................................6
2.4.2.1. Dụng cụ và thiết bị.................................................................6
2.4.2.2. Chuẩn bị mẫu và hóa chất......................................................6
2.4.2.3. Quy trình thực hiện.................................................................6
2.4.2.4. Tính kết quả............................................................................6
2.4.3. Ưu điểm và nhược điểm................................................................7
3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ......................7
3.1. Khái quát về gluten...............................................................................7
3.1.1. Định nghĩa......................................................................................7
i
 3.1.2. Thành phần.....................................................................................8
3.1.2.1. Gliadin...................................................................................8
3.1.2.2. Glutenin.................................................................................8
3.2. Các phương pháp xác định gluten trong bột mì.................................8
3.3. Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp thủ công..................8
3.3.1. Nguyên tắc......................................................................................8
3.3.2. Chuẩn bị..........................................................................................9
3.3.3. Tiến hành........................................................................................9
3.3.4. Ưu điểm và nhược điểm................................................................10
3.4. Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (High Performance Liquid Chromatography)..................................11
3.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao..................11
3.4.1.1. Khái niệm.............................................................................11
3.4.1.2. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao...............................11
3.4.1.3. Nguyên tắc hoạt động của hệ thống SE – HPLC..................12
3.4.2. Chuẩn bị........................................................................................12
3.4.3. Tiến hành......................................................................................13
3.4.4. Kết quả..........................................................................................14
3.4.5. Ưu điểm và nhược điểm................................................................15
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................16

ii
 MỤC LỤC HÌNH
Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.....................................................12
Hình 2: Kết quả SE-HPLC của protein trong bột mì.........................................15

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1: Lập đồ thị nồng độ protein....................................................................5
Bảng 2: Kết quả khảo sát hàm lượng gluten trong bột mì số 8, 11 và 13..........10

iii
 LỜI MỞ ĐẦU
Protein là một trong những thành phần quan trọng của thực phẩm cung cấp các
tiền chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể. Ngoài ra, protein còn trực tiếp
tham gia vào việc tạo nên hương vị của thực phẩm hay tham gia vào các phản ứng nhiệt
và enzyme để tạo nên các chất màu, chất mùi trong quá trình chế biến và bảo quản.
Protein cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên các tính chất vật lý của thực
phẩm qua khả năng tạo và ổn định các hệ gel, bọt, nhũ tương và cấu trúc sợi [1] . Mỗi loại
thực phẩm khác nhau chứa hàm lượng protein khác nhau đặc trưng cho từng loại thực
phẩm. việc phân tích hàm lượng protein trong thực phẩm có vai trò quan trọng trong việc
xác định hàm lượng dinh dưỡng, định giá thực phẩm dựa trên hàm lượng protein, khảo
sát tính chất của sản phẩm thực phẩm, xác định một số tính năng sinh học,… [2]. Ở bài
báo cáo này, chúng tôi xin được trình bày 2 phương pháp xác định hàm lượng protein có
trong sữa và hàm lượng gluten có trong bột mì.

1.

1
 1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN [2] [3]
1.1. Phân loại và những nghiên cứu chung:
Protein là thành phần phong phú và không thể thiếu được của tất cả các cơ thể
sống. Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vâ ̣t. Protein trong thực
phẩm rất phức tạp, nhưng nó lại là mô ̣t chỉ tiêu hết sức quan trọng để xác định giá trị dinh
dưỡng của thực phẩm. Chỉ trên nền tảng protein cao thì tính chất sinh học của các cấu tử
khác mới thể hiê ̣n đầy đủ. Các protein có khối lượng phân tử lớn và khác nhau, từ khoảng
5000 đến hơn 100000000 Dalton. Chúng bao gồm các nguyên tố gồm C, H, O, N. Mô ̣t số
còn có chứa mô ̣t lượng nhỏ S. Chủ yếu bao gồm các α -amino acid liên kết với nhau bằng
các liên kết peptide.
Protein có thể được phân loại dựa vào hình dạng, thành phần, cấu trúc hoă ̣c chức
năng sinh học, khả năng hòa tan của chúng. Trong thực phẩm, protein có nhiều cấu trúc
khác nhau như dạng sợi, xoắn hay dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục). Dựa vào thành phần
hóa học mà các protein hình cầu được phân thành hai nhóm lớn là Protein đơn giản và
Protein phức tạp.
1.2. Vấn đề phân tích protein:
Viê ̣c phân tích protein trong thực phẩm rất phức tạp vì thực tế có mô ̣t số thành
phần thực phẩm có tính chất hóa lý gần như tương tự với protein. Các chất không phải
protein nhưng có chứa nitrogen có thể là các amino acid tự do, các peptide nhỏ, nucleic
acids, phospholipids hoă ̣c mô ̣t số vitamin, v.v… gây khó khăn cho viêc̣ phân tích. Rất
nhiều phương pháp khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển nhằm đo lường hàm
lượng protein trong thực phẩm. Những nguyên tắc cơ bản của các phương pháp này bao
gồm viê ̣c xác định Nitro, liên kết peptide, sự hấp phụ tia cực tím của protein, v.v… Viê ̣c
lựa chọn sử dụng phương pháp nào phải dựa vào đô ̣ nhạy, đô ̣ chính xác, tốc đô ̣ và chi phí
phân tích, ngoài ra còn phải xét đến những ứng dụng cụ thể để lựa chọn phương pháp sao
cho phù hợp.
2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PROTEIN TRONG SỮA
2.1. Các loại protein có trong sữa [4]
Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhưng hầu hết trong số này chỉ chiếm một
lượng rất nhỏ. Protein có thể được phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học
hay vật lý, và chức năng sinh học của chúng. Thông thường, người ta phân loại protein
sữa thành casein, whey protein và các protein thiểu số.
2.1.1. Casein
Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa. Casein có mặt trong tất cả
sữa động vật, bao gồm cả sữa người. Trong sữa bò, casein chiếm 75-85% tổng số protein.

2
Các dạng casein: αs-casein (47-57%), β- casein (25-35%) và κ-casein (8-15%). Casein tồn
tại dưới dạng các micelle casein.
2.1.2. Whey protein
Whey protein (protein hòa tan) là thuật ngữ thường được dùng như là một từ
đồng nghĩa với protein huyết thanh của sữa, nhưng nên dùng nó để chỉ protein trong
whey từ quá trình sản xuất pho mát. Ngoài protein huyết thanh của sữa, whey protein còn
chữa những đoạn của phân tử casein bị tách rời trong quá trình đông tụ men dich vị của
sữa. Một số protein huyết thanh sữa tồn tại với nồng độ thấp hơn trong sữa gốc. Điều này
là do biến tính nhiệt trong quá trình thanh trùng sữa trước khi làm phomat.
2.1.3. Protein thiểu số
Protein thiểu số bao gồm màng các hạt cầu béo (membrane protein) và enzyme.
Một số protein thiểu số phổ biến: protein màng, lactoperoxidase, phosphate, lipase…
2.2. Các phương pháp xác định protein trong sữa
Có nhiều phương pháp để phân tích protein trong sữa, ví dụ như định lượng
protein theo phương pháp Kjeldahl, Bradford, Lowry, quang phổ, v.v… Trong phần này,
chúng tôi sẽ giới thiê ̣u về hai quy trình xác định protein trong sữa theo phương pháp của
Bradford và phương pháp Lowry.
2.3. Xác định protein trong sữa bằng phương pháp Lowry
2.3.1. Nguyên tắc [5] [6]
Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret và phản ứng với thuốc thử Folin–
Ciocalteau phenol (acid phosphomolybdic-phosphotungstic) lên gốc tyrosine và
tryptophan có trong protein (Hình 1). Phức màu xanh được tạo thành có đô ̣ hấp thu cực
đại ở bước sóng 750 nm (đô ̣ nhạy cao cho nồng đô ̣ protein thấp) hoă ̣c 500 nm (đô ̣ nhạy
thấp cho nồng đô ̣ protein cao). Có thể tính hàm lượng protein của sữa dựa vào đường
chuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin. Cường đô ̣
màu tỉ lê ̣ với nồng đô ̣ protein.
2.3.2. Cách tiến hành [5] [6]
2.3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dung dịch protein chuẩn có 10 - 100 μg protein/1ml.
Dung dịch chuẩn: Albumin 0.1% , thường là huyết thanh bò (BSA - bovine serum
albumin).
Bình định mức 25 ml.
Pipet 5 ml và 0.5 ml.
Ống nghiê ̣m.

3
 Thiết bị: máy so màu quang điê ̣n.
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu và hóa chất
Dung dịch nghiên cứu (sữa) được pha loãng đến phạm vi thích hợp (10 - 100 μ
g/1ml).
Dung dịch A: Na2CO3 2% hòa tan trong NaOH 0.1N.
Dung dịch B: CuSO4.5H2O pha trong dung dịch natri citrat 1% .
Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B với tỉ lê ̣ 49:1.
Dung dịch Folin có nồng đô ̣ 1N.
Cách pha dung dịch Folin: pha trong bình cầu có thể tích là 2L. Cân 100 g natri
tungstat (natri wonfamat (Na2WO4.2H2O) và 25 g natri molypdat (Na2MoO4.2H2O) và
cho vào bình cầu đáy tròn nút nhám. Thêm vào đó 700 ml nước cất và 500 ml acid ortho
phosphoric 85% (H3PO4), khuấy tan và thêm vào đó 100 ml HCl tinh kiết và đâ ̣m đă ̣c rồi
tiếp tục khuấy. Đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2 lít có ống sinh hàn
làm lạnh hồi lưu trong 10 giờ. Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150 g lithium sulfat
(Li2SO4.H2O) tinh khiết. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 - 10 ml nước
Brom khuấy đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút (không có ống làm lạnh hồi lưu) để đuổi
lượng brom thừa. Chú ý dung dịch phải có màu vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải
xử lý với Brom lần thứ hai sau khi làm nguô ̣i dung dịch ở nhiê ̣t đô ̣ thường. Để vào bình
định mức 1 lít và định mức đến vạch (có thể lọc nếu dung dịch không trong). Đựng trong
chai thủy tinh nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 - 3 tháng, dung dịch chuyển
sang màu xanh thì thêm vài giọt Brom và đun sôi 15 phút sao cho dung dịch có màu vàng
trở lại. Trước khi dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng đô ̣ 0.5N.
2.3.2.3. Quy trình thực hiện
a) Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu
Cho vào ống nghiê ̣m 1 ml dung dịch mẫu (sữa), thêm vào ống nghiê ̣m 4 ml dung
dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiê ̣t đô ̣ phòng. Sau đó thêm 0.5 ml thuốc thử
Folin, lắc đều và để yên trong 30 - 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng
sang màu xanh. Tiếp theo sẽ đem đo đô ̣ hấp thu ở bước sóng 750 nm và ghi nhâ ̣n mâ ̣t đô ̣
quang học của dung dịch nghiên cứu.
Thực hiê ̣n tương tự với mô ̣t ống đối chứng bằng cách thay 1 ml dung dịch mẫu
bằng 1 ml nước cất.
b) Lập đồ thị chuẩn
Lấy sáu ống nghiê ̣m đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bẳng sau:

Ống số Protein Nước cất Nồng đô ̣ Dung Thuốc OD

0.1% (ml) (ml) protein dịch C thử Folin

4
 (mg/ml) (ml) (ml)

1 0,00 10,00 0 2 0,5

2 0,50 9,50 50 2 0,5

3 1,00 9,00 100 2 0,5

4 1,50 8,50 150 2 0,5

5 2,00 8,00 200 2 0,5

6 2,50 7,50 250 2 0,5

Bảng 1: Lâ ̣p đồ thị nồng đô ̣ protein

Trình tự và thao tác tương tự như phần dung dịch thí nghiê ̣m. Sau đó đem đo đô ̣
hấp thu của các ống ở bước sóng 750 nm. Từ đó xây dụng đồ thị chuẩn.
2.3.2.4. Tính kết quả
Dựa vào bảng 1, khi lâ ̣p đồ thị ta lấy trị số mâ ̣t đô ̣ quang các ống từ 2 - 6 trừ đi mâ ̣t
đô ̣ quang của ống 1. Kết quả thu được chính là đô ̣ hấp thu thực sự của dung dịch protein
chuẩn, từ đó ta lâ ̣p đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mâ ̣t đô ̣ quang theo nồng đô ̣ protein
chuẩn, với trục hoành là nồng đô ̣ protein và trục tung là mâ ̣t đô ̣ quang.
Tương tự đô ̣ hấp thu thực sự của protein có trong ống thí nghiê ̣m là trị số mâ ̣t đô ̣
quang của ống thí nghiê ̣m trừ đi ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu và
suy ra lượng protein có trong mẫu sữa đem đi thí nghiê ̣m.
2.3.3. Ưu điểm và nhược điểm [2]
Ưu điểm: Phương pháp Lowry có đô ̣ nhạy tương đối cao ít bị ảnh hưởng bởi đô ̣
đục của mẫu, cụ thể hơn nhiều so với mô ̣t số phương pháp khác và tương đối đơn giản,
có thể hoàn thành trong vòng 1 - 1.5 giờ.
Nhược điểm: Màu sắc không thâ ̣t sự tỷ lê ̣ chă ̣t chẽ với nồng đô ̣ protein.
2.4. Định lượng protein trong sữa bằng phương pháp Bradford (1976)
2.4.1. Nguyên tắc [6]
Khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, thuốc nhuộm thay đổi
màu sắc từ màu đỏ đến xanh nhạt, và sự hấp thụ tối đa của thuốc nhuộm là từ 465-595
nm. Sự thay đổi độ hấp thụ ở 595 nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein của mẫu. Giống với
những phương pháp nhuộm bắt buộc khác, Bradford dựa trên tính chất lưỡng tính của
protein. Khi dung dịch mang protein được acid hóa đến một pH nhỏ hơn điểm đẳng điện
của protein đang phân tích, thuốc nhuộm sẽ tạo liên kết tĩnh điện. Hiệu quả liên kết sẽ

5
được tăng cường bởi sự tương tác kỵ nước của thuốc nhuộm phân tử với các polypeptide
liền kề trục dư lượng tích điện dương trong protein. Trong phương pháp Bradford, thuốc
nhuộm kết hợp với protein có một sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ tương đối so với
thuốc nhuộm không liên kết.
2.4.2. Cách tiến hành
2.4.2.1. Dụng cụ và thiết bị [7]
Cuvett bằng nhựa
Micropipet
Máy đo quang phổ Shimadzu UV - 200s
2.4.2.2. Chuẩn bị mẫu và hóa chất [7]
Các mẫu protein.
Dung dịch màu:
- 40mg coomassie blue G (sevra No 35050)
- 20ml ethanol (EtOH) (absolute)
- 40ml H3PO4 85%
- 40ml H2O
Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100mg/ml
2.4.2.3. Quy trình thực hiện [7]
a) Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA)
1,8ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5-40mg BSA trong nước cất được đưa
vào cóng đo nhựa
Thêm 0,6ml dung dịch màu, lắc đều để 5 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độ
phòng.
Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595nm sau 2 phút.
Dung dịch mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị từ 1.8ml nước cất và 0,6ml chất thử
màu.
Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm. Đường
cong tiêu chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong các mẫu chưa
biết, cũng được xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry.
b) Định lượng protein của mẫu

6
 Các mẫu có chứa từ 1-10mg protein trong 1,8ml H2O được đưa vào cóng nhựa.
Thêm vào 0,6ml dung dịch màu lắc đều.
Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm.
2.4.2.4. Tính kết quả
Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức sau:
C .V . a
X (mg) =
1000
Trong đó:
- X: số mg protein có trong mẫu
- [C]: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml)
- V: thể tích dung dịch mẫu
- a: độ pha loãng
2.4.3. Ưu điểm và nhược điểm [6]
Ưu điểm:

Nhanh chóng; phản ứng có thể được hoàn thành trong 2 phút.
Nhạy cảm gấp nhiều lần phương pháp Lowry.
Không có sự can thiệp của ammonium sulfate, polyphenol, carbohydrate như
sucrose, hoặc cation như K+, Na+ và Mg2+
Đo được protein hay peptide có khối lượng phân tử xấp xỉ hoặc lớn hơn 4000 Da
Nhược điểm:

Bị cản trở bởi cả thuốc tẩy mang ion và không ion như là Triton X-100 và sodium
dodecyl sulfate. Tuy nhiên, với sai số nhỏ khoảng 0,1%, các chất tẩy rửa có thể được
dùng với sự kiểm soát một cách thích hợp.
Phức hợp protein-thuốc nhuộm có thể liên kết với cuvette thạch anh. Vì vậy các
nhà phân tích phải sử dụng cuvette thủy tinh hoặc nhựa.
Màu sắc đa dạng tuỳ theo loại protein. Các protein tiêu chuẩn phải được lựa chọn
cẩn thận.
3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GLUTEN TRONG BỘT MÌ
3.1. Khái quát về gluten

7
 3.1.1. Định nghĩa [8]

Gluten có thể được định nghĩa như là một loại protein có tính “cố kết, nhớt đàn
hồi”. Về mặt sinh học, gluten được định nghĩa như một loại protein dự trữ trong hạt
lúa mì.
Một cách khái quát, gluten là tên gọi chung của một loại protein có trong một số
loại ngũ cốc, là thành phần protein chính trong lúa mì, giúp tạo nên tính đàn hồi đặc
trưng của bột. Hàm lượng protein trong bột mì càng cao, chất lượng và độ bền của
gluten càng cao.
Gluten là một trong những yếu tố để phân biệt công dụng của các loại bột khác
nhau.
3.1.2. Thành phần [9]
Gluten bao gồm hai thành phần là Gliadin (Prolamin) và Glutenin. Các chất này
liên kết với tinh bột và tồn tại trong nội nhũ của hạt của một số loại cây hòa thảo, đặc biệt
là lúa mì, yến mạch và lúa mạch.
3.1.2.1. Gliadin

Là các chuỗi đơn polypeptide chứa các liên kết disulfide nội phân tử.
Khối lượng phân tử: 30000 - 50000 Da.
Gồm bốn loại: α -, β -, γ -, và ω-gliadin.
Phát triển mạng lưới gluten bằng cách hình thành các liên kết hydro, liên kết kỵ
nước giữa các mạch nhánh chứa acid amin không phân cực và chuyển đổi thiol-
disulfide, tương tác với lipid (lipid của bột hoặc lipid bổ sung vào).
Gliadin đặc trưng cho độ nhớt và độ co giãn của bột nhào.

3.1.2.2. Glutenin

Là hỗn hợp các polypeptide liên kết với nhau qua cầu nối disulfide tạo nên
những đại phân tử có khối lượng phân tử lên đến hàng triệu.
Khối lượng phân tử: 60000 - 106 Da.
Gồm hai loại: HMW (67000 - 88000 Da) và LMW (<69000 Da).
Chứa thêm cystein nằm ở cuối mạch phân tử → tạo liên kết disulfide với các
phân tử glutenin khác → phát triển mạng gluten.
Glutenin đặc trưng cho độ đàn hồi của bột nhào.

8
 3.2. Các phương pháp xác định gluten trong bột mì
Ở đây chúng tôi xin phép được trình bày 2 phương pháp để xác định hàm lượng
gluten trong bột mì là phương pháp thủ công và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography).
3.3. Xác định gluten trong bột mì bằng phương pháp thủ công [10] [11]
3.3.1. Nguyên tắc

Thành phần protein trong bột mì gồm 4 loại [9] :

Albumin: tan trong nước.

Globulin: tan trong dung dịch muối loãng.

Gliadin/ prolamin: tan trong dung dịch cồn nồng độ 60-70%.

Glutenin: tan trong dung dịch acid hay kiềm đậm đặc.

Dựa vào tích chất trên, để xác định gluten trong bột mì, người ta trộn bột với
dung dịch muối loãng sau đó đem đi rửa để thu được gluten.

3.3.2. Chuẩn bị

Bột mì.
Dung dịch NaCl 20g/l (pH=6.2)
Dung dịch I20.1%/KI 3%.
3.3.3. Tiến hành
a) Quy trình thực hiện

Cân khoảng 20g bột cần phân tích.

Đong 100ml dung dịch NaCl 20g/l. Cho lượng bột mì đã cân vào tô nhựa và
thêm từ từ dd NaCl vào cho đến khi tạo thành khối đồng nhất.
Vét hết các mảnh bột dính vào tô, vê khối bột thành hình cầu.
Cho vào chén, đậy kín và ủ trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau đó rửa khối bột nhào đã ủ bằng nước :

9
  Đổ 1-2l nước vào chậu. Cho khối bột vào ngâm và rửa tách tinh bột và
các thành phần hòa tan khác.
 Thay nước rửa 3-4 lần tùy theo mức độ tinh bột trong nước rửa.
 Để xác định việc rửa xong, tiến hành thủ nước rửa gluten bằng cách
cho vài giọt dung dịch I2/KI, nếu dung dịch không có màu xanh nhạt
là đã rửa hết tinh bột.
Sau khi thu được gluten ướt, đem sấy ở nhiệt độ khoảng 105oC đến khối
lượng không đổi để thu gluten khô.
b) Tính kết quả
Tính kết quả:
m2−m0
X= .100 %
m1
Trong đó: m2: khối lượng đĩa và gluten sau khi sấy (g)
m0: khối lượng đĩa sấy (g)
m1: khối lượng bột mì sử dụng (g)
c) Kết quả thực nghiệm
Sau khi tiến hành thí nghiệm trên các loại bột mì số 8, 11 và 13, chúng tôi thu
được kết quả như sau:

Loại bột mì

8 11 13

m1 25.01 25.11 20.00

m2 2.46 4.14 5.48

Lần 1
m0 1.52 2.12 2.52

X 3.76 8.04 14.80

m1 20.01 30.55 20.02

m2 3.99 7.32 5.43

Lần 2
m0 2.02 3.37 2.81

X 9.85 12.93 13.09

10
 m1 23.35 20.00 20.02

m2 3.95 4.13 4.87

Lần 3
m0 2.05 2.23 2.81

X 8.14 9.50 10.29

Bảng 2: Kết quả khảo sát hàm lượng gluten trong bột mì số 8, 11 và 13

3.3.4. Ưu điểm và nhược điểm

Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ thực hiện
Nhược điểm: độ chính xác không cao do gluten có thể bị mất đi trong quá trình
rửa.
3.4. Xác định hàm lượng gluten bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (High Performance Liquid Chromatography)
3.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.4.1.1. Khái niệm [12]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó
pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng
tiểu phân hoạc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến bằng liên kết hóa học với các liên kết hữu cơ. Phương pháp này có độ nhạy cao, khả
năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoạc dễ bị phân hủy nhiệt.
3.4.1.2. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [13]

11
12
 Hình 1: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các thành phần cơ bản sau đây.
1. Bình chứa pha động 5. Cột sắc ký (pha tĩnh)
2. Bộ phận khử khí 6. Đầu dò
3. Bơm cao áp 7. Hệ thống máy tính
4. Bộ phận tiêm mẫu 8. In dữ liệu
3.4.1.3. Nguyên tắc hoạt động của hệ thống SE – HPLC [14]
Cột sắc ký có chứa các hạt gel, các hạt gel này sẽ hỗ trợ việc phân tách các phân tử
theo kích thước của chúng. Khi phân tách các thành phần của protein, các phần tử có kích
thước phân tử lớn sẽ được phân tách trước. Trong khi đó các phần tử nhỏ sẽ được bao bọc
trong các hạt gel và được rửa giải sau cùng.
Khi quá trình phân tách vừa kết thúc thì sắc ký đồ cũng vừa hoàn thành trên máy
tính.
3.4.2. Chuẩn bị [15]
Hóa chất

0.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) 0.05M

Dung dịch đệm phosphate (pH 6.9) dùng để tinh sạch protein

Acetonitrile (190 grade, Ajax Laboratory Chemicals, Auburn, NSW, Australia)

Triflouroacetic acid

Nước cất

Dụng cụ

Máy sóng siêu âm

Máy li tâm( Jouan A-14 microcentrifuge, Societe Jouan, Saint Herblain, France)

Màng vi lọc, kích thước lỗ lọc 0.45 µm (Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, MI,
U.S.A.)

13
 Máy HPLC (Beckman Instruments,Inc.,Fullerton,CA, USA ) cấu hình kiểu bơm
126, kiểu đầu dò 166 (UV), kiểu lấy mẫu tự động 507E.

3.4.3. Tiến hành [15]

Bước 1: Tinh sạch protein ra khỏi bột mì
Chúng ta sẽ lấy 10mg bột trộn với 1ml 0.5% SDS 0.05M, dung dịch đệm
phosphate (pH 6.9), sau đó đưa vào máy siêu âm trong 10 giây. Sau đó tiến hàn đem ly
tâm với lực ly tâm là 17000xg trong 15 phút, sau đó phần protein được hút ra và lọc qua
màng vi lọc. Phần protein được tinh sạch này được dùng để đo sắc ký.
Nguyên tắc cơ bản của quá trình này là hạt tinh bột sẽ bị phá vỡ trong quá trình
siêu âm, các protein được giải phóng ra ngoài. SDS là chất tẩy rửa giúp cho protein được
sạch và giữ protein được ổn định cấu trúc, dung dịch đệm cần thiết để cho chất tẩy rửa
SDS có thể hoạt động tốt hơn. Hỗn hợp sau khi siêu âm sẽ được đem đi ly tâm, dịch nổi
protein có trọng lượng phân tử thấp sẽ nổi lên trên, còn những chất còn lại có trọng lượng
phân tử cao sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm. Phần dịch nổi phía trên chính là protein đã
được tinh sạch.
Bước 2: Tiến hành sắc ký protein

Cho dung môi bao gồm 50% acetonitrile, 50% nước tinh khiết và cả 2 đều có chứa
0.05% triflouroacetic acid vào các bình chứa dung môi pha động của máy sắc ký

Sử dụng sóng siêu âm để làm sạch đầu lọc dung môi và đuổi bọt khí trong các ống
trong hệ thống sắc ký

Các đầu lọc sẽ hút dung môi đi vào hệ thống kênh dung môi, sau khi đi vào hệ
thống máy các dòng dung môi sẽ nhập lại thành một dòng và đi vào máy bơm

Ta tiến hành tiêm mẫu protein đã được tinh sạch vào. Máy sẽ tự hút chính xác
20µl mẫu bơm vào cột

Quá trình sắc ký bắt đầu xảy ra. Bên trong máy có một cái đầu dò UV-Vis. Do
mẫu protein có thể hấp thụ các tia tử ngoại, nên đầu dò này sẽ thu nhận các tín hiệu phản
hồi từ mẫu ở bước sóng 214nm và đưa thông tin về máy tính.
14
 Sau khi đã được phân tích, dung môi theo ống dẫn và được thải ra ngoài.

Tiến hành thu nhận kết quả và phân tích kết quả trên sắc ký đồ.

3.4.4. Kết quả [15]

Kết quả phân tích sẽ cho ra sắc ký đồ. 3 đỉnh chính xác đã được xác định trên sắc
ký đồ hiển thị trên máy, mỗi đỉnh đại diện cho các phản ứng phát hiện ở một hợp chất
khác nhau.
Đỉnh thứ nhất là các protein cao phân tử ( polymeric protein ) chủ yếu là
glutenin. Đỉnh thứ hai là các monomeric gliadin, đỉnh thứ 3 là hỗn hợp của monomeric
protein:albumin và globulin. ở sắc ký đồ ta thấy là trục hoành chỉ thời gian quét là 10
phút, trục tung chỉ tín hiệu phản hồi của đầu dò UV.

Hình 2: Kết quả SE-HPLC của protein trong bột mì.

3.4.5. Ưu điểm và nhược điểm [15]
Ưu điểm
SE-HPLC là một kỹ thuật tốt được thiết lập và có nhiều cải tiến trong thiết kế
dụng cụ, xử lý thông tin trong máy tính và hiệu suất đo lượng.
Nhược điểm

15
 Các lỗi thường xảy ra khi sử dụng pương pháp này là sai sót trong việc chuẩn bị
mẫu, đặc biệt là các bước sử dụng sóng siêu âm, và trong việc giải thích các dữ liệu thu
được từ sắc ký đồ.

16
 Tài liệu tham khảo:
1. Hoàng Kim Anh (2015), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
2. S. Suzanne Nielsen (2015), Food Analysis Laboratory Manual. 2 nd rd. USA,
p.135.
3. Lê Ngọc Tú và cô ̣ng sự (2002), Hóa sinh Công nghiê ̣p. Hà Nô ̣i: Nhà xuất bản
Khoa Học và Kỹ Thuâ ̣t.
4. ThS. Đặng Thị Ngọc Dung, Bài giảng Công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm
từ sữa, Khoa Công nghê ̣ Hóa học và Thực phẩm ,Trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật
Tp. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại Học Quốc
Gia Hà Nô ̣i.
6. S. Suzanne Nielsen (2015) . Food Analysis. 2 nd rd. USA.
7. NJ Kruger , The protein protocols handbook, 2009 – Springer.
8. Anon (1992), Mr Frederic Reckitt. Reckitts’ Magazine. Vl(7), 1.
Apichartsrangkoon, A., A. E., Ledward, D. A., & Schofield, J. D. (1999).
Dynamic viscoelastic behavior of high-pressure-treated wheat gluten. Cereal
Chemistry, 76(5), 777-782
9. TS. Vũ Trần Khánh Linh, Giáo trình môn Công nghê ̣ chế biến đường và bánh kẹo,
Khoa Công nghê ̣ Hóa học và Thực phẩm, Trường ĐH Sư phạm Kỹ thuâ ̣t Tp. Hồ
Chí Minh.
10. TCVN 7871-1 (2008), Hạt lúa mì và bột mì-Hàm lượng Gluten-Phần 1 Xác
định Gluten ướt bằng phương pháp thủ công.
11. TCVN 7871-3 (2008) (ISO 21415-3:2006) Hạt lúa mì và bột mì – Hàm
lượng gluten – Phần 3: Xác định gluten khô từ gluten ướt bằng phương
pháp sấy.
12. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN
TÍCH THÍ NGHIỆM TP.HCM.
13. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-High Performance Liquid
chromatography)-TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH THÍ NGHỆM TP.HCM.
14. High Performance Liquid Chromatography (HPLC): principle, type,
instrumentation and application, July 28,2015 by Dhurba Giri in Biochemistry
15. I J Wesley at al, Measurement of Gliadin and Glutenin content of Flour by NIR
Spectroscopy, Journal of Cereal Science ,volume 34 (2001) 125-133

17