Bioavailability 

and 
Bioequivalence Studies

Marc Sturgill, Pharm.D.
Assistant Director, Pediatric CRC
UMDNJ‐Robert Wood Johnson Medical School
 Objectives
| Discuss the pharmacokinetic processes that 
determine absolute bioavailability
| Discuss the basic FDA requirements for 
approval of ANDAs submitted by generic drug 
manufacturers
| Discuss the basic study methods for 
bioequivalence
Ž Study design
Ž Statistical analysis
 Bioavailability (F)
| (21 CFR 320.1):  “rate and extent to which the 
active ingredient or active moiety is absorbed from 
a drug product and becomes available at the site of 
action”
| AUC (total amount of unchanged drug that reaches 
the systemic circulation) is used to calculate F 

absolute F =
(Dose IV ⋅ AUCoral ,∞ )
(Doseoral ⋅ AUCIV ,∞ )
 Factors that affect F
| Physical or formulation properties (molecular 
weight, polarity, dissolution rate, stability in 
gastric acid)
| Gastric emptying rate

| Metabolism in intestinal wall (CYP3A4)

| Drug efflux from intestinal wall (Pgp)

| Hepatic first pass metabolism
 Bioequivalence
| (21 CFR 320.1):  “absence of a significant 
difference in the rate and extent to which the 
active ingredient or active moiety in 
pharmaceutical equivalents or pharmaceutical 
alternatives becomes available at the site of 
drug action when administered at the same 
molar dose under similar conditions in an 
appropriately designed study”
 Definitions
| Pharmaceutical alternatives
Ž Same active ingredient
Ž May differ in salt, ester, dosage form or strength
Ž Example:  different dosage forms or strengths within a 
single manufacturers’ product line
| Pharmaceutical equivalents
Ž Same active ingredient, dosage form and strength
Ž Same USP standards (strength, quality, purity, identity)
Ž May differ in shape, color, excipients, release 
mechanism, packaging, labeling and expiration date 
Ž Example:  brand name and generic version of a drug
 Therapeutic equivalents
| Defined by the Drug Price Competition and 
Patent Term Restoration Act of 1984 (Hatch‐
Waxman Act)
Ž Permits pharmaceutical equivalents to be considered 
“therapeutically equivalent” (will have the same 
clinical effect and safety profile)
Ž Allows generic manufacturers to gain FDA approval 
via ANDA (abbreviated NDA) submission
Ž ANDAs do not include pre‐clinical data or proof of 
safety/efficacy; only have to prove bioequivalence
Normal drug approval process
Pre‐clinical testing Clinical trials                 FDA review

reviewer comments
Final approval
Sponsor addresses 
FDA review
FDA review
Synthesis &  Phase I
purification

Phase II
Animal 
testing
Phase III
Short‐term toxicity

Long‐term toxicity

3‐4 years 1 year 1‐2 years 3 years

IND NDA
 Investigational new drug (IND)
| Under the Federal Food, Drug & Cosmetic Act 
no drug can be distributed across state lines 
prior to final FDA approval
Ž IND grants an exemption to the sponsor in order to 
conduct clinical trials
Ž Three types:  Investigator IND, Emergency Use IND, 
Treatment IND
Ž Must include:  (1) animal pharmacology/toxicology; 
(2) manufacturing information; (3) detailed clinical 
testing plan (protocols/investigator qualifications)
 NDA
| Submitted after clinical testing; must include:
Ž “Substantial evidence” of safety and efficacy (results 
of both animal and human testing)
Ž Proposed labeling, package insert
Ž Proof of adequate “Good Manufacturing Practices” to 
maintain USP standards for drug identity, strength, 
quality, and purity
Ž Duration of FDA review
| Regular review must be completed within 12 months
| Fast‐track review is completed within 6 months
 ANDA (generic drugs)
| Active ingredient was already approved under 
the original sponsor NDA
Ž Generic manufacturer only required to demonstrate 
bioequivalence (Phase I)
Ž Typically 24‐36 healthy volunteers in a double‐blind, 
randomized, crossover trial (or trials)
| Single‐dose fasting
| Steady‐state fasting
| Single‐dose fed/fasting
 Study design
| Randomized, two‐sequence, two‐period 
crossover
Ž Treatment sequence is randomized
| Every subjects gets both treatments
| Half get generic drug first, half get brand drug first (minimizes the 
sequence effect)
Ž Crossover design
| Each subject serves as his/her own control (minimizes intersubject
variability)
| Fewer subjects required to achieve adequate statistical power
Ž Treatment periods separated by a washout
| At least 5 drug half‐lives
| Minimizes the carryover (residual) effect
 Sampling of biologic specimens
| Blood (plasma) samples are recommended
Ž 12‐18 samples (including                                           
predose) in each subject,                                     
Cmax
spanning at least 3 drug                                        
elimination half‐lives ln C
slope = λZ
Ž Sampling should be spaced                                       
to allow accurate estimation                                    
of Cmax and λz AUC0‐t

Ž Minimum of 3‐4 samples                                            
during terminal log‐linear                                           time
Tmax
phase to accurately                                             
estimate λz
 Required studies
| Oral solutions, elixirs, syrups, tinctures
Ž Bioequivalence studies are generally waived
| Oral suspensions and immediate‐release solid 
oral dosage forms
Ž Single‐dose fasting (highest strength)
| Extended‐release solid oral dosage forms
Ž Single‐dose fasting (all strengths)
Ž Multiple‐dose steady‐state (highest strength)
Ž Single‐dose fed/fasting (highest strength)
 Single‐dose fasting
| PK parameters to be submitted
Ž Subject, period, sequence, treatment
Ž Plasma concentrations and time points
Ž Measures of systemic exposure (reflect rate and 
extent of absorption):
| Early exposure – partial AUC (truncated at population median Tmax
value)
| Peak exposure – Cmax
| Total exposure – AUC0‐t , AUC∞

Ž Also report Tmax, λZ, t½
| Statistical analysis of AUC0‐t , AUC∞, and Cmax
 Multiple‐dose (steady‐state) 
| PK parameters to be submitted:
Ž Subject, period, sequence, treatment
Ž Plasma concentrations and time points
Ž Total systemic exposure – AUC0‐τ (τ = dosing interval)
Ž Also report 
| Cmax
| Tmax
| Cmin
| Cavg,ss (AUC0‐τ/τ) 
| DFss (degree of fluctuation, or [Cmax – Cmin]/Cavg,ss)
| Swing ([Cmax – Cmin]/Cmin)

| Statistical analysis of AUC0‐τ and Cmax
 Single‐dose fed/fasting
| PK parameters to be submitted
Ž Subject, period, sequence, treatment
Ž Plasma concentrations and time points
Ž Measures of systemic exposure (reflect rate and 
extent of absorption):
| Early exposure – partial AUC (truncated at population median Tmax
value)
| Peak exposure – Cmax
| Total exposure – AUC0‐t , AUC∞

Ž Also report Tmax, λZ, t½
| Statistical analysis of AUC0‐t , AUC∞, and Cmax
 Demonstrating bioequivalence
| Statistical comparison of generic to brand Cmax
and AUC using ANOVA
Ž Evaluates potential confounding effect of 4 factors:
| Sequence (treatment order)
| Period
| Subject
| Treatment (formulation)
Ž Cmax and AUC are log‐transformed prior to analysis
| ANOVA is based on the assumption of normal distribution of data
| Most pharmacokinetic parameters have a skewed distribution (log 
transformation normalizes the distribution)
 80/20 rule
| Enough subjects must be tested to permit 
detection of a 20% difference in                    
log‐transformed parameters with 80% power
Ž Report the following for each parameter (Cmax, AUC0‐t , 
AUC∞, or AUC0‐τ):  arithmetic mean, geometric mean, 
geometric mean ratio (generic/brand) and 90% 
confidence interval (CI)
Ž With log transformation the ± 20% rule translates to a 
mean ratio and 90% CI for each parameter of 80‐125%
 FDA Orange Book
| http://www.fda.gov/cder/ob
| "A" – therapeutically equivalent with no known or anticipated 
bioequivalence problems:  AA (oral), AN (soln/powder for 
aerosolization), AO (injectable oil), AP (injectable aqueous 
soln), AT (topical)
| "AB" – recognized as therapeutically equivalent based on 
ANDA approval
| "B" – not yet proven therapeutically equivalent:  B* (require 
further FDA review), BX (therapeutically inequivalent), BC 
(extended‐release caps/tabs/injectables), BD (known 
bioequivalence problems), BE (oral delayed‐release), BN 
(soln/powder for nebulization), BP (potential bioequivalence 
problems), BR (suppositories/enemas), BS (drug standard 
deficiencies), BT (topical) 
 Example
| In a single‐dose randomized, crossover study 
6 healthy volunteers are each given a 50 mg 
oral dose of a generic drug (Treatment A) and 
its brand name reference drug (Treatment B). 
Cmax and AUC0‐t values are given below.  For 
each parameter, calculate the mean ratio and 
90% confidence interval.  Based on these 
criteria, does the generic drug meet the 
requirements for bioequivalence?  
 Evaluation of Cmax
Treatment A Treatment B Difference
Subject Cmax (ng/mL) ln Cmax Cmax (ng/mL) ln Cmax (ln Cmax A – ln Cmax B)
1 11.4 2.4336 12.9 2.5572 ‐0.1236
2 10.6 2.3609 10.1 2.3125 0.0484
3 12.1 2.4932 9.4 2.2407 0.2525
4 11.7 2.4596 11.2 2.4159 0.0437
5 11.2 2.4159 10.8 2.3795 0.0364
6 12.1 2.4932 12.3 2.5096 ‐0.0164
Mean 0.0402
SD 0.1226
SEM 0.0501

mean Cmax ratio = 100 ⋅ e(mean ln Cmax difference) =  100 ⋅ e(0.0402) =  104.09

(mean ln Cmax difference ± tdf,0.05 ⋅ SEMdifference)
90% CI = 100 ⋅ e                                                           =  93.76 to 115.56

(1)  degrees of freedom (df) = # of groups ⋅ # of treatments ⋅ (n – 1) = 2⋅2⋅(6‐1) = 20

(2)  at alpha = 0.05 and 20 df, t = 2.086
(3)  lower limit = 100 ⋅ e[0.0402 – (2.086 ⋅ 0.0501)] =  93.76
(4)  upper limit = 100 ⋅ e[0.0402 + (2.086 ⋅ 0.0501)] =  115.56
 Evaluation of AUC0‐t
Treatment A Treatment B Difference
Subject AUC0‐t (ng⋅hr/mL) ln AUC0‐t AUC0‐t (ng⋅hr/mL) ln AUC0‐t (ln AUC0‐t A – ln AUC0‐t B)
1 154.3 5.0389 140.2 4.9431 0.0958
2 166.1 5.1126 147.2 4.9918 0.1208
3 151.7 5.0219 160.2 5.0764 ‐0.0545
4 155.8 5.0486 142.2 4.9572 0.0914
5 161.7 5.0857 150.7 5.0153 0.0704
6 144.4 4.9726 154.7 5.0415 ‐0.0689
Mean 0.0425
SD 0.0824
SEM 0.0336

(mean ln AUC0‐t difference)

mean AUC0‐t ratio = 100 ⋅ e                                    =  104.34
(mean ln AUC0‐t difference ± tdf,0.05 ⋅ SEMdifference)
90% CI = 100 ⋅ e                                                             =  97.28 to 111.92

(1)  df = 2⋅2⋅(6‐1)  =  20
(2)  at alpha = 0.05 with 20 df, t = 2.086
(3)  lower limit = 100 ⋅ e[0.0425 – (2.086 ⋅ 0.0336)] = 97.2788 
(4)  upper limit = 100 ⋅ e[0.0425 + (2.086 ⋅ 0.0336)] = 111.9173
 References
| Bioavailability and bioequivalence. In: Shargel L, Andrew Y, 
eds. Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, 4th ed. 
Stamford, CT:Appleton & Lange, 1999:247‐79.
| Guidance for industry: bioavailability and bioequivalence 
studies for orally administered drug products – general 
considerations. Rockville, MD:U.S. DHHS, 2003: 1‐23.
| Statistical tests for bioequivalence. In: De Muth JE, ed. Basic 
Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications. New 
York: Marcel Dekker, Inc., 1999: 497‐528.
| From idea to market: the drug approval process. J Am Board 
Family Med 2001;14(5)