Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim LOI MO DAU Ngay nay, cling véi sy phat trién manh mé cia céng nghé sinh hoc, cdc ché pham enzyme duge san xuat cing nhiéu va duge sit dung trong hau het trong cdc linh vue nhu: ché bién thyc pham, nong nghiép, chin nudi, y té... Hang nam lugng enzyme duge san xuat trén thé gidi dat khoang trén 300.000 tan v6i gia tri trén 500 trigu USD, duge phan phéi trong cac Tinh vue khac nhau. Phan Ién enzyme duge sin xuat 6 quy m6 céng nghiép déu thudc loai enzyme don cau ti, xtic tac cho phan img phan hiy. Khoang 75% ché phim la enzyme thay phan duge str dung cho vige thiy phan co chat ty nhién Protease la enzyme duge str dung nhiéu nhat hién nay trong mét sé nganh san xudt nhu: ché bién thye pham (d6ng tu sita lam pho mat, lam mém thit, bd sung dé lam tang chat lugng san pham trong san xuat bia, xi ly phé phy pham trong ché bién thye pham...), san xudt chat tdy rita, thude da, y té, néng nghigp... Qua nhiéu nam, viée gia ting str dung vi sinh vat nhu 1a m6t ngudn cung cdp protease da cai thién dang ké higu qua san xudt va san phim duge tao ra nhiéu hon. Tuy nhién gid thinh ché phim protease cén kha cao, do dé cing Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim han ché viée sir dung rdng rai enzyme trong san xuat. Cac ché pham thu duge sau qué trinh nudi cdy san xudt enzyme chua phai la ché phim cé dé tinh khiét cao vi protein chi chiém 20-30% .Vi vay, vie nghién ctu cai tién phuong phap tach va tinh ché enzyme nhim thu duge ché phim 6 d6 tinh khiét cao rat can thiét. Dé tach va tinh ché enzyme noi riéng va protein néi chung thug cé mét loat phuong phap héa-ly va héa hoc khac nhau, Cé thé chia kim n&im nhém phuong phip sau: - Phuong phap bién tinh chon Igc - Phuong phap két tua phan dgan - Phuong phap hap thy chon loc - Phuong phap sic ky - Phuong phap tach hé hai pha nuée Cho dén nay kh6ng cé6 phuong php tach va lam sach chung cho cdc enzyme. Dé xay dung phuong phap tach va lim sach mét enzyme nao do can biét Iya chon va phéi hop mdt cach cé higu qua nhat cdc bién phap tach va lam sach khac nhau. Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim PHAN I: TONG QUAN KI enzyme - Enzyme li nhiing protein c6 kha nding xtc tac cho cdc phan tmg hod hoc véi mite d6 dac higu khac nhau 6 nhiét 46 tuong déi thap. - Enzyme cé trong tat cd cac té bao séng, la cdc chat xtic tac sinh hoc. - Enzyme cé day dit cdc tinh chat cia chat xtc tac, nhung enzyme cé higu swat xtc tac lon hon tat ca cde chat xe tac hitu co va v6 co khac.Enzyme khong nhimg 6 thé xc tac cho cdc phan img xay ra trong co thé séng, ma sau khi tach khoi hé théng song, & nhimg diéu kién nhat dinh ching van git duge hoat tinh xiic Nhu vay,cé thé néi mt céch khdi quét, enzyme 14 nhing phan ti lén tén tai trong tu nhién, hay duge ting hop cé kha nang xtc tac cho mot hay nhiéu phan img v6i mirc d6 dic higu khac nhau 6 nhigt d6 va ap suat binh thudng. Dé xac dinh xem protein duge chiét tach ra cé phai 14 enzyme tinh khiét khéng hay con chtta nhimg tap chat protein khong hoat dong, ngudi Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim ta sir dung mét sé phuong phdp chu yéu dya trén viée nghién ctu nhimg tinh chat vat ly cua protein. - Lam ling (két tia) dung dich protein trong phan quay phan tich cia may sigu ly tam: phat hign mt dinh cua protein thi dé li protein thuan nhat, Tuy nhién m6t sé protein tuy khac nhau nhung cé cing trong lrgng phan tir va c6 hinh dang tiéu phan ( ho’ c6 khi ¢6 sy bi phu cia céc anh huéng cua khdi Ivgng va hinh dang) thi cé hing sé ling tring nhau. Vi thé khi siéu ly tam, ching co thé ling vi nhu nhau va cho mét dinh chung. - Bign li ( phuong phap ranh gidi di dgng): phuong phap nay rit higu qua. Tuy nhién kh ma phan bigt duge nhig protein giéng nhau vé trj s6 di dng dign li. Dung dich enzyme khi duge dign li khu vue trong jela tinh bot hodc thach chi ra mt dinh cn d6i thi d6 1a dau higu cia enzyme thuan nhat. Thé nhung khi ham Ivgng nhing protein tap nh6(<=1%) thi khé phat hign ra ding. - Xéc dinh hoat d6 rigng, mat 46 quang hoc riéng trong nhimg dinh quang phé dic trumg cing ham lugng cde nhém ngoai dic higu. - Bign phap kha nhay cam dé xc dinh mite 46 thudn nhat ctia enzyme ( cing nhu protein khac) la két hop sy phan tich dign li va nhing Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim phan img mign dich héa hoc dc higu, dc bigt dign di trén thach theo grabar. - Bién phap nghién citu cé trién vong nhung tuong déi it nhay vé d6 thuan nhat cua protein la sy x4c dinh d6 hoa tan cla nd theo norchrop. Thudng dé xét d6 thudn nhdt cia enzyme, ngudi ta dya trén sy so sdnh nhing két qua thu duge tir mt vai phuong phap khéc nhau. Dic biét, nhimg ché pham enzyme cang tinh khiét thi cang dé hong va khi bdo quan trong cde dung dich 6 4°C déu nhanh chéng mat hoat tinh, Vi thé, khi tai két tinh enzyme lp lai ta thudng thay cé sy giam hoat 46 riéng vi cdc tinh thé 44 bi 6 nhiém bai phan enzyme bj ite ché. Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim PHAN IT TACH CHIET& TINH SACH ENZYME C6 3 khé khitn trong khi tach enzyme khéi té bao cin phai hét site leu y. - Enzyme cé trong té bao sinh vat voi lugng khong I6n so vai cae thanh phan khac. - Enzyme la chat hitu co khéng bén, ching rat dé bi bién tinh khi bi tac d6ng ctia cde yéu t6 bén ngoai, - Enzyme li protéin. Prétéin enzyme luén luén di cing nhing loai protéin khéng phai enzyme nhung lai cé tinh chat ly hoa rt giéng protéin enzyme. Do dé, rat dé mat hoat tinh sinh hoc khi bj tach ra khdi té bao va co thé. Vige mat hoat tinh c6 thé do nhiét 6 cao, sy thuy phan béi cdc enzyme proteolytic, tac dung cia pH thdp, cdc chat oxy hoa hay chat khir, cac chat gay bién tinh,cac chat we ché bat thudn nghich...Tuy nhién, cdc enzyme khac nhau cé thé nhay cam voi nhimg téc nhan néu trén 6 cde mite d6 rat khéc nhau. Trong san xuat ché phim enzyme thi viée git dugc hoat tinh cua enzyme 1a mét trong nhing yéu cdu hang dau. Thong thudng qua méi buéc tinh sach Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim thi m6t phan enzyme cing nhu hoat d6ng cia ché phambi mit di, gid thanh cao Ién do chiphi vé thiét bi, nguyén ligu, cong site va do mat hoat d6. Véi enzyme ding trong muc dich cong nghiép, khéng phai Itic nao cing can phé phim cé d6 tinh sach cao,trong mét sé trudng hop co thé ding phé pham enzyme & dang tho. Dé han ché téi da sy giam hoat dé enzyme trong qua trinh tinh sach thi thudng cn chon dung dich chiét rat enzyme thich hgp, vita cho higu sudt chiet iat enzyme cao, vita khong lam bién tinh enzyme. Cac bude tinh sach thuéng dugc tién hanh & nhiét d6 thap ( khodng 40C hodc thap hon, tuy yéu 16 gay két tha) dé vita han ché sy bign tinh enzyme cing nhu tac dung phan gidi cla cdc enzyme proteolytic cé mat trong dich chiét.Pdi voi nhiéu enzyme,cé thé bé sung cdc chat tre ché ctia enzyme proteolytic vao dich chiét dé han ché sw thuy phan déi voi cée enzyme quan tim. Cac enzyme proteolytic duge phan thanh 4 6p la: + protease serine + protease cystein +. protease axit + protease chia kim loai. Trén co so cia 4 I6p protease nay, nhudi ta cing cha cdc chat tte ché cla cdc enzyme nay theo 4 Iép tuong img. Tuy vay, do su phd bién cita 2 loai Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim protease serine va protease cystein, nén vige bé sung vao dich chiét protein enzyme céc chat tte ché cua hai logi protease nay 1a phd bién. Trong mot sb trudng hop, déi voi cdc enzyme nhay cam véi cdc phan cat proteolytic, thi ca 4 loai chat te ché déu duge sit dung. Bé sung céc yéu td lam bén ( nhu CaCh, hay MgCl & néng 46 2-SmM, glycerol 10-20%...) chdt chéng oxy hod, xay dung quy trinh tinh sach don gidn it bude nhdt cing 1a nhimg cdch dé han ché sy giam hoat déng ctia enzyme. Déi voi mt sé enzyme bén nhiét thi co thé ding bude xit ly nhiét ( 70-80°C, trong vong 15-30 phiit) 6 ngay giai doan dau dé vira han ché tac dung phan cat proteolytic, vita loai bé mét sé protein khéng monh muén khac. Tuong ty co thé ding bude xir ly axit 9 dua pH xudng 3-4) & giai doan dau ddi voi cac enzyme bén & pH thap. II. Thu nhén ché phim enzyme thé Ngoai trir m6t sé truéng hop enzyme quan tam 1a enzyme ngoai bao tir vi sinh vat ( enzyme duge tiét vao mdi trudng trong qua trinh nudi cay té bao) va cae enzyme ngoai bao tir cdc dich cua dong vat va thyc vat, cdc truéng hop cén lai, buée dau tién trong nghién ctru enzyme 1a phai thu nhan dich chiét enzyme ti nguyén ligu.Dé thu dich chiét m6 hode té bao chita enzyme, trude hét phai pha vo té bao. Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Dé thu nhan enzyme ndi bao, ngudi ta phai phd vo té bao bing nhiéu phuong phap.Cac phurong phap pha ve té bao thudng duge str dung dé pha ve 1 bao nhu: + Phuong phap co hoc. Nghién bi, nghién c6 chat tro nghién nhu bét thuy tinh, cat thach anh, déng hoa bang thiét bj ddng hoa + Phuong phap vat ly nhu ding séng siéu am ... + Phuong phap hod hoc nhwr ding ce loai dung méi, butylic, aceton, glycerol, ethylacetate Sau khi pha v6 té bio, ngudi ta thudng str dung nuéc, dung dich dém, dung dich mudi trung tinh dé tach enzyme ra khdi sinh khéi da xtr ly theo nhimg phuong phap trén. Dich chiét thu duge,nguéi ta goi 1a ché pham enzyme thé. So di goi la ché pham enzyme thé vi trong ché pham nay,ngoai enzyme ra con cé nuée, protein khong phai enzyme cdc thinh phan cia té bio. Ché pham thu duge 6 cde buée ban dau nay thuéng chita rat nhiéu protein va cdc hgp chat khéng mong muén, néng 46 enzyme quan tam thap. Dich chiét c6 thé duge cé dae 6 nhiét 46 thap dé lam ting ning 46 enzyme, hoac duge bé sung tac nhan gay két tia protein enzyme dé loai bé mét sé chat khong mong muén, sau dé hoa tan enzyme trong m6t thé tich nhé dung dich dém thich hop. Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Dé két tia protein cho myc dich tinh sach, ngudi ta thuéng ding dung méi hitu co nhu ethanol hay aceton hoge mudi trung tinh, Cac dung méi hitu co khi thém vao dung dich nude sé lam gidm hing sé dién mdi ctia dung dich, do dé lam thay ddi tinh tan cia protein va din dén lam két tua protein. Ning 49 ciia céc dung méi gay két tia protein thuéng tt 80% (V/V) tré Ién. Sy két tua c6 thé cé tinh chon lgcmét phan, nghia la cdc protein khéc nhau cé thé duge két tia bing céc ndng dé khdc nhau cia dung mdi. Dung méi hitu co sau d6 ¢6 thé duge loai bang cach cho bay hoi trong chan khong, hay tham chi trong hk6ng khi, Dé két tha enzyme tir dich chiét thé, ngudi ta ciing co thé ding mét sé mudi trung tinh, thuong ding nhat ld ammonium sulfatese, do mudi nay co mite d6 hoa tan rat cao trong nudc, it lam mat hoat tinh enzyme, tham chi con cé tac dung lam bén enzyme. M6t sé uu diém nita cia mudi ammonium sulfate la kha nang két tia chon loc protein, do dé sé loai bo duge nhiéu protein khéng mong muén trong dich chiét. Luu y khi sir dung mudi ammonium sulfate 1a phai bd sung vao dung dich enzyme mét cach tir tir, két hop khudy déu dé tranh kha nang ting qué nhanh cuc bé cua néng d6 mudi, lam mit di tinh két tua chon loc cia n6, tham chi c6 thé lam bién tinh mét sé enzyme kém ben. Han ché ctia phuong phap str dung ammonium sulfate chinh 1a mat nhiéu thi gian, do ndng 46 ammonium sulfate cao nén ty trong cla Cée phucong phap tinh sach enzyme 10Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim dung méi lén, dé két tua duge cac protein can phai ly tam & téc dé cao va nhigt d6 thdp, sau d6 can logi mudi khoi ché phim khi chuyén sang bude tinh sach tiép theo. IV/Céc phwong phip tach chiét va tinh sach enzyme *Khdi nigm Vige lam sach enzyme chinh la vige loai protéin khong phai la enzyme, nuée,cde thanh phan khde eta té bao khoi enzyme. Cong viée nay hoan toan khong dé ding. Do d6, vige lim sach enzyme d0i hoi nguéi lim nghién ciu vé enzyme, ngoai sy hiéu biét vé enzyme ra con phai nim vig rat nhiéu thao tac ky thudt khac nhau dé tranh gay mit tinh hoat d6ng cua enzyme. Trong dich chiét, ngoai enzyme con chia cdc protein tap va nhiéu chat khac, dé loai bo chung phai sir dung phi hyp nhiéu bién phap khdc nhau. Dé loai bé mudi va cdc tap chat cé phan tir Iugng thdp thuong ding cc bign php thm tich d6i voi nuéc hay d6i véi cdc dung dich dém loang hode bing céch Igc qua gel sephadex. Dé loai bé cdc protein tap va cdc tap chat 6 phan tir Iugng cao khdc, thuéng ding két hop nhiéu bién phap khac nhau: phuong phap bién tinh chon loc nhé tae dung eta nhigt d6 hode pH ctia mdi trudng, phuong phip két tia phan doan bing mudi trung tinh hoge cdc dung mdi hitu co, cde hpuong phap sic ky( sic ky hap phy, sac ky trao ddi ion),dign di, phuong php loc gel. Cée phucong phap tinh sach enzyme iGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim 1/Phwong phap bién tinh chon loc Phuong phap nay dya trén sy tac dng cua nhigt 49, pH lam bién tinh cde loai protein tap. Phuong phap nay chi thich hyp voi enzyme chiu axit va bén nhiét.Ngudi ta dua nhiét 46 clia dung dich enzyme lén 50-70°C va pH 6 diéu kign nay nhiing enzyme khéng bén nhiét va khéng chju duge pH thap sé bj bién tinh.Sau do, bang phuong phap ly tam hogc phuong phap Ic dé loai b6 cdc thanh phan khong phai la enzyme ma ta mong mudn. 2/Phuong phap két tiia phn doan Phuong phap két tua phan doan bang (NH,)2 SO, dya trén co so sy khéc nhau vé kha ning két tia cia cdc protein enzyme & mét néng dé mudi (tinh theo u phan % néng d6 bao hoa) xdc dinh duge ding phd bién dé loai bé buse protein tap cla cée dich enzyme. Cac loai mudi cé thé duge ding la (NHy)2 SO;, Na; SOy, MgSO, ... ngudi ta di nhan thay mudi (NH,)2 SO, 1a tét nhat vi nd khéng lam hai ma lam 6n dinh (lam bén) hdu hét cdc loai enzyme. Logi mudi nay lai ré va phé bién, DO hoa tan cla né Iai rit 1én (bao hoa 767g/1 6 250C). Phuong phip nay chi ding véi nhimg enzyme it bj bién tinh bai céc dung moi duge chon ding. Dé gitt cho enzyme khéi bj mat kha ning hoat dong, qué trinh két tia phai duge thyc hién 6 nhigt dd thip (-5°C). Cée phucong phap tinh sach enzyme 12Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim 3/Phwong phap hap phu chon loc Nguoi ta cé thé cho chit hap phy tryc tiép vao dung dich enzyme, hoac cho dung dich enzyme chay qua m6t cét, trong c6t 6 chita chat hap phy. Chat hap thy duge st: dung rng rai la hydrocyapatite. Ngudi ta c6 thé thye hién mét trong hai cach sau: hoe li hap phy enzyme hoac la hap phy protein tap. Dé tranh lam bién tinh enzyme, ngudi ta thuéng thye hign qua trinh hap phy & nhiét 46 0°C.Sau khi hdp phy, ngudi ta lai tién hanh chiét enzyme (qua trinh phan hap phy) bang cac dung mdi thich hop. 4/Phwong phap sic ky * Plucong phip stic kj trao déi ion Dya trén co so cia phan img trao déi ion gitta protein tan trong nuée hode dung dich dém loang va téc nhan trao déi ion, ngudi ta ap dung phuong phap sac ky trao déi ion dé Lim sach enzym. Ngu6i ta thuéng str dung cc tic nhan trao déi ion sau: - Nhya trao déi ion - Din xuat ester cta cellulose nhu carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose. (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl- cellulose. Ngudi ta thug sir dung dietylaminoetylxelluloza (DEAE-cellulose) . Uu diém cla DEAE-cellulose 1a véi dich chiét thich hop ngoai tap hon Cée phucong phap tinh sach enzyme 13Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim chat protein con cé kha nang loai bé cdc tap chit axit nucleic.Diéu dé cho phép khéng can ding dén cdc bign phap nhim loai bé axit nucleic khé va phire tap nhu két tia protamin hode streptomixin sunfat thuong duge ding trude day. Sephadex 1a dan xuat cia polysaccharide dextran. Trong chat nay, cdc phan ti cia ching thuong lién két voi nhau béi cdc lién két ngang nho tac dung cia epiclohydrin, tao thanh “sang phan ti”. Sé lugng lién két ngang tao thanh cang nhiéu, kich thude cia 15 sang phan tir cang nho.Khi tién hanh loc, cdc chat phan ttr c6 khich thuée nhé sé khuéch tén vao bén trong cdc hat sephadex di duge ngdm trong dung dich dém, cn céc phan tir cé kich thuée lon hon khéng c6 kha ning di vao cae hat sé duge chiét nhanh ra khéi cét. Vay co sé cia phuong phédp loc gel sephadex dya vio sy khac nhau vé kich thuée, hinh dang va phan tir lugng cia cde chat cé trong hén hgp.Phuong phap nay duge ap dung rng rai trong k¥ thuat enzyme. * Phuong phip sic kj cot Dich chiét enzyme da duge loai bé phan Ién cac protein tap nhung van chua dim bao 46 déng nhat can thiét. Do dé dich chiét enzyme duge tiép tuc lam sach bang phuong phap sic ky cét. Phuong phap ding chat ray phan tit (Igc gel - gel filtration). Dé dam bao cho vic tach enzyme duge tét, chat ray phan ttr phai la chit tro, khong phan Cée phucong phap tinh sach enzyme 14Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim img véi protein enzyme. Chat nay ciing kh6ng hoa tan va tuong déi bén véi cae yéu t6 vé co hge ciing nhu sinh hoc. Ngoai ra chit duge str dung cho myc dich loc phan ttr phai la chat kh6ng cé tinh dan héi (khéng co) va phai 1a chat wa nude (hydrophyl). Co sé ky thuat nay dya vao sy phan bé khac nhau cla hén hgp trong dung dich hai pha khéng héa tan vao nhau. Cac hé hai pha dac trang bing cach tron cae hé dung méi vao nhau dé tao thinh hai pha riéng biét. Hé dung méi duge str dung trong phuong phadp nay cé thé 1a polymer/polymer nhu: polyethylene glycol (PEG) va dextran hoe polymer/muéi nhu PEG va potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate,... Cae protein va manh vé té bao cé kha nang héa tan khée nhau gitta hai pha, vi vay phuong phép nay cé thé duge dig cho ca hai truéng hyp: phan tach protein khoi manh vé té bao va phan chia cdc enzyme trong suét qué trinh tinh sach protein. Hé hai pha nuée duge xem li phuong phap t6t cho vige phan tach va tinh sach cdc hén hop, vi phan tach chat long c6 mat 4 khae nhau dé dang hon phan tach cdc chat rin ra khoi cdc chat long. So voi cac phuong phap tinh sach khac thi hé hai pha nude cé mét s6 wu diém hon nhu: cé d6 hoa tan trong nude cua hai pha Ién (70-80%), dat dé tinh sach cao, higu suat cao, dé dang sit dung & quy mé Ién va dac bigt polymer duge tai sit dung. Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Su phan tach dat higu qua cao tity thudc vao cde théng s6 nhu khdi lugng phan ter va dign tich cia déi tung nghién citu, ndng 46 va khéi lugng phan tir cia cdc polymer, nhiét 46, pH, théi gian, Ive ion cua hén hgp va sy hign dién ctia cdc loai mudi da héa trj nhu phosphaste hode sulphate... 6/ Ngoai ra con 6 ede phwong phap : - Phuong phap ding chat hap phy dac higu sinh hoc - Phuong phap sac ky ai lye (affinity chromatography) Hign nay, chua c6 m6t phuong phap chun nao that sy c6 higu qua trong im lam sach chi tl vig ach enzyme.Do 46, it su cé higu qua khi ta biét Iya chon cac phuong phap rigng,két hp véi nhau, tgo ra hé théng phong phap néi tiép voi nhau mét cach hai hoa nhat. Cée phucong phap tinh sach enzyme 16Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim V/Quy trinh sin xuat 1/Tir ngudn thye vat a.Enzyme bromel Bromelin la tén goi chung cho nhém enzyme thye vat cht nhém sulfhydryl, c6 kha nang phn giai protein duge thu nh§n tir ho bromeliaceae, die bigt 1a 6 cay dita (than va trai) Enzyme bromelin c6 thé thu duge tir trong than, trong phan thit qua va trong chdi qua. Tay theo nguén thu nhan ma ngudi ta phan biét bromelin than hay bromelin qua va bromelin than la nhém cé gid tri kinh t8. 6 méi khac nhau trén cay dita, bromelin cé pH téi wu khac nhau va cé cau tao khac nhau. Bromelin chiém 50% protein trong qua dita. Né cé kha ning thily phan kh manh va hoat dng tot & pH tir 6-8. Bromelin cé hoat tinh xiic tac sy phan giai protein twong ty nhu papain trong mi du dit hay ficin trong cy thude ho Sung. Enzyme bromelin c6 trong Iugng phan tir khong 33.000 DA, lén gap 1,5 lan so véi papain. Thit qua dita chi c6 hoat tinh enzyme bromelin khoang tir 3 thang truéc khi chin, trong 46 hoat tinh bromelin cao nhat 14 khoang 20 ngay tuée khi chin. Khi trai chin, hoat tinh bromelin giam xuéng nhung khéng mit hin, Cée phucong phap tinh sach enzyme 17Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Bromelin con c6 thé thu duge tir trong than dita(trung binh cé thé thu duge 3,6 kg bromelin tir 3781 nuée rut ra tir thin cay dua, Cée phucong phap tinh sach enzyme 18Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Vigc thu nh@n va tinh sach bromelin cé thé thyc hign theo so dé sau: Gein te > Dich loc Ly tam Két tia Ché phim brommelin Say khd Tinh sach San pham enzym tinh khigt Cée phicong phép tinh 3 inh Ki 19Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Thu dich enzyme thé Qua dita hoe thin duge xoay nhuyén, vit ky, Igc bé ba va thu dich loc, ly tam dich loc véi téc d6 6.000 vong/phut trong 10 phut dé loai bé chat xo sé thu duge dich chiét c6 chtra bromelin. Cic phwong phip tich bromelin * Phicong phap két tia enzyme DOi v6i enzyme protein ciing nhu cdc protein enzyme khac, dé cé the thu duge enzyme, diéu can thiét 1a phai pha vo lop nude lién két xung quanh phan tur nay bang cach bé sung vao dung dich protein enzyme cdc dung méi hode cc hoa chat ua nude cé ai lye voi nuée manh hon protein dé Idi kéo nude ra khéi phn tr protein d6, gitp cho protein két tia xuéng. Cae dung méi thudng duge str dung dé két tia bromelin 1a acetone va ethanol, cén cdc héa chat khée nhu cdc mudi trung tinh & néng d6 cao cing c6 thé két tha duge enzyme. Heinicker va Gortner da ding acetone dé két tia bromelin tt than va trai. Bromelin trong dung dich nuéc rat nhay cdm véi cde dung méi hitu co do dé dé su két ia dat higu qua cao thudng tién hanh qué trinh két tia trong diéu 0, kign lanh, Nhu vay, nuée ép tir thin va trai dita phai duge kim lanh & 0- va aceton tinh khiét 6 20°C.Ethanol cing duge str dung dé két tia protein va hon hgp bromelin-ethanol cing phai gitt & diéu kign nhigt 46 lanh. Sau khi Cée phucong phap tinh sach enzyme 20Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim thu duge két tia, tia bromelin phai duoc rita bang aceton va lam khé that nhanh dé bromelin kh6ng bj bién tinh, Dé c6 thé thu nhan enzyme, viée dau tién la phai pha vo t6 chic md cd chira enzyme bing cdc nghién m6 dé thu dich chiét cé chita bromelin réi sau 6 ding cac tac nhn khdc nhau dé két tua bromelin. Nhimg yéu té chinh anh hung dén higu suat va chat Iugng ctia ché pham enzyme dé la: - Nong 46 clia ammonium sulfate. - pH cia dich chiét. - Nhig - Thoi gian ti¢p xtc cua tac nhan va dich chiét. * Phuong phap hap phy Co thé str dung kaolin hay betonite dé hap phy bromelin. Cach lam: cho kaolin khé ( ho§c 44 ngam truong né ) vio dung dich nude dita sau ly tim voi ty 18 25 mg kaolin/ml dung dich nude dita. Khudy déu bang may khudy ti, sau dé ly tam dé thu ta . Tua duge goi li bromelin- kaolin, * Phuong phip siéu loc Str dung mang FS SOPP cé gid trj loai trix 30.000, dign tich mang 336 cm’, Cée phucong phap tinh sach enzyme BrGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Dich dita sau ly tam duge cho qua siéu loc, trong qué tr2inh nay thém nude cdt vio dé tinh sach va thu duge dung dich c6 dac. Thu nhfn tia bing cach sir dung acetone hoac say thing hoa dung dich c6 dac. Thu nhgn bromelin bing phuong phdp sit dung cacboxyl methyl cellulose (CMC). Phuong php téch bromelin bing CMC cho phép thu duge bromelin & dang bét tring cé hoat tinh cao, thai gain nhanh va don gidn hon so véi cde phutong phap khie. Phuong phép tinh sach enzyme bromelin Enzyme bromelin duge tinh sach bang phuong phép tham tich, loc qua sephadex, phuong phap sac ky. * Tinh sach bing phwog phap thm tich. Can 1g enzyme thd, pha trong 10ml dung dich dém sodium phosphate 0,03M cé pH7,2. Sau khi tat cd enzyme da hoa tan thi cho hdn hgp vio tii cellophane réi dat tai vio céc c6 chita IL dung dich dém sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Tui cellophane duge chuan bj bang cach truée khi ding duge trang day bing dung dich dém tuong ty nhu trén. Tién hanh thim tich trong 6 gid va cir sau 2gié thay dung dich dm bén ngoai 1 Kin. Dung dich dém phia ngoai tai duge khuay lién tue bang 1 may khuay tir. Trong qua trinh tham tich, dé lim gidm su bién tinh cia enzyme do nhiét, ngudi ta thong tién hanh tinh sach enzyme 6 nhiét 46 Cée phucong phap tinh sach enzyme 22Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim * Tinh sach bang cach loc qua sephadex. Tinh sach bing c4ch loc qua sephadex G-50. - Tinh sach bang cach loc qua sephadex G-10. * Tinh sqch bromelin bing phwong phép siic ky. Bromelin thin duge cho chay sac ky trén Duolite CS101 6 pH 6,05 cho 2 phan doan khdc nhau vé dign tich véi hoat tinh xtc tac phan gidi BAEE, casein va glucagon. Bromelin than va bromelin qua thé duge cho chay sic ky gel trén sephadex G-75, tiép theo sir dung phuong phap sac ky trao déi ion trén sulfo ethyl sephadex chi cho mét phin doan protein don cé hoat tinh phan giai protein. b/ Enzyme papain : Duge tdéch tir nhya trai du di xanh, papain thuge nhém enzyme thuy phan c6 ngudn géc thye vat duge nghién ctr nhiéu nhat vé tinh chat va co ché hoat dong. papain 1a mét sulfhydryl protease, dau tién dyoc tach ra boi Bals va cOng sy ciia Ong, sau 46 béi Kimmel va Smith tir nhyza khé. Cay: dang sinh truéng t6t, khOng bj su bénh, thin cay m§p map cho nhya nhiéu. Cée phucong phap tinh sach enzyme 23Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Qua: l4y 6 nhing qua dang cdn xanh, v6 qua min, cé trong lugng ti 0,3- Ikg 1a tot nhat. Thdi gian lay nhya: sing sém, két thes vo gitta budi sing. Khi d6 am Khong khi thép, dong nhya chay ch§m va dic, khé thu nhan. -Mia khé: nhya it, dic, ndng d6 protein cao. -Miia mua: nhya nhiéu, loading, ndng d6 protein thap. Tién hanh : - Nhya du du dy & qua xanh con 6 trén cay. - Dimng dao inox ¢é dau nhon rach vai duéng theo qua 6 ché duéng kinh qua to nhat, - Himg ldy nhya chay ra bang lo thuy tinh miu miéng rng trong 4-6 phut, sau khi lay nhya xong day nap kin gitt trong tdi. - Bao quan lanh: - Khi lay nhya can tranh khong cho cae chat ban hodc céng tring lan vao. Khong nén tron nhya khé véi nhya tuoi vi né lim gidm chat lugng. - Khi tién hanh cdc thao tae véi nhya tuoi, tranh khéng cho nhya tiép xtic vao da vi né sé gay bong. Dong théi cing khong nén dé nhya tiép xtie voi cdc dung cy lam tir kimloai nang nhu sat, dong... vi né lam bién mau va giam hoat tinh enzyme. Cée phucong phap tinh sach enzyme 24Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Hoa Sink The pl - Nhvya tuoi khéng bén, vi thé nén sdy khé t6i 5% d6 4m. Plucong php thu nhgn papain tinh khiét, - Hoa tan nhya du du, muc dich la loai bé cdc chat nhya, can, tap lon... - Loai bé cac chat khong tan 6 pH 9. = Qué trinh phan doan bang ammodium sulfute. - Qua trinh phan doan bang NaCl. - Két tinh. - Tai két tinh, - Say chan khong. Phwong phip tinh sach enzym tinh khié * Phuong phip hap phy cé chon loc. Dé thye hign phuong phap nay ngudi ta cho dich enzyme chay tt tir qua c6t chat hap phy. Khi d6, tiy theo kha nang tuong tac cla chat hap phy v6i timg loai enzyme, cdc enzyme khac nhau sé duge hap phy trén chat hap phy véi kha ning khée nhau. Sau a6 dinf céc dung dich dm thich hgp dé chiét rar enzyme ra khdi c6t. Phuong phap hap phu thuong ding dé lam dac dung dich enzyme. C6 thé hip phy chon loc cdc enzyme theo 2 cach: Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim - Hap phy 4m tinh: néu enzyme khéng duge hap thy, phuong phip xir ly nay cé thé xem nhu [a ding chat hap thy dé tach nhimg hyp chat tap ra khdi dung dich enzyme. -Hap phy duong tinh: néu enzyme duge hap phy, né sé duge tach ra khoi nhiing cdu ttr khdc trong dung dich va sau dé duge rita gidi khoi chat hap phy béi dung dich dgm pH kiém va cdc dung dich dgm khac ¢6 kha nang rira giai enzyme. Sau khi li tam dé loai cdc hgp chat khong tan, dung dich enzyme cé thé tham tach dé loai dich dém. Muén su hap phy enzyme tot nhat can phi tuan theo nhitng nguyén tac chung sau day: - Ham lugng protein trong dung dich khong vugt qua 1%. - Tilé cia gel( trong lugng khé) d6i véi protein thuémg la 20:1. - Méi trudng hoi axit pH=5-6. - Nong d6 chat dign li( mudi) thap trong dung dich. Sy tdn tai cua bat ki mOt lugng mudi nao cing déu anh huong dén qué trinh hap phy. ud trinh duge tién hinh twin ty nhu sa -Cho vao dung dich enzyme lién tiép nhing Iurgng thich hgp gel. -Trn déu. -Quay ling. -Thu hii timg phan gel truéc khi cho phan tiép theo vio. Cée phucong phap tinh sach enzyme 26Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim * Phuong phap cét sikc kj: Dé qué trinh tinh ché enzyme dat higu qua cao nhit, ngodi ning phuong phap thong thuong phé bién nhu két tia enzyme bing mudi ho§e cde dung dich hitu co tir cée dung dich, phuong phap thip phy chon gc trén jela vo co. Sac ky trao déi ion la mét phuong phdp higu qua dé chiét tach enzyme tinh khiét, qua trinh phan tachco thé dya trén sy hap phy, trao 446i ion hoge higu img ray phan tir, nhung trén thyc té, hau nhu cdc qué trinh phan tach déu chju anh huéng ca ca 3 qua trinh trén, Qué trinh dya trén phan img trao di ion gitta céc protein tan trong nude hodc nhimg dung dich dém long voi nhimg chat trao déi ién khéc nhau, protein duge tao bang cach tao cc lién két tinh dién gitra nhimg phan tinh dign trén bé mit chat hp phu. Thong thuong, cho dung dich ché phim enzyme vao trong dung dich 48m v6i c6t trao déi in di duge can bang -> dung dich dém giai hap phy bang dung dich dién giai (gradient mudi) véi ndng dé tang dan chay qua cdc c6t, cdc ién ctia dung dich rita sé day ra khoi nhya, cc enzyme vita lién két véi nhya. Khi 46, enzym nao cé 4i lye véi nhya kém nhat sé dé bj day ra khdi nhya nhat. Do d6, lan lugt cac enzyme Cée phucong phap tinh sach enzyme 27Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Khe nhau s& duge chiét ra khdi c6t theo timg phan chiét khée nhau, trong dé cé phan chita enzyme can thu véi ndng dé cao nhit. Lye hap phy cia mét chat trao d6i i6n duge xdc dinh boi : -Tinh chit héa ly cia protein. -Dic tinh cua nhimg nhém tich dign trong chat trao & -Nhiing diéu kign hap phy protein. Do do khéng thé dé ra truée nhimg didu kién can thiét dé tach tét nhdt nhimg enzyme 6 ra khoi nhimg protein khdc bang chat trao déi ion ma phai thy vao trudng hop, nhimg diéu kién d6 cin phai duge nha thyc nghigm Iya chon, Khi p! ich, qu: h h tu nhw sai -Lay mét thé tich V dung dich ( khéng qué 1/3 thé tich ct) cho chay m6t phan qua c6t dé lai mudi ra khoi dung dich protein, -Protein chay ra khoi ct vao mot thé tich dung dich hoi ln hon so véi thé tich_ctia né lic dua vao cét . -Ngbai ra, cic cOt chira sephadex G-75, G- 100 va G-200 cing xay ra sy phan tach ting phan cdc protein thy theo khéi lugng phan tir cia chang. Do 6, vige loai tri nhimg chat “két tinh” ra khoi dung dich, cac c6t chita sephadex tir G-75 dén G-200 cé thé str dung dé phan téch timg phan protein dya theo kich thuée phan ti. Cée phucong phap tinh sach enzyme 28Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Hoa Sink The pl * Phuong phip dign di LA phuong pha vat ly e6 gid trj dé phan tach cae hén hop protein, enzyme va cing la phuong phap dé xdc dinh sy tinh khiét cli cdc ché pham protein.Gin day,phuong php nay duge 4p dung 6 nhimg giai doan tinh ché enzyme cuéi cing. Nguyén ti Cé nhiéu phuong phap dién ly khac nhau.Trong tinh ché enzyme c6 hai phuong duge ap dung: Phuong phap rang gidi chuyén dng: duge 4p dung chit yéu dé xac dinh diém ding dién va 46 tinh khiét cing tinh thudn nhdt ca ché phim enzyme. Phuong phap dién di khu vyc trén gidy va trong khdi hodc trong c6t 6 chita cdc chat lam day: duge ap dung dé chiét xuat so bd va tinh khiét enzyme. Diéu kién can thiét dé tién hanh dién di: pH, nong 46 dung dich dém, dign thé ciia dong dign va théi gian thi nghiém duge Iya chon qua thyc nghiém va tinh chat cla enzyme nghién citu. * Phuong phap két tinh Khi enzyme da dat dén d6 ting khiét phi hop no cé thé két tinh. Tuy nhién két tinh khong c6 nghia la ché phan enzyme tinh Cée phicong phép tinh sach enzyme 29Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim khiét.Ngudi ta xdc dinh ring nhimg tinh thé dau tinh cua protein hay enzyme thudng 6 d6 tinh khiét khéng qua 50% va cé thé chira nhigu loai enzyme khie nhau, Hoat d6 riéng cita tinh thé ting khi cdc enzyme tai két tinh va qué trinh tai két tinh can duge lap lai nhiéu lin cho dén khi hoat d6 riéng ting dén m6t gid tri cao nhat. Phuong phap két tinh va tai két tinh duge tmg dyng khi tinh ché enzyme nhu li mét phuong phap phan doan protein co gid tri. Vi thé t6t nhat nén xem qua trinh két tinh nhu la m6t phuong phap cu thé ctia qua trinh phan doan, va duge sit dung 6 nhig giai dan tinh ché cudi cing. Su két tinh enzyme thuéng dugc tién hanh th cdc ammonium sulfate. Enzyme thudng duge két tinh theo nhiéu phuong phap khac nhau.Vi dy: nhu tir cdc dung méi hitu co .Khi nhimg phuong phap nay that bai nguéi ta cé thé két tinh mudi kim loai nang ctla enzym. Ching han, phosphopyruvate hydratase duge két tinh nhu mudi thay ngan khong hoat d6ng, tir d6 cae enzyme hoat dong cé thé duge thu nhan théng qua su loai bo kim loai bang qué trinh tham tich déi voi dung dich ammonium sulfate chita ammonia va cyanyte. c/ Enzyme Ficin : Ficin la 1 protease duge tim thay trong nhya ciia cay thudc ho Ficus (sung, va), hudc ho Moraceae, b6 Urticales. Cée phucong phap tinh sach enzyme 30Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Hau hét cc b6 phan cia cay 6 chita nhya bao gd cao su 2,4%, resin, albumin, cerin, duéng, malic acid, rennin, proteae, diatase, Ngudi ta nhan thay ring hoat tinh cua enzyme ficin cao khi nhya duge thu nhin vao budi sing sém. Do 6, nhya sung thuéng duge thu vio sang som, sdy khé dé ding trong céng nghé thyc phim. Phwong phép thu nhdn ficin thé tir cy sung: Tie Id vat qua: 14 va qua sau khi hai vé duge rita so, ct nho va ngam trong nuéc ri xay nhuyén.Loc qua vai thudng, loai bo xdc va thu 14 dich Igc. Dich lec duge xéc dinh dem di xdc dinh hogt tinh enzyme bing phuong phap Kunitz, tir d6 xéc dinh hoat tinh cua enzyme ficin chita trong dich loc. Tie nhya than: nhya sung duge thu vio budi sang tir 6-8 gid. Nhya sung duge bao quan lanh & ngan déng cé nhiét d6 thap hon 0°C. Hoat tinh ciia protease trong nhya tuoi duge xdc dinh bing phuong phap Kunitz. Mét sé phyong phap chiét tach enzyme: * Phuong phip chiét tich enzyme dya vo tinh hod tan. -Tia phan doan enzyme bang dung méi hiru co. -K&t tiia enzyme bing mudi ammonium sulfate. Cée phucong phap tinh sach enzyme 31Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim So ché dich nhua tuoi tit cdy sung Ficus rasemosal thanh ché pham enzyme ficin - Djch nhya sung sau khi thu duge pha theo ty 18 1g dich nhya trong 2ml nude cat. -Khudy déu dung dich bing may khudy tir trong 5 phut dé enzyme hoa tan hoan toan trong nude. -Ly tam hén hop véi téc dé 3000 vong /phit trong thoi gian 10 phut dé cao su déng dic lai va ing xuéng. Loai bé phan ling 6 phia duéi, thu dich néi bén trén. -Ding phuong phap tia phan doan enzyme bang ethanol 96% dé thu lay cde phan doan va xée dinh hoat tinh enzyme trong cae phan doan. -Nhiing phan doan cé hoat tinh enzyme duge pha loc gel dé logi bé cdc tap chat trong cdc phan doan enzyme. -Cac phan doan sau khi qua cét gel sé duge xdc dinh Iai hoat tinh, trn v6i tinh bot voi ty 16 1:1 di sdy kh6 & nhiét 46 40°C. Ché phim enzyme thu duge & dang bét sé bao quan 6 nhiét 49 0-4°0C. Cée phucong phap tinh sach enzyme 32Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Vic thu nbn ficin tir nha sung cé thé duge thuc hign theo so d6 sau a Dich ahya sung _ > Pha nuéc cat(ty 1é 1g dich nhya: 2 ml nuéc) Khudy bang may khudy tir trong 5 phat Ly tam téc d6 3000 vong/phut, 10 phit Thu dich bén trén Tiia phén doan bing ethanol Thu lay cdc phan doan Xe dinh hoat tinh cdc phan doan Thu cée phin dogn cé hoat tinh P va dua loc gel Thu phan doan Xéc dinh hoat tinh fe phan doan Don véi tinh bot Ché phim enzyme Bao quan nhiét d6 lanh 0-4°C Cée phucong phap tinh sach enzyme 33Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Hoa Sink The pl hong phap tinh sach enzyme Fi * Plucong phép loc gel: Céch lam + Nhéi t: ngdm gel sephadex G75 trong dung dich NaN; 0,02% trong 24 gig dé gel truong né hoan toan. - Cho dung dich dém vao edt. - Cho m6t lép gon thay tinh vao cét, dé gel tir tir vao cdt dén chiéu cao can thiét, Trong qué trinh dé gel vao cOt phai khudy déu dé gel duge déng nhat va phai cha y 1a lun luén cé mét lp dung dich dém trén mat dé ngin can hién tugng khé gel. Dat lén gel mdt lép gidy loc. - Dé cét én dinh trong vai gid, rita ct bang dung dich dém phosphate. + Nap mu: can mau va hoa tan mau vao 3-5 ml dung dich dém pH 6,1 sao cho néng dé protein khoang 10 mg/ml. - Nap mau vao e6t, sau khi hét mau van tiép tue cho dung dich dm qua ct. - Thu miu vio éng nghiém, mdi éng nghiém chita 2,5ml. Mdi phan doan duge thu trong théi gian 5-10 phut, dem cdc phan doan di do OD 280nm. Dén chung nhimg phan doan nao c6 sw hign dign ciia enzyme 48 do hoat tinh va xac dinh him Iugng enzyme. Cée phucong phap tinh sach enzyme 34Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Hoa Sink The pl * Phuong phip dign dimini-gel SDS polyacrylamide: Céch lam: + Chuan bj hod chat: - Dung dich acrylamide gel phan tach Tris-HCI 1,5M ; pH 8,8. - Dung dich SDS(10%). - Dung mdi pha miu. - Dém dign di - Dung dich nhuém protein. ~ Dung dich rita mu, + Tién hanh: - Chudn bj mau: hoa tan mau khé dung dich trong dung méi pha miu dé c6é néng 46 protein khoang Img/ml dung dich pha mau. Dun cach thuy hén hop trong 5 phut, dé ngugi, cho vao cac giéng cia enzyme. - Chudn bj gel phan tach(10ml) Dém gel phan tach: 2,5ml; nude cét: 3,2ml Dung dich acrylamide: 4,15ml; SDS 10%: 0,1ml Amonium persulfate; it tinh thé; TEDMED: 3,3microlit Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Lac nhe cho tan hét rdi ding pipette dua gel phan tach vao khodng gitra hai tim kinh cho dén lite gel cao khoang 8em ( chi ¥ khi). Cho mét lép nuée cat lén gel, che gel déng lai. - Chudin bj gel gom Dém gel gom: 0,5ml; nuée cat 1,18ml Dung dich acrylamide: 0,3ml; SDS 10%: 20 microlit Acnomium persulfate: it tinh thé; TEDMED: Imicrolit Lc nhe cho tan hét. Sau khi gel phan tach déng lai, hat bé phan nude cat & trén rdi ding pipette dura gel gom vio khuén. Lite nay dua luge vao khuén dé tao giéng. Khi gel gan déng, nhe nhang lay luge ra rdi lip khuén gel vao 6 dign di. Tién hanh dign di: cho dung dich dign di vao 2 budng dign di. Bom tir tir 5-10 microlit mau vao cdc giéng. chay dién di. Sau khoang 1 gid, khi thay vach mau chi thj di chuyén xuéng dén gan day cua gel thi ngat dién va tién hanh nhudm gel. Nhuém gel: ngam gel trong dung dich thuée nhudm protein, lay déng nhe cho thudc nhudm ngdm vao gel(1-4 gid). Chuyén gel sang dung dich rita mau, thay dung dich vai lan dén khi gel trong sudt va cdc Cée phucong phap tinh sach enzyme 36Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim vach mau xanh xudt hign tai c4c vj tri protein. Chyp hinh va ghi nhan dt qua Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim 2.Tie nguon dong vét Cae enzym thu tt dong vat nhu: rennet, pepsin, catalase, lipase, trypsin, pancreatin va lysozyme d6ng vat. Pepsin Thu nh4n pepsin Phuong phap 1: Da day bé rita sach tach mang nhay nghién va ngim nuéc co butanol 5% dé tranh nhiém khudn sau ché hoa bing etanol dé pepsin két tia, Phuong phap 2 : Niém mac da day bio quan & nhiét d6 lanh vir tach ra khoi vat méi mé ding HCl hay H3P04, H2S04 véi ndng 46 thich hop dé chiét téch va hogt héa thinh pepsinogen thanh pepsin, Dung dich pepsin khé sé duge dan qua mét chat két tia cholesterol. Chat két tua thu duge sau khi xir ly bang ester sé thu lai chat can c6 thanh phan cau tao Ia pepsin. Tinh sach pepsin Phuong phap ket tinh cia Northrop Cée phucong phap tinh sach enzyme 38Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Dung dich pepsin + MgSO, chat két tia (rita. dung dich Mgs0, ‘Hoa tan bing NaOH +NaOH +E2S0, Lam lan tdi tia trong acid *Rennin Phuong php thu nhan: Phuong phap 1 : -Da day bé xay nhuyén -HC10.2% -Cho 0.7 avid borie trén téng V Phuong phap 2: -Da day bé xay nhuyén Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sinh The phim -Nuée mudi 10% - Chinh HCI dé pH =4 -Cho 0.7 acid boric trén tong V. Gitt nhigt 46 35-40 0 C. Li mang thu duge rennin Phuong php tinh sach (Chet két tia (ronnet dang bét) Dung dich bio hoa + NaCl va gelatin (i tim 5.000vong/pht) y ra oe qua vai ‘rung tinh + NaCl Litam, Ige, Rennet tinh khiét 3.Tir ngudn vi sinh vat: So véi protease dong vat va thyc vat, protease vi sinh vat cé nhig dic diém khac biét. Trude hét hé protease vi sinh vat li mét hé théng rat phite tap bao gom nhidu enzyme rat gidng nhau vé cdu tric, khdi lvgng va hinh dang phan tir nén rat khé tach ra duéi dang tinh thé déng nhat. Cée phicong phép tinh sach enzyme 40Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sinh The phim Ciing do 1a phirc hé gdm nhiéu enzyme khac nhau nén protease vi sinh vat thuéng cé tinh dac higu rong rai cho san pham thuy phan triét 4é va da dang, Cac logi enzym trén thj trudng duge trich ra tir vi khudn hay ndm nhu cdc loai: Bacillus, Aspergillus va Trichoderma. So dé chung tach enzym Thiet bi khuyéch tin Dung dich nuée gitu emzim te VSV Bé sung thé Dung dich chia emzym_ Dich thu khéng chira tap chat Théo ba nim méc da duge chide rit Khuéch tin bing nhigt €@ 25-28°C Cée phicong phép tinh sach enzyme 41Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Hoa Sink The pl UNG DUNG ENZYME PROTEASE - Protease duge str dung rong rai trong nhiéu nganh céng nghiép nhu céng nghigp thyc phim, céng nghigp nhe, céng nghigp duge phim va néng nghigp... Protease véi cong nghiép thye phim: Viéc sir dung trong ché bién lim mém thit la tmg dung cé tinh truyén thong. Nhan dan ta tir rat lau da ding thom dé ndu canh thit bo; ding rau séng 1a chudi chat, va két hop thire an nhiéu thjt; du du trong chéng tao bén...ma thye chat la stt dung papain, bromelain, fixin. Nguoi Nga con ding protease tir hat dau tuong nay mam dé lam mém thit. Ngoai kha nang phn gidi 4é Lim mém tht, tao thite an dé tigu héa, cong nghé san xuat cac loai dich thiy phan giau protein di duge ap dung mét cach c6 higu qua tinh nang cia protease. - Trong céng nghiép ché bién thit : protease duge ding lam mém thit nho sy thay phan mét phan protein trong thit, két qua lim cho thit co mot 46 mém thich hgp va 6 vi tt hon. Protease duge str dung dé lam mém thit va ting huong vj thit. (ngam thjt vao dinh dudng protease & pH va nhigt 49 xac dinh- phuong phap nay phé bién va thuan Igi nhat; Tam hén hop lam mém Cée phicong phép tinh sach enzyme aGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim thit (enzyme, muéi, bot ngot). Tiém dung dich enzyme vio thit; tiém dung dich enzyme vao con vat truée khi giét md). Str dyng protease dé san xuit dich dam: tir Streptomyces fradiae tach duge ché pham keratineza thuy phan duge keratin rat c6 gid tri dé san xut dich dam tir da, long vi. Néu ding axit dé thuy phan sé mat di hoan toan cdc axit amin chtra lu huynh, néu ding kiém dé thuy phan sé bi raxemic hoa (chuyén dang L sang D lam giam gia tri sinh hgc ctia axit amin). Dé thuy phan sau sac va trigt dé protein (trong nghién citu, ché tao dich truyén dam y té) can ding cdc protease c6 tinh dic higu cao va tac dung rong, mudn vay ngudi ta thong ding phdi hgp ca 3 loai protease ong cong 1- 2% khdi hrgng ctia 3 loai: vi khudn, ném méc, thye vat voi ty protein can thuy phan. Uu diém cia viée thuy phan protease béi enzyme 1a bao toan duge vitamin cita nguyén ligu, khéng tgo ra cae sin phim phy, khéng lam sim mau dich thuy phan. - Trong ché bién thuy sén: Khi san xuat nuée mim (va mét sé lodi mim) thudng théi gian ché bién thudng 1a dai nhat, higu sudt thuy phan (46 dam) lai phu thugc rat nhigu dia phuong, phuong phap gai nén, nguyén ligu cd. Nén hign nay quy trinh san xudt nuéc mam ngan ngay da duge hoan thién trong dé sit dung ché phim enzyme thyc vat (bromelain va papain) va vi sinh vat dé rat ngin théi gian lam va cai thién huong vi cia nude mdm. Tuy nhién van Cée phicong phép tinh sach enzyme a3Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim con sé tén tai c4n phdi hoan thién thém vé céng nghé. - Trong céng nghiép sita: protease duge ding trong san xuat phomat nh hoat tinh lam d6ng ty sia ctia chung, Protease tir m§t s6 vi sinh vat nhu A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,... duge ding trong san xudt pho mat . - Trong céng nghiép san xudt bénh mi, banh quy... protease lam giam thoi gian tron, ting dO déo va lam nhuyén bét, tao dO x6p va no tét hon. - Trong san xudt bia: ché phim protease c6 y nghia quan trong trong viée Lim ting 46 bén ciia bia va rut ngin thi gian loc. Protease ciia A. oryzae duge ding dé thiy phan protein trong hat ngii céc, tao digu kién xi ly bia tt hon . 2, Cac nganh eéng nghép khie : - Trong céng nghiép da: protease duge sit dung lam mém da nhé sy thiy phan mét phan protein ctia da, chi yéu 1a collagen, thanh phan chinh lam cho da bj ctmg. Két qua da loai bo khoi da cdc chat nhét va lim cho da co dg mém déo nhat dinh, tinh chat d6 duge hoan thign hon sau khi thudc da. Trude day, dé lam mém da ngudi ta ding protease duge phan lap tir co quan tigu héa cia d6ng vat. Hign nay, vige dua cdc protease tach tir vi khudn (B. mesentericus, B. subtilis), ndm méc (A. oryzae, A. flavus) va xa khuan (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vao céng nghiép thudc da da dem lai nhiéu két qua va dan din chiém mét vj tri quan trong. - Trong céng nghiép dét: Proteinase vi sinh vat duge sit dung dé lam sach to Cée phicong phép tinh sach enzyme “Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim tim, tay to nhan tao (cdc sgi nhan tao duge bang cdc dung dich cazein, gelatin) dé sqi duge duge bing, dé nhudm. Protease ¢é tae dung thay phan lop protein serisin 44 lim dinh bét cae sqi to ty nhién, lim bong va tach roi cac loai to tim, do d6 lam gidm long hod chat dé tay tring, Ngodi ra, protease con dugc ting dung réng rai trong rdt nhiéu nganh khde nhu: ché dich dam thiy phan ding lam chat dinh dudng, chat ting vi trong thyc pham va san xuat mot s6 thite an kiéng. - Protease cia nam méc va vi khuan phéi hyp véi amylase tao thanh hon hgp enzyme ding Lim thite &n gia sitc c6 d6 tigu héa cao, c6 ¥ nghia lon trong chan nudi gia sic va gia cam. - Diéu ché méi trudng dinh dudng ctia vi sinh vat dé sin xuat vaccine, khang sinh... - San xuat keo déng vat, chat giat ting hop dé gidt tay cdc chat ban protein, san xuat my pham,... Cée phicong phép tinh sach enzymeGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim UNG DUNG CAC LOAI ENZYME KHAC TRONG CONG NGHE THUC PHAM Enzyme la mt céng cu dé ché bién cdc phé ligu ciia céng nghigp thyc pham thanh thie an cho ngudi va vat nuéi. Nguoi ta cdn khai théc tinh déng ty nhu cia renin, pepsin vao cong nghiép thye pham nhu trong san xuat phomat, Pectinase véi cong nghiép thye phim: Pectinase da duge dimg trong mot sé nganh céng nghiép thye pham sau: - San xuat rugu vang. - San xudt nude qua va nude udng khong cé rugu. ~ San xuat cac t hing tir qua: qua c6 dc, mitt. - San xudt nuée gidi khat. - San xuat ca phé. é pham pectinase duge sit dyng trong san xuat nude qua tt cdc nguyén ligu qua nghién hay dé lam trong nude qua ép. Boi vi khi cé pectin thi khéi qua nghién sé cé trang thai keo, do d6 khi ép dich qua khéng théat ra dug. Nho pectinase ma nude qua trong suét, dé loc, higu suat tang. Cée phicong phép tinh sach enzyme 46Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Pectinase con gép phan chiét ritt cdc chat mau, tanin va cdc chat hoa tan khac, do dé lam tang chat lugng cia thanh phim. Nhimg nghién citu khi ép nho co xir ly bang pectinase khéng nhimg lam tang higu suat ma con lam ting mau sic. Trong san xuat mit nhit, mitt dong... nho pectinase ma dich qua co ning d9 dim dic hon. Cellulase véi céng nghiép thye phim: Cellulose a thanh phan co ban cia té bao thye vat, vi vay né cé mit trong moi logi rau qua ciing nhu trong cde nguyén ligu,phé ligu cia cdc nganh trong trot va lam nghiép. Nhung ngudi va dng vat khong cé kha ning phan gidi cellulose. Né chi ¢6 gid tri lam ting tiéu hoa, nhung voi lugng Idn no tré nén v6 ich hay can tro tigu héa. Ché pham cellulase thuéng ding dé: - Tang chat long thyc phm va thite an gia stic. - Tang higu suat trich ly cde chat tir nguyén ligu thy vat. Ung dung truce tién cia cellulase 46i véi ché bién thyc pham Ia ding né dé ting d6 hap thu, nang cao pham chat vé vi va lam mém nhiéu loai thyc pham thyc vat. Dac biét 1a d6i v6i thie an cho tré con va noi chung chat lugng thye phim duge tang lén. Cée phicong phép tinh sach enzyme a7Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Mét sO nude da ding cellulase dé xir ly cdc loai rau qua nhu bap cai, hanh, ca rét, khoai tay, t4o va long thye nhu gao. Ngudi ta cdn xir ly ca che, céc logi tao bién. Trong san xuat bia, dui tac dung ctia cellulase hay phic hé citase trong 46 c6 cellulase, thanh té bao cia hat dai mach bj pha huy tao diéu kién t6t cho tac dng cua protease va duéng hoa. Trong san xuat agar-agar, tac dung cia ché phdm cellulase sé lam ting chat lugng agar-agar hon so véi phuong php dig acid dé pha vé thinh t8 bao. Dat biét la vide sir dung ché pham cellulase dé tan thu cdc phé ligu thyc vat dem thoy phan, ding lim thite an gia sue va cng ng! Nhiing tmg dung ciia cellulase trong cong nghiép thye pham da cé két qua rat tét. Tuy nhién han ché lén nbat 1a rat kh6 thu duge ché pham co cellulase hoat 46 cao. Amylase voi céng nghiép thyc phim: Ché phim amylase da duge ding phé bién trong m6t sé lanh vue ctia cong nghiép thyc pham nhu san xuat banh mi, glucose, rugu, bia... Trong san xuat banh mi, ché phim amylase da lim thay déi hoan tan chat lugng cia banh mi ca huong vi, mau sic, d6 xép...Ché phim amylase sach cho chat Iugng banh mi tét hon & dang phitc hgp véi protease. Cée phicong phép tinh sach enzyme aGvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim Trong san xuat banh keo ngudi ta thuéng ding maltose 1a san pham thy phan tinh bét bing amylase va glucose bing glucoamylase. Chinh glucoamylase, la yéu té lam tang higu suat trong san xuat rugu. Trong san xuat bia, viée sir dung amylase co trong cdc hat ndy mim thay thé malt 44 gop phan dang ké trong vigc giam gid thanh. Cée phicong phép tinh sach enzyme “0Gvhd :Ths Ding Thi Nggc Dung Héa Sink Thye phim KET LUAN Cé thé thu nhan enzyme tir dong vat nhu trypsin, chimotrypsin, tir thyc vat nhu papain cia du du, amylase cia dai mach. Nhung enzyme vi sinh vat 1a ngudn phé bién va gid thanh cé y nghia kinh té nat. Protease can thiét cho cdc sinh vat song, rat da dang vé chire nang tir mite d6 té bao, co quan dén co thé nén duge phan bé rat rong rai trén nhiéu déi tugng ti vi sinh vat (vi khuan, va virus) dén thyc vat (du di, dita...) va dong vat (gan, da day bé). Hign cho dén nay khéng cé phuong phap tach sach enzyme chung. Dé xay dung phuong phap va tinh sach enzyme nao d6 can biét phdi hop mdt cach cd higu qua nhat c4c bign php téch va lam sach enzyme khéc nhau. Mie di trong vige xay dyng de phuong phdp méi da dat duge nhiéu thanh tyu van dé tach va lam sach enzyme than khiét van gap nhiéu kho khan, phite tap. Cée phucong phap tinh sach enzyme 50