Họ và tên: Chu Sỹ Thạch

Mã sinh viên: 21002418

Nhóm: 3
Lớp: K66 Khoa học và công nghệ thực phẩm

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH THỰC PHẨM

Bài 1: Xác định sự có mặt của thịt bò/ lợn trong thực phẩm bằng phương
pháp PCR (Phần 2: Khuếch đại ADN bằng phương pháp PCR)

I/ Mục tiêu
- Nắm được nguyên lý hoạt động của phương pháp PCR và các thao tác để khuếch
đại ADN bằng phương pháp PCR
- Nắm được nguyên tắc của phương pháp điện di và các thao tác để điện di ADN
xác định được sự có mặt của thịt bò / lợn có trong mẫu thực phẩm.

II/ Cơ sở lý thuyết
1. Phương pháp PCR là gì?
- PCR (hay còn gọi là Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được sử dụng
rộng rãi nhằm khuếch đại nhanh một đoạn phân tử ADN nhất định lên nhiều lần trong
một khoảng thời gian ngắn.
- Thành phần trong phản ứng PCR:
1) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase): enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối
ưu ở 72oC.
2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP: nguyên liệu để tổng
hợp ra các bản sao DNA.
3) DNA khuôn (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu
nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
4) Cặp mồi (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide
và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.
 5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt
động hiệu quả.
6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho
phản ứng nhân bản diễn ra.
- PCR gồm 3 giai đoạn chính: Biến tính, Gắn mồi, Kéo dài
+ Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ
bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
+ Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi sẽ
bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
+ Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72oC, Taq polymerase sẽ sử
dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
- Multiplex PCR là quá trình khuếch đại nhiều đoạn trình tự DNA cùng lúc bằng
cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR.

2. Kĩ thuật điện di
- Sản phẩm sau phản ứng PCR được quan sát bằng kỹ thuật điện di DNA trên gel
agarose. Chất nhuộm DNA có trong gel agarose sẽ bám vào các sản phẩm PCR khi
những phân tử này di chuyển trong gel dưới tác dụng của điện trường. Dưới ánh sáng cực
tím (UV) chất nhuộm DNA sẽ phát quang và cho phép xác định được vị trí của sản phẩm
PCR. Khi so sánh với vị trí của các đoạn DNA chuẩn biết trước kích thước, sẽ biết được
kích thước của sản phẩm PCR và kết luận được trong mẫu DNA ban đầu có chứa DNA
mục tiêu hay không.
- Nguyên tắc: Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi
khung sườn từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate. Theo cấu trúc này, mỗi một
nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ thuận với
khối lượng. Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di
chuyển từ điện cực âm đi về phía điện cực dương.
- Kích thước băng sản phẩm của mtDNA bò là 271bp và mtDNA lợn là 212bp.

III/ Dụng cụ, hóa chất

1. Hóa chất:
+ Master mix (2x TaqMM)
 + Mồi (Mồi xuôi, mồi ngược)
+ Nước H2O
+ Khuôn (mẫu ADN tách chiết từ xúc xích bò)
+ Agarose gel
+ Marker
+ Đệm TAE 1X (Tris-Acetate-EDTA)
+ RedSafe 20000X
2. Dụng cụ:
+ Máy PCR
+ Pipette
+ Đầu côn
+ Ống tube 1,5 ml
+ Khay và lược
+ Bể và nguồn điện di

IV/ Các bước tiến hành

1. Thành phần phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp cặp mồi J01394 (bò) và cặp mồi
AF039170 (lợn)
- Cho 20 µl Master mix vào một ống PCR (1) 0,2 ml trước
- Cho tiếp 1,2 µl hỗn hợp mồi bò / lợn, 14.8 µl nước vào ống PCR (1)
-> Khi dùng pipette cho vào các thể tích nhỏ hơn 5 µl thì cần cho trực tiếp thẳng vào
dung dịch, không nhả quá cao so với bề mặt dung dịch sẵn có
- Lần lượt lấy 9 µl dung dịch từ ống PCR (1) vào các ống PCR 0.2 ml (2) và (3)
- Thêm vào ống PCR (1) 1 µl H2O -> Mẫu đối chứng (-)
- Thêm vào ống PCR (2) 1 µl khuôn plasmid -> Mẫu đối chứng (+)
- Thêm vào ống PCR (3) 1 µl khuôn chứa mẫu ADN tách chiết từ xúc xích bò ->
Mẫu (M)
- Mix đều dung dịch và spin down mẫu trước khi cho vào máy chạy PCR

2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đoạn gen đặc trưng cho mtADN bò và mtADN lợn
 Tên giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 1 chu kỳ 94oC 2’
Gắn mồi 30 chu kỳ 94oC 30s

58oC 30s

72oC 45s

Kéo dài 1 chu kỳ 72oC 5’

3. Điện di
- Chuẩn bị gel agarose 2%
- Chuẩn bị đệm TAE 1X
- Đổ bản gel agarose:
+ Chuẩn bị khay đổ gel và lược (đảm bảo rằng khay và lược đều sạch và
khô trước khi đổ gel). 2 mặt của lược có 8/8/17 và 12/12/25 răng, sử dụng mặt lược chứa
8 răng.
+ Đun bình đựng gel agarose 2% cho đến khi gel tan hoàn toàn
+ Chờ hỗn hợp gel nguội bớt (Khoảng 55-60 oC). Sau đó đổ 15ml gel vào
ống falcon 50 và cho 0,5 µl RedSafe 20000X, lắc đều.
=> RedSafe 20000X có vai trò như là một thuốc nhuộm để sau khi điện di ADN và chiếu
tia UV vào khay bản gel thì sẽ xuất hiện những vạch sáng màu lục, dễ dàng nhìn thấy kết
quả.
+ Đổ 15ml gel agarose vào khay đã đặt sẵn lược (đến vạch ngang trên
khay), tránh đổ khay quá dày sẽ khó quan sát kết quả, hay quá mỏng sẽ làm khay dễ bể.
Khi đổ thì đổ từ trong góc rồi hướng ra góc còn lại bên phía lược, sau khi đổ cần dàn đều
để gel có thể tràn khắp bề mặt khay, cần đổ đều tay, tránh tạo bọt khí sẽ ảnh hưởng đến
kết quả -> Có thể khắc phục bằng cách dùng đầu côn pipette kéo dồn các bọt khí vào một
góc trước khi bản gel đông
+ Đợi gel đông từ 15-30’
- Thao tác điện di trên gel agarose
+ Chuẩn bị bể điện di và nguồn điện di. Đặt bản gel agarose vào trong bể
điện di chú ý đặt cạnh có vạch đen về đầu âm của nguồn điện. Đổ đệm TAE 1X vào bể
cho tới khi ngập bản gel agarose (đệm nên bao phủ toàn bộ giếng và bề mặt gel, tránh sử
dụng quá ít hay quá nhiều đệm)
+ Sử dụng pipette 1-10 µl để tra 5 µl mẫu vào từng giếng. Thực hiện lần
lượt tra vào 8 giếng theo thứ tự:
(M) / (+) / (-) / Marker / (-) / (+) / (M) / (/)
Nhóm 3 Nhóm 4
=> Cần phải thêm mẫu vào sau khi đặt bản gel vào bể và đổ dung dịch đệm lên. Nếu
thêm mẫu vào bản gel trước thì khi đổ dung dịch đệm có thể làm tràn mẫu làm ảnh hưởng
đến kết quả thu được. Khi nhỏ mẫu vào khay sau khi đổ dung dịch đệm lên khay bản gel
thì sẽ tránh làm mẫu bị tràn, bởi master mix trong mẫu sẽ khiến mẫu chìm trong giếng
=> Không đâm đầu côn xuống quá sâu sẽ làm thủng giếng, nên đưa vào từ 1/3 đến 1/2
chiều cao của giếng. Khi tra mẫu vào giếng tránh việc nhả mẫu quá nhanh để mẫu không
bị khuếch tán ra đệm bên ngoài giếng.
- Đậy nắp bể khớp và đúng đầu điện cực
- Điều chỉnh các thông số trên bộ nguồn điện di: 90V, 25’. Và ấn nút RUN để chạy
máy.
=> Kiểm tra dây dẫn ở các đầu cực đã hoạt động hay chưa bằng cách xem có xuất hiện
bọt khí từ các dây dẫn hay không. Khoảng 3’ sau khi chạy nên kiểm tra xem mẫu đã chạy
đúng chiều hay chưa bằng cách xem màu dye dịch chuyển (hướng di chuyển từ giếng đến
cuối bản gel), nếu thấy dye đang di chuyển không đúng chiều, cần STOP máy ngay và
kiểm tra lại chiều nguồn điện.
- Khi máy đã chạy hết thời gian thì sẽ tự ngừng cấp điện cho bể điện di. Tắt máy,
rút dây của bể điện di và lấy bản gel điện di ra.
- Đọc kết quả bằng máy chiếu tia UV

4. Đọc kết quả

- Mẫu đối chứng (-) sẽ không hiện lên vạch nào, nếu hiện lên vạch tức là trong quá
trình làm mẫu đã bị nhiễm ADN từ các nguồn bên ngoài làm kết quả thu được bị sai
- Mẫu đối chứng (+) sẽ luôn có 2 vạch, nếu không thì kết quả thu được bị sai
- Với mẫu (M), nếu xuất hiện vạch tại 212bp thì mẫu có thịt lợn, xuất hiện vạch tại
271bp thì mẫu có thịt bò
V/ Kết quả / Nhận xét

Ảnh 1: Khay gel sau khi đã chiếu tia UV Ảnh 2: Thang chuẩn DNA với 2%
agarose gel và 1X TAE
- Nhận xét:
Quan sát khay gel khi đã chiếu tia UV. Thứ tự mẫu được tra vào giếng là:
(M) / (+) / (-) / Marker / (-) / (+) / (M) / (/)
Có thể thấy với mẫu xúc xích bò (bên trái giếng chứa Marker), mẫu đối chứng (-)
không xuất hiện vạch nào, mẫu đối chứng (+) có 2 vạch => Kết quả xét nghiệm chính
xác, trong thao tác mẫu không lây nhiễm chéo DNA từ nguồn khác. Ở mẫu (M), chỉ xuất
hiện 1 vạch mờ ở thang 212bp nên có xuất hiện thịt lợn ở trong mẫu xúc xích bò, không
xuất hiện vạch ở thang 271bp nên không hề có thành phần thịt bò trong mẫu. Giải thích
cho điều này có thể do trong mẫu xúc xích chỉ chứa hỗn hợp các loại thịt khác bao gồm
thịt lợn, thịt bò có thể có trong xúc xích nhưng với một tỷ lệ rất nhỏ.