A.

TITLE OF EXPERIMENT
Thin Layer Chromatography
B. OBJECTIVE OF EXPERIMENT
Separation of amino acid in a mixture by thin layer chromatography
C. BACKGROUND
Thin layer chromatography (TLC) was developed in 1938 by Ismailoff
and Schraiber. Adsorbents are coated on a glass plate which acts as a support for
the stationary phase. The mobile phase will creep along the stationary phase and
form a chromatogram. This is also known as open column chromatography. This
method is simple, fast in high separation and it is easy to recover the separated
compounds.
The term chromatography is used in several separation techniques based
on different “medium migration”, namely the distribution of the stationary phase
and the mobile phase. There are 3 things that must be present in this technique.
The first is that there must be a displacement medium, which is the place where
separation occurs. Secondly there must be a force for species to separated along
the “migration medium”. The third must be a selective repulsion style. This latter
force can cause the separation of the chemicals under consideration.
Basically thin layer chromatography (TLC or thin layer chromatography)
is very similar to paper chromatography, especially in the way do it. The real
difference is seen in the separation media, which is used a thin layer of fine
adsorbent that is supported on glass boards, aluminum or plastic as a substitute for
paper. This thin layer of adsorbent in the separation process applies as a stationary
phase. When KLT is compared to KKT, the advantages of typical KLT are
versatility, speed, and sensitivity. The versatility of the TLC is due to the fact that
in addition to cellulose, a number of different absorbers can be applied to glass
plates or other supports and used for chromatography. Namely the eluent and the
stationary phase is silica gel.
Thin layer chromatography is a widely used technique of separating old
ways, especially in the analysis of complex mixtures from natural sources. But in
recent quantizations thin layer chromatography was replaced by “HPLC” (high
performance thin layer chromatography) or high performance thin layer
chromatography. In some cases, it is possible to make the spots appear by reacting
with chemicals to produce a colored product. A good example is the
chromatogram produced from a mixture of amino acids. Chromatograms can be
dried and sprayed with ninhydrin solution. Ninhydrin reacts with amino acids to
produce colored compounds, generally brown or purple.
Separation of the components of a mixture based on the different degrees
to which they interact with two separate material phases is called chromatography.
The nature of the two phases and the kind of interaction can be varied, giving rise
to the different types of chromatography that will be described in the next section.
One of the two phases is a moving phase (the mobile phase), while the other does
not move (the stationary phase). The mixture to be separated is usually introduced
into the mobile phase, which then is made to move or percolate through the
stationary phase either by gravity or some other force. The components of the
mixture are attracted to and slowed by the stationary phase to varying degrees,
and as a result, they move along with the mobile phase at varying rates, and are
thus separated. Among the various types of separation methods, solvent extraction
or also called water extraction is the best and most popular method of separation.
The main reason is that this separation can be done either at the macro or micro
level. This technique can be used for preparative use, purification, enrichment
separation and analysis, then developed into a good, simple fast method and can
be used for metal ions which act as tracers and can be used for metal in macro
grams (Kenkel, 2003: 310).
D. EXPERIMENT METHOD
1. APPARATUS
a. Pencil 1 unit
b. Ruler 1 unit
c. Scissor 1 unit
d. Spray bottle 1 unit
e. Graduated Cylinder 10 mL 1 unit
f. Pinset 1 unit
g. Chamber 2 units
h. Hot plate 1 unit
i. Rough cloth 1 unit
j. Soft cloth 1 unit
2. CHEMICALS
a. TLC plate
b. Capillary pipe
c. Alanine C3H7NO2
d. Aspartic Acid C4H7NO4
e. Glutamic acid C5H9NO4
f. Histidine C6H9N3O2
g. Tyrosine C6H9N3O2
h. Ninhydrin solution C9H6O4
i. Aquadest H2O
j. Sample x
k. Eluent A solution (buthanol : acetic acid : water = 80 : 20 : 20)
l. Eluent B solution (propanol : water = 70 : 30)
3. WORK PROCEDURES
a. TLC plate was cut accordance to its chamber size.
b. TLC plate was drew with using pencil (1 cm above the bottom side of the
plate and 0.5 cm under the top of side).
c. Samples such as amino acid (alanine, glutamic acid, tyrosine and histidine)
and also X mixture were spotted using capillary pipe above the line.
d. Plate was put in a chamber that contain eluent A and B. Let a few minutes,
removed and dried.
e. Plates were sprayed with ninhydrine.
f. Plates were dried in few minutes.
g. Plates were heated in oven.
h. The value of Rf of amino acids and X mixture was calculated.
E. EXPERIMENTAL RESULTS
1. OBSERVATION RESULTS
a. Emulsion A
NO Name of Sample Distance Color Rf
Eluent Spot
1 Acetic Acid Glacial 5.8 2.3 Yellow 0.39
2 Hystidine 5.8 0.3 Purple 0.05
3 Glutamic Acid 5.8 0.5 Violet 0.08
4 Tyrosine 5.8 1.2 Violet 0.20
5 Alanine 5.8 0.6 Red brick 0.10
6 Mixture X 5.8 1.2 Violet 0.20
b. Emulsion B
N Name of Sample Distance Color Rf
O Eluent Spot
1 Acetic Acid Glacial 5.8 5.3 pink 0.91
2 Hystidine 5.8 1.8 Purple 0.31
3 Glutamic Acid 5.8 4.0 Violet 0.68
4 Tyrosine 5.8 5.0 Violet 0.86
5 Alanine 5.8 0.4 Violet 0.06
6 Mixture X 5.8 2.6 purple 0.44
2. DATA ANALYSIS
a. Elution A (Butanol : Asetic Acid : Water = 80 : 20 :20)
1. Alanine
Spot distance = 2.3 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 2.3 cm
Rf = = =0.39
Eluent distance 5.8 cm
2. Glutamic Acid
Spot distance = 0.3cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 0.3 cm
Rf = = =0.05
Eluent distance 5.8 cm
3. Aspartic Acid
 Spot distance = 0.5 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 0.5 cm
Rf = = =0.08
Eluent distance 5.8 cm
4. Histidine
Spot distance = 1.2 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 1.2cm
Rf = = =0.20
Eluent distance 5.8 cm
5. Tyrocine
Spot distance = 0.6 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 0.6 cm
Rf = = =0.10
Eluent distance 5.8 m
6. Mixture X
Spot distance = 1.2 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 1.2cm
Rf = = =0.20
Eluent distance 5.8 cm
b. Elution B (Propanol : water = 70 : 30)
1. Alanine
Spot distance = 5.3 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 5.3 cm
Rf = = =0.91
Eluent distance 5.8 cm
2. Glutamic Acid
Spot distance = 1.8 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 1.8 cm
Rf = = =0.31
Eluent distance 5.8 cm
3. Aspartic Acid
Spot distance = 4.0 cm
Eluent distance = 5.8 cm
 Spot distance 4.0 cm
Rf = = =0.68
Eluent distance 5.8 cm
4. Histidine
Spot distance = 5.0 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 5.0 cm
Rf = = =0.86
Eluent distance 5.8 cm
5. Tyrocine
Spot distance = 0.4 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 0.4 cm
Rf = = =0.06
Eluent distance 5.8 m
6. Mixture X
Spot distance = 2.6 cm
Eluent distance = 5.8 cm
Spot distance 2.6 cm
Rf = = =0.44
Eluent distance 5.8 m
F. DISCUSSION
Telah dilakukan percobaan tentang kromatograpi lapis tipis. Dimana
kromatograpi lapis tipis adalah salah satu metode pemisahan komponen yang
sederhana yang memilik kecepatan dalam pemisahan dan bersifat sensitive.
Kecepatan pemisahan tinngi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-
senyawa tertentu. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk memisahkan asam-asam
amino dalam suatu campuran dengan cara kromatograpi lapis tipis. Prinsip dasar
dari kromatografi lapis tipis ini adalah memisahkan komponen-komponen
senyawa berdasarkan perbedaan adsorpi atau partisi oleh fasa diam yang berupa
lapisan tipis dan fase gerak berupa eluen. Sedangkan prinsif kerjanya adalah
pengukuran, penotolan, dan pengelusian.
Pada percobaan in yang menjadi fase diamnya yaitu silika gel pada plat
kromatografi lapis tipis sedangkan fase geraknya yaitu larutan pengelusi A dan
pengelusi B. Alasan digunakan dua jenis pengelusi adalah untuk mengetahui
pengaruh jenis eluen dalam penampakan noda dan mudahnya zat terbawa oleh
eluen, yang akan berpengaruh pada nilai Rfnya serta mengetahui pengelusi yang
sesuai untuk pemisahan asam-asam amino.Pengelusi A terdiri dari komposisi
butanol : asam asetat : air (80 : 20 : 20) dan pengelusi B terdiri dari komposisi
propanol : air (70: 30). Sedangkan asam-asam amino standar yang digunakan
pada percobaan ini yaitu alanin, asam glutamat, asam aspartat, tirosin, dan
histidin. Selain itu, ada pula larutan sampel x yang akan diidentifikasi.
Pada percobaan ini langkah pertama yang harus dilakukan adalah
memotong kertas plat KLT sesuai dengan ukuran chamber. Fungsinya agar kertas
plat bisa masuk kedalam chamber. Kemudian Plat diberi garis batas atas dan
batas bawah dengan menggunakan pensil. Digunakan pensil karena pensil terbuat
dari grafit dimana grafit tidak ikut terlarut dalam eluen menghasilkan noda.
Sedangkan jika digunakan pulpen, maka tinta dari pulpen akan larut yang dapat
mengganggu penampakan noda. Batas atas sebagai batas rambatan eluen
sedangkan batas bawah sebagai plat tempat penotolan sampel serta batas agar
cuplikan tidak terendam dalam eluen karena tidak akan terjadi perambatan noda
keatas melainkan sampel akan larut bersama eluen. Kemudian Plat ditotolkan
dengan sampel.
Penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler, agar hasil
totolannya tida terlalu besar, karena diameter dari pipa kapiler cuku kecil.
Penotolan diusahan tidak terlalu besar karena dapat mempengaruhi penampakan
noda, jika totolannya terlalu besar maka nodanya dapat melebar kesamping atau
kebawah. Setelah plat ditotolkan dengan sampel, plat kemudian dimasukkan
kedalam chamber yang berisi pengelusi atau pelarut dimana spot tidak boleh
menyentuh pelarut atau pengelusi. Hal ini dikarenakan jika spot terkena atau
menyentuh pengelusi, spot tidak akan bergerak ke atas melainkan merembes ke
dalam pengelusi. Kemudian chambernya ditutup, penutupan chamber berfungsi
untuk menjenuhkan larutan dalam chamber agar tidak menguap. Dimana jika
pelarut dalam chamber terjenuhkan maka akan mempercepat merambatnya zat.
Setelah eluen telah mencapai batas atas, plat dikeluarkan dan dikeringkan.
Setelah itu disemprotkan dengan ninhidrin, ninhidrin yang berfungsi untuk
menampakkan noda dari hasil elusi yang ditandai dengan adanya warna ungu.
Dimana ninhidrin merupakan oksidator lemah yang jika bereaksi dengan asam-
asam amino akan menghasilkan hidrindantin dan senyawa aldehid dengan
melepaskan gas CO2 dan NH3. Setelah penyemprotan warna noda akan muncul,
jika warna noda tidak muncul maka dilakukan pemanasan dengan hot plate, tujuan
pemanasan adalah untuk mempercepat reaksi antara ninhidrin dan asam amino
sehingga membentuk noda pada plat. Digunakan hot plate agar kertas tidak
gosong. Setelah noda terbentuk maka dilakukan perhitungan Rf dengan rumus
sebagai berikut:
jarak yang ditempuh noda
Rf =
jarak eluen
Berdasarkan percobaan jarak noda pada pengelusi A untuk asam-asam
amino asam aspartate, histinin, asam glutamate, tirosin alanine dan sampel x
secara berturut- turut yaitu 2.3 cm, 0.3 cm. 0.5 cm. 1.2 cm. 0.6 cm. 1.2 cm dan
berdasrkan analisis data diperoleh nilai Rf berturut-turut sebesar 0.39, 0.05, 0.08,
0.20, 0.10, dan 0.20. sedangkan jarak noda pada pengelusi B untuk asam-asam
amino asam aspartate, histinin, asam glutamate, tirosin alanine dan sampel x
secara berturut- turut yaitu 5.3 cm, 1.8 cm, 4.0 cm, 5.0 cm, 0.4 cm, dan 2.6 cm
dan berdasrkan analisis data diperoleh nilai Rf berturut-turut sebesar 0.91, 0.31,
0.68, 0.86, 0.06 dan 0.44. berdasrkan hasil yang diperolah dapat diketahui bahwa
rambat asam amino pada pengelusi B lebih besar daripada pengelusi A. Sehingga
dapat disimpulkan bahwa, larutan pengelusi yang baik digunakan untuk
pemisahan asam amino adalah larutan pengelusi B yang terdiri dari propanol dan
air. Sampel x pada eluet A yang ditotolkan adalah tirosin dimana noda pada
sampel x sama dengan noda pada sampel tirosi dan jarak rambatnya juga sama
yaitu 1.2 cm, sedangkan pada eluent B sampel x nya adalah histidin karena noda
yang dihasilkan pada sampel x sama dengan noda yang dihasilkan pada sampel
histidin. Aapun reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan asam-asam amino
sehingga muncul noda yaitu:
1. Asam glutamate + ninhidrin
2. Histidin + ninhidrin

3. Tyrosin + ninhidrin

4. Alanin + ninhidrin
O O
NH2 OH
OH
H3C COOH + 2 N
OH + HOC-CH2-CH3 + CO2 + 4 H2O

O O O

Ungu

5. Asam aspartate + ninhidrin

O O
NH2 OH
OH
H3C COOH + 2 N
OH + HOC-CH2-CH3 + CO2 + 4 H2O

O O O
Ungu
G. CONCLUSION
Amino acids can be identified through thin layer chromatography. Where
from the experiment it can be seen that amino acids will propagate faster using
elucidator B (propanone: water) than elucidator A (acetic acid: water: butanol).
 BIBILIOGRAPHY

Kenkel, John. 2002. Analytical Chemistry for Technicians Third Edition. The
United States of America: Lewis Publishers is an imprint of CRC Press
LLC.
ANSWER TO QUESTION
1. What happens if the protein is hydrolyzed by a strong acid that will produce its
constituent amino acids.
2. The basic principle of KLT is to identify qualitatively for quantitative analysis
where the stationary phase is a thin layer of fine adsorbent on a glass plate or
aluminum (Soebagio, 2002: 87).
3. Amino acids identified are acetic acid

APPROVAL SHEET
 The Complete Report of Analytical Chemistry II Experiment with The
Title “Thin Layer Chromatography” was made by :
name : Kasriani
id : 1713440010
class : ICP of Chemistry Education
group : VII
After checked and consulted by Assisten and Assistant Coordinator. So, this
report was accepted.

Makassar, May 2019

Assistant Coordinator Assistant

Mutmainnah Umar Ummu Salamah

ID. 1513440003 ID. 1513440005
Known by
Responsibility Lecturer

Dr. Eng Sulfikar, M.T

ID. 19701202 1999802 2 001