2 Nguồn nguyên liệu thu nhận

Nhược điểm: Protein cơ (thịt, cá, trứng,

• Chu kỳ sinh trưởng dài sữa), tụy tạng (insulin,
trypsin, chymotrypsin,
• Nguồn nguyên liệu khó cải tạo Động vật lipase), màng nhầy dạ dày
• Nguyên liệu dùng làm thực phẩm (pepsin, gastrysin, rennin)

Vi
Dứa (bromellin), đu đủ Thực vật
sinh vật Saccharomyces cerevisiae
(papain), sung (ficin),
đậu nành (urease), ngũ (-glucosidase), Aspergillus
cốc nẩy mầm (amylase) oryzae (protease)
 2 Nguồn nguyên liệu thu nhận
Chủ động về nguyên liệu
nuôi cấy và giống

Chu kỳ sinh trưởng

Hiệu quả kinh tế cao
Vi sinh VSV ngắn
vật

Hệ enzyme VSV Điều khiển quá trình sinh

phong phú, hoạt tính cao tổng hợp theo hướng có lợi

➢ Khả năng tổng hợp protein mạnh trong một thời gian ngắn
Yêu cầu lựa chọn VSV:
➢ Dễ tách enzyme và không sinh độc tố
Nguyên lý điều hòa quá trình sinh tổng hợp protein từ VSV
Nguyên lý điều hòa quá trình sinh tổng hợp protein từ VSV
❖ Khi có sự hiện diện của chất ức chế
Nguyên lý điều hòa quá trình sinh tổng hợp protein từ VSV
❖ Khi có sự hiện diện của chất hoạt hóa
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein từ VSV

Giống
vi sinh vật
Phương pháp
• Yêu cầu của giống nuôi cấy VSV
• Phân lập giống
Môi trường • Nuôi cấy bề mặt / bề sâu
• Bảo quản giống
nuôi cấy • Điều kiện nuôi cấy: pH, toC

• Thành phần dinh dưỡng

• Loại môi trường
3 Quy trình tinh sạch protein
• Nghiên cứu (cấu trúc, hoạt tính, giải trình tự, ...)  95 %
• Dược liệu > 99 %
WHY
• Công nghiệp < 95 %

WHAT Số bước ít nhất Thời gian ngắn nhất

• Xử lý mẫu trong điều kiện tối ưu
• Hạn chế đưa thêm hóa chất vào mẫu

WHEN • Loại bỏ sớm các tạp chất nguy hiểm

Protein-enzyme đạt độ tinh sạch

3 Quy trình tinh sạch protein
Protein Protein
Nguyên liệu
nội bào ngoại bào

Phá vỡ tế bào Biến tính chọn lọc

Sắc ký

Protein
Điện di tinh sạch
Phương pháp phá vỡ tế bào

Phương pháp cơ học : nghiền, xay, ...

Phương pháp vật lý : sóng siêu âm, tia tử ngoại, ...

Phương pháp hóa học: ethanol, acetone, ....

Phương pháp sinh học: enzyme (lysozyme)

Phương pháp ly tâm

Quá trình phân tách các cấu tử trong hệ dựa trên sự khác biệt về tỉ trọng và
kích thước giữa các cấu tử
3 Quy trình tinh sạch protein
Nguyên liệu Phần rắn

Phá vỡ tế bào

Lọc/ly tâm Phần dịch lỏng

Phân tử nhỏ Phân tử lớn Cell

Amino acid, Sugar,
Nucleotides
Nucleic
Protein Carbohydrate (Lipid) Debris
acid
Biến tính chọn lọc bằng phương pháp kết tủa phân đoạn

Discard pellet
Precipitate
contaminants

Add Add Precipitant,

Centrifugation,
Precipitant, Chromatography
Discard supernatant,
Centrifugation Resuspend protein

Precipitate Discard
protein of supernatant,
interest Resuspend
protein
Phương pháp thẩm tích

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua

màng bán thấm trong đó các phân tử có
kích thước lớn như protein, một số các
polysaccharide không thể di chuyển qua
màng nhưng các phân tử có kích thước
nhỏ như các muối, các hợp chất hữu cơ có
trọng lượng phân tử thấp... có thể khuếch
tán qua màng
Phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý để phân tách các cấu tử phân bố giữa hai
pha, dựa vào tính ái lực khác nhau của các cấu tử đó đối với pha tĩnh
(stationary phase) và pha động (mobile phase)

Phân tích
Xác định công thức
Tinh sạch
Định lương
Sắc ký cột
Sắc ký cột
Pha tĩnh Pha động

Tại trạng thái cân

bằng, tùy thuộc vào ái
lực của các hợp chất
trong hỗn hợp mà chúng
sẽ phân bố theo một tỉ lệ
nhất định giữa hai pha
tĩnh và pha động
Các loại lực liên kết hình thành trong sắc ký cột
Sắc ký cột

Phân đoạn
Sắc ký cột

Trên thực tế thì các mẫu sắc ký

phần lớn không có màu sắc
???
Lựa chọn phân đoạn như thế nào ?
Câu hỏi 1: Phân đoạn nào có chứa protein ?
➢ Đo độ hấp phụ của mẫu tại bước sóng 280 nm
để xác định hàm lượng protein tổng

Câu hỏi 2: Phân đoạn nào chứa protein mục tiêu

➢ Loại bỏ những phân đoạn không có protein
➢ Sử dụng các phương pháp đặc hiệu để nhận
biết hoạt tính protein “mục tiêu” trong các
phân đoạn chứa protein

Câu hỏi 3: Kiểm tra độ tinh sạch của protein

➢ Bằng phương pháp điện di hoặc sắc ký bản mỏng
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sắc ký cột

Vấn đề: Chọn cột có kích thước như thế nào là phù
hợp với quá trình sắc ký ?

Một sinh viên A cần sắc ký 1 g

hỗn hợp protein, thì phải chọn
cột nào (A), (B), (C) ?

(A) (B) (C)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sắc ký cột
Cột nhỏ nhất có đường kính cột 1 – 2 cm
Cột lớn nhất có đường kính cột 10 – 15 cm

Phải biết khối lượng chất hấp phụ cần để nhồi cột
→ tìm cột sắc ký kích thước phù hợp
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sắc ký cột
 Kích thước cột
➢ Lượng chất hấp phụ cần gấp 25 − 50 lần khối
lượng mẫu (w/w)

➢ Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính

trong của cột

Chiều cao silica gel 8 – 10

=
Đường kính trong của cột 1
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sắc ký cột
 Vận tốc dòng chảy

Dung dịch chảy Dung môi rớt Dung môi rớt

ra thành dòng xuống từng liên tục nhưng
liên tục: vận giọt: vận tốc có thể đếm được
tốc dòng chảy dòng chảy từng giọt: vận
quá nhanh quá chậm tốc dòng chảy 5-
50 giọt/phút
Phân loại sắc ký cột các phân tử hấp phụ chất lỏng bao
lên bề mặt pha tĩnh phủ bên ngoài

hạt vật liệu rắn

pha tĩnh
Sắc ký hấp phụ (hạt vật liệu rắn) Sắc ký phân bố

pha tĩnh pha tĩnh

(hạt vật liệu (hạt vật liệu
rắn có mang rắn có các
các nhóm chức lỗ xốp với
Sắc ký trao đổi ion hóa học mang Sắc ký lọc gel kích thước
điện tích) xác định)
 Phân tách protein – enzyme dựa trên sự khác biệt về kích thước
Sắc ký lọc gel • Pha tĩnh: polyacrylamide, dextran hoặc agarose
• Pha động: dung dịch protein/đệm
 Một số
loại gel
thương mại

28
Sắc ký lọc gel

ví dụ:

M.W. (kDa)

30
 100

10

Chạy trên cột sắc ký Sephadex G-100

Hệ đệm có pH=6.3
Sắc ký trao đổi ion

➢ Protein là những phân tử mang điện. Tại một giá trị pH nào đó, nó có thể
tồn tại dưới dạng anion (-), cation (+) hoặc không mang điện

cation pH = pI anion

pH tăng

➢ Sắc ký trao đổi ion phân tách protein dựa trên yếu tố mang điện tích
Sắc ký trao đổi ion

Trao đổi anion

Trao đổi cation

Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion

Ví dụ:

pI (6) pI (7) pI (7) pI (8)

➢ Có 4 phân tử protein mang điện tích khác nhau

➢ pH môi trường là 7.5
➢ Pha tĩnh mang điện dương
Kỹ thuật điện di
 Điện di (electrophoresis) là hiện tượng các phân tử di chuyển trên giá thể trong
môi trường có điện trường chạy qua

 Giá thể có thể là: giấy hoặc gel (polyacrylamide,

agar, agarose, tinh bột)

 Điện di cho phép ước lượng nhanh chóng số lượng

protein khác nhau trong một hỗn hợp hoặc mức độ
tinh sạch của một chế phẩm protein

 Điện di cho phép xác định một số tính chất chủ yếu của protein như điểm đẳng
điện, trọng lượng phân tử …
Kỹ thuật điện di Điện di SDS-PAGE
Nguyên tắc:
(-) (+)
 Tốc độ di chuyển khác nhau tùy theo khối lượng phân tử của các protein

 Các phân tử protein có thể tích điện

(-) hoặc (+), vì vậy phải làm cho tất
cả các protein tích điện (-) bằng cách
gắn protein lên chất SDS (sodium
dodecyl sulfate) còn gọi là SDS-
polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE)
Kỹ thuật điện di Điện di SDS-PAGE

1.4 gam of SDS per gam of protein

Kỹ thuật điện di Điện di SDS-PAGE
Điện di luôn được thực hiện trên gel bởi vì gel giống như một
cái rây phân tử sẽ làm tăng sự phân tách

• Những phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ

gel sẽ di chuyển xuyên qua lỗ gel với vận
tốc khác nhau

• Những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như

không di chuyễn
SDS-PAGE
Kỹ thuật điện di Điện di điểm đẳng điện
Phân tách protein dựa trên điểm đẳng điện hoặc
dùng để xác định pI của một protein
Kỹ thuật điện di Điện di hai chiều

Điện di 2 chiều là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong việc phân tách
hỗn hợp protein phức tạp, bao gồm 2 bước :
• Điện di điểm đẳng điện (isoelectric focusing)
• Điện di SDS – PAGE

Điện di 2 chiều phân tách các protein có trọng lượng phân tử giống nhau
nhưng khác nhau điểm đẳng điện hoặc ngược lại