ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Dự án Thực tập Chuyên ngành Sinh hóa

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG LÊN
MEN THÍCH HỢP ĐẾN SỰ SINH TỔNG HỢP ENZYME
PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS

Giảng viên hướng dẫn: Trần Thị Diễm Hương

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đình Ninh 19150416
Nguyễn Thanh Trang 19150490

TP.HCM, 11/2022
 ĐẶT VẤN ĐỀ
Protease là một trong những enzyme được ứng dụng nhiều trong mọi lĩnh vực,
trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm protease đã có những đóng góp
rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên
thế giới công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển,
tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng của enzyme protease. Ở Việt Nam
có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng protease, chủ yếu tập
trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được
nghiên cứu trong hơn 10 năm trở lại đây. [1]
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều
hơn. Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế
việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá
trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì
protein chỉ chiếm 20 – 30% [2]. Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp tách
chiết và tinh sạch enzyme protease nhằm thu được sản phẩm có nhiều sinh
khối và độ tinh khiết cao là rất cần thiết.
Với dự án “Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường lên men thích hợp đến
sự sinh tổng hợp enzyme protease từ Bacillus subtilis” hy vọng sẽ đóng góp
tích cực một phần vào các công trình nghiên cứu đã, đang và sẽ được thực hiện
liên quan đến yếu tố ảnh hưởng từ môi trường lên men vi sinh, các phụ phẩm
nông nghiệp khác nhau sẽ ảnh hưởng một phần đến sinh khối enzyme protease.
Chính vì thế, vấn đề của dự án đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồn
cơ chất, nguyên liệu giàu protein từ các phụ phẩm nông nghiệp làm môi trường
cảm ứng tăng sinh protein cho vi sinh vật nhằm nâng cao giá trị sinh khối của
enzyme protease.

-1-
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

-2-
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU

-3-
 MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU ...............................
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................
1.1. Protease .......................................................................................
1.1.1. Định nghĩa ........................................................................
1.1.2. Cấu tạo và phân loại .........................................................
1.1.3. Tính chất protease từ vi sinh vật ......................................
1.1.4. Ứng dụng ..........................................................................
1.2. Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis ..........................................
1.2.1. Nguồn gốc.........................................................................
1.2.2. Phân loại ...........................................................................
1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, nuôi cấy ............................
1.2.4. Ứng dụng ..........................................................................
1.3. Sự hình thành protease trong vi khuẩn .......................................
1.4. Các phương pháp thu nhận protease từ vi sinh vật ....................
1.4.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt ..........................................
1.4.2. Phương pháp nuôi cấy chìm .............................................
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme ................
1.5.1. pH......................................................................................
1.5.2. Nhiệt độ ............................................................................
1.5.3. Chất tăng hoạt và chất kìm hãm .......................................
1.6. Khảo sát nguồn cơ chất từ các phụ phẩm nông nghiệp ..............
1.6.1. Bột đậu nành .....................................................................
1.6.2. Đậu nành tách béo ............................................................
1.6.3. Bã đậu ...............................................................................
1.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và Thế giới............................
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ....................................
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ...........................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................

-4-
 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Protease
1.1.1. Định nghĩa
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự đến sản phẩm cuối cùng là
các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng phân thủy phân
liên kết esther và vận chuyển acid amin.

Hình 1.1.1. Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein

1.1.2. Cấu tạo và phân loại
1.1.2.1. Cấu tạo
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối
tượng từ vi sinh vật đến thực vật và động vật. So với protease động vật và
thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ
protease vi sinh vật là một hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống
nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới
dạng tinh thể đồng nhất.
Cấu trúc bậc 4 của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ
chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất
dễ phân giải hơn dạng tetramer.

-5-
 Hình 1.1.2.1. Mô hình cấu trúc không gian enzyme protease

1.1.2.2. Phân loại

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Hình 1.1.2.2. Sơ đồ phân loại protease

Dựa vào vị trí tác dụng của Protease lên các peptide trong phân tử protein,
người ta chia Protease thành 2 nhóm chính: exopeptidase và
endopeptidase.

-6-
Exopeptidase (Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptide):
Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc
một tripeptide.
Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Endopeptidase (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác):
Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của enzyme. Nhóm này bào gồm 2 nhóm nhỏ chymotrypsin
và subtilisin. Nhóm chymotrypsin: bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme
vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm
hoạt động. Cysteine proteinase bao gồm các protein thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và protein ký sinh trùng. Các cysteine
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.
Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinse có chứa nhóm carboxyl
trong nhóm trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung
tính.
Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, Protase còn được phân loại dựa vào thành phần amino acid và
vùng pH tối ưu:

-7-
Protease acid: hoạt động ở vùng pH acid 2 – 4.
Protease kiềm: hoạt động ở vùng pH kiềm 9 – 11.
Protease trung tính: hoạt động ở vùng pH trung tính 7 – 8.
1.1.3. Tính chất protease từ vi sinh vật
Các kết quả từ những công trình nghiên cứu protease vi sinh vật cho thấy
các protease của cùng một loại vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều
tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp, protease
vi sinh vật được chia thành 4 nhóm: P – serine; P – thiol; P – kim loại;
P – acid.
Tính chất hóa lý
Protease – serine và Protease – thiol có khả năng phân giải liên kết esther
và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin.
Protease – kim loại và Protease – acid thường không có hoạt tính estherase
của các dẫn xuất của acid amin.
Trọng lượng phân tử
Protease – serine: 20.000 – 27.000 dalton.
Protease – thiol và Protease – acid: 30.000 – 40.000 dalton.
Protease – kim loại: 33.800 – 48.400 dalton.
1.1.4. Ứng dụng
Trong công nghiệp thực phẩm: chế biến thủy sản, chế biến thịt, sản xuất sữa
và phomat, tăng tính xốp dẻo cho bánh mì, bánh quy , sản xuất bia, ngũ
cốc…
Trong công nghiệp da, dệt: làm mềm dẻo da, làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân
tạo. bóng sợi tơ…
Trong một số ngành công nghiệp khác: điều chế dịch đạm thủy phân dùng
làm chất dinh dưỡng, điều chế môi trường dinh dưỡng để sản xuất kháng
sinh, sản xuất chất tẩy, keo động vật…
1.2. Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis
1.2.1. Nguồn gốc

-8-
 Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần
30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là
“Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn
này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.
1.2.2. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Firmicutes
- Lớp (Class): Bacilli
- Bộ (Order): Bacillales
- Họ (Family): Bacillaceae
- Giống (Genus): Bacillus
- Loài (Species): Bacillus subtilis

1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, nuôi cấy

Hình thái: Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram (+)
bắt màu tím, kích thước 0.5 – 0.8 μm x 1.5 – 3 μm, đơn lẻ hoặc thành
chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử
hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước bào tử
từ 0.8 – 1.8 μm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào
tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (100℃ trong 180 phút),
chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng.

Hình 1.2.3. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi
-9-
 Sinh hóa: lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose,
mannitol, saccharose, xylose và arabinose.
Thử nghiệm indol (-), Voges – Proskauer (+), nitrate (+), H2S (-), NH3
(+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), có khả năng di
động (+) và hiếu khí (+).
Bảng 1.2.3. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis
(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)
STT Phản ứng sinh hóa Kết quả
1 Hoạt tính catalase +
2 Sinh indol -
3 MR (Methyl – red) +
4 VP (Voges – Proskauer) +
5 Sử dụng citrate +
6 Khử nitrate +
7 Tan chảy gelatin +
8 Di động +
9 Phân giải tinh bột +
10 Arabinose +
11 Xylose +
12 Saccharose +
13 Manitol +
14 Glucose +
15 Lactose -
16 Maltose +
Nuôi cấy: vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí,
tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối
ưu là 37℃, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh
dưỡng cơ bản:
- Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng
tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau
1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
- 10 -
- Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển
làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở
đáy, khó tan khi lắc đều.
- Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng,
đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72
giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung
cấp đủ nguồn carbon (glucose) và nitơ (peptone).
1.2.4. Ứng dụng
B. subtilis được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất amino acid,
thức ăn gia súc vì chúng có khả năng tổng hợp lysine với hàm lượng
khá cao (15 - 20%) từ tinh bột.
Trong y dược, B. subtilis được sản xuất thành ống thuốc Subtilis
10 ml điều trị bệnh tiêu chảy ở trẻ em do vi khuẩn Coliform, bệnh dường
ruột do lị trực tràng, B. subtilis còn dùng để sản xuất các kháng sinh
thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm
Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae...
Người ta thấy rằng sự phát triển của B. subtilis trong cây làm tăng
khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ
(Rhizobacterium). Khả năng này được ứng dụng trong kiểm soát sinh
học.
B.subtilis được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học
(probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng
trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao
nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất
tẩy rửa. Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những
dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước.
B. subtilis tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất
polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải
như là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm.

- 11 -
1.3. Sự hình thành protease trong vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả
hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao.
Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử
protein.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là B. subtilis, B.
mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis S5 có khả năng tổng hợp protease mạnh
nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở
vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 -
8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy
phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá
trị dinh dưỡng. Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin
ưa béo và thơm và được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng
phân tử từ 20.000 - 30.000 dalton. Ổn định trong khoảng pH 6 - 12 và hoạt
động trong khoảng pH rộng 7 - 12.
1.4. Các phương pháp thu nhận protease từ vi sinh vật
1.4.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nguyên tắc: Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện
cho vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao đổi chất trên bề mặt môi trường.
Môi trường sử dụng có thể ở dạng rắn hoặc lỏng.
Nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt dịch thể thường được dùng cho nhóm vi
sinh vật hiếu khí. Thiết bị nuôi cấy phải có bề mặt rộng thoáng để vi sinh
vật phát triển.
Nuôi cấy vi sinh vật sử dụng môi trường bán rắn thường được dùng cho
nhóm vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí. Trong quá trình nuôi cấy cần lưu ý
độ ẩm môi trường phải đảm bảo khoảng 60 – 70%.
- 12 -
Chế phẩm enzyme thô trong nuôi cấy bề mặt bao gồm thành phần môi
trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước.

Hình 1.4.1. Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt

Ưu điểm của phương pháp:

+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao
+ Chế phẩm enzyme sau thu nhận dễ sấy khô và bảo quản
+ Dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản, không tốn kém
+ Dễ xử lý khi nhiễm vi sinh vật lạ (do môi trường nuôi cấy tĩnh)
Nhược điểm của phương pháp:
+ Tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy
+ Chế phẩm enzyme thô nhiều thành phần dẫn tới tốn kém khi tinh sạch.

1.4.2. Phương pháp nuôi cấy chìm

Nguyên tắc: Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát
triển, sinh sản và trao đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong
nuôi cấy chìm thường là môi trường lỏng. Phương pháp này có thể được sử
dụng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí.
Quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong môi trường lỏng, vi sinh
vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân thường là
các enzyme hòa tan trong nước. Do đó, việc thu nhận enzyme trong trường
hợp này là thu nhận dịch nuôi cấy (sau khi đã tách sinh khối và những thành
phần không hòa tan của môi trường).

- 13 -
 Quá trình nuôi cấy chìm cần thực hiện:
+ Khuấy đảo và sục khí
+ Theo dõi sự tạo bọt và biện pháp phá bọt
+ Điều chỉnh pH của môi trường
+ Điều chỉnh nhiệt độ môi trường

Hình 1.4.2. Dây chuyền nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy chìm

Ưu điểm của phương pháp:

+ Không mất nhiều diện tích
+ Dễ cơ giới hóa, tự động hóa quá trình nuôi cấy
Nhược điểm của phương pháp:
+ Đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị
+ Khó xử lý khi nhiễm vi sinh vật lạ (thải bò toàn bộ dịch nuôi), tốn kém.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme
1.5.1. pH
Hoạt độ của E phụ thuộc vào pH môi trường, đó là vì pH ảnh hưởng đến
trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc a.a trong phân tử E, ion hóa các
nhóm chức trong trung tâm hoạt động, ion hóa cơ chất, do đó ảnh hưởng
đến vận tốc phản ứng. Đường biểu diễn vận tốc đầu của nhiều phản ứng E
ở các pH khác nhau có dạng hình chuông hẹp cân đối, có đỉnh chuông ứng
với pH trung tính. Như vậy pH thích hợp (pHopt) của phần lớn E vào khoảng
7. Tuy nhiên, cũng có một số E có pHopt rất thấp (pepsin, protease acid của
vi sinh vật), hoặc khá cao như subtilisin (protease kiềm của Bacillus), hoặc
ít thay đổi trong một khoảng pH xác định.
- 14 -
Hình 1.5.1. Ảnh hưởng của pH môi trường phản ứng đến phản ứng E
a) Đường biểu diễn chung đối với nhiều E; b) Pepsin;
c) Subtilisin của Bacillus pumilus; d) Cholinesterase;
e) Papain với cơ chất benzoylarginylamide.

Xác định độ bền pH của E có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu nhận
chế phẩm E, tinh sạch và nghiên cứu E. Để xác định độ bền pH của E, tiến
hành giữ E trong các dung dịch đệm có pH khác nhau trong thời gian xác
định, sau đó chỉnh về cùng pH giống nhau (pH thích hợp để xác định hoạt
độ của nó) trước khi tiến hành xác định hoạt độ.
1.5.2. Nhiệt độ
Do bản chất hóa học của E là protein nên khác với các phản ứng hóa học,
vận tốc phản ứng do E xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới
hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của E.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng E cho
thấy nhiệt độ hoạt động thích hợp (topt) của nhiều E vào khoảng 40℃ - 50℃.
- 15 -
 Trên 50℃ hoạt độ thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử E
(ngoại trừ một số E có nguồn gốc từ thực vật và một số E có nguồn gốc từ
vi sinh vật có topt cao hơn).
Dưới 0℃ hoạt độ E thường giảm nhiều, nhưng lại có thể được hồi phục khi
đưa về nhiệt độ bình thường.

Hình 1.5.2. Đường biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng E
1.5.3. Chất tăng hoạt và chất kìm hãm
- Chất tăng hoạt: các ion kim loại có thể kìm hãm hay hoạt hóa E. Các ion
kim loại nặng, ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không
thuận nghịch E. Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của
chúng, mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng
độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá ngưỡng nồng độ này, lại
có tác dụng kìm hãm E.
Đặc điểm tác dụng của ion kim loại:
+ Làm cầu nối giữa E và cơ chất
+ Làm trung gian cho các phản ứng oxy hóa – khử
+ Làm bền dạng cấu trúc trung tâm hoạt động của phân tử E.
Một số ví dụ:
+ Các ion kết hợp chặt với E, tạo thành các metallo E. Ttong quá trình tinh
sạch, ion kim loại vẫn còn kết hợp với E. Các ion thường gặp trong các
metallo E là: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+.
+ Các ion có trong dung dịch liên kết lỏng lẻo với E, có vai trò kích thích,
làm tăng hoạt độ của E, do đó khi thêm các ion này vào E tinh sạch sẽ làm
tăng hoạt độ của nó. Thuộc loại này, thường gặp là các ion kim loại kiềm
hay kiềm thổ như Na+, K+, Mg2+ hay Ca2+.

- 16 -
- Chất kìm hãm: Các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất. Chất
ức chế gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzyme cạnh tranh với
cơ chất, khiến cho hoạt động xúc tác của enzyme chậm lại. Khi chất ức chế
được giải phóng hoạt động xúc tác của enzyme trở lại bình thường.
Cơ chế của các chất kìm hãm:
+ Kìm hãm thuận nghịch
+ Kìm hãm cạnh tranh
+ Kìm hãm không cạnh tranh
Một số ví dụ:
+ Sử dụng carboxypeptidase tách gốc tyrosine đầu C khỏi phân tử fructose
– biphosphate aldolase làm giảm hoạt độ cho phép giả thiết gốc Tyr đầu C
có vai trò kết hợp với nhóm 6 – phosphate của cơ chất này.
+ Sử dụng Subtilisin (protease kiềm của Bacillus) cắt phân tử ribonuclease
thành 2 phần gọi là S – peptide (gồm 20 gốc a.a đầu tiên của E) và phần còn
lại của phân tử ký hiệu là S – protein (gồm 104 gốc a.a của phân tử E. Cả 2
phần S – peptide cũng như S – protein đều mất hoạt tính xúc tác.
1.6. Khảo sát nguồn cơ chất từ các phụ phẩm nông nghiệp
Phân loại các chế phẩm từ đậu nành:
Isolated soy protein (ISP) (hàm lượng protein > 90%)
ISP là một dạng đạm đậu nành được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong
thực phẩm. Sau khi loại bỏ hầu hết các thành phần non-protein như chất
béo, chất xơ và cacbohydrate, ISP được tinh chế với hàm lượng protein cao
nhất trong các loại chế phẩm từ đậu nành và hàm lượng tối thiểu là 90%.
Đặc điểm: dạng bột, màu vàng nhạt, vị trung tính.
Textured Soy Protein (TSP) hoặc Soya chunks (hàm lượng protein>50%)
TSP là một dạng khác của protein đậu nành được tạo nên từ hỗn hợp bột
đậu nành và đậu nành cô đặc. Sau đó trải qua quá trình loại nước, tách dầu,
ép đùn làm thay đổi cấu trúc của protein tạo nên chất nền dạng sợi, cấu trúc
khô, xốp khi loại nước và dai mềm sau khi ngâm nước. Một số hình dạng
cơ bản của TSP như dạng vảy, dạng miếng, dạng hạt, vvv. Do đó TSP/TVP
được ứng dụng là thành phần chính trong những sản phẩm chay thay thế
thịt.
- 17 -
 TVP (texture vegan protein) là tên gọi khác của dòng sản phẩm thịt chay
mà thay vào đó đậu nành có thể từ nguồn đạm thực vật khác như các loại
đậu, yến mạch, lúa mì, v.v. có tên gọi phổ biến là protein thực vật kết cấu.
Đặc điểm: cấu trúc giòn xốp, màu sắc đa dạng tùy vào sự phối trộn nguyên
liệu hay màu.

Soy Protein Concentrate (SPC) (hàm lượng protein > 65%)

Cả đạm đậu nành (ISP) và đạm đậu nành cô đặc (SPC) đều chứa hàm lượng
protein rất cao. Tuy nhiên điểm khác biệt là đạm đậu nành cô đặc chỉ loại
bỏ chất béo và các thành phần tan trong nước, giữ lại carbohydrate và chất
xơ. Vì vậy, hàm lượng protein trong SPC sẽ thấp hơn ISP và chứa ít nhất
65%protein.
Đặc điểm: dạng bột, màu vàng nhạt, mùi vị đậu nành tự nhiên.
1.6.1. Bột đậu nành
Trong hạt đậu nành có các thành phần hóa học sau protein (40%), lipit (12 -
25%), glucid (10 - 15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các
vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose.
Trong đậu tương có đủ các amino acid cơ bản isoleucin, leucin, lysin,
metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là
một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể
các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể. Các thực phẩm làm từ
đậu tương được xem là một loại "thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực
vật dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật.
Cơ chất dùng trong khảo sát là hạt đậu nành được xay mịn thành bột.
1.6.2. Đậu nành tách béo
Đậu nành tách béo hay còn gọi là protein đậu nành là sản phẩm được phân
tách từ hạt đậu nành đã khử chất béo, ngâm rửa trong cồn hoặc nước để loại
bỏ đường và chất xơ. Ngày nay chúng ta có thể dễ dàng tiếp cận và đa dạng
hóa công thức chế biến từ các dạng chế phẩm protein đậu nành.
1.6.3. Bã đậu nành
Bã đậu nành (có khi gọi là bã đậu) là một thành phần từ hạt đậu nành thu
được, sau quá trình sàng lọc để làm sữa đậu nành, váng đậu, đậu phụ. Bã
đậu nành là phần không hòa tan của hạt đậu nành với nước trong quá trình
- 18 -
sản xuất và chế biến sữa đậu nành hoặc đậu phụ. Phần bã còn lại có màu
trắng sữa hoặc vàng nhạt, rất mịn.
Trong bã đậu nành có chứa nhiều dưỡng chất như: Chất béo 8 - 15%, chất
xơ 12 - 14.5%, chất đạm 24% và 17% đạm đậu nành, canxi, sắt,... Do trong
bã đậu nành có độ ẩm và hàm lượng dinh dưỡng cao nên nhanh bị hư hỏng.
Thành phần bã đậu nành giàu chất xơ (high fiber) Mỗi 100 gam bã đậu
nành chứa đến 12 gam chất xơ, nhiều vượt trội hơn so với các loại thực
phẩm khác. Chất xơ chứa trong bã đậu nành không hòa tan trong nước, vì
thế chất xơ trong bã đậu nành sẽ giúp loại bỏ các độc tố tích tụ trong thành
ruột, ngăn ngừa việc ứ đọng mỡ thừa trong cơ thể, tránh bị táo bón và còn
có thể giúp phòng ngừa bệnh ung thư ruột.
Bã đậu nành còn chứa nhiều chất đạm, canxi, kali, tinh bột,.... Mỗi 100 gam
bã đậu nành chứa 81 mg calcium, 350mg potassium, khoảng 14g gam
carbohydrate (tinh bột), và khoảng 17 gam chất đạm thực vật. Chất tinh bột
trong bã đậu nành có nguồn gốc từ hạt đậu nành nên sẽ cung cấp một số vi
sinh có lợi cho quá trình tiêu hóa và hấp thụ dưỡng chất trong ruột. Bã đậu
nành còn chứa một số sinh tố như Vitamin E, K, B1, B2. Ngoài ra nó còn
cung cấp thêm folic acid cùng một số khoáng chất khác như kẽm, magiê,
sắt, phốt pho, đồng, và muối natri.
1.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và Thế giới
Việt Nam: Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập thành
công hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme
nattokinase trên môi trường đậu nành hấp chín nuôi cấy trên đĩa petri và khay.
Năm 2013, Bùi Thị Nhung và cộng sự đã nghiên cứu thu được kết quả điều
kiện lên men bề mặt Bacillus subtilis với cơ chất là bột đậu nành và cám mì
thu enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất ở pH 9, độ ẩm từ 50 - 60% và
thời gian lên men 48h. Năm 2016, Nguyen Nhut Huy và Nguyen Thuy Huong
đã thực hiện lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là
hạt đậu nành ở điều kiện nhiệt độ 37℃; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu
nhận được enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất. Năm 2016, Nguyễn Thị
Minh Nguyệt đã phân lập và định danh được 2 chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis natto từ natto thương phẩm của Nhật Bản. Năm 2019, Phan Thị Bích
Trâm, Lương Thị Thu Hương và Khúc Ngọc Vy, “Sản xuất protease từ
Bacilus subtilis N1 sử dụng phụ phẩm đậu nành”.
- 19 -
Thế giới: Năm 1998, Hidehiro Miyamura và các cộng sự đã nghiên cứu lên
men Bacillus subtilis trên bã đậu nành ở điều kiện thích hợp là nhiệt độ 37ºC,
độ ẩm 80%, thời gian 24 giờ. Năm 2010, Xiaoyan Zu và các cộng sự đã khảo
sát cho thấy: “Sản lượng enzyme sản xuất từ bã thãi đậu nành cao hơn và có
hoạt tính không thấp hơn so với lên men natto hạt đậu nành”. Năm 2013,
Rohit Kapoor và Bibhu Prasad Panda đã nghiên cứu lên men Bacillus subtilis
với cơ chất là hạt đậu nành bổ sung 1% khối lượng sữa bột, 30% nước (w/v)
thu được enzyme protease có hoạt độ cao nhất khi thu nhận enzyme bằng
đệm Tris pH 9. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu được thực hiện theo hướng
tận dụng những nguồn cơ chất rẻ tiền, sẵn có khác.

- 20 -