Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky

Bài 1: Hoá Học Protid

*Mục tiêu: Nguyên lý, tiến hành, kết quả, giải thích, ứng dụng của các phản ứng.
I. Phản ứng Ninhydrin tìm acid amin
1. Nguyên tắc:
- Ninhydrin là chất oxy hoá mạnh, có khả năng khử carbonyl hoá α acid amin tạo thành CO2, NH3 và aldehyde kém 1
carbon so với acid amin ban đầu. Đồng thời ninhydrin bị khử thành hydrindantin.

α Acid amin Ninhydrin Aldehyde Hydrindantin

- Ninhydrin và Hydrindantin phản ứng với NH3 tự do tạo phức màu xanh tím (độ hấp thụ cực đại ở bước sóng λ=570
nm). Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ acid amin ban đầu. (1)

Hydrindantin Ninhydrin Phức hợp màu xanh tím

- Những acid amin không phải alpha acid amin cũng có phản ứng với ninhydrin tạo phức màu nhưng không giải phóng
CO2. Prolin (công thức cấu tạo đặc biết nhất trong số 20 alpha acid amin) và 4-hydroxy prolin tạo phức màu vàng với
ninhydrin. (2)

Ninhydrin Prolin Phức màu vàng

2. Tiến hành:
- Lấy 3 ống nghiệm đánh số 1 đến 3, cho vào cả 3 ống mỗi ống 5 giọt dd Ninhydrin 0,1%, sau đó cho lần lượt:
+ Ống 1 thêm 1 ml dd Glycin 0,1%
+ Ống 2 thêm 1 ml dd Prolin 0,1%
+ Ống 3 thêm 1 ml dd Protein 0,1%
- Lắc đều, đun sôi cách thuỷ 10 phút rồi quan sát màu.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 thấy màu xanh tím. Do Glycin phản ứng với ninhydrin theo nguyên tắc (1).
- Ống 2 thấy màu vàng. Do Prolin phản ứng với ninhydrin theo nguyên tắc (2).
- Ống 3 thấy màu xanh nhạt. Do trong dd Protein (là dd từ lòng trắng trứng) có chứa một số acid amin tự do, các acid
amin này phản ứng với ninhydrin theo nguyên tắc (1).
4. Ứng dụng:
- Ứng dụng phản ứng Ninhydrin với acid amin để tìm sự có mặt acid amin có trong một mẫu nhất định (định tính)
- Do cường độ màu của phức hợp màu phụ thuộc nồng độ acid amin, nên có thể ứng dụng để định lượng nồng độ
acid amin trong mẫu.
- Ứng dụng trong phương pháp sắc ký trên giấy để phân tích acid amin.
Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Ứng dụng trong điều tra phát hiện dấu vân tay trên bề mặt đồ vật do ninhydrin phản ứng với acid amin từ da để lại
ở dấu vân tay.

II. Phản ứng tạo PbS phát hiện acid amin:

1. Nguyên tắc:
- Trong môi trường kiềm, đun sôi, Cystin và Cystein phản ứng với Pb2+ tạo thành PbS kết tủa màu đen xám.
(CH3COO)2Pb + NaOH (dư) -> 2CH3COONa + Pb(OH)2 + NaOH dư
Pb(OH)2 + NaOH (dư) -> Na2PbO2 + H2O + NaOH dư
HSCH2-CH(NH2)-COOH + 2NaOH -> HOCH2-CH(NH2)-COOH + Na2S + H2O
(Cys) (Ser)
Na2S + 2H2O + Na2PbO2 -> PbS↓ + 4NaOH
2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm: 20 giọt dd Protein 0,1% + 20 giọt NaOH 2N + 1 giọt Chì acetat 5%
- Đun sôi cách thuỷ, quan sát hiện tượng.
3. Kết quả, giải thích:
- Dd xuất hiện kết tủa màu đen xám là PbS
- Do trong dd protein (lấy từ lòng trắng trứng) có chứa acid amin tự do Cystein, acid amin nayfphanr ứng với chì
acetat trong môi trường kiềm đun nóng tạo kết tủa PbS.
4. Ứng dụng:
- Chứng minh sự có mặt của Cystein trong Protein lòng trắng trứng.
- Định tính acid amin chứa lưu huỳnh(Met,Cys,Cystin) có trong một mẫu nhất định.
III. Phản ứng Biure:
1. Nguyên tắc:
- Trong môi trường kiềm, các Nito trong liên kết peptid của tripeptid trở lên sẽ tạo phức màu tím với ion Cu2+ giống
với khi 2 phân tử Ure (Biure) phản ứng nên được gọi là phản ứng màu biure.

2. Tiến hành:
- Lấy 2 ống nghiệm đánh số 1,2.
- Cho 10 giọt dd protein 1% và ống 1 và 10 giọt dd Glycin 1% vào ống 2
- Cho vào mỗi ống thêm 10 giọt dd biure (gồm CuSO4, Na-K tartrat, KI, NaOH, nước cất)
- Quan sát
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 thấy dd có màu tím hồng. Do protein có phản ứng biure
- Ống 2 thấy màu dd vẫn là màu xanh lam nhạt của dd biure do Glycin không có phản ứng biure.
- Chỉ những chất có từ 2 liên kết peptid trở lên mới có phản ứng màu biure do mỗi ion Cu2+ tạo phức 4 càng với 2
phân tử peptid/protein nên cần 2 liên kết với Nito trong kết peptid mỗi bên.
4. Ứng dụng:
- Phát hiện Peptid/Protein có trong mẫu.
- Phân biệt với các dipeptide hoặc acid amin do chúng không có phản ứng màu biure.

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
Bài 2: Hoá học Protein
*Mục tiêu: Trình bày được nguyên lý, tiến hành đúng, nhận định được kết quả, giải thích và ứng dụng của các phản ứng tủa
protein.
Nhắc lại về sự kết tủa protein:
- Protein hoà tan trong nước thành dung dịch keo nhờ 2 yếu tố: Tích điện cùng dấu và Lớp áo nước. Nếu làm mất cả 2
yếu tố trên thì protein sẽ kết tủa
- Làm mất lớp điện tích:
+ Đưa pH dung dịch về pH đẳng điện (pHi) của protein đó bằng các acid yếu/ base yếu. Ở pH này, các protein ở trạng
thái lưỡng cực nên không mang điện tích.
+ Trung hoà điện tích của tiểu phân protein bằng các chất điện giải như NaCl, (NH4)2SO4 …
- Làm mất lướp áo nước:
+ Gây biến tính protein/ đảo lộn cấu trúc protein bằng cách: nhiệt độ cao, áp suất cao, kim loại nặng, acid/base
mạnh…
+ Thêm các chất hút nước như ancol etylic, tanin, (NH4)2SO4 …
- Có 2 phản ứng kết tủa protein là thuận nghịch và không thuận nghịch.

+ Trong phản ứng kết tủa thuận nghịch, protein đã kết tủa có thể tan trở lại dung dịch trong dung môi thích hợp
hoặc nếu loại bỏ yếu tố gây kết tủa ban đầu, và tính chất lý hoá cũng như sinh học của protein vẫn không thay đổi. Các yếu
tố gây kết tủa thuận nghịch là muối vô cơ như NaCl, (NH4)2SO4, các dung môi hữu cơ như ether, ancol, aceton…
+ Phản ứng kết tủa không thuận nghịch (biến tính protein) có sự biến đổi cấu trúc không gian của phân tử protein cà
không thể phục hồi dù ở điều kiện nào, do đó protein đã kết tủa sẽ mất đi các đặc tính ban đầu. Các chất gây kết tủa không
thuận nghịch là những acid hữu cơ (tricloacetic, sulfosalicilic…), acid vô cơ đậm đặc, ion kim loại nặng, nhiệt độ…
I. Tủa protein bằng nhiệt độ:
1. Nguyên tắc:
- Khi đun sôi các tiểu phâ nprotein bị mất áo nước.
- Nếu các protein này bị trung hoà điện tích hoặc đưa về pHi tiếp thì chúng sẽ kết tủa.
2. Tiến hành:
- Lấy 5 ống nghiệm đánh số 1 đến 5
- Cho vào cả 5 ống mỗi ống 1ml dd protein đã thẩm tích 1% (là dd protein đã được lọc bỏ các chất điện giải và chất
tan kích thước nhỏ)
- Ống 1 không cho thêm gì.
- Ống 2 thêm 2 giọt acid acetic 1%
- Ống 3 thêm 5 giọt acid acetic 10%
- Ông 4 thêm 5 giọt acid acetic 10% và 2 giọt NaCl bão hoà
- Ống 5 thêm 2 giọt NaOH 10%
- Lắc đều, đun sôi cách thuỷ 5 phút, nhận xét và giải thích hiện tượng.
3. Kết quả, giải thích:
- Do đun sôi nên protein trong tất cả các ông đều đã được loại bỏ lớp áo nước. Ống nào làm mất được điện tích của
protein sẽ có kết tủa.
- Ống 2 thấy có kết tủa trắng chứng tỏ pH2 xấp xỉ pHi của protein, protein không tích điện nên bị kết tủa.
- Ống 1 không có kết tủa, pH1 > pH2 do đó pH1 > pHi, protein tích điện âm nên không bị kết tủa.
- Ống 3 do nồng độ acid cao hơn ống 2 nên pH3 < pH2, tức là pH3<pHi, do đó protein tích điện dương nên không bị kết
tủa.
- Ống 4 do có thêm NaCl là muối điện giải làm mất điện tích của protein, nên có kết tủa trắng.
- Ống 5 có pH5>pH1>pHi nên protein tích điện âm, do đó nó không bị kết tủa.
4. Ứng dụng:
- Kết tủa protein trong những điều kiện thích hợp nhằm lấy/loại bỏ protein trong dung dịch.
- Ứng dụng trong nấu chín đồ ăn chứa protein.
- Ứng dụng để tránh tác đụng của nhiệt độ làm ảnh hưởng đến trạng thái của các protein có hoạt tính sinh học
(enzyme)

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
II. Tủa protein bằng acid hữu cơ:
1. Nguyên tắc:
- Tủa protein bằng acid hữu cơ xảy ra không thuận nghịch.
- Sử dụng acid tricloacetic/acid sulfosalicilic để tủa protein
Trong đó acid tricloacetic tủa protein nhưng không tủa peptid và acid amin nên được dung để loại bỏ protein khỏi
huyết thanh trong việc định lượng các chất không phải protein. Còn acid sulfosalicilic tủa được cả 3 và được dùng
để phát hiện protein niệu và trong các dịch sinh vật.

2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 5 giọt dd protein 0,1%
+ 2 giọt dd acid sulfosalicilic 20%
- Quan sát và giải thích hiện tượng
3. Kết quả, giải thích:
- Xuất hiện kết tủa trắng làm đục dung dịch trong ống nghiệm.
- Protein trong dung dịch đã bị mất áo nước do acid hữu cơ là chất hút nước mạnh, còn điện tích đã bị trung hoà do
trong dd protein ban đầu (lòng trắng trứng) đã có sẵn các ion muối điện giải.
4. Ứng dụng:
- Định tính protein niệu (urino protein), có tác dụng trong đánh giá chức năng lọc của thận. Độ đục càng cao tỷ lệ với
lượng protein có trong nước tiểu, qua đó phản ánh tình trạng tổn thương của thận.
III. Tủa protein bằng kim loại nặng:
1. Nguyên tắc:
- Protein tạo muối với kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen…) thành những phức hợp không tan trong nước.
- Dựa vào tính chất này người ta dùng sữa, trứng (có chứa protein) để sơ cứu những trường hợp ngộ độc do ăn phải
muối thuỷ ngân, chì…trong giai đoạn cơ thể chưa kịp hấp thu.
2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 10 giọt dd protein 0,1% + 2 giọt dd Chì acetat 5%
- Lắc nhẹ và quan sát
3. Kết quả, giải thích:
- Xuất hiện kết tủa trắng
- Trong dung dịch protein (lấy từ lòng trắng trứng) có chứa sẵn một số ion muối điện giải do đó protein trong dung
dịch đã bị trung hoà điện tích. Khi có mặt ion kim loại nặng là Pb2+ sẽ phá vỡ lớp áo nước bao phủ phân tử protein
làm chúng bị kết tủa. Nếu vẫn còn dư ion kim loại sẽ phá vỡ cấu trúc bậc 2,3 của protein làm nó bị biến tính (phản
ứng không thuận nghịch do đó không thể trở lại trạng thái như ban đầu)
4. Ứng dụng:
- Ứng dụng trong sơ cứu bệnh nhân bị ngộ độc im loại nặng bằng cách cho dùng ngay protein trong thực phẩm như
trứng, sữa…
- Loại bỏ ion kim loại nặng khỏi dung dịch, khử độc kim loại nặng trong nước…
IV. Xác định điểm đẳng điện của protein trứng:
1. Nguyên tắc:
- Sử dụng 1 thang dung dịch đệm có pH khác nhau biết trước, với dự bổ trợ của chất khử nước tanin, trong điều kiện
đó dung dịch nào cho tủa albumin mạnh nhất là dung dịch có pH gần pHi của albumin nhất.
- Protein ở pHi tồn tại ở dạng lưỡng cực không mang điện nên dễ dàng kết tủa nếu không còn lớp áo nước, do đó sẽ
kết tủa nếu ta cho thêm các chất khử nước như ancol, tanin, aceton hoặc amoni sulfat.
2. Tiến hành:
- Lấy 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5.
- Ống 1 cho 1 ml dd đệm pH 3,6
- Ống 2 cho 1 ml dd đệm pH 3,8
Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Ống 3 cho 1 ml dd đệm pH 4,75
- Ống 4 cho 1 ml dd đệm pH 5,6
- Ống 5 cho 1 ml dd đệm pH 5,8
- Cho thêm vào cả 5 ống mỗi ống 0,5ml dd protein 1% và 1ml dd tanin
- Lắc đều, để 5 phút, quan sát và so sánh độ đục ở các ống.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 3 đục nhất do pH tương đương pHi nên lượng protein bị tủa là nhiều nhất. Các ống còn lại pH xa pHi nên có kết
tủa thì cũng rất ít.
4. Ứng dụng:
- Xác định điểm đẳng điện của một protein nhất định
V. Phân đoạn albumin và Globulin lòng trắng trứng bằng amoni sulfat (pp diêm tích)
1. Nguyên tắc:
- Globulin bị trung hoà điện tích ở nồng độ amoni sulfat nửa bão hoà và kết tủa. Albumin thì bị trung hoà điện tích và
kết tủa ở nồng độ amoni sulfat bão hoà.
2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 2ml lòng trắng trứng 1%, thêm 2ml dd amoni sulfat bão hoà để được dung dịch amoni sulfat
nửa bão hoà. Globulin sẽ kết tủa
- Để yên sau 5 phút, lọc tủa để loại bỏ globulin, trong dung dịch còn lại albumin.
- Thêm một ít bột amoni sulfat cho đến khi bão hoà, tủa albumin sẽ nổi lên.
- Thêm nước cất vào ống nghiệm để làm mất nồng độ bão hoà của amoni sulfat, tủa albumin sẽ tan trở lại. Dùng dung
dịch bị hoà tan để làm phản ứng biure bằng cách cho vào 1 ống nghiệm 10 giọt dd trên và 10 giọt thuốc thử biure.
Lắc đều, quan sát hiện tượng và giải thích.
3. Kết quả, giải thích:
- Sau khi làm phản ứng màu biure, thấy dung dịch trong ống nghiệm có màu xanh tím chứng tỏ sự có mặt của protein
mà cụ thể là albumin trong dung dịch.
4. Ứng dụng:
- Để tách riêng globulin và albumin trong dung dịch lòng trắng trứng hoặc 1 dung dịch protein bất bì/huyết tương.

Bài 3: Một số yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme
*Mục tiêu: Nguyên tắc, tiến hành, kết quả, ứng dụng các phản ứng chứng minh ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt động của
enzyme.
I. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
1. Nguyên tắc:
- Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng rõ rệt lên hoạt tính enzyme. Ở nhiệt độ thích hợp, hoạt tính của enzyme là lớn
nhất. Càng xa nhiệt độ thích hợp, hoạt tính của enzyme càng giảm.
- Khi nhiệt độ tăng cao (khoảng >60oC), hầu hết các enzyme bị biến tính
- Ở 0oC enzyme hầu như không hoạt động.
2. Tiến hành:
- Lấy 3 ống nghiệm rồi đánh số từ 1 đến 3 rồi lần lượt cho vào mỗi ống 1ml nước bọt 1/20.
- Ống 1 để trong đá 15 phút
- Ống 2 đun sôi 5 phút rồi lấy ra
- Ống 3 để ở nhiệt độ phòng
- Giữ nguyên ống 1 trong đá, đồng thời cho vào cả 3 ống 4ml tinh bột 1%
- Lắc đều, tiếp tục để ống 1 ở nhiệt độ trên. Lấy ngay 1 giọt dung dịch ở ống 3 làm phản ứng màu với Iod trên lỗ đầu
tiên của khay sứ. Sau đó cứ 1 phút 1 lần lặp lại phản ứng của dung dịch ống 3 với iod cho đến khi nó không làm
chuyển màu iod nữa thì dừng lại. Lúc này cho ngay vào cả 3 ống mỗi ống 2 giọt dd iod. Quan sát màu các ống và
nhận xét.
3. Kết quả, giải thích:

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Ống 1 dung dịch có màu xanh tím. Do để trong nước đá nhiệt độ thấp, enzyme amylase trong nước bọt hầu như
không xúc tác phản ứng thuỷ phân tinh bột, do đó phần lớn tinh bột vẫn còn trong dung dịch, nó tạo màu xanh tím
đặc trưng với iod.
- Ống 2 dung dịch có màu xanh đậm. Do khi đun sôi 5 phút thì amylase đã bị biến tính, kết quả là lượng tinh bột còn
nguyên nên bắt màu với iod đậm hơn.
- Ống 3 dung dịch có màu vàng tím chính là màu của dd iod. Do lúc này lượng tinh bột đã bị thuỷ phân hết thành các
phân tử ngắn hơn mà chủ yếu là các maltose, maltose không bắt màu iod do đó không làm chuyển màu dung dịch
iod.
4. Ứng dụng:
- Nắm được ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của enzyme trong cơ thể sống để ứng dụng trong bảo quản thực
phẩm bằng cách đông lạnh/nấu chín giúp giữ cho thực phẩm có thể bảo quản lâu hơn, tránh bị hỏng.
- Ứng dụng để duy trì nhiệt độ tối ưu cho các phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra tốt.
II. Ảnh hưởng của pH:
1. Nguyên tắc:
- pH của môi trường cũng ảnh hưởng tới hoạt độgn xúc tác của enzyme.
- Hoạt tính của enzyme hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH tương đối hẹp gọi là pH tối ưu.
- Theo dõi hoạt động của amylase ở những môi trường pH khác nhau từ đó rút ra pH tối ưu của enzyme này.
2. Tiến hành:
- Lấy 3 ống nghiệm đánh số lần lượt từ 1 đến 3.
- Cho 1ml dd đệm pH 5,6 vào ống 1
- Cho 1ml dd đệm pH 6,8 vào ống 2
- Cho 1ml dd đệm pH 8,0 vào ống 3
- Cho vào cả 3 ống mỗi ống 1ml tinh bột trong NaCl + 1ml nước bọt 1/20
- Lắc đều và để ở nhiệt dộ phòng.
- Làm phản ứng màu ống số 2 với iod; cứ 1 phút 1 lần lấy 1 giọt trong ống 2 nhỏ lên lỗ khay nhựa có chứa iod cho tới
khi dd không còn làm đổi màu iod nữa thì ngừng lại. Lúc này lập tức cho vào cả 3 ống mỗi ống 2 giọt iod. Quan sát
màu và giải thích.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 thấy dung dịch màu xanh đậm. Do pH trong dung dịch không thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase.
Amylase bị biến tính trong môi trường acid do đó nó không thể xúc tác cho phản ứng thuỷ phân tinh bột. Tinh bột
trong dung dịch phản ứng màu với iod tạo màu xanh tím đậm.
- Ống 2 thấy dung dịch màu vàng nhạt. Do pH này thuận lợi cho enzyme amylase hoạt động, nó xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân tinh bột thành các dextrin ngắn (acrodextrin) và một phần maltose. Do đó chúng bắt màu kém/không bắt
màu với iod làm cho dung dịch có màu vàng gần giống với màu của iod.
- Ống 3 thấy dung dịch có màu đỏ vàng. Do pH không phải là thuận lợi nhất để enzyme amylase hoạt động. Do đó tinh
bột bị thuỷ phân không được triệt để và cắt ngắn được như ở ống 2. Tạo ra các dextrin dài hơn ở ống 2
(erythrodextrin), dextrin này bắt màu với iod cho màu đỏ vàng đậm hơn của ống 2.
4. Ứng dụng:
- Xác định pH tối ưu của enzyme amylase.
- Giải thích được lí do enzyme amylase trong nước bọt chỉ thuỷ phân được tinh bột khi ở miệng còn dạ dày thì không,
là do ở dạ dày pH acid làm enzyme không thể hoạt động. Khi xuống ruột non, nhờ amylase của tuỵ, glucid tiếp tục
được thuỷ phân để tạo sản phẩm cuối cùng là maltose.
III. Ảnh hưởng của ion kim loại:
1. Nguyên tắc:
- Theo dõi hoạt động của enzyme amylase trong điều kiện bình thường khi có mặt một số chất để rút ra chất nào là
chất ức chế và chất nào là chất hoạt hoá đối với enzyme đó.
- Thông thường, các muối cơ bản như NaCl là chất hoạt hoá, các ion kim loại nặng là chất ức chế đối với enzyme.
2. Tiến hành;
- Lấy 3 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 3
- Cho vào cả 3 ống, mỗi ống 2ml nước bọt 1/20
- Ống 1 thêm 10 giọt nước cất, ống 2 10 giọt dd NaCl 0,9%, ống 3 10 giọt dd CuSO4
- Thêm vào cả 3 ống, mỗi ống 2ml dd tinh bột 1%

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Lắc đều, cả 3 sinh viên đồng thời cùng làm: mỗi người thử phản ứng của 1 ống với iod: cứ 1 phút lấy 1 giọt ở ống của
mình nhỏ lên khay nhựa có chưa iod.
- Tới khi dd của ống nào không làm chuyển màu iod nữa thì ngừng lại và cho đồng thời vào cả 3 ống mỗi ống 2 giọt
Iod, lắc đều, quan sát hiện tượng( so sánh tốc độ phản ứng giữa 3 ống và kết luận chất hoạt hoá, chất ức chế)
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 dd màu đỏ vàng. Do amylase trong nước bọt xúc tác thuỷ phân tinh bột tạo thành dextrin trung gian bắt màu
đỏ vàng với iod.
- Ống 2 dd màu vàng cam. Do NaCl là chất hoạt hoá làm tăng hoạt động của amylase, do đó tinh bột bị thuỷ phân
thành các sản phẩm cuối cùng không bắt màu iod.
- Ống 3 dd màu xanh. Do CuSO4 là chất ức chế hoạt động của amylase làm cho phản ứng thuỷ phân tinh bột nhờ
enzyme này khó diễn ra hơn, tinh bột không được thuỷ phân hoặc chỉ được thuỷ phân rất ít nên bắt màu xanh với
iod.
4. Ứng dụng:
- Để tăng hoạt tính của enzyme làm cho phản ứng sinh hoá diễn ra nhanh hơn thì sử dụng chất hoạt hoá.
- Muốn kìm hãm một phản ứng sinh hoá nào đó không cần thiết hoặc có sinh ra sản phẩm bất lợi thì sử dụng chất ức
chế.

Bài 4: Hoạt động của enzyme

*Mục tiêu: nguyên lý, tiến hành, kết quả và ứng dụng của phản ứng xác định hoạt động của enzyme.
I. Enzym vận chuyển nhóm amin (transaminase):
1. Nguyên tắc:
- ALT (Alanin Transaminase) hay GPT (Glutamat-Pyruvat Transaminase) là enzyme vận chuyển nhóm có nhiều ở tổ
chức gan và cơ. Nó xúc tác cho phản ứng vận chuyển nhóm amin từ acid amin Alanin sang cho acid α ceto glutaric
để tạo thành acid pyruvic và acid glutamic và ngược lại.
- Pyruvat phản ứng với 2,4-dinitrophenyl hydrazine (2,4-DPH) trong môi trường kiềm tạo thành 2,4-dinitro phenyl
hydrazon pyruvat natri có màu nâu đỏ.

Alanin α cetoglutarat (xảy ra ở bào tương) pyruvat glutarat

CH3COCOOH + H2N-NH-C3H3(NO2)2  CH3-C(COOH)=N-NH-C6H3(NO2)2 + H2O

CH3-C(COOH)=N-NH-C6H3(NO2)2 + NaOH  CH3-C(COONa)=N-NH-C6H3(NO2)2 + H2O
(2,4-dinitro phenyl hydrazon pyruvat natri)
2. Tiến hành:
- Chiết suất dịch enzyme: nghiền 2g cơ tươi trong cối sứ thật mịn, thêm 3ml dung dịch NaCl 9%. Tiếp tục nghiền
mạnh, thêm 3ml dung dịch NaCl 9%, ngoáy kỹ. Gạn (lọc qua vải màn) lấy nước trong.
- Tiến hành phản ứng: lấy 2 ống nghiệm đánh số.
- Cho 1ml dịch enzyme vào mỗi ống, ống 2 đun sôi 2 phút.
- Cho 1 ml dd đệm phosphate + 0,5 ml cơ chất vào + 0,5 ml dd 2,4-DPH vào mỗi ống
- Lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Thêm 1ml dd NaOH 10% vào mỗi ống rồi lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Quan sát và giải thích hiện tượng
3. Kết quả, giải thích:
Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Ống 1 thấy dung dịch có màu nâu đỏ. Do enzyme ALT xúc tác phản ứng chuyển Alanin thành Pyruvat, pyruvat tác
dụng với 2,4-DPH trong môi trường kiềm tạo ra hợp chất có màu nâu đỏ.
- Ống 2 thấy dung dịch có màu nâu nhạt. Do enzyme ALT khi đun sôi 2 phút đã bị biến tính, không còn khả năng xúc
tác cho phản ứng như ở ống 1, tuy nhiên trong dịch cơ tươi vốn đã có một lượng pyruvat nhất định là sản phẩm của
quá trình đường phân tạo năng lượng ở cơ, do đó vẫn có phản ứng giữa lượng pyruvat này với 2,4-DPH tạo sản
phẩm màu nâu đỏ như ở ống 1. Màu ống 2 nhạt hơn do lượng pyruvat ở ống này ít hơn ống 1.
4. Ứng dụng:
- Dùng phản ứng này để làm xét nghiệm đo hoạt độ ALT(GPT) trong máu, thông qua đó gián tiếp đánh giá chức năng
gan.
II. Hoạt động của enzyme lipase:
1. Nguyên tắc:
- Lipase được sản xuất ở tế bào tuyến tuỵ, tham gia xúc tác phản ứng thuỷ phân triglyceride thành glycerol và acid
béo. Sự có mặt của acid béo làm pH dung dịch thay đổi. Thông qua chất chỉ thị màu có thể nhận biết điều này.
2. Tiến hành:
- Lấy 2 ống nghiệm đánh số 1,2
- Thêm vào mỗi ống 10 giọt dd sữa 10% + 1 giọt phenolphthalein 1%
- Nhỏ từ từ vào mỗi ống dd Na2CO3 1% cho tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt.
- Ống 1 thêm 5 giọt nước cất, ống 2 thêm 5 giọt dịch tuỵ.
- Lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, quan sát sư thay đổi màu và giải thích.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 dd vẫn có màu hồng nhạt. Do không có sự thuỷ phân triglyceride trong sữa nên không có sản phẩm acid béo
làm thay đổi pH môi trường nên màu dd vẫn như cũ.
- Ống 2 dd mất màu hồng. Do dịch tuỵ chứa lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân triglyceride thành glycerol và acid béo,
acid béo sinh ra làm giảm pH của môi trường, từ đó chất chỉ thị pp chuyển từ hồng sang trong suốt không màu.
4. Ứng dụng:
- Nhận biết sự có mặt của tryglycerid trong dung dịch.
- Chứng minh hoạt động của enzyme lipase.
III. Hoạt động của enzyme catalase:
1. Nguyên tắc:
- Catalase là enzyme oxy hoá-khử có ở trong tất cả các tế bào. Catalase xúc tác phân huỷ H2O2 thành H2O và giải
phóng O2
H2O2 ------------------------- H2O + ½ O2
(catalase)
- Oxy mới sinh ra được phát hiện bằng phản ứng cháy.
2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm to 1g gan đã nghiền nhuyễn trong 10ml nước cất. Đổ nhanh dd H2O2 1% đầy ống nghiệm.
- Bịt nhanh ống nhiệm, lộn ngược ống vào chậu nước.
- Thả ngón tay cho nước trong ống chảy ra, vẫn giữ ống úp thẳng đứng để Oxy tạo ra chiếm ở đáy ống.
- Nhấc ống khỏi mặt nước, gạt hết bọt trong ống.
- Đưa từ từ 1 que đóm đẫ tắt chỉ còn tàn hồng vào đáy ống nghiệm.
3. Kết quả, giải thích:
- Que đóm đã tắt bùng cháy trở lại khi gặp Oxy ở đáy ống.
4. Ứng dụng:
- Ứng dụng phản ứng này để sát trùng vết thương phòng nhiễm khuẩn ở những vết xây xát nhờ cơ chế: ở tại mô tổn
thương, các tế bào bị tổn thương giải phóng catalase tại vết thương, người ta dùng nước oxy già (H2O2) rửa vết
thương thì khi đó catalase xúc tác phân huỷ oxy già tạo Oxy; oxy này là oxy nguyên tử mới được sinh ra nên có tính
oxy hoá mạnh, do đó nó oxy hoá vi khuẩn tại vết thương và diệt khuẩn. Cũng cần chú ý không nên sử dụng oxy già
nhiều và nhất là trong giai đoạn lên da non vì ngoài oxy hoá Tế bào vi khuẩn thì Oxy còn oxy hoá cả các tế bào của cơ
thể tại vết thương, nên chỉ dùng để sát khuẩn ban đầu chứ không dùng như 1 dung dịch để vệ sinh vết thương đều
đặn.

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
Bài 5: Hoá học Glucid
I. Xác định tính khử của monosaccarid – phản ứng Fehling.
1. Nguyên tắc:
- Tất cả các phân tử monosaccarid đều chứa nhóm chức có tính khử (nhóm aldehyde –CH=O hay cetone >C=O ) do đó
chúng có tính khử.
- Nhờ có tính khử mà chúng có thể khử các ion kim loại (Cu2+, Fe3+,…) thành các kim loại hoặc ion hoá trị thấp hơn.
- Trong phản ứng Fehling, monosaccarid khử Cu(OH)2 trong môi trường kiềm nóng tạo thành CuOH, CuOH mất nước
tạo kết tủa Cu2O màu đỏ gạch. Đây là phản ứng đặc trưng nhằm nhận biết nhóm chức aldehyde.
HOCH2-[CHOH]4-CHO + 2Cu(OH)2 ----------- HOCH2-[CHOH]4-COOH + 2CuOH +H2O ------------ Cu2O↓ + H2O
(kiềm,to) (to) (đỏ gạch)
2. Tiến hành:
- Lấy 4 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 4
- Cho vào mỗi ống 1ml dd Fehling màu xanh lam gồm fehling A và fehling B với tỷ lệ 1:1 (thành phần chứa CuSO4,
H2SO4 đ,muối Na-K tartrat, NaOH, nước cất)
- Lần lượt thêm 10 giọt nước cất vào ống 1, 10 giọt dd Glucose 1% vào ống 2, 10 giọt dd Fructose 1% vào ống 3, 10
giọt dd Gallactose 1% vào ống 4.
- Lắc đều các ống, đun sôi cách thuỷ 5 phút, quan sát và nhận xét các ống.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 không có hiện tượng gì, không kết tủa.
- Ống 2,3,4 đều thấy kết tủa đỏ gạch. Do ống 2 chứa Glucose có chức aldehyde, ống 3 Fructose trong môi trường kiềm
của Fehling chuyển dạng thành Glucose nên cũng có chức aldehyde, ống 4 Gallactose có cấu tạo gần giống Glucose
và cũng có chức aldehyde nên ở cả 3 ống này đều có phản ứng để tạo kết tủa đỏ gạch.
4. Ứng dụng:
- Tìm đường trong nước tiểu để chẩn đoán đái tháo đường và các bệnh lý về thận.
II. Xác định cetose bằng phản ứng Selivanoff:
1. Nguyên tắc:
- Fructose khi bị đun sôi trong môi trường acid vô cơ sẽ mất nước tạo 5-hydroxy metyl fucfural, chất này ngưng tụ với
resorcin tạo hợp chất màu hồng.
- Các aldohexose cũng cho phản ứng này tuy nhiên xảy ra rất chậm, nên phản ứng Selivanoff được coi là phản ứng đặc
hiệu của cetohexose.
(Lý do vòng 5 cạnh dễ phản ứng hơn là do phản ứng với resorcin là dẫn xuất của fucfural là dạng vòng 5 cạnh, nên
những hexose có cấu tạo vòng 5 cạnh như cetohexose dễ phản ứng hơn cấu tạo vòng 6 cạnh của aldohexose)

2. Tiến hành:
- Lấy 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5
- Cho vào mỗi ống 15 giọt dd Selivanoff A (etanol, H2SO4 đ) và 1 giọt dd Selivanoff B (Resorcin, etanol)
- Ống 1 thêm 5 giọt nước cất, ống 2 thêm 5 giọt dd Glucose 1%, ống 3 thêm 5 giọt dd Fructose 1%, ống 4 thêm 5 giọt
dd Maltose 1%, ống 5 thêm 5 giọt dd Saccarose 1%.
- Lắc đều các ống, đun sôi cách thuỷ 1 phút rồi nhận xét kết quả.
- Cho vào nồi cách thuỷ lại, để sôi 3 phút, lấy ra nhận xét kết quả và giải thích.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1,2,4 dung dịch có màu vàng. Do nước cất, Glucose, Maltose (gồm 2Glu) đều không có phản ứng Selivanoff nên
không quan sát thấy màu hồng
- ống 3,5 dung dịch có màu tím hồng, màu ở ống 5 nhạt hơn ống 3. Do trong ống 3 có Fructose là cetohexose nên có
phản ứng selivanoff. Ống 5 saccarose trong môi trường acid đặc đun sôi bị thuỷ phân thành đơn phân Glu và Fruc,

Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
sản phẩm thuỷ phân có phản ứng selivanoff nên dd cũng có màu hồng. Màu hồng ống 5 nhjat hơn do thuỷ phân
saccarose không hoàn toàn nên lượng fructose thu được không nhiều bằng ống 3.
4. Ứng dụng:
- Phân biệt aldose và cetose.
- Nhận biết sự có mặt của cetose trong dung dịch.
III. Xác định tính khử của disaccarid:
1. Nguyên tắc:
- Disaccarid nào trong phân tử còn nhóm chức khử (nhóm OH bán acetal) thì sẽ có khả năng khử Cu2+ theo nguyên tắc
phản ứng Fehling.
(nhóm OH bán acetal –hemiacetal- là nhóm chức được hình thành từ phản ứng giữa nhóm aldehyde hoặc ceton với
nhóm ancol.

Nếu alcol và carbonyl trong nội phân tử liên kết với nhau => bán acetal nội phân tử.

Nhóm OH bán acetal vẫn còn tính khử tương tự nhóm carbonyl, do đó nó vẫn khử được Cu2+ như aldose)
2. Tiến hành:
- Lấy 4 ống nghiệm đánh sô 1 đến 4
- Cho vào mỗi ống 1ml dd Fehling
- Ống 1 thêm 10 giọt nước cất, ống 2 thêm 10 giọt dd Saccarose 1%, ống 3 thêm 10 giọt dd Lactose 1%, ống 4 thêm 10
giọt dd Maltose 1%.
- Lắc đều các ống, đun sôi cách thuỷ 5 phút, nhận xét kết tủa các ống và nêu nhận xét.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 và 2 không thấy có kết tủa.Do nước cất không phản ứng Fehling,saccarose thì cấu tạo từ α Glucose và β
Fructose liên kết 1,2-glycosid nên không còn hemiacetal do đó không còn tính khử.
- Ống 3 và 4 có kết tủa đỏ gạch. Do Lactose cấu tạo từ Galactose và Glucose liên kết 1,4-glycosid với nhau nên kết quả
là còn 1 hemiacetal trong phân tử Glucose làm cho Lactose có tính khử như aldose. Maltose thì cấu tạo từ 2 đơn
phân Glucose liên kết 1,4-glycosid nên cũng còn 1 hemiacetal nên có tính khử tương tự aldose.
4. Ứng dụng:
- Phát hiện disaccarid trong kiểm định thuốc.
- Phân biệt giữa các disaccarid phụ thuộc vào tính khử của hemiacetal.
IV. Thuỷ phân disaccarid, xác định thành phần cấu tạo : (không học)

Bài 6: Chuyển hoá Glucid

I. Thuỷ phân polisaccarid bằng acid: (không học)
II. Xác định acid lactic trong cơ:
1. Nguyên tắc:
Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Khi cơ hoạt động, tại cơ phần lớn glucose bị thoái hoá theo con đường đường phân yếm khí, sản phẩm của quá trình
này là acid lactic.
- Acid lactic được chiết xuất từ cơ tươi. Phát hiện sự có mặt của acid lactic trong dịch chiết bằng phản ứng tạo lactat
sắt màu vàng:
C6H5OH + FeCl3 -> [(C6H5O)6Fe]3- (phenol sắt – màu tím)
[(C6H5O)6Fe]3- + 2CH3-CHOH-COOH -> [(CH3-CHO--COO)2Fe]+ + 6C6H5O- + 2H+
Acid lactic lactat sắt – màu vàng
2. Tiến hành:
- Chiết acid lactic từ cơ: lấy khoảng 2g cơ tươi nghiền nát trong cối sứ. Thêm 5ml nước cất, nghiền thật kỹ, gạn lấy
nước trong, thêm tiếp 3ml nước cất, lắc kỹ, đun sôi, protein sẽ tủa lại. Lọc lấy nước trong, đó là dịch chiết có chứa
acid lactic.
- Cho vào ống nghiệm 1ml dd phenol 1% + 2 giọt dd FeCl3 1% + 4 giọt dịch chiết cơ
- Lắc đều rồi nhận xét màu của ống nghiệm.
3. Kết quả, giải thích:
- Dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng chanh.
- Do trong dịch chiết cơ có acid lactic phản ứng tạo lactat sắt theo nguyên tắc đã nêu.
4. Ứng dụng:
- Định lượng acid lactic trong máu => đánh giá tình trạng nhiễm toan chuyển hoá, đánh giá chức năng gan.
(acidlactic sinh ra ở cơ là một chất độc, gây toan hoá máu, nếu tích tụ với lượng lớn gây rối loạn hàng loạt quá trình
trong cơ thể, do đó nó được đưa vào máu để vận chuyển về gan nhằm giải độc bằng cách tổng hợp lại đường (chu
trình Cori))
- Phát hiện (định tính) acid lactic trong một mẫu nhất định.

Bài 7: Hoá học lipid

I. Nhũ tương hoá dầu lạc
1. Nguyên tắc:
- Dầu, mỡ không tan trong nước (dung môi phân cực) do trong phân tử chứa nhiều nhóm không phân cực (-CH2-).
- Khi lắc mạnh dầu, mỡ trong nước (tác động cơ học) sẽ tạo nhũ tương không bền (để 1 thời gian sẽ phân lớp trở lại)
- Nếu thêm chất nhũ tương hoá như Na2CO3, muối mật, protid, xà phòng… sẽ tạo nhũ tương bền (gồm các hạt lipid
kích thước nhỏ lơ lửng trong dung dịch và không tích tụ trở lại sau khi đã được nhũ tương)
(Sự nhũ tương hoá là sự phân cắt khối lipid kích thước lớn thành các hạt kích thước nhỏ lơ lửng trong dung dịch. Các
phấn tử lipid liên kết với nhau bởi lực Van’de Wal yếu, nếu chỉ tác động cơ học thì sẽ tạo các hạt(giọt) lipid nhỏ
nhưng không bền. Khi có chất nhũ tương hoá, những chất này liên kết với đầu kị nước của phân tử lipid làm bộc lộ
đầu ưa nước ra ngoài, từ đó hấp phụ các phân tử nước tạo micelle -> tạo nhũ tương bền.
Muốn tạo được nhũ tương bền cần có sự kết hợp của 2 yếu tố là chất nhũ tương hoá và tác động cơ học như
lắc/khuấy..)
2. Tiến hành:
- Lấy 6 ống nghiệm đánh số 1 đến 6
- Ống 1 cho 20 giọt nước cất, ống 2 cho 20 giọt dd Na2CO3 1%, ống 3 cho 20 giọt dd protein 1%, ống 4 cho 20 giọt dd
mật 30%, ống 5 cho 20 giọt dd xà phòng 5%, ống 6 cho 20 giọt ancol-ete 1:1
- Thêm vào mỗi ống 2 giọt dầu lạc
- Lắc kỹ các ống nghiệm,quan sát hiện tượng nhũ tương hoá bền và không bền ở các ống và so sánh.
3. Kết quả, giải thích:
- Ống 1 tạo thành nhũ tương không bền, chất lỏng trong ống nghiệm phân lớp rõ. Do không có chất nhũ tương hoá
nên nhũ tương hình thành không bền và phân lớp
- Các ống còn lại đều cho nhũ tương bền, dầu lạc tan trong các chất tạo thành các dung dịch được nhũ tương bền có
độ đục nhất định do các tiểu phân chất béo được nhũ tương lơ lửng trong dung dịch.
- Chứng tỏ các chất ở ống 2 đến 6 đều là các chất nhũ tương hoá.
4. Ứng dụng:
- Giặt, tẩy sử dụng xà phòng và các chất nhũ tương hoá giúp các vết dầu, mỡ dễ dàng sạch.
- Lipid trong sữa(chủ yếu là triglyceride) được nhũ tương hoá và tồn tại trong sữa nhờ các protein làm chất nhũ tương
hoá.
Merky
 Ôn tập thực hành Hoá Sinh 1 – Merky
- Muối mật (sản xuất ở gan) nhũ tương hoá lipid ở khúc II tá tràng, tạo điều kiện cho lipase thuỷ phân lipid để hấp thụ.
Khi tắc mật hay gặp vấn đề bệnh lý về gan làm cho dịch mật không được cung cấp đầy đủ dẫn tới lipid trong thức ăn
không được nhũ tương hoá làm cho lipase không thể phân giải lipid cũng cấp cho cơ thể dẫn tới cơ thể thiếu lipid,
thiếu nguyên liệu cho chuyển hoá, đồng thời do lipid không được tiêu hoá nên bệnh nhân xuất hiện tình trạng đại
tiện phân nhiễm mỡ, sợ mỡ…
- Ancol-ete có trong xi đánh giày dùng cho sản phẩm đồ da có tác dụng tạo độ bóng cho bề mặt da do nó nhũ tương
hoá các lipid trên bề mặt da làm chúng dễ dàng dàn đều và ngấm trên bề mặt da.
- Dsngj vạn chuyển lipid trong máu là lipoprotein là sự kết hợp của lipid với protein mà bản chất là protein nhũ tương
hoá các lipid mà nó sẽ vận chuyển.
III. Thuỷ phân Lecithin, xác định thành phần cấu tạo: (không học)
IV. Xà phòng hoá dầu lạc:
1. Nguyên tắc:
- Tryglycerid có trong dầu lạc khi kết hợp với kiềm sẽ giải phóng glycerol và muối kiềm của acid béo

2. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 20 giọt dầu lạc + 10 ml KOH 0,5 mol pha trong ancol (mục đích pha trong ancol là để tryglycerid
được nhũ tương hoá bởi ancol, giúp cho phản ứng dễ dàng xảy ra hơn do tăng bề mặt tiếp xúc giữa các chất tham
gia)
- Đun cách thuỷ, vừa đun vừa khuấy 30 phút cho tới khi được dịch quánh.
- Thêm 2ml nước cất, lắc nhẹ thấy có bọt, đó là xà phòng.
3. Kết quả, giải thích:
- Tryglycerid trong dầu lạc bị thuỷ phân trong môi trường kiềm nóng tạo thành glycerol và muối của acid béo. Sản
phẩm của phản ứng gọi chung là xà phòng, do đó phản ứng có tên xà phòng hoá.
4. Ứng dụng:
- Xác định mạch của acid béo:
Mạch acid béo càng dài và càng bị che phủ không gian nhiều thì phản ứng thuỷ phân càng khó do các liên kết este
cần thuỷ phân bị che phủ, khi đó lượng KOH phản ứng càng ít và ngược lại.
- Chỉ số xà phòng hoá là số mg KOH cần để thuỷ phân hoàn toàn triglycerid và trung hoà hết acid béo tự do có trong
1g chất béo (= chỉ số acid + chỉ số este hoá). Chỉ số này lớn chứng tỏ trong chất béo có những acid phân tử khối nhỏ.
Ngược lại nếu nhỏ chứng tỏ chất béo chứa các acid béo phân tử khối lớn hoặc các chất không xà phòng hoá được.

Merky