WELCOME TO WEBINAR OLIGO

GIỚI THIỆU VỀ OLIGO

VÀ CÁC TIÊU CHÍ THIẾT KẾ
TRONG PHẢN ỨNG PCR,
REAL-TIME PCR
Hồ Phú Khánh
(18/08/2023)
2 1
NỘI DUNG TRÌNH BÀY
Giới thiệu oligonucleotide
1
2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Tầm quan trọng của mồi và mẫu dò trong PCR và

3 Real-time PCR
Tiêu chí thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và Real-time
4 PCR

2
1 Giới thiệu oligonucleotide

Cấu trúc của nucleotide

• Nucleotide là đơn vị cấu trúc

(monomer) của RNA, DNA (polymer).

• Gồm 3 phần chính:

➢ Nhóm đường pentose (Ribose trong

RNA hoặc deoxyribose trong DNA)

➢ Nhóm Phosphate

➢ Nhóm base nitơ (adenine (A),

thymine (T), cytosine (C), guanine
(G) hoặc uracil trong RNA)
Steve Minchin et.al. (2019)

ABT 13
1 Giới thiệu oligonucleotide

Cấu trúc của oligonucleotide

• Oligonucleotide là các phân tử DNA

hoặc RNA mạch đơn, ngắn

• Oligonucleotide bao gồm các đơn

phân nucleotide liên kết với nhau
qua liên kết phosphodieste (liên kết
cộng hóa trị) ở vị trí 3’OH và
5’phosphate tạo ra một phân tử
nước

• Chiều dài của một oligonucleotide

được đo lường bằng số lượng
nucleotide tạo thành
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Oligonucleotide_Structure.png

ABT 24
1 Giới thiệu oligonucleotide
Ứng dụng phổ biến của oligonucleotide

Mồi (Primer) Mẫu dò (Probe)

(18-30 base)

• Mồi là một đoạn DNA mạch đơn ngắn được thiết
kế bắt cặp bổ sung ở đầu và cuối của trình tự
mục tiêu sẽ được khuếch đại.
• Trong PCR hoặc Real-time PCR, các mồi quyết
định chính xác trình tự DNA nào được sao chép.
• Mẫu dò lai là một trình tự oligonucleotide (DNA
hoặc RNA) được sử dụng để phát hiện trình tự
bắt cặp bổ sung với nó (DNA hoặc RNA)
• Có nhiều phương pháp và loại đánh dấu mẫu
dò khác nhau → cho phép phát hiện chúng

Mồi và mẫu dò ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của PCR hoặc qPCR
ABT 35
2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Các loại mẫu dò acid nucleic

Loại mẫu dò Chiều dài Nguồn gốc Đánh dấu Ứng dụng
Oligonucleotide • Real-time PCR (các
probe 15-100 Nu Tổng hợp hóa học oligonucleotide
(DNA hoặc RNA) probe)
PCR • Reverse dot blot
DNA probe • Đồng vị phóng xạ • Southern blotting
Trên 100 Nu Phiên mã ngược
(gene probe) • Phân tử không phóng xạ • Northern blotting
thành các cDNA
• Microarray
Phiên mã từ đoạn • FISH
Lên đến vài
RNA probe DNA dòng hóa vào • ………
ngàn Nu
vector thích hợp
Marilena A.M. et.al. (2008)

ABT 46
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Các tác nhân đánh dấu mẫu dò

• 32P
Đồng vị phóng xạ • 35S
32P
35S
• 3H
3H

• Biotin, dioxigenin
Phân tử không • Fluorescense
phóng xạ • Kháng thể

ABT 57
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ

• Sử dụng đồng vị phóng xạ 32P, 35S, 3H…
• Đọc bằng ảnh X-ray hoặc máy đếm Geiger-Muller.
• Ngày nay ít sử dụng phổ biến do vấn đề độ bền thấp, tính an toàn và vấn đề loại bỏ
sau khi sử dụng
32P
• Có độ nhạy tốt nhất, có thể phát hiện ở nồng độ rất thấp
35S
3H
Thông số các loại đồng vị phóng xạ dùng để đánh dấu mẫu dò

Đồng vị Độ phân giải Độ nhạy Thời gian bán rã

32P + +++ 14.3 ngày
35S ++ ++ 87.4 ngày
3H +++ ++ 12.3 năm
Marilena A.M. et.al. (2008)

ABT 68
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng phân tử không phóng xạ

Phản ứng
32P Thời gian đánh dấu lên
35S
3H
phát tín mẫu dò hiệu
hiệu ngắn quả, đơn
giản và ít tốn
kém

Độ ổn
An toàn
định cao

ABT 79
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng Biotin, Dioxigenin

o Sử dụng phân tử Biotin, dioxigenin
o Độ bền trên 52 tuần
o Ít nguy hiểm hơn, độ bền tốt hơn nhưng độ nhạy kém hơn đánh dấu phóng xạ

32P Đánh dấu bằng Biotin Đánh dấu bằng Dioxigenin

35S
3H

ABT https://stratechscientific.wordpress.com/tag/biotin-streptavidin/
810
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng kháng thể

o Các RNA probe được giữ trên bề mặt vật rắn

o Các DNA mục tiêu được đưa vào → Hình

32P
35S
thành phức hợp lai giữa DNA-RNA
3H
o Kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấp) được
phát triển để nhận diện phức hợp lai DNA-
RNA

o Bổ sung kháng thể thứ cấp (đã liên kết với

enzym)

o Sau khi bổ sung cơ chất → tạo màu→ phát

hiện

ABT 911
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng fluorescence

o Phân tử fluorescence có thể hấp thụ ánh sáng có bước sóng cụ thể và phát xạ ánh sáng có bước
sóng khác, cao hơn.
o Được sử dụng trong real-time PCR (Taqman probe, Scorpion probe, Molecular beacon probe )
hoặc trong phương pháp lai tại chỗ (Fluorescence In situ Hybridization - FISH)
32P
35S
3H Taqman probe Scorpion probe Molecular beacon probe Fluorescence probe trong lai tại chỗ

ABT 10
12
 2 Phân loại và các tác nhân đánh dấu mẫu dò phổ biến

Đánh dấu bằng flourescence

• Chiều dài thiết kế mẫu dò

32P
• Trình tự của mẫu dò
35S
3H
• Độ tương thích của reporter với
quencher

→ Hiệu quả dập tắt ánh sáng

huỳnh quang

→ Độ nhạy của phản ứng

ABT 11
13
 3 Tầm quan trọng của mồi và mẫu dò trong PCR và qPCR

32P
Ảnh hưởng
35S
3H

ABT 12
14
 3 Tầm quan trọng của mồi và mẫu dò trong PCR và qPCR

Độ đặc hiệu Tỉ lệ dương

của xét tính giả của
nghiệm kém xét nghiệm
cao

Độ chính
32P
35S Chất xác của xét
3H
lượng mồi nghiệm thấp
và mẫu dò
kém

Độ nhạy của
Tỉ lệ âm tính
xét nghiệm
giả của xét
kém
nghiệm cao

ABT 13
15
 3 Tầm quan trọng của mồi và mẫu dò trong PCR và qPCR

Đảm bảo độ đặc hiệu

▪ Cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược) và mẫu dò phải chuyên biệt với vùng trình tự DNA mục tiêu và
duy trì độ đặc hiệu cao chỉ duy nhất với vùng trình tự đó.

▪ Để tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu, mồi sau khi thiết kế cần được kiểm tra in silico và
khảo sát thực nghiệm.
32P
35S
3H

Chiều dài
Vùng trình Điều kiện
primer/probe
tự gene mục bắt cặp
tiêu Trình tự
Nhiệt độ
bắt cặp primers/
probe

Cặp mồi và mẫu dò cần chỉ bám trên vùng trình tự

ABT mục tiêu của tác nhân mục tiêu 14
16
3 Tầm quan trọng của mồi và mẫu dò trong PCR và qPCR
Đảm bảo độ nhạy
Độ nhạy của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có
kết quả xét nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy

- Độ ổn định bắt cặp của Tần suất primers/probe bắt Hiệu quả
vào mạch khuôn và được khuếch đại Độ nhạy của
mồi hoặc mẫu dò
xét nghiệm
- Nồng độ primer/probe kéo dài PCR

Trình tự
Chiều dài Nhiệt độ
primer/probe Các yếu tố tác
primer/probe bắt cặp động đến nồng độ
Vùng gene
Điều kiện bắt cặp của mồi, mẫu dò
mục tiêu
của primer/probe trong phản ứng
ABT 15
17
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Nhiệt độ bắt cặp

Nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature - Ta): là khoảng

nhiệt độ mà mồi hoặc mẫu dò bám tốt với mạch khuôn.

• Ta tính dựa vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) theo công thức:

Ta = 0.3 x Tm (primer/probe) + 0.7xTm (sản phẩm) – 14.9

• Ta thường thấp hơn Tm khoảng 3 - 5oC.

• Ta quá thấp(<50oC): có thể độ đặc hiệu kém (tạo các

sản phẩm thứ cấp)

• Ta quá cao (>70oC): có thể độ nhạy kém (ảnh hưởng

khả năng bắt cặp bổ sung)
Rychlik W et.al. (1990)

ABT 16
18
 4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature - Tm): nhiệt độ

mà tại đó 50% sợi đôi DNA phân tách nhau ra thành sợi đơn.
• Tm được tính thông qua công thức như sau:
Tm =4 °C x (G + C) + 2 °C x (A + T)
Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n
• Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base
của mồi.
• Tm trong khoảng 58 - 62 oC.
• Tm của probe nên cao hơn Tm của primers 8-10 oC
• Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC
Breslauer K.J. et.al. (1986)
Công cụ OligoAnalyzer trên trang web IDT (https://www.idtdna.com/calc/analyzer)
ABT 17
19
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Chiều dài mồi hoặc mẫu dò

• Độ dài của mồi và mẫu dò nên nằm trong khoảng từ 15 - 30 bp (tối ưu nhất 18-25 bp).

< 15 bp 15 - 30 bp > 30 bp

Độ đặc hiệu thấp Đảm bảo mồi và mẫu dò gắn
vào mạch khuôn một cách dễ
dàng và đặc hiệu tại nhiệt độ
bắt cặp.
ABT
Độ nhạy thấp
Đối với mẫu dò (Taqman probe)
→ Hiệu quả dập tắt ánh sáng
huỳnh quang thấp từ quencher
18
20
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Trình tự mồi và mẫu dò

Yêu cầu Tác động Ảnh hưởng

• %GC trong khoảng 30-70%, tốt nhất 40-60% Tác động đến Tm và khả năng bắt Độ đặc hiệu
• 5 Nu cuối cùng ở đầu 3’ nên có một đến hai G cặp với mạch khuôn của mồi và Độ nhạy
hoặc C (Không nhiều hơn 3) mẫu dò

• Tránh lặp lại liên tục 4 lần hoặc hơn cùng 1 Tác động đến việc bắt không đặc Độ đặc hiệu
loại Nu, đặc biệt là G hoặc trình tự đôi hiệu.
(GCGCGCGC)
• Tránh trình tự có độ lặp lại cao.

• Tránh tương đồng chéo Bắt cặp vào vùng trình tự khác trình Độ đặc hiệu
tự mục tiêu

ABT 19
21
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Trình tự mồi và mẫu dò

Yêu cầu Tác động Ảnh hưởng

• Tránh bắt cặp bổ sung 2 hoặc 3 Nu ở đầu 3’ Hình thành cấu trúc đặc biệt hoặc Độ nhạy
của cặp primer không bắt cặp tốt vào khuôn
→ Hạn chế hình thành primer-dimer.
• Không hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi
hoặc mẫu dò
• Tránh mismatch quá nhiều Nu giữa đầu 3’ của
mồi và mạch khuôn.
* Đối với probe: Tránh G ở đầu 5’ của mẫu dò Hiệu quả dập tắt ánh sáng huỳnh Độ nhạy
hoặc gần Reporter → Chọn mạch bắt cặp bổ quang của reporter
sung để probe có nhiều C hơn G.

Chiều của mồi: cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về
phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổ sung của mạch khuôn→ Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không được tạo ra.

ABT 20
22
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR
Trình tự mồi và mẫu dò
Cấu trúc thứ cấp hoặc primer
dimer có thể xảy ra
• Primer dimer là các sản phẩm
PCR ngắn, không mong muốn
gây ra bởi sự khuếch đại của mồi
(mồi là mạch khuôn khuếch đại)

• Hai loại primer dimer phổ biến:

➢ Self-dimer

➢ Cross-dimer

• Ngoài ra cần tránh cấu trúc thứ

cắp (Hairpin) xảy ra trong phản
ứng

ABT Công cụ OligoAnalyzer trên trang web IDT (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) 21

23
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Cấu trúc thứ cấp hoặc primer dimer có thể xảy ra

Probe và primer tạo cấu trúc thứ cấp Primer-dimer hình thành
Primer-dimer ảnh hưởng độ đặc hiệu trong phản ứng
hoặc primer-dimer ảnh hưởng độ nhạy

Hình thành cấu trúc thứ cấp hoặc primer-dimer trong phản ứng ảnh hưởng cả độ đặc hiệu và độ
nhạy của xét nghiệm → Cần kiểm tra in silico sau khi thiết kế mồi và mẫu dò

ABT 22
24
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR
Trình tự mồi và mẫu dò

Mismatch giữa mồi, mẫu dò và

mạch khuôn 5’ 3’
• Mismatch trong quá trình bắt cặp bổ sung
làm giảm đến hiệu suất khuếch đại sản phẩm
5’
khi chạy real-time PCR 3’
• Mismatch càng gần đầu 3’ (5 Nu đầu 3’) càng
ảnh hưởng lớn đến hiệu suất khuêch đại
5’ 3’
Ralph Stadhouders et.al. (2010)

Ảnh hưởng 3’
5’

Độ nhạy, độ đặc hiệu

ABT 23
25
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Thiết kế mẫu dò cho Real-time PCR

Chọn cặp Reporter và Quencher Taqman probe

FRET

Dye Max Max Compatible

EX (nm) EM (nm) Quencher
6-FAMTM 495 520 BHQTM-1, TAMRA
JOETM 529 555 BHQTM-1, TAMRA
TETTM 521 536 BHQTM-1, TAMRA
HEXTM2 535 556 BHQTM-1, TAMRA
Cal Flour® Gold 5401 522 544 BHQTM-1
✓ Chọn cặp reporter-quencher phù hợp và
Cal Flour Orange 5602 538 559 BHQTM-1
reporter tương thích với các kênh màu của
TAMRA 557 583 BHQTM-2 thiết bị qPCR.
Cyanine 3 549 566 BHQTM-2
Quasar® 5703 548 566 BHQTM-2 → Ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng

ABT 24
26
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR

Vùng trình tự mục tiêu

• Tránh các vùng trình tự dễ tạo cấu

trúc thứ cấp trên mạch khuôn
• Tránh các vùng tương đồng cao

• Khả năng bắt cặp của primers và

probe vào đúng trình tự mục tiêu Vùng trình tự mạch khuôn dễ tạo cấu trúc thứ cấp

• Hiệu suất khuếch đại

• Đối với real-time PCR, mồi nên được thiết kế sao cho chiều
Ảnh hưởng
dài của trình tự được khuếch đại trong khoảng 60 - 150 bp

Độ nhạy, độ đặc hiệu → Tiết kiệm thời gian chạy chẩn đoán và nguyên liệu tiêu thụ

ABT 2527
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR
Vùng trình tự mục tiêu ngắn
Cần khuếch đại vùng trình tự bảo tồn mục tiêu ngắn
→Tm của mồi và mẫu dò không đạt yêu cầu
→Độ đặc hiệu của các mồi và mẫu dò thấp
→Khó khăn trong việc thiết kế các mồi và mẫu dò

Probe gắn thêm gốc MGB ở đầu 3’ cùng với quencher

→ Tăng nhiệt độ nóng chảy Tm của probe
→ Ổn định khả năng bắt cặp giữa probe và mạch khuôn
→ Probe có thể được thiết kể ngắn hơn với độ đặc hiệu
và độ nhạy được cải thiện so với probe truyền thống
Grünweller A. et.al. (2007) (cùng chiều dài)
Igor V. Kutyavin et.al. (2000)
ABT 2628
4 Tiêu chí trong thiết kế mồi và mẫu dò cho PCR và qPCR
Vùng trình tự mục tiêu bị đột biến

Sử dụng wobble base (vị trí có thể bắt với

nhiều base khác nhau)
Vùng trình tự mục tiêu có nhiều đột biến giữa • Theo nguyên tắc tổng hợp, vị trí wobble sẽ bổ
các biến thể của tác nhân sung nhiều hơn 1 loại base vào phản ứng
→Xảy ra nhiều mismatch khi bắt cặp →Tạo ra nhiều loại oligonucleotide khác nhau một
vài vị trí wobble trong hỗn hợp primer hoặc probe
→Giảm độ nhạy của xét nghiệm
→ Cho phép bắt cặp với trình tự mục tiêu có nhiều
G đột biến.
A
• Hạn chế thấp nhất số vị trí wobble trong 1 trình
A A
tự
A
G
G
→ Càng nhiều vị trí wobble nồng độ mỗi biến thể
trình tự càng giảm
G
→ Cường độ tín hiệu và độ nhạy thấp.
ABT 2729
 TỔNG HỢP
Ảnh
Thông số Liên quan đến Yêu cầu
hưởng
Bắt chéo trình tự -Kiểm tra khả năng bắt cặp chuyên biệt với mục tiêu Độ đặc hiệu
Tác động đến Tm -%GC (30-70%, tốt nhất 40-60%), chiều dài (18-30 Độ đặc hiệu
(Tm của tất cả mồi nên từ 58-62oC và không chênh lệch base). Độ nhạy
nhau quá 2oC. Tm của mẫu dò nên cao hơn Tm của
primer từ 8-10 oC.)
Tác động đến việc bắt không đặc hiệu. -Tránh lặp lại liên tục 4 lần hoặc hơn của cùng 1 loại Độ nhạy và
Nucleotide, đặc biệt là G. đặc hiệu
-Tránh trình tự có độ lặp lại cao.
Trình tự của -Primer tránh lặp lại liên tục 3 hoặc nhiều hơn Nu G
mồi và mẫu
hoặc C ở đầu 3’.
dò
Hình thành các cấu trúc đặc biệt hoặc không bắt cặp tốt -Tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc 3 base ở đầu 3’ Độ nhạy
vào khuôn của cặp primer để hạn chế hình thành primer-dimer.
- Không hình thành các cấu trúc thứ cấp bền
-Tránh mismatch giữa đầu 3’ của primer và khuôn.
Tác động đến việc tương tác giữa trình tự và Reporter -Tránh G ở đầu 5’ của Probe hoặc gần Reporter, bởi Độ nhạy
vì nó sẽ gây ra quencing.
-Chọn mạch bắt cặp bổ sung để probe có nhiều C
hơn G.
Chiều dài sản Tác động đến lượng nguyên liệu tiêu thụ; tương tác Đối với qPCR, trình tự khuếch đại mục tiêu nên dài từ Độ nhạy, độ
phẩm PCR trình tự mục tiêu với primer/probe. 60-150bp đặc hiệu
ABT 2830
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Marilena et.al. (2008). Probe Design, Production, and Applications, Medical Biomethods
Handbook, 41-53. Doi:10.1007/978-1-60327-375-6_4.
2. Rychlik et.al. (1990). Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro,
Nucleic Acids Res, 18(21), 6409-6412. DOI: 10.1093/nar/18.21.6409.
3. Breslauer KJ. Et.al. (1986). Predicting DNA duplex stability from the base sequence, Proc Natl
Acad Sci U S A, 83(11), 3746-3750. DOI: 10.1073/pnas.83.11.3746.
4. Grünweller A. et.al. (2007). Locked nucleic acid oligonucleotides: the next generation of
antisense agents?, BioDrugs, 21(4), 235-243. DOI: 10.2165/00063030-200721040-00004.
5. Kutyavin IV et.al. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at
PCR extension temperatures, Nucleic Acids Res, 28(2), 655-661. DOI: 10.1093/nar/28.2.655.
6. Anh VNQ et.al. (2020). Validation of a Highly Sensitive qPCR Assay for the Detection of Plasma
Cell-Free Epstein-Barr Virus DNA in Nasopharyngeal Carcinoma Diagnosis, Cancer Control. ,
27(3), 1073274820944286. DOI: 10.1177/1073274820944286.
7. Linda et.al. (2013). Comparative Analyses of Real-time RT-PCR Protocols for the Detection of
Mature miRNA Molecules in Human Blood Serum, Perspectives in Cytology and Genetics, 16,
1-10. DOI:10.13140/2.1.1780.8003
ABT 2931
 CONTACT
ABT BIOLOGICAL SOLUTONS COMPANY LIMITED.
6.07 and 5.02, Lot L2, Long Hau Industrial Park, Long An
Province, Vietnam.

0903 307 258 sales@abtvn.com http://www.abtvn.com

THANK YOU FOR

YOUR ATTENTION

ABT