Khoá Luận Tốt Nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM

HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ
NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI
Thành phố Hồ Chí Minh

- 2007 -
iii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM

HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN
BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ
NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI
Thành phố Hồ Chí Minh

- 2007 -
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá
trình học tại trường.
TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua.
Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng.
Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi
trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua.
Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia
đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện
Bùi Thị Phi
iii
TÓM TẮT
BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP,
KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH
ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC"
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế
phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi,
chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không
sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường
nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian
bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus
subtilis. Kết quả chúng tôi có được:
Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục
khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme
(amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi
ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ
đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột)
đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt
độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại.
Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của
các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ
enzyme của vi khuẩn tốt nhất.
Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C
trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm.
iv
ABSTRACT
A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase,

protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the
results had showed:
We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase,
protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation.
The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with
sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust +
1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7
for 48 hours culture.
Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C.
v
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iv
ABSTRACT ...............................................................................................................v
MỤC LỤC ................................................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................x
DANH SÁCH SƠ ĐỒ.............................................................................................. xi
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .....................................................................................................1
1.2. Mục đích đề tài .............................................................................................2
1.3. Yêu cầu đề tài ...............................................................................................2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN .........................................................................................3
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ...........................................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện ...................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................4
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá .................................................................................5
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ..............6
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................6
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử .......................................................................6
2.1.7. Tính chất đối kháng ..............................................................................6
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease .....................................7
2.3.1. Enzyme amylase ...................................................................................7
2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................7
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase ..................................................................7
2.3.1.3. Đặc tính của amylase .....................................................................8
vi
2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................10
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase .......10
2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật .....................................................11
2.3.2. Enzyme protease .................................................................................11
2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease................................................11
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ...........................12
2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ...............................13
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của
vi sinh vật .....................................................................................................14
2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật ....................................................14
2.3. Giới thiệu về probiotic................................................................................15
2.4.1. Định nghĩa ...........................................................................................15
2.4.2. Chức năng sinh học .............................................................................15
2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng ..............................................15
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn
Bacillus subtilis .....................................................................................................16
Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................18
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................18
3.1.1. Thời gian .............................................................................................18
3.1.2. Địa điểm ..............................................................................................18
3.2. Vật liệu thí nghiệm .....................................................................................18
3.2.1. Đối tượng khảo sát ..............................................................................18
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...........................................................18
3.2.2.1. Thiết bị .........................................................................................18
3.2.2.2. Dụng cụ: ......................................................................................18
3.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................19
3.4. Phương pháp thực hiện đề tài .....................................................................19
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ...........................................19
3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn .......................................19
vii
3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................19
3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............20
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................21
3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis..........................................21
3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis .............................................................................................22
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất
enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ......................................................23
3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus
subtilis .............................................................................................................25
3.4.3.1. Quy trình thực hiện ......................................................................25
3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản ..............................25
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................26
4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................26
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................26
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis..........26
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................27
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến
khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. ..................29
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi
khuẩn Bacillus subtilis ..........................................................................................31
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các
chủng Bacillus subtilis ..........................................................................................33
4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất .........34
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................36
5.1. Kết luận ......................................................................................................36
5.2. Đề nghị .......................................................................................................36
PHỤ LỤC ..................................................................................................................40
viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 ...................................................................................21
Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá ................................................................ 29
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2).............................................29
Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm ...31
Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. ..............32
Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất ....................33
Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm ..................................34
ix
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................... 3
Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis .......................................................26
Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .........................................27
x
DANH SÁCH SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất................................................20
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21
xi
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa
học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh
thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi
những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu
cầu của người tiêu dùng.
Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế
hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc
kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là
“probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi
được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường
ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo
con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá
(nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men
của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu
khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế
phẩm sinh học”.
1
1.2. Mục đích đề tài
Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất
chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả
kinh tế trong chăn nuôi.
1.3. Yêu cầu đề tài
Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm.
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian
bảo quản.
2
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,
thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis

www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba...
3
 Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất
trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,
vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng
như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G + , kích thước
0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động,
có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế
bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của
bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ (Tô Minh Châu, 2000).
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy

 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C
 Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
 Môi trường
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
4
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh indol -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005).
5
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các
chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là
một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi
chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý.
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành
bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi
(dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.7. Tính chất đối kháng

Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh
6
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.3.1. Enzyme amylase

2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme
amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu
này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông
nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm
(malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường.
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,
trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất và phương
pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase
(γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase).
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase
Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men
và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các
giống vi sinh vật sau:
Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus.
Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975;
Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961).
Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium
acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh
trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương
đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.
Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu
7
và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục
nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C.
2.3.1.3. Đặc tính của amylase
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase,

β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của
tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase,
amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase)
thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính
chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.
 α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng
ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase.
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột
còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể
chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên,
α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh
bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng,
α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị
kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg2+. So với α-amylase của nấm mốc,
amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa.
8
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ
tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh
bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và
Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn
α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%.
pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của
vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500C.
Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase
của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu
điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao.
 β-amylase
β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.
β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào.
β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy
mầm). Vi khuẩn không có β-amylase.
 Glucoamylase
Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 - glucan
trong polysaccharide.
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hòan toàn tinh bột, glucogen,
amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH 3,5 – 5.
Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu
etylic, aceton.
9
2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong
bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào
được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:

Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối
thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh
bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi
trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon,
nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi
lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi
sinh vật.
Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác.
Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase
khỏi tác động của protease.
10
Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase.
Coban kích thích tổng hợp amylase.
Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.
 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase:
Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng
không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào
đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α–
amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với
sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase.
Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự
sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật.
2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp
nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công
nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung
vào khẩu phần chăn nuôi.
2.3.2. Enzyme protease

2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có
thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease
ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với
protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công
nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông
nghiệp, y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
11
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi
sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt
động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau:
Protease – xerin
Protease – tiol
Protease – kim loại
Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin
vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có
trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton.
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc
trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham
gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là
12
trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các
protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E+S E–S E – S * + P1 E + P2
Trong đó:
E – là enzyme, S – là cơ chất.
E – S : là phức chất enzyme – cơ chất
E – S* : là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme)
P1 : là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới
được tạo thành)
P2 : là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới
được tạo thành).
2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các
protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể
hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid
amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này
có thể có ‎nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội
bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,
13
hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh
Cẩm Ngọc, 2005).
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông
thoáng, thành phần môi trường...
Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng
hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các
vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh
chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt,
pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa
pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật.
Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích
luỹ protease trong môi trường.
Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá
trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống
vi sinh vật.
Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng
rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi
trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp.
2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật
 Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp
thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá,
thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh.... Ngoài ra protease
còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt, ...
14
có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng
chữa viêm lợi.
 Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản
xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá
kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh
nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ
viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy
vi sinh vật.
 Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức
ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm
2.3. Giới thiệu về probiotic
2.4.1. Định nghĩa

Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như
một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua
việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột.
2.4.2. Chức năng sinh học

Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống
enzyme.
Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng.
Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính.
Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột.
2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng

Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng
khác nhau như:
ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie .
15
VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng.
Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN,
UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA.
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus
subtilis
 Trong nông nghiệp:

Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis
trong nông nghiệp được tiến hành như sau:
Chăn nuôi:
Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm
Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con.
Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc
Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng.
Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc,
nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic.
Trồng trọt:
Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm
Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae... ngoài ra còn ứng dụng nhiều
trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch.
Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm
sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại
nấm bệnh trên rau cải.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà
Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia
furnacalis trên bắp.
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm
kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm
mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus.
16
Kháng sinh:
Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác
dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr- (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
17
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
3.1.1. Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007.
3.1.2. Địa điểm

Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tƣợng khảo sát

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
3.2.2.1. Thiết bị
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex),
lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …
3.2.2.2. Dụng cụ
Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri,
micropipete, giá ống nghiệm, …
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch,
bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút.
18
3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản.
3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở
dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô
trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1.
3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự
từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có
nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được
nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn
các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ
mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và
trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở
370C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc
nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống
lại trên môi trường TSA nghiêng.
19
Mẫu đất
Đồng nhất và pha loãng
mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00
Dd pha loãng mẫu 10-1

Lần lượt pha loãng được
các nồng độ tiếp theo
Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA
ủ ở 370C/ 24h
Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh
hoá
Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng
Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc
Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi.

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan
sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình
dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát
dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi
khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn
lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục
nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá
để khẳng định.
Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được.
20
Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi
Thử phản ứng sinh hóa
Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+),
Citrat (+), Maltose (-).
Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006)
3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis
3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất.
Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1
Chế độ sục
Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí
Thời khí
Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ
gian
amylase protease amylase protease
24 giờ
48 giờ
 Cách làm:
Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa
4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để
cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô.
Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi
trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với
21
thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy
mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt
độ phòng, sau đó đọc kết quả.
Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy
khác nhau.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa
chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn
Bacillus subtilis
 Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí
nghiệm 1.
 Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước
muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử
nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ
đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát:
Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Tỉ lệ giống 3%
pH = 6
Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1.
Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth.
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld.
22
Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn
môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo.
Hoạt độ enzyme
Môi trƣờng Hoạt độ enzyme
amylase
protease
Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2

Rỉ đường + 2%
tinh bột
Rỉ đường + 1%
tinh bột
Rỉ đường + 1%
tinh bột + 0,5%
pepton
TSB + 1% tinh
bột
23
3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme
của các chủng Bacillus subtilis
 Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở
thí nghiệm 1.
 Cách làm:
Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước
muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục.
Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí
nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn
ở thí nghiệm 1.
Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần).
pH 6,0 7,0
Hoạt độ enzyme
Thời gian
24h
48h
 Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus
subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
24
3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ
Bacillus subtilis
3.4.3.1. Quy trình thực hiện
Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1
Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn
Thời gian 48h, nhiệt độ 370C
Môi trường sản xuất: cám gạo
Thu hoạch
chế phẩm
Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C
Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase
3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản
Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày,
20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng.
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0.
25
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis
Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ,
quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có
bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm
màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân
lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm
hình thái.
Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc

Bacillus subtilis
4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis
Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng
đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái
giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ,
hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi
ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng.
26
Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Bacillus subtilis
(www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg)
4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là
Bacillus subtilis
Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis
được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở
bảng 4.1.
Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định
được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí
nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi
trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
phân lập được.
27
Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập
Chủng Các phản ứng sinh hóa

phân lập Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose
1 + + + + +
2 + + + + +
3 + + + + +
4 + + + + +
5 + + + + +
6 + + + + +
7 + + + + +
8 + + + + +
9 + + + + +
10 + + + + +
11 + + + +
12 + + + +
13 + + + +
14 + + + +
15 + + + +
16 + + + +
17 + + + +
18 + + + +
19 + + +
20 + + +
21 + + +
Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính

(-) là phản ứng âm tính
28
4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến
khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis phân lập đƣợc
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10.
Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai
chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ
phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme
amylase và protease với kết quả như sau:
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)
Chế độ sục khí Lô 1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí
(n = 18) (n = 18)
Thời gian Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ
(W0/ml) (Hdp/ml) (W0/ml) (Hdp/ml)
24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44
48 giờ 47,11 40 25,78 8
Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72
Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai
loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung
bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự
khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ
lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi
khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục
khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt).
29
Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai
loại enzyme giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ) (với P < 0,05) (Phụ
lục A). Theo kết quả của chúng tôi khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis ở 48 giờ
với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điều kiện nuôi cấy
sục khí liên tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxy
càng nhiều thì chúng phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme.
Cũng theo kết quả thống kê: có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy (cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng:
chủng 2 – 5, chủng 2 – 6, chủng 2 – 8, chủng 1 - 9, chủng 4 - 9,...).
Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme
trong cùng một chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxy một số
chủng này phát triển tốt hơn và ở chế độ không cung cấp oxy một số chủng khác lại
phát triển tốt hơn. Điều này cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giữa các
chủng.
Từ các kết quả có được như trên, chúng tôi quyết định chọn chế độ sục khí
liên tục trong thời gian 48 giờ và chọn 4 chủng: 2, 7, 9, 10 trong 9 chủng phân lập
được để tiếp tục khảo sát hoạt độ của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy
khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo.
30
Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn
thí nghiệm
Chủng vi Hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme Hoạt độ trung bình
khuẩn amylase (W0/ml) protease (Hdp/ml) của 2 loại enzyme
24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ amylase protease
1 40 48 16 32 44 24
2 64 56 24 32 60 28
4 40 48 20 32 44 26
5 32 48 20 32 40 26
6 32 40 24 40 36 32
7 32 48 56 48 40 52
8 32 40 32 32 36 32
9 48 48 64 56 48 60
10 32 48 40 56 40 48
4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi
khuẩn Bacillus subtilis
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus
subtilis trên 4 loại môi trường: rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ
đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và
điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cấy giống là 3%, sục khí liên tục trong 48
giờ (mỗi chủng 4 loại môi trường) (thí nghiệm lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày
qua bảng 4.4.
31
Bảng 4. 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn.
Hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme
Môi trường amylase protease
(W0/ml) (Hdp/ml)
Rỉ đường + 2% tinh bột
(1) 26 30
(n = 8)
18,5 22
(2)
(n = 8)
+ 0,5% pepton (3)
(n = 8) 20 32
TSB + 1% tinh bột (4)

14,5 20
(n = 8)
Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis,
chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường + 2% tinh bột có hoạt độ enzyme
trung bình cao hơn hoạt độ enzyme trung bình trên các môi trường rỉ đường + 1%
tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột.
Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên
(cụ thể là có sự khác biệt giữa các môi trường: 1 - 2, 1 - 4, 2 - 3, 3 - 4) (Phụ lục B)
và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P < 0,05) (Phụ lục B).
Theo Nguyễn Đức Duy Anh, (2005): trong 5 loại môi trường nhân giống cấp
1 (Edward, Fragie, Nomura, pepton - gelatin, rỉ đường + 2% tinh bột) thì môi
trường rỉ đường + 2% tinh bột cũng cho kết quả tốt nhất nhưng hoạt độ của cả hai
loại enzyme đều rất cao (amylase: 256 W0/ml, protease: 128 Hdp/ml) so với hoạt độ
enzyme của môi trường rỉ đường + 2% tinh bột trong thí nghiệm này (amylase: 26
W0/ml, protease: 30 Hdp/ml). Sự chênh lệch hoạt độ enzyme trong cùng một loại
môi trường này có thể là do sử dụng hai nguồn vi khuẩn khác nhau, lượng giống
cho vào với tỉ lệ khác nhau.
32
Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn môi trường rỉ đường + 2% tinh
bột để tiến hành khảo sát ở thí nghiệm tiếp theo.
4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của
các chủng Bacillus subtilis
Dựa trên các kết quả có được ở các thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành
nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường rỉ đường + 2%
tinh bột ở hai điều kiện pH khác nhau: pH = 6 và pH = 7, thời gian khảo sát là
24 giờ, 48 giờ, với tỉ lệ giống 3%, nhiệt độ phòng (mỗi chủng nuôi ở hai pH khác
nhau). Kết quả được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme
của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
pH
6,0 7,0
Thời gian Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ
24 giờ
27 13 32 18
(n = 8)
48 giờ
32 18 36 18
(n = 8)
Qua kết quả khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất
enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ở bảng 4.5 chúng tôi thấy ở
pH = 7 thì hoạt độ enzyme trung bình của vi khuẩn cao hơn so với pH = 6 và ở thời
gian nuôi cấy là 48 giờ hoạt độ enzyme cũng cao hơn khi nuôi ở 24 giờ (kết quả này
phù hợp với kết quả về thời gian nuôi cấy ở thí nghiệm 1).
Tuy nhiên kết quả xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa hai
điều kiện pH và thời gian ở cả hai loại enzyme (amylase, protease) và cũng không
có ý nghĩa về mặt thống kê bởi vì mức ý nghĩa của hai loại enzyme đều lớn hơn
mức ý nghĩa cho phép (Pamylase = 0,055 > 0,05 và Pprotease= 0,215 > 0,05) (Phụ lục C).
33
4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất
Sau khi đã lựa chọn được 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi tiến
hành nuôi tăng sinh trong môi trường TSB, sau đó trộn với cám gạo để thử nghiệm
thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản sau khi thành chế phẩm của vi khuẩn
Bacillus subtilis.
Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 - 100C) và ở nhiệt độ phòng
(30 - 370C) trong thời gian là 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm
Nhiệt độ 4 - 100C 30 - 370C

Thời gian amylase protease amylase protease
0 ngày 56 38 56 38
10 ngày 5,25 0,0 4,75 0,0
20 ngày 5,25 0,0 4,25 0,0
30 ngày 5,0 0,0 4,5 0,0
Từ kết quả ở bảng trên cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh thì hoạt độ
của hai loại enzyme cao hơn so với điều kiện bảo quản thường. Hoạt độ của hai loại
enzyme này giảm rất nhanh (hơn 10 lần) chỉ sau 10 ngày bảo quản.
Ở kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy kết quả cụ thể cho từng loại
enzyme. Với enzyme amylase kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa
về mặt thống kê giữa hai nhiệt độ bảo quản (với P = 0,0026 < 0,05), còn với thời
gian bảo quản có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 0 ngày với các khoảng thời gian còn
lại (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Riêng với enzyme protease kết quả thống kê
cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhiệt độ bảo quản này
(với P = 1,000 > 0,05) và ở thời gian bảo quản cũng có kết quả tương tự như đối với
34
enzyme amylase, đó là chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa khoảng
thời gian là 0 ngày với 10, 20, 30 ngày (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D).
Qua những kết quả ở trên, do có sự giảm đáng kể của cả hai loại enzyme
chỉ trong khoảng thời gian 10 ngày bảo quản, trong khảo sát của chúng tôi cho thấy
cám gạo không phải là chất nền thích hợp cho chế phẩm enzyme amylase, đặc biệt
với enzyme protease lại càng không thích hợp.
35
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau một khoảng thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi có những kết luận sau:
Phân lập được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất.
Chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và cho
enzyme tốt hơn
Môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3
loại môi trường còn lại.
pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ thì hoạt độ enzyme của vi khuẩn là tốt nhất.
Trong chất nền thử nghiệm cám gạo, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 4 – 100C hoạt
độ của enzyme amylase bảo toàn tốt hơn ở nhiệt độ
30 – 370C, riêng về thời gian bảo quản hoạt độ của hai loại enzyme có sự thay đổi lớn từ
0 ngày đến 10 ngày, còn từ 10, 20, 30 ngày thì không có sự thay đổi hoạt độ enzyme.
5.2. Đề nghị
Cần phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ nhiều nguồn
khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất.
Cần khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hai
loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Thử nghiệm nhiều loại môi trường sản xuất khác nhau để có được môi
trường sản xuất thích hợp nhất cho vi khuẩn.
Tìm kiếm chất nền thích hợp cho việc bảo quản enzyme amylase và
protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm.
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 74 trang.
2. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế
phẩm probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử
nghiệm. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM.
3. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của
vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, Khoa
Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
4. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ
sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
5. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và
tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm
Probiotic. LVTN, khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM
6. Vũ Thị Thứ, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng
của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận án phó tiến sĩ
khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới.
37
7. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Tủ sách trường
Đại học Nông Lâm TP.HCM.
8. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ
đất và khảo sát khả năng sử dụng các chủng phân lập được trong xử lý
nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y.
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
9. Nguyễn Duy Khánh, 2006. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi
khuẩn Bacillus subtilis. LVTN, khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại
học Nông Lâm TP.HCM.
10. Lê Đỗ Mai Phương, 2004. Phân lập và giám định vi khuẩn Bacillus
subtilis trong tự nhiên, bước đầu khảo sát khả năng sinh enzyme amylase
và enzyme protease. LVTN, trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM.
11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1976. Vi sinh vật gây bệnh thú y tập 1, 2, 3. NXB
Nông nghiệp Hà Nội.
12. Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976. Một số phương pháp
nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.
13. Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ sản xuất mì
chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản khoa học kỹ
thuật.
14. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ
sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Viện
Khoa học Nông Nghiệp và Kỹ Thuật Miền Nam.
38
15. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y tập I. Nhà xuất bản đại học
và trung học chuyên nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
16. Trần Linh Thước, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục.
17. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản khoa học
kỹ thuật, Hà Nội.
18. Nguyễn Văn Đông, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn
Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng và trị bệnh tiêu
chảy heo con. LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y. Trường Đại học Nông Lâm
TP.HCM.
Tài liệu tham khảo trên internet

19. www.sciencebuddies.org/.../MicroBio_img_004.jpg
20. www.fam.br/microrganismos/bacteriologia_bacil...
21. www.mbc.ntu.edu.tw/faculty/LeeKT/fig3.jpg
22. www.biol.pmf.hr/e-skola/odgovori/odgovor451.htm
23. www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba...
39
PHỤ LỤC
Phụ lục 1
Bảng phụ lục 1: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi sục khí
Lần 1 Lần 2
Chủng Hoạt độ
Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ
vi amylase
amylase protease protease
khuẩn (W0/ml) (Hdp/ ml)
(W0/ ml)
(Hdp/ ml)
24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ
1
32 64 16 32 48 32 16 32
2 64 64 24 32 64 48 24 32
4 32 64 16 32 48 32 24 32
5 32 64 16 32 32 32 24 32
6 32 48 32 32 32 32 16 48
7 32 48 48 64 32 48 64 32
8 32 32 32 32 32 48 32 32
9 32 48 64 64 64 48 64 48
10 32 48 48 64 32 48 32 48
Bảng phụ lục 2: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi không sục khí
Lần 1 Lần 2
Chủng Hoạt độ
Hoạt độ Hoạt độ Hoạt độ
vi amylase
amylase protease protease
khuẩn (W0/ml) (Hdp/ ml)
(W0/ ml)
(Hdp/ ml)
24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ
1 16 32 12 8 12 24 4 12
2 16 32 12 8 12 24 4 12
4 16 32 12 8 12 24 6 12
5 12 24 4 4 12 24 4 8
6 16 24 4 4 16 24 4 4
7 12 24 4 4 16 24 4 12
8 12 24 4 4 16 24 4 12
9 16 24 4 4 16 24 4 12
10 16 24 4 4 16 32 4 12
Bảng phụ lục 3: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong 4 loại môi trƣờng
Hoạt độ enzyme amylase

Hoạt độ enzyme protease
Môi trƣờng
Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn
2 7 9 10 2 7 9 10
Rỉ đường +
28 28 24 24 32 32 32 24
2% tinh bột
Rỉ đường +
18 18 18 20 24 16 24 24
1% tinh bột
Rỉ đường +
1% tinh bột 20 20 20 20 32 32 32 32
+0,5%pepton
TSB + 1%
14 14 16 14 20 20 20 20
tinh bột
Bảng phụ lục 4: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3
6,0 7,0
pH
Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn
Thời
gian 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10
24 giờ
28 24 28 28 12 12 12 16 32 32 32 32 24 16 16 16
(n = 8)
48 giờ
32 32 32 32 24 16 16 16 32 48 32 32 24 16 16 16
(n = 8)
 A. Điều kiện sục khí và thời gian nuôi cấy
Analysis of Variance for PHI1.ketquaa - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI1.CON 1023.1111 8 127.8889 1.612 .1558
B:PHI1.dksuckhi 9522.0000 1 9522.0000 120.025 .0000
C:PHI1.thoigian 1682.0000 1 1682.0000 21.202 .0000
INTERACTIONS
AB 792.00000 8 99.000000 1.248 .3007
AC 264.00000 8 33.000000 .416 .9038
BC 50.00000 1 50.000000 .630 .4409
ABC 296.00000 8 37.000000 .466 .8715
RESIDUAL 2856.0000 36 79.333333

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 16485.111 71
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Analysis of Variance for PHI1.ketquap - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI1.CON 2570.000 8 321.250 7.292 .0000
B:PHI1.dksuckhi 15901.389 1 15901.389 360.939 .0000
C:PHI1.thoigian 420.500 1 420.500 9.545 .0039
INTERACTIONS
AB 3209.1111 8 401.13889 9.105 .0000
AC 326.0000 8 40.75000 .925 .5078
BC 93.3889 1 93.38889 2.120 .1541
ABC 485.1111 8 60.63889 1.376 .2398
RESIDUAL 1586.0000 36 44.055556

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.dksuckhi

-------------------------------------------------------------------------
-------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 36 20.111111 X
1 36 43.111111 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
contrast difference limits
0 - 1 -23.0000 4.25873 *
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference.
Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.thoigian
-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 36 26.777778 X
48 36 36.444444 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 - 48 -9.66667 4.25873 *
-------------------------------------------------------------------------
-------
Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.dksuckhi

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 36 6.722222 X
1 36 36.444444 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 - 1 -29.7222 3.17361 *
-------------------------------------------------------------------------
-------
Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.thoigian

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 36 19.166667 X
48 36 24.000000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 - 48 -4.83333 3.17361 *
-------------------------------------------------------------------------
-------
 B. Loại môi trƣờng nuôi cấy
Analysis of Variance for PHI2.kqa - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI2.con 2.00000 3 .66667 .023 .9951
B:PHI2.moitruong 546.00000 3 182.00000 6.276 .0051
INTERACTIONS
AB 42.000000 9 4.6666667 .161 .9956
RESIDUAL 464.00000 16 29.000000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Analysis of Variance for PHI2.kqp - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI2.con 32.00000 3 10.66667 .267 .8484
B:PHI2.moitruong 832.00000 3 277.33333 6.933 .0033
INTERACTIONS
AB 160.00000 9 17.777778 .444 .8906
RESIDUAL 640.00000 16 40.000000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple range analysis for PHI2.kqa by PHI2.moitruong

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
4 8 14.500000 X
2 8 18.500000 X
3 8 20.000000 X
1 8 26.000000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
1 - 2 7.50000 5.70944 *
1 - 3 6.00000 5.70944 *
1 - 4 11.5000 5.70944 *
2 - 3 -1.50000 5.70944
2 - 4 4.00000 5.70944
3 - 4 5.50000 5.70944
-------------------------------------------------------------------------
-------
* denotes a statistically significant difference
Multiple range analysis for PHI2.kqp by PHI2.moitruong
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
4 8 20.000000 X
2 8 22.000000 X
1 8 30.000000 X
3 8 32.000000 X
--------------------------------------------------------------------------------
1 - 2 8.00000 6.70539 *
1 - 3 -2.00000 6.70539
1 - 4 10.0000 6.70539 *
2 - 3 -10.0000 6.70539 *
2 - 4 2.00000 6.70539
3 - 4 12.0000 6.70539 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference
 C. Điều kiện pH và thời gian nuôi cấy

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI3.con 54.00000 3 18.00000 .474 .7049
B:PHI3.ph 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555
C:PHI3.thigian 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555
INTERACTIONS
AB 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038
AC 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038
BC 2.00000 1 2.000000 .053 .8239
ABC 54.00000 3 18.000000 .474 .7049
RESIDUAL 608.00000 16 38.000000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI3.con 198.00000 3 66.000000 2.200 .1278
B:PHI3.ph 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150
C:PHI3.thigian 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150
INTERACTIONS
AB 38.000000 3 12.666667 .422 .7396
AC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396
BC 50.000000 1 50.000000 1.667 .2150
ABC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396
RESIDUAL 480.00000 16 30.000000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.ph
-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
6 16 29.500000 X
7 16 34.000000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
6 - 7 -4.50000 4.62137
-------------------------------------------------------------------------
-------
Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.thigian

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 16 29.500000 X
48 16 34.000000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
24 - 48 -4.50000 4.62137
-------------------------------------------------------------------------
-------
 D. Thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI5.con 279.500 3 93.167 248.444 .0000
B:PHI5.nhietdobq 4.000 1 4.000 10.667 .0026
C:PHI5.thoigianbq 31417.000 3 10472.333 27926.222 .0000
INTERACTIONS
AB 3.50000 3 1.166667 3.111 .0400
AC 772.50000 9 85.833333 228.889 .0000
BC 2.00000 3 .666667 1.778 .1712
ABC 4.50000 9 .500000 1.333 .2592
RESIDUAL 12.000000 32 .3750000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:PHI5.con 432.000 3 144.0000 2.250 .1015
B:PHI5.nhietdobq .000 1 .0000 .000 1.0000
C:PHI5.thoigianbq 17328.000 3 5776.0000 90.250 .0000
INTERACTIONS
AB .0000 3 .00000 .000 1.0000
AC 1296.0000 9 144.00000 2.250 .0443
BC .0000 3 .00000 .000 1.0000
ABC .0000 9 .00000 .000 1.0000
RESIDUAL 2048.0000 32 64.000000

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.thoigianbq

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
20 16 4.750000 X
30 16 4.750000 X
10 16 5.000000 X
0 16 56.000000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
0 - 10 51.0000 0.44111 *
0 - 20 51.2500 0.44111 *
0 - 30 51.2500 0.44111 *
10 - 20 0.25000 0.44111
10 - 30 0.25000 0.44111
20 - 30 0.00000 0.44111
-------------------------------------------------------------------------
-------
Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.nhietdobq

-------------------------------------------------------------------------
-------
-------------------------------------------------------------------------
-------
30 32 17.375000 X
4 32 17.875000 X
-------------------------------------------------------------------------
-------
4 - 30 0.50000 0.31191 *
-------------------------------------------------------------------------
Phụ lục 2:
 Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA)

Thành phần g/l
Soy pepton 15 g
Tryptone peptone 5g
NaCl 5g
Agar 18 g
Nước cất 1000 ml
pH 7,3 ± 0,2
Cân 30 g bột môi trường TSB + 18 g agar cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi
cho hòa tan. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C/ 15 phút.
 Môi trƣờng Tryticase Soya Broth (TSB)
Thành phần g/l
Soy pepton 15 g
Tryptone peptone 5g
NaCl 5g
pH 7,3 ± 0,2
Cân 30 g bột môi trường TSB cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi cho hòa
tan. Đem hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.
 Môi trƣờng Clark lubs
Thành phần g/l
Pepton bột 7g
Glucose 5g
KH2PO4 5g
pH 6,7 – 7,1
 Môi trƣờng lên men các loại đƣờng

Thành phần g/l
Cao thịt 5g
Pepton bột 10 g
Đường 10 g
Phenol red 0,01 g
pH 7,4
Hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.
 Môi trƣờng Simons Citrate Agar
Thành phần g/l
Sodium citrate 2g
K2HPO4 1g
MgSO4 0,2 g
Brothymol blue 0,08 g
NaCl 5g
NH4H2PO4 1g
Agar 18 g
pH 6,9 ± 0,2
 Môi trƣờng khử Nitrate
Thành phần g/l
Cao thịt 3g
Pepton bột 5g
NaNO3 1g
Agar 7g
pH 7,0 ± 0,2
 Môi trƣờng Lòng đỏ trứng

Thành phần g/l
Cao thịt 1g
Pepton bột 10 g
Mannitol 10 g
NaCl 10 g
Phenol red 0,0025 g
Agar 15 g
pH 7,2 ± 0,2
Chia 225 ml môi trường vào bình tam giác. Khử trùng ở 1210C/15 phút.
Khi môi trường nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều
rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng.
Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng trứng bên
ngoài bằng cồn. Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào
bucher có chứa 25 - 30 ml nước muối sinh lí vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở
40C để dùng.
 Môi trƣờng Rỉ đƣờng + 2% Tinh bột
Thành phần g/l
KH2PO4 20 g
K2HPO4 20 g
MgSO4 0,5 g
(NH)4SO4 40 g
Tinh bột 20 g
pH 5–6
 Môi trường rỉ đường + 1% Tinh bột, môi trường rỉ đường 1% tinh bột + 0,5%
peptone tương tự như môi trường rỉ đường + 2% tinh bột, chỉ thay đổi tỉ lệ tinh
bột cho vào.
 Môi trƣờng TSB + 1% Tinh bột
Thành phần g/l
Soy pepton 15 g
Tryptone peptone 5g
NaCl 5g
Tinh bột 10 g
pH 7,3 ± 0,2
 Hóa chất
Nước muối sinh lí 9%o
NaCl 9g
Dung dịch Iod 0,02N
Cân 2 g KI hòa tan trong 3 ml nước cất, lắc đều cho tan, them nước cất vào
cho đến 100 ml
Dung dịch tinh bột 0,1%
Tinh bột 0,1 g
Nước cất thêm đến 100 ml
Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất đang sôi,
khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml.
Dung dịch casein 0,1%
Casein 0,1 g
NaOH 0,1N 5 ml
Nước cất 25 ml
Đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh
pH = 8. Thêm nước cất để đủ 100 ml.
Nước muối 0,1%
Cân 0,1 g muối NaCl hòa tan trong 100 ml nước cất.
Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol
Acid acetic đặc 1 ml
Nước cất 49 ml
Ethanol 96% 50 ml
Hòa tan acid acetic đặc trong nước cất và ethanol.
 Phƣơng pháp nhuộm Gram
Các bước tiến hành :
Phết canh khuẩn lên miếng lam
Cố định mẫu bằng cách hơ qua ngọn đèn cồn
Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn
Nhuộm bằng crystal violet trong 2 phút
Rửa nước, thấm khô
Cố định màu bằng lugol trong 1 phút
Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây
Nhuộm màu bằng dung dịch Fuchsine kiềm loãng
Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)
 Thử các phản ứng sinh hóa
 Khả năng lên men đường
Chuẩn bị:
Môi trường đường: maltose, glucose, saccharose
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Ống nghiệm, ống Durham
Cách làm: cho vào ống nghiệm đã có sẵn môi trường đường một ống
Durham hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường ủ ở
370C/24 giờ. Quan sát sự đổi màu sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men
đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường
giảm, sẽ chuyển màu môi trường.
Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ
Phản ứng (+): môi trường có màu vàng
 Thử phản ứng Catalase
Chuẩn bị:
Dung dịch H2O2 30%
Lame
Cách làm: dung piptte lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và
khô. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả su khoảng 15 giây.
Kết quả:
Phản ứng (-): không có hiệ tượng sủi bọt
Phản ứng (+): có hiện tượng sủi bọt
 Thử phản ứng VP (Voges Proskauer)
Chuẩn bị:
Môi trường Clark lubs
α – naphtol 10%, NaOH 40%
Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ
370C/24 giờ. Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt NaOH 40% và 3 – 5 giọt α – naphtol 10%. Sau
15 phút đọc kết quả.
Kết quả:
Phản ứng VP (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng VP (+): môi trường có màu đỏ.
 Thử phản ứng MR (Methyl – Red)
Chuẩn bị:
Môi trường Clark lubs
Thuốc thử Methyl Red
Cách làm: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường Clark lubs,
nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau đó nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Methyl Red vào canh
khuẩn và đọc kết quả.
Kết quả:
Phản ứng MR (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng MR (+): môi trường có màu đỏ.
 Thử phản ứng khử Nitrate (NO3)
Chuẩn bị:
Môi trường Nitrate
Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B
Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch
nitrate, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt Giess
A, sau đó nhỏ tiếp 2 – 3 giọt Giess B.
Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ
 Thử khả năng sử dụng Citrate
Chuẩn bị:
Môi trường Citrate
Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate. Nuôi ở nhiệt độ 370C/24
giờ.
Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu xanh lá mạ non
Phản ứng (+): môi trường có màu xanh dương
 Các phƣơng pháp thực hiện
 Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth)
Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn
lượng tinh bột với chất chỉ thị màu Iodine.
Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C,
khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu
với Iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên
1 ml dịch môi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme.
Thiết bị, vất liệu và hóa chất:
Bình tam giác hay bình cầu
Ống nghiệm
Máy ly tâm hay máy lọc
Pipette
Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chưa vi sinh
vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung
dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 – 2 giờ trên mấy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly
tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần
ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích.
Dung dịch tinh bột 0,1%
Dung dịch NaCl 0,1%
Dung dịch iod 0,02%
 Cách tiến hành:
Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi óng 1 ml dung dịch NaCl 0,1%.
Thêm vòa ống thứ nhất 1 ml enzyme ròi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai
lại lắc đều và lấy 1 ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau
cùng lấy 1 ml ở ống thứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch tinh bột 0,1%,
lắc đều, giữ ở 300C trong 30 phút. Làm lạnh, cho vào mooyj giọt dung dịch Iodine
0,02 N. Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không cho tạo màu với Iodine.
Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu
thì hoạt tính của enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme là 16 x 2 = 32 đơn vị. Trong
đó 16 là độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống thứ tư, 2 là số mg tinh bột
trong mỗi ống nghiệm.
 Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (Phương pháp Gross và
Fluld)
Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic
trong ethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại
không bị kết tủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở
xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị
kết tủa bởi acid acetic trong ethanol.
Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1ml dung dịch nghiên cứu có khả
năng phân giải 1 mg casein ở 380C trong thời gian 30 phút.
 Thiết bị, vật liệu và hóa chất
Bể điều nhiệt hay tủ ấm (380C)
Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer)
Ống nghiệm
Dung dịch casein 0,1%
Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol
 Cách tiến hành:
Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô
Cho vào mỗi ống 1ml nước cất, trừ ống thứ nhất.
Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc
đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1 ml
dung dịch của ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12.
Kaays 1 ml từ ống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều
là 1 ml.
Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 380C bằng cách đặt chúng vào bể
điều nhiệt cài ở 380C từ 10 – 15 phút.
Thêm vào mỗi ống 2 ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 380C, lắc đều.
Giữ ở 380C trong 30 phút.
Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nước đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo
vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol.
Nếu thấy tất cả các ống đều có kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không
đủ để phân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dụng dịch enzyme có nồng độ cao
hơn. Còn nếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung
dịch enzyme đem phân tích.
Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa
thì chọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là
ống có lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein.
Ví dụ: ở ống thứ 7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban
đầu pha loãng 64 lần trong ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme
ban đầu, và như vậy 1 ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128
đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độ của enzyme trong 1 g chế phẩm.

Khoá Luận Tốt Nghiệp

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Khoá Luận Tốt Nghiệp

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM

Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện

Thành phố Hồ Chí Minh

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Phi

Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.

A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase,

We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis.

1.1. Đặt vấn đề

1.3. Yêu cầu đề tài

2.1.1. Lịch sử phát hiện

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Loài: Bacillus subtilis

Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy

2.1.5. Đặc điểm sinh hoá

(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005).

2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử

2.1.7. Tính chất đối kháng

2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease

2.3.1. Enzyme amylase

2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase

2.3.1.3. Đặc tính của amylase

Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase,

 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:

2.3.2. Enzyme protease

2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật

2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật

2.4.1. Định nghĩa

2.4.2. Chức năng sinh học

2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng

 Trong nông nghiệp:

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

3.1.1. Thời gian

3.1.2. Địa điểm

3.2. Vật liệu thí nghiệm

3.2.1. Đối tƣợng khảo sát

Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Dd pha loãng mẫu 10-1

Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi.

Thử phản ứng sinh hóa

Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis

Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1

Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2

Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3

Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1

Thời gian 48h, nhiệt độ 370C

Môi trường sản xuất: cám gạo

Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase

Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0.

Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc

Chủng Các phản ứng sinh hóa