VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài tiểu luận tổng quan

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của loài vi tảo lục
Haematococcus pluvialis Flotow giàu astaxanthin để ứng
dụng trong nuôi trồng thủy sản”

Nghiên cứu sinh: Lưu Thị Tâm

Khóa: 2013
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

Người hướng dẫn: PGS. TS. Đặng Diễm Hồng

Hà Nội, tháng 8/ 2016

 Ứng dụng của vi tảo trong đời sống

Các hoạt chất sinh

học
Nuôi trồng
Thực phẩm chức thủy sản
năng

Vi tảo

Nhiên liệu Phân bón

sinh học sinh học

Xử lí nước
thải
Tổng quan về các sản phẩm từ tảo và thị trường ứng dụng

 Các sắc tố từ tảo (trong đó có astaxanthin) được coi như

các sản phẩm tảo tiềm năng cho sản xuất thương mại
 Astaxanthin
Cấu trúc (3S, 3’S) - 3,3’-Dihydroxy-ß, ß’-carotene-4,4’-dione)

• Astaxanthin là sắc tố carotenoit

chính tìm thấy trong các động
vật thủy sinh
• Động vật có vú không tự tổng
hợp được astaxanthin  lấy từ
nguồn thức ăn.
• Astaxanthin có các chức năng:
Có hoạt chất chống oxi hoá, Tạo
ra các màu sắc trong tự nhiên:
đỏ, cam, vàng, xanh, tía, nâu….
Có tác dụng cải thiện khả năng
sinh sản, thúc đẩy sự phát triển
Công thức phân tử: C40H52O4
và chức năng bảo vệ tế bào
Trọng lượng phân tử: 596.82
chống lại tác hại của tia UV
 Ứng dụng của astaxanthin

Tăng màu sắc và chất Thực phẩm chức năng

lượng thịt cá hồi
Astaxanthin

Mỹ phẩm dưỡng da

Tăng màu sắc sặc

sỡ cho cá cảnh
Làm chất phụ gia trong nuôi gia cầm
 Nuôi trồng thủy sản – cá hồi

 Nuôi cá hồi đang là một hướng đi mới, với nhiều tiềm năng ứng
dụng cao vì giá trị kinh tế của nó và khả năng cung cấp dinh dưỡng
 Màu sắc thịt cá hồi là tham số chất lượng quan trọng. Màu sắc của
cá được tạo bởi sự lắng đọng của các carotenoit (astaxanthin)
 Cá không tự tổng hợp được astaxanthin  lấy từ nguồn thức ăn
 Cá hồi nuôi: Thức ăn nhân tạo chứa astaxanthin tổng hợp bằng pp
hóa học  màu sắc đỏ nhạt, cá khó hấp thụ, khó tiêu hóa
--> Cần tìm kiếm nguồn thức ăn cung cấp chất màu astaxanthin tự
nhiên
 Các nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên
STT Nguồn cung cấp Hàm Dạng Ưu điểm Nhược điểm
lượng tồn tại
(mg/kg)
1 Phế liệu giác - Ester Nguyên liệu dễ - Hàm lượng thấp
xác thuỷ sản hóa kiếm - Độ ẩm + Tro cao
khó tách chiết
2 Nấm men 30- 800 Ester Dễ dàng nuôi sinh - Hàm lượng thấp
Phaffia khối (0,02 – 0,5% SKK)
rhodozyma hóa - Vách cứng  khó
tiêu hóa
3 Vi khuẩn 200 - 2000 Ester Dễ dàng nuôi sinh - Hàm lượng thấp
hóa khối (0,02 – 0,2% SKK)
(Mycobacterium
lacticola)
4 Vi tảo 10000 - Ester - Dễ tiêu hóa, dễ - Giá cao
Haematococcus hấp thụ - Khó khăn trong nuôi
pluvialis 30000 hóa (3S- - Hoạt tính chống sinh khối
3S’) ô xy hóa cao nhất,
an toàn
 Khai thác astaxanthin từ tảo H. pluvialis đang được quan tâm hiên nay
 Tổng quan về vi tảo lục H. pluvialis
 H. pluvialis là vi tảo lục nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính
 Sinh trưởng chậm, vòng đời phức tạp
 Trạng thái tế bào phụ thuộc vào pha sinh trưởng, điều kiện
nuôi

(I) Giai đoạn tế bào sinh dưỡng

(II) Giai đoạn tạo bào nang
(III) Giai đoạn tế bào nang hoàn
chỉnh
(IV) Giai đoạn nảy mầm

Các dạng hình thái

tế bào tảo H.
pluvialis tương ứng
với từng giai đoạn
trong vòng đời
 Sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein trong tế bào

Dựa vào tỷ lệ
Asta/ chla có thể
xác định được pha
sinh trưởng của
tảo

Giai đoạn Sinh dưỡng Encyst Cyst Nảy mầm

Tế bào hình cầu,

Tế bào hình elip, Tế bào hình cầu, Tế bào hình elip,
màu xanh,
màu xanh, có hai màu đỏ đậm, có hai roi, màu nâu
Trạng thái tế không có roi.
roi. Kích thước tế không có roi. đỏ đến xanh. Kích
bào Kích thước tế
bào: 13 x 16 ÷ 19 x Kích thước: 35 ÷ thước: 8 x 11 ÷ 10
bào: 14 ÷ 30 ±
25 ± 0,50 µm 40 ± 0,20 µm x 15 ± 0,30 µm
0,50 µm

Tỷ lệ Asta/chla 0,30 ± 0,05 0,90 ± 0,20 2,40 ± 0,10 0,60 ± 0,20

Phản ứng của tế bào Haematococcus dưới điều kiện stress
Mô hình hoạt động

Các nhân stress: Tốc độ phân chia tế bào chậm

 Cạn kiệt dinh dưỡng
 Sốc muối
 Ánh sáng cao
+ Ánh sáng Dư thừa ánh sáng
 Nhiệt độ thấp
Gốc tự do
 Hạn hán
 Tuổi tảo

Cảm biến tế bào – yếu tố

trung gian

Kích hoạt các phản ứng tế bào

Quá trình encyst hóa

1. Chu trình xanthophyll
Thay đổi trong TB
2. Các E dập tắt gốc tự do
3.Chất chống ô xy hóa (đồng hóa lipit)

Tế bào Nang bào Tế bào cyst Tích lũy astaxanthin

10
sinh dưỡng
 Tỷ lệ ánh sáng/ tế bào là nhân tố giới hạn sinh trưởng

Light intensity (mE m-2 s-1) • Tốc độ tăng trưởng phụ

25 100 500 thuộc vào cả cường độ
10000 100 ánh sáng và mật độ tế
bào ban đầu. Đây là 2
biến phụ thuộc lẫn nhau

Biomass dry weight (g/L)

1000 10
Cell density (Mc/L)

• Tỷ lệ ánh sáng / tế bào

Chl (mg/L)

là một tín hiệu cho phản

100 1 ứng tế bào: phân chia
(tỷ lệ thấp, các tế bào
màu xanh lá cây), ngủ,
10 0.1 encystment (tỷ lệ cao,
các tế bào màu đỏ).
Cells Chl
Chl Biomass
1 0.01
0 7 14 21
Continuous illumination (day)
Afalo và cs., 2007
 Ảnh hưởng của các điều kiện bất lợi khác nhau lên sinh trưởng và
tích lũy asaxanthin
30
A
NL
Dưới điều kiện bất lợi, tế bào
ngừng phân chia và tích lũy
Cells – 105/mL
HL
-N
10
-P các hợp chất thứ cấp
-S
(astaxanthin). Chiếu xạ cao
3 là một nhân tố hiệu quả để
cảm ứng tích lũy astaxanthin
10
100 C Final yield – mg/ml
B 41
8

TCar:Chl – w/w
Chlorophyll – mg/mL

30 6 39

4
10
41
2
53
3 13
0
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
Time - day 12 Time - day
Afalo và cs., 2007
 Yếu tố giới hạn trong sinh tổng hợp
astaxanthin ở tảo H. pluvialis

Thiếu hụt Nitrate

dinh dưỡng Phosphate

Các chất Muối

hóa học Ion sắt
Các gốc tự do

Tăng cường Tăng chiếu xạ

độ chiếu Tăng cường stress
sáng ô xy hóa
http://mattershypnosis.com/hypnosis-stress-management/

 Yếu tố giới hạn : bên cạnh thiếu hụt dinh dưỡng, nguồn
Cacbon chính là yếu tố giới hạn tích lũy astaxanthin ở tảo H.
pluvialis
 Biện pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất
astaxanthin từ tảo H. pluvialis

2. Cải biến di 1. Chất hóa học

truyền trao đổi
chất
- Chuyển gen H. pluvialis
- Đột biến (vật
lý hoặc hóa
học) 3. Tác nhân vật lý
- Tăng cường (ánh sáng + nhiệt độ)
mức độ biểu và yếu tố dinh dưỡng
hiện của gen
BKT và CHY

 Hiệu quả tăng cường tích lũy astaxanthin

phụ thuộc vào từng phương pháp tác động
 Công nghệ nuôi trồng tảo H. pluvialis giàu
astxanthin

Công nghệ nuôi

tảo H. pluvialis

Qui trình nuôi Qui trình nuôi

cấy 1 pha cấy 2 pha

- Gồm 2 giai đoạn nuôi khác nhau

-Gồm 1 giai đoạn nuôi duy nhất
- Sinh trưởng và tích lũy
astaxanthin diễn ra liên tục
trong cùng hệ thống nuôi
- Sinh trưởng của tảo và cảm
ứng tích lũy astaxanthin diễn ra
gián đoạn ở 2 hệ thống nuôi khác
biệt
 Mô hình sản xuất astaxanthin ở vi tảo H. pluvialis theo qui trình
nuôi cấy 2 pha ở qui mô thương mại
Giai đoạn xanh
- Nuôi tảo trong điều kiện tối ưu cho sinh trưởng (Nhiệt độ
25- 280C; 2 klux; dinh dưỡng đầy đủ (nitrate ≈ 8mM)
- Sinh khối đạt cao nhất (0,01- 0,5 g/L/ngày )

Giai đoạn đỏ
- Các tế bào tảo được nuôi trong điều kiện bất lợi ( Cạn kiệt dinh
dưỡng + Chiếu sáng cao (135 µmol photo/m2s + sục CO2 (5-10%))
- Tế bào ở dạng bào xác ( hình cầu, thành tế bào dày, kích thước
tăng)
- Tổng hợp và tích lũy astaxanthin với hàm lượng cao nhất (4- 7%)

Thu hồi sản phẩm

- Phá vỡ tế bào và chiết sinh khối ( pp CO2 siêu tới hạn)
- Tinh sạch

Kết quả: Mật độ tế bào cực đại:

+/ trong bể hở là 0,3 – 0,6 x 106 TB/mL (Haker và cs., 1996)
+/trong hệ thống kín (1 – 2 L) là 5 - 7 x 106 TB/mL (Rajibar và cs.,2008)
Hàm lượng astaxanthin: 4- 7% sinh khối khô (Kang và cs., 2005)
 Các dạng hệ thống tảo H. pluvialis

A C
B

E E
1 2
C D
E D F
D
Năng suất tảo: 0,025
A: Dạng ống ; B: Dạng bán cầu
kg/m2/ngày ( 82 tấn/ ha/ năm)
C: Dạng vành khuyên; D: Dạng tấm
Sinh khối đạt cực đại 0,5 – 1
phẳng; E, F: Dạng cột thẳng đứng
kg/m3
Năng suất tảo: 1,535 kg/m2/ngày
( 158 tấn/ ha/ năm)
Sinh khối đạt cực đại 4 kg/m3
 Nuôi trồng tảo H. pluvialis trong các hệ thống nuôi khác nhau
Mật độ tế bào Năng suất sinh Tốc độ tích
Hàm lượng
(x 106 tế bào/ khối [Astaxanthin] lũy
Tác giả astaxanthin cực Điều kiện Hệ thống nuôi
mL (g/L/ngày) % sinh khối khô astaxanthin
đại (mg/L)
(mg/L/ngày)
Olaizola (2000) Hệ thống photobioreactor kín
0,036-0,052 - 2,5 2,2 25000 L ngoài trời
Del Rio và - Nuôi cấy quang tự dưỡng một
cs.,(2005/ 2008) 0,6/1,9 - 0,8 5,6/20,8 pha liên tục
Suh và cs.,(2006) - Hệ thống photobioreactor double -
357 5,79 layer
Ranjbar và cs., PBRs bubbing column 1,0 L, nuôi
2008 3,5 0,36 - 3,6 12 kiểu fed batch
Zhang và - Bể hở, sinh trưởng 2 giai đoạn 1
cs.,(2009) 0,15 51,06 2,79 4,3 quá trình
Kang và - Nuôi cấy fed batch trong
cs.,(2010) 0,44 190 4,8 14 photobioreactor Flat 1L
Choi và cs.,(2011) - Hệ thống photobioreactor airlift,
0,14 100 - 3,3 nuôi theo mẻ
Yoo và cs.,(2012) - Photobioreactor bubbling column
0,047 217,78 - 1,4 (6 L), nuôi theo mẻ
Wang và - Photobioreactor bubbling column
cs.,(2013) - 0,58 - - 16 (0,6 L), nuôi theo mẻ, môi trường
BG11
Zhang và cs., 160 Mật độ ban đầu 10 g/m2; Hệ thống nuôi gắn màng
(2014) - - - 2,2 mg/m2/ngà ánh sáng 100 µmol/m2/s
y
Wan và cs., 2015 Nuôi tuần tự Dị dưỡng – Nuôi dị dưỡng trong bình lên men
7 1,538 - 4,6 64 pha loãng- cảm ứng quang 50L, môi trường NIES –C, nhiệt
tự dưỡng độ 28oC
Wen và cs., 2015 Ethanol 3%, ánh sáng Hệ thống Photobioreactor column
- - 119,61 - 11,26 150 µmol/m2/s (0,3 L), nuôi theo mẻ, môi trường
BG11N
Han và cs., 2015 Ánh sáng trắng: ánh sáng Hệ thống Photobioreactor 5L,
- - 91,8 - - xanh (tỷ lệ 3:1) ở cường nuôi kiểu fed batch
độ sáng 7000 klux
Hong và cs., 2016 7,06 [Fe2+] 50mM Hệ thống Photobioreactor thin film
- 62 4 5,53 25 L, bổ sung thêm Fe2+
g/m2/ngày
 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng vi tảo H.
pluvialis ở Việt Nam
+/ Ở Việt Nam: có rất ít công trình công bố nuôi trồng thành công tảo H.
pluvialis (Nguyễn Thị Hường et al., 2010; Đặng Diễm Hồng et al., 2010;
Đinh Đức Hoàng et al.,2011…).
+/ Nuôi trồng tảo H. pluvialis: Mới thiết lập trong điều kiện phòng thí
nghiệm ở bình tam giác, hệ thống bình nhựa 1,5 ; 10lít; Hệ thống bể hở
1 – 10 m2 và Hệ thống nuôi kín (20, 50 và 100 lít)  Tuy nhiên, Mật độ
tế bào đạt thấp < 1 x 106 tế bào/ mL. Việc tìm kiếm các điều kiện nuôi
trồng cho tảo H. pluvialis đạt được mật độ tế bào cao đến 4 triệu tế
bào/mL và hàm lượng astaxanthin chiếm 4% sinh khối khô là
nhiệm vụ cần giải quyết hiện nay

 Mục tiêu: Nuôi trồng thành công vi tảo lục H. pluvialis phân lập tại
Việt Nam với tốc độ sinh trưởng nhanh và hàm lượng astaxanthin
cao. Đồng thời, bước đầu ứng dụng sinh khối tảo giàu astaxanthin
làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (Cá Hồi Vân, Cá
Koi Nhật)
Các công trình công bố cho đến nay (07)
1/ Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Hoang Thi Minh Hien, Dang Diem Hong (2014).
Effect of bicarbonate concentration on astaxanthin accumulation of green microalga Haematococcus
pluvialis. Proceeding of The 3rd academic conference on natural science for master and PhD. students
from Asian countries. Phnompenh, Cambodia 11-15 November 2013. Publishing House of natural
science and Technology. DOI 10.1562/MBSD2.2014 -0068. P: 135-140.
2/ Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Đinh Thị Ngọc Mai, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng
(2013). Cảm ứng tích lũy astaxanthin ở vi tảo lục Haematococcus pluvialis dưới điều kiện thiếu hụt nitơ
và ánh sáng cao. Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013. Quyển 1: 523-527.
3/ Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Đinh Thị Ngọc Mai, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Nguyễn Cẩm Hà,
Đặng Diễm Hồng (2013) Ảnh hưởng của nồng độ nitrate lên sinh trưởng của vi tảo lục Haematococcus
pluvialis Flotow trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tạp chí Sinh học 35(2): 219- 226.
4/ Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Hà Thu, Đặng Diễm Hồng (2015). Bước đầu nghiên cứu
ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho cá hồi Vân ở
Việt Nam. Tạp chí Sinh học, 37(4): 470- 478.
5/ Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyễn Cẩm Hà, Ngô Thị Hoài Thu, Lê Hà Thu, Đặng Diễm Hồng (2015).
Nhân tố giới hạn cho quá trình tích lũy astaxanthin trong pha 2 của vi tảo lục Haematococcus pluvialis ở
điều kiện phòng thí nghiệm. Tạp chí Công nghệ sinh học, 13(4): 1-7.
6/ Luu Thi Tam, Le Ha Thu, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat,
Hoang Thi Lan Anh and Dang Diem Hong (2016). Screening for Haematococcus strains containing
asstaxanthin in some places in Vietnam. The 4th Academic Conference on Natural Science for Young
Scientists, Master and PhD Students from Asean Countries (CASEAN - 4). Bangkok, Thailand, 15-18
December 2015 . Publishing House of natural science and Technology. ISSN 978-604-913-088-5. P:
352- 359
7/ Luu Thi Tam, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Lan Anh, Dang Diem Hong. Biological
characteristics and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis isolated from Vietnam (đã gửi
đăng bài ở tạp chí Algae; SCI-E; FI>1)