THƯ VIỆN

ĐẠI HỌC NHA TRANG

660.6
Tr 121 Th

3000010763
TRẦN LINH THƯỚC

PHU0NG PHÁP PHÂN TÍCH

VI SINH VẬT
TRONG NƯỚC,
mực PHẨM VÀ M ĩ PHẨM
m

(Tái bán ỉún thứ ba)

TRƯỠM6 BAI HỌC NHATRAMG

TH Ữ ' VIỆN ■

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC

 LỜI NÓI DfiU

ĩ l / g ộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên, trỏ

thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ
ngộ độc thực phẩm nhưng phẩn lớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện
diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong
nước uống, thực phẩm. Ngày nay, an toàn, nhất là về phương diện vi sinh vật, trở thành một
trong những yêu cầu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm.

Việt Nam là một nước nông nghiệp có ỉiểm lực lớn vể sản xuất nông sản, thủy hải sản,
thực phẩm. Ngoài thị trường tiêu thụ nội địa cho gần 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản
của nước ta củng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới. Đặc biệt, thủy, hải sản chế biến
của Việt Nam đã có được thị phẩn quan trọng tại Bắc Mỳ, châu Ầu, Nhật B ả n l à mật trong
những ngành kinh tế mang lại ngoại tệ quan trọng cho đất nước, giải quyết việc làm cho một
số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị. Do nhận thức ngày càng được
nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tãng cường về
quản lý nhà nước, kiểm tra, giảm sát của cảc cơ quan chức năng, việc phân tích vi sinh vật
gây bệnh và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn
an toàn về vi sinh vật ngày càng được cảc đơn vị sản xuất, chế biến thực phẩm nội địa quan
tâm. Đối vỏị thủy hải sản xuất khẩu, đ ể đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt về vi sinh của các
thị trường thế giới và tăng cường năng iực cạnh tranh, trong những năm gẩn đây, các đơn vị
sản xuất chế biến thủy hải sản xuất khẩu Việt Nam đã rất chú trọng đển việc đẩu tư đổi mới
công nghệ, thực thi các chương trình quản lý đảm bảo chất lượng như HACCF*1), trong đó
việc xây dựng phòng phân tích, kiểm định và đào tạo cản bộ phân tích, kiểm định vi sinh vật
ngày càng được quan tâm.

Như vậy, hiện nay đang có một nhu cầu thực tiễn rất lớn về phía nhà sản xuất cũng như
về phía người lao động về đào tạo cán bộ phân tích vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhà
sản xuất có phòng thí nghiệm phân tt h tốt, có đột ngủ phân tích có tay nghề cao sẽ dễ thuyết
phục, tạo được niềm tin ở đối tác đ ể ký kết các hợp đồng sản xuất quan trọng. Cán bộ kỹ
thuật, kỹ thuật viên được đào tạo, nâng cao kỹ năng về phân tích vi sinh vật sẻ dễ củng cố vai
trò và sự cân thiết của mình đối vởi đơn vị. Thanh niên, học sirih, sinh viên được đào tạo về
phân tích vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm sê có lợi thế hơn trong tìm việc làm trong lĩnh
vực sản xuất chế biến thực phẩm, đặc biệt là thủy hải sản xuất khẩu.

M ặt khấc, sau thực phẩm, nhu cầu về làm đẹp đã trở thành mối quan tầm rất quan
trọng của xã hội khi đời sống kinh tế ngày càng được cải thiện. Thị trường và chủng loại mỹ
phẩm được sản xuất và tiêu thụ tại Việt Nam ngày càng được mở rộng. M ặc dù không được

,n HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points (Phân tích mối nguy và điểm kiểm
soát tới hạn).

3
đưa vào đưởng tiêu hóa, nhưng sự tiếp xúc trực tiếp, thường xuyên của mỹ phẩm lên da,
mặt, m ắ t cơ thể... là điều kiện rất tốt cho sự tấn công của vi sinh vậỉ gãy bệnh, gây hại lên
người sử dụng. Sự hiện diện của vi sinh vật, nhất là vi sinh vật gây bệnh trong mỹ phẩm tạo
ra mối nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng, rất đáng được quan tâm. Trên
thực tế, ngày nay, các hảng mỹ phẩm lớn, có uy tín rất coi trọng việc kiểm soát vi sinh vật
trong mỹ phẩm. Do vậy, tuy quy mô không được tương xứng như ở lĩnh vực thực phẩm,
nhưng củng đang cỏ một nhu cầu thực ỉiễn khá lớn về đào tạo cán bộ phân tỉch vi sinh vật
trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm.

Quyển sách 'Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
p h ẩ m " được biên soạn nhằm đáp ứng các nhu cầu thực tiễn nêu trên. Sách cung cấp các kiến
thức cô đọng về các vi sinh vật gày bệnh, các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong
nước, thực phẩm và mỹ phẩm, các yêu cầu cơ bản trong vi'ặc thành lập và vận hành một
phòng kiểm nghiệm vi sinh vật. Phần quan trọng nhất được dành cho các nộị dung về phương
pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu, các kỹ thuật cơ bản trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh
vật, quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật thường được yêu cầu trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm- Đ ể tham khảo và tạo điều kiện tiếp cận cấc kỹ thuật và phương pháp mới. ngoài các
phương pháp, quy trình chuẩn, sách củng giới thiệu các phương pháp mới như các phương pháp
thử nhanh, phương pháp miễn dịch, phương pháp lai phân tử, phương pháp P C R - được gọi
chung là các phương pháp không truyền thống, đang ngày càng được sử dụng rộng rải và có
khả năng được công nhận là phương pháp chuẩn trong tương lai.

Đây Ịà tài liệu được biên soạn trên cơ sở cầc tài liệu thực tập vê vi sinh vậỉ học đại
cương, phân tích vi sinh vật trong thực phẩm được giảng dạy trong thời gian qua tại Khoa Sinh
học Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chỉ Minh, cùng cảc tài liệu tham
khảo trong và ngoài nước khấc. Sách có thể được sử dụng một phẩn hay toàn bộ làm giáo trình
vể phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm trong các trường trung học chuyên nghiệp, cao
đẳng và đại học. Sách cũng thích hợp cho kỷ thuật viên các phòng phân tích, sinh viền, học
viên sau dại học đã được trang bị kiến thức về vi sinh học đại cương đ ể thực hiện cấc thi
nghiệm, phân ỉỉch các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước, thực phẩm hay mỹ phẩm.

Tác giả xin chân thành cảm ơn Nhà Xuất bản Giáo dục đã tạớ điều kiện thuận lợi cho
việc xuất bản quyến sách này. Tác giả cũng cảm ơn các anh chị học viên cao học đả có nhiều
đóng góp trong quá trình chuẩn bị bản thảo.

Lấn xuất bản đẩu tiên của 'quyển sách chắc chắn không tránh khỏi nhiều sai sót. Rất
mong được các đóng nghiệp và bạn đọc góp ý đ ề lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn.

T Á C G IẢ

4
 MỤC LỤC
Trang
Lời n ói đ ầ u 3
Mục lụ c 5
CHƯƠNG ĩ. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KiỂM SOÁT
TRONG NƯỚC, THựC PHẨM v à m ỹ p h ẩ m
1. Vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỳ phẩm 7
2. Các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước 18
3. Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm 21
4. Các chi tiêu vi sinh vật trong mỹ phẩm 21

CHƯƠNG ỈI. YÊU CẦU C ơ BẢN CỦA PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
1. Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật 30
2. Dụng cụ, thiết bị 32
CHƯƠNG III. PHƯƠNG PH Á P THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MAU
1. Đặc điểm của mẫu 36
2. Thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu nước 37
3. Thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm 38
4. Thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu mỹ phẩm 41

CHƯƠNG IV. KỶ THUẬT c ơ BẢN TRONG PHÂN TÍCH,

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT
1. Pha chế môi trường và các kỹ thuật vô trùng 43 .
2. Quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi 60
3. Phương pháp định lượng vi sinh vật 63
3.1 Phương pháp đếm trực tiếp .6 3
3.2 Phương pháp đếm khuẩn ỉạc 65
3.3 Phương pháp màng lọc 67
3.4 Phương pháp MPN 68
3.5 Phương pháp đo độ đục 69
4. Thử nghiệm sinh hóa 71
4.1. Các thử nghiệm sinh hỏa quan trọng 74
4.1.1 Thử nghiệm khả năng lên men 74
4.1.2 Thử nghiệm khả năng ôxi hóa - lên men 77
4.1.3 Thử nghiệm Bile Esculin 79
4.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate 79
4.1.5. Thử nghiệm khầ năng biến dưỡng malonate 81
4.1.6. Thử nghiệm catalase 81
4.1.7. Thử nghiệm decarboxylase 83
4.1.8. Thử nghiệm coagulase 84
4.1.9. Thử nghiệm urease 85
4.1.10. Thử nghiệm gelatinase 86
4.1.11. Thử nghiệm khả năng sinh H2S 87

A
 4.1.12. Thử nghiệm khả năng sinh indol 88
4.1.13. Thử nghiệm KIA, TSI 89
4.1.14. Thử nghiệm nitratase 91
4.1.15. Thử nghiệm oxidase 92
4.1.16. Thử nghiệm ONPG 93
4.1.17. Thử nghiệm MR (Methyl Red) 94
4.1.18. Thử nghiệm VF (Voges-Proskauer) 95
4.1.19. Thử nghiệm CAMP 96
4.1.20. Thứ nghiệm tính di động 98
4.2. Các bộ kit sinh hóa định danh vi sinh vật ưd các hệ thống 99
định danh tự động
CHƯƠNG V. QUY TRÌNH PH Â N TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT
1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 101
2. Coliforms và Escherichia coỉi Ị05
3. Staphylococcus aureus 113
4. Feacal Streptococcus 117
5. Salmonella 120
6. Shigella 127
7. Vibrio 131
8. Listeria monocytogenes 137
9. Bacillus cereus 141
10. Clostridium 147
11. Pseudomonas aeruginosa 149
12. Tổng nấm men nấm mốc 156
13. Candida albicans 160
CHƯƠNG VI. CÁC PHƯƠNG PH ÁP KHỔNG TRUYEN TH ốN G
1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 166
2. Phuơng pháp ELISA 169
3. Phương pháp lai phân tử 171
4. Phương pháp PCR 173
5. Một số phương pháp thử nhanh khác 180
5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 180
5.2. Kỹ thuật màng ỉọc phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) 181
và màng ỉọc lưới kỵ nước
5.3. Kỹ thuật màng petrifilm 181
5.4. Kỹ thuật Redigel ■' 182
5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng 183
5.6. Kỹ thuật đo vỉ lượng calorie 184
5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ 184
P h ụ lụ c 185
1. Ảnh màu 185
2. Một số môi trường và thuốc thử thông dụng 197
3. Bảng tra MPN 227
T àỉ liệ u th a m k h ả o 230

6
 CHƯƠNG I

CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC

KIỂM SOÁT TRONG NƯỚC, THựC PHAM
VÀ MỸ PHẨM

1. VI SINH VẬT TRONG NƯỚC, TH ựC PHẨM và mỹ ph ẩ m

1.1. Vi sinh vật gây b ệnh trong nước và thực phẩm
Nước và thực phẩm nuôi sống con người nhưng cũng có thể gây ngộ
dộc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tô" vi sinh
vật, độc tô" hóa học hoặc chứa các vi sinh vật gây bệnh. Có rất nhiều vụ
ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong nước và
thực phẩm. Ngộ dộc thực phẩm thường dược hiểu là các triệu chứng gây
ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm bệnh
bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng
thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh. Tuỵ nhiên hiện nay, khái niệm
ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ãn có chứa các vi sinh
vật gây bệnh hiện diện ở mật độ rất thấp trong nguyên liệu hay bị
nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế biến hay bảo
quản, các vi sinh vật này và độc tô' của chúng có thể tăng lên nhanh
đến mức gây ngộ độc.
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra
những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên mức độ
tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể
trạng khác nhau của từng người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc
thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sổít, đau
đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tùy thuộc vào
tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tô' do vi sinh vật tạo ra và
tiết vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc
tố nằm trong tế bào VI sinh vật (nội độc tố).
Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm
soát là các vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gâý ngộ
độc hay gây bệnh ở người khi bị đào thải ra khỏi cơ thể bằng đường phân
sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị nhiễm phân này. Nước trở thành môi

7
trường phân tán, lan truyền mầm bệnh cho người khi nước được sử dụng
mà không được tinh sạch đúng quy cách. Nước là môi trường sông, môi
trường nuôi trồng các loài thủy sản nên khi nước bị ô nhiễm thì vi sinh
vật gây bệnh có th ể n hiễm vào các loài thủy sản, làm nhiễm nguồn
nguyên liệu của các thực phẩm thủy hải sản chế biến. Đó là một trong
nhừng con đường nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thực phẩm. Mặt khác,
trong quá trìn h sản xuất, chế biến thực phẩm, vi sinh vật gây bệnh cũng
có thế nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề m ặt thiết bị, công
nhân. Mặc dù đế có th ể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh hiện diện
hoặc độc tố của chúng tiết, ra trong thực phẩm khi được sử dựng phải đủ
lớn. Tuy m ật độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc
trong thực phẩm có thế rấ t thấp nhưng ở những điều kiện n h ất định
thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tô của vi sinh vật trong quá trình
chê biến hoặc bảo quản thực phẩm, m ật độ vi sinh vật được n h ân lên
nh an h đến mức đủ để gây bệnh hay sản xuất đủ lượng độc tô' gây hại. Do
vậy, m ậ t độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là
rấ t thấp, trong đa số các trường hợp là bằng không.
Sau đây là một số đặc điểm liên quan đến các vi sinh vật gây ngộ
độc, gây bệnh chính hoặc một số nhóm vi sinh vật có liên quan khác
thường được quan tâm trong nước và thực phẩm :

Salmonella

Salmonella có thể gây ngộ độc

thực phẩm khi hiện diện đến mức cả
triệu t ế bào trong một gram thực
phẩm. Các triệu chứng do
Salmonella gây ra thường là tiêu
chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ
bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị
nhiễm cho đến khi các triệu chứng
được biểu hiện là 12 - 36 giờ. Triệu
chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 -
Hình 1.1 Salmonella (ảnhchụp qua 7 ngày. Không phải tấ t cả mọi người
kính hiển vi điện tử) khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm
Salm onella đều bị ngộ độc. Các loại
thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salm onella cao là thịt gia cầm, sản phẩm
thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại
thực phẩm này thường là ph ân người và động vật, được nhiễm gián tiếp
hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loài Salm onella typhi,
S. paratyphi A, B, c gây sốt thương hàn.

8
 Campylobacter

Campylobacter gây bệnh viêm

nhiễm đường ruột, hiện diện khắp
nơi, đặc biệt trong hệ vi sinh vật của
nhiều loại động vật và chim. Tuy
nhiên các dòng Campylobacter gây
ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa
nhiệt bắt buộc, không thế phát triến
ỏ' nhiệt độ thấp hơn 30°c. Các triệu
chứng ngộ độc do vi sinh vật này gây
ra là đau nhức, tiêu cháy, sốt, đau Hình 1.2 Cam pylobacter (ảnh chụp q u a .
đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, kính hiẻn vi diện tá')
mê sang, thỉnh thoáng có Iihừng biểu
.hiện bệnh giông như cảm cúm. Thời gian ủ bệnh từ 2 - 1 1 ngày. Các sản
phẩm sữa, thịt gia cầm, nước là nguồn có thể gây nên ngộ độc do
Ccimpylohactcr. Campylobacter có thể hiện diện trong các loại thực phẩm
hút chân không. Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên có
thê bị tiệt trùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pasteur và
không tăng trưởng được trong thực phâm có tính acid.

Clostridium perfringens

c. perfringens được tìm thấy trong' đất, trong phân người. Trước
đây người ta cho rằng chỉ các dòng c. perfringens khán g nhiệt, tạo bào
tử và không làm tan máu mới có th ể gây ngộ độcthực phẩm. Ngày nay,
đã có những ghi n h ậ n các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bơi các dòng
c. perfnngens nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu. Các triệu chứng
ngộ độc do độc tổ’ của vi sinh vật này gây ra là đau th ắ t vùng bụng, tiêu
chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12 - 24 giờ. Nguồn thực phẩm có th ể chứa các
vi sinh vật này thường là th ịt gia cầm, n h ấ t là gia cầm đông lạnh sâu,
thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác. Bào tử của
c. perfringen có tính bền đối với nhiệt nên chúng có th ể sông sót qua
quá trình nâu chín, đặc biệt là khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và
thời gian ngắn. Các bào tử sông sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ
nấy mầm, tăng trưởng.

Clostridium botuiinum

Loài vi sinh vật này phân bố khắp nơi trong đất, nước, trong đường
ruột các gia súc và các loài thủy sàn. Vi sinh vật này sinh độc tố botulin
gây ngộ độc thịt làm thực phẩm cho người. Triệu chứng lâm sàng khi ngộ
độc là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn th ầ n kinh

9
như choáng váng, rối loạn thị giác,
rối loạn các CO' ở cổ và miệng, đau ở
vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể
dẫn đến tử vong. Các triệu chứng
trên biểu hiện 12 - 36 giờ sau khi tiêu
thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo
dài 2 - 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm
độc và tình trạn g sức khoẻ của từng
bệnh nhân. Các loại thực phẩm như
thịt, rau quả không được bảo quản
Hình 1.3 c. botulinum (ảnh chụp qua
đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất,
kính hiển vi điện tử)
phân động vật được chế biên không
đu nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách
có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao. Điều kiện thích hợp
cho sự tàng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí,
pH trung tính, khỏng có các vi sinh vật khác cạnh tranh. Độc tô botulin
do c. botu.linum tiết ra gồm một sô loại khác nhau như A, B, Cl, c 2, D, E,
F, G, trong đó tác động m ạnh đến con người là dạng A, B và E. Nhừng
năm gần đây, các vụ ngộ độc gây ra do c. botuỉinum dòng E thường có
nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này thường
phan lặp được từ các mầu bùn đáy tại các cửa sông.

Staphylococcus aureus

Trong tự nhiên Staphylococcus

aureus thường được tìm thấy trên
da, mũi, tóc hay lông của các loài
động vật máu nóng. Staphylococcus
aureus sản sinh một sô' loại độc tố
đường ruột enterotoxin bền nhiệt,
không bị phân hủy ở 100°c trong 30
phút. Khi ãn phải thực phẩm có
chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ
người bị ngộ độc có các triệu chứng
kính hiển vi điện tử) tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8
giờ. Các loại thực phẩm có chứa
nhiều muôi như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ớ nhiệt
độ cao hơn 40°C).và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay
nhiễm loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thong qua tiếp
xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến.

10
 Vibrio spp.

Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần 1011
N a+ đế p h át triển; một sô loài có khá năng gây bệnh cho người là Vibrio
cholerae, V. parahaemoỉyticus, V. vulnificus, V. hollisac, V. furnsii,
V. mimic us, V. fluvialis, V. alginoỉyticus, V" cholerae là tác nhân gây nên
các vụ dịch tả trên toàn th ế giới. Loài vi sinh vật này được chia thàn h
hai kiểu huyết thanh chính lầ 0} và không Ơ! Ínon-Oi). Kiểu huyết thanh
o, lại gồm ba kiểu huyết thanh phụ là Ogawa, Inaba và Eltor (còn được
gọi là kiểu 0139). Hai kiểu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày nay chỉ còn
được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu Á. Trong khi đó, các vụ
dịch tả trê n khắp th ế giới lại gây ra bởi kiểu Eltor. Dịch tả gây ra bởi
V. cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm
thực phẩm và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ sinh kém.
V. choỉerae tạo ra độc tố tả cholerae-toxin, có độc tính mạnh: chỉ cần 5 |Lig
gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành.
Ngoài độc tcí tả, loài này cũng tiết ra một sỏ' độc tố khác như hemolysin
có độc tính tương tự tetrodotoxin của cá nóc hay độc tố tương tự shiga-
toxin. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước
uống, nước trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩm sữa, các loại thủy sản
tươi sống (không' qua gia nhiệt hay gia nhiệt nhẹ).
Một loài gây ngộ độc thực phẩm
quan trọng khác là V. parahaemolyticus
tạo độc tổ’ hemolysin bền nhiệt có phản
ứng kháng nguyên Kanagawa. Tuy
nhiên, những năm gần đây người ta
phát hiện ra rằn g nhiều dòng
V. parahaemolyticus có phản ứng
Kanagawa âm tính cũng có thế gây
bệnh. Triệu chứng ngộ độc là đau th ắ t
vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và
Hình 1.5 Vibrio (ảnh chụp qua
tiêu chảy nhẹ xuất hiện 2 - 96 giờ sau kính hiển ví điện tử)
khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm. Thời
gian ủ bệnh phụ thuộc vào m ật độ t ế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể
trạng của từng bệnh nhân. Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng
trong môi trường có hàm lượng muối cao, thường phân lập được từ các
sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven bờ biển.
Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có
thể gây n ên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như
hai loài trên. Riêng loài V. vulnificus không gây các triệu chứng bệnh
đường ruột mà gây nhiễm trùng máu cho người.

11
 Escherichia coli

E. coll là vi sinh vật hiếu khí tùy ý

hiện diện trong đường ruột của người và
các loài động v ật máu nóng. Hầu hết
các dòng E. coỉi không gây hại và đóng
vai trò quail trọng trong việc ổn định
sinh lý đường ruột. Tay n hiên có 4 dòng
có thề gây bệnh cho người và một SCI
loài động vật là Enteropathogenic
E. coỉi (EPEC), Enterotoxigenic E. coli
Hình 1.6 E. coli (ảnh chụp qua
(ETEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC)
kính hiển vi điện tử)
và Enterohaemorrhagic E. coỉi
(EHEC)/Verocytoxin E. coli (VTEC) hay E. coỉi 0157: H7. Các loài E. coỉi
hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu
cơ, p h át triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây người ta còn
chứng minh được rằn g E. coli cũng hiện diện ỗ những vùng nước ấm,
không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bô' rộng rãi trong tự nhiên nên
E. coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn
nước trong quá trìn h sản xuất, chế biến. Các dòng E. coli gây bệnh gây ra
các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ
nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm,
dòng gây nhiễm và k hả năng đáp ứng của từng người.

Shigella spp.

Giống Shigella thuộc họ vi khuẩn

đường ruột (Enterobacteriaceae) gồm 4
loài khác nhau là s. dysenteriae, s.
sonneỉ, s. plexneri và s. boydii. Các
loài Shigella có tính chuyên biệt ký
chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng
trong người và các loài linh trưởng. Do
vậy, các loài Shigella hiện diện trong
môi trường là có nguồn gốc từ phân
người hoặc phân các loài linh trưởng.
Hình 1.7 s. sonnei (ảnh chụp qua
kính hiển vi điện tử)
Trong môi trường nước các loài này có
thể tồn tại hơn 6 tháng. Các vụ ngộ
độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các nước kém phát
triển, nơi việc sản xuất chế biến thực phẩm được thực hiện trong điều
kiện vệ sinh không đảm bảo. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ
người qua người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ
trực trùng) trong khoảng 1 - 7 ngày sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm.

12
Biếu hiện bệnh lý có thể thay đôi từ dạng nhẹ như tiêu cháy nhẹ đến
mức nghiêm trọng (đặc biệt là ỏ' trẻ om và ngưởi già) như đi tiêu ra máu,
có những m ảnh niêm mạc ruột, inất nước, sốt cao và bị co rút thành
bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo dài từ 12 - 14 ngày thậm chí lâu
hơn, Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh vật gây
bệnh này. Vi khuẩn Shigella lây nhiễm chủ yếu qua nước và thực phẩm.
Thực phẩm bị nhiễm Shigeỉỉa từ nguyên liệu hay thong qua tiếp xúc bề
mặt trong quá trình sản xuất, chê biến thực phẩm.

Conforms

Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật

dùng để chi thị khá năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm. Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ
khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, len men đường lactose
và sinh hơi trong mối trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng
trướng, nhóm này lại được chia th à n h hai nhóm nhỏ là Coliform và
Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Trên thực tế
kiểm nghiệm Coliform phân được quail tâm nhiều hơn Coỉiíbrm. Coliform
phán có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các
giông Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Khi Coliform phân hiện
diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm
phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân.
Trong các th à n h viên của nhóm Coliform phân thì E. coỉi là loài được sự
quan tâm nhiều n h ấ t về vệ sinh an toàn thực phẩm.

Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes trở th à n h tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ
em, phụ nừ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Mặc dù
L. monocytogenes chỉ hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng
khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng
trưởng nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh. Triệu chứng
bệnh thường bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ. sau đó là nhiễm trùng máu,
tốn thương hệ thần kinh trung ương, tim, mắt; gây nên sẩy thai, đẻ non
hay nhiềm trùng thai nhi ở phụ nữ mang thai. L. monocytogenes ưa lạnh,
tăng trưởng được ở nhiệt độ từ 2 - 44°c, thường được phân lập từ phô
mai, sữa, th ịt cá, rau quả và trong nước. Loài này có th ể nhiễm vào thực
phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau
quả. Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài
này có cơ hội tàng trưởng th à n h sô' lượng lớn. Các sản phẩm được thanh
trùng bằng phương pháp Pasteur và được bảo quản trong các tủ lạnh có
nguy cơ nhiễm vi sinh vật này r ấ t cao.

13
 Bacillus cereus

B. cereus là trực khuẩn Gram

dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng
trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ
5 - 50°c, tối ưu ở 35 - 40°C; pH dao
động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào
tử náy mẩm rất dễ dàng. Vi khuẩn này
hiện diện trong đất. bụi, các loại thực
phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia
vị, sản phẩm khô ...). Vi khuẩn có thể
tiết ra hai loại độc tổ' chính là
Hình 1.8 B. cereus (ảnh chụp qua
kính hiển vi điện tử)
diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và
emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc
thực phẩn) gây ra bởi B. ccreus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không
được giừ trong điều kiện lạnh trong vài giò' trước khi sử dụng. Thực phẩm
chửa vi khuẩn Ư m ật độ trên 10h tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng
ngộ độc phổ biến gây ra bởi B. cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sôt,
bắt đầu 4 - 1 6 giờ sau khi án thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong
12 -24giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau
1 - 5giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảv, kéo dài
khoảng 24 giờ.

Aspergillus

Aspergillus flctmis và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng

trong cácloài nâm môc cókhả năng tạo độc tô mycotoxin gây ngộ độc
thực phẩm. Độc tố"mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai
loài này được gọi chung là aílatoxin có khả năng gây ung thư. Gác nấm
mốc này có thể p h át triển ở nhiệt độ từ 7 - 40uc và tối ưu ở 24 - 28°c, do
vậy có khả năng tăn g trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa
miến, đậu phộng, bắp, lúa mì ...) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các
nước nhiệt đới vói điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao. Từ các
nguyên liệu này, nấm mốc và độc tô có thể nhiễm vào thực phẩm gáy độc
cho người, ơ các chủng có khả năng sinh độc tố, sau khi tăng trưởng 1 - 3
ngày độc tô' được tạo ra và tiết vào cơ chất. Bôn loại aílatoxin đưực tạo ra
bởi A. flavus và A. parasiticus là aílatoxin Bi, Ba phát huỳnh quang màu
xanh (blue) và G|, Gy phát huỳnh quang màu lục (green). Khi ăn cò hoặc
thức ăn chứa aflatoxin B] hoặc B2, bò sừa có thế chuyến hóa chúng thành
các độc tô aílatoxin Mị, Ma hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là chất
gây ung thư m ạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước dều
có tiêu chuẩn quôc gia về hàm lưựng tối đa cho phép sự hiện diện của độc
tố này trong nông sản, thực phẩm, thường là lOppb (một phần tỷ).

14
 Virus
Các vụ dịch bệnh gây ra do tác nhân virus từ thực phâm cho đến nay
vần là vân đề bí ẩn. Các nghiên cứu về virus thực phẩm, dặc điểm sinh lý
của virus đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực
phẩm cho đến nay vần còn nhiều hạn chế. Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật
sinh học phân tử như lai phân tử, kỳ thuật PCR... người ta có thể phát
hiện virus có hại cho con người trong thực phẩm. Sự lan truyền virus qua
người thông qua đường miệng đã được biết từ những năm 1950. Các virus
gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ các sả 11 phẩm
thủy sản. Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột được biết hiện nay
chí một vài loại có khả năng gảy bệnh cho người (Hepatitis type A virus,
HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non A, Virus Non B).
Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự
nhân lên trong nước hay trong thực phẩm. Chúng xâm nhiễm vào thực
phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài
nhuyễn thế ăn lọc như nghêu, sò ... có khả năng tích lũy nhiều virus trong
nước làm m ật độ virus trong nhuyễn thế cao hơn rá't nhiều so với môi
trường nước xung quanh. Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có
thê thâp hơn rất nhiều so với vi khuẩn. Virus hiện diện trong cơ thể
người và các loài động vật và được tìm thây với số lượng lớn trong phân
của những người bị nhiễm, tồn tại từ nhiều ngày đến nhiều tuần. Nước bị
nhiễm phân là con đường lây nhiễm gián tiếp hay trực tiếp của virus vào
thực phẩm. Khả năng sông sót của virus trong mỏi trường hay trong thực
phẩm phụ thuộc vào các yếu tô' : nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ
m ặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu cơ khác. Tất cả virus
đường rưột đều có tính kháng với acid, các enzym thủy phân, muối m ật có
trong đường tiêu hóa. Một số’ virus có thể kháng nhiệt như virus viêm gan
siêu vi A (HAV), hoặc kháng phenol, ethanol... 0 zôn và chlorine là
nhừng tác nh ân có thế làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột. Đế
ngản ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được
nấu chín đế khử virus trước khi dùng, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải
được khai tlh á c từ những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi
trong các vùng nước sạch trưóc khi tiêu thụ.

1.2. Vi sin h v ậ t tron g m ỹ phẩm

Trước đây ngành công nghiệp mỹ phẩm không xem trọng công tác
kiểm nghiệm vi sinh vật. Người ta cho rằng mỹ phẩm không n h ấ t thiết,
phải ở trạng thái vô trùng vì vi sinh vật hiện diện khắp nơi, có thế
nhiễm vào mỹ phẩm bất kỳ lủc nào. Ngoài ra, các biện pháp nhằm ngăn
chặn sự nhiễm vi sinh vật vào mỹ phẩm lại có thể ảnh hưởng đến mặt
thẩm mỹ của sản phẩm. Tuy nhiên gần đây các kiến thức về sự gây hổng

15
mỹ phẩm và hậu quả bởi vi sinh vật ngày càng được tích lũy. do vậy việc
kiểm nghiệm vi sinh vật trở nên rất cần th iết đối với các nhà sản xuât
mỹ phẩm. M ặt khác, hiện nay các loại mỹ phẩm sử dụng các th à n h phần
có nguồn gốc thiên nhiên r ấ t được người tiêu dùng ưa chuộng. Việc đưa
các th à n h ph ần này vào mỹ phẩm tạo diều kiện cho vi sinh vật tăng
trưởng dễ hơn. Vi sinh vật tăng trưởng trong mỹ phẩm khi tiếp xúc với
da, n hất là ở chỗ da bị rách hay tôn thương, có thể gây nhiễm cho người
sử dụng. Nguy cơ gây nhiễm này càng cao ở các loại mỹ phẩm sử dụng
cho trẻ sơ sinh, người già, người có sức khỏe yếu cũng như người bệnh
đang được điều trị. Sự nhiễm và gây hỏng mỹ phẩm bởi vi sinh vật có thế
xáy ra trong quá trìn h sản xuât cũag như sau khi sản phẩm đã được bán.
Vì vậy, trong mỹ phẩm, các chât bảo quản có tác dụng diệt khuẩn khác
nhau được sử dụng n h ằm mục đích ngăn cản sự gây hỏng mỹ phẩm bởi vi
sinh vật đế kéo dài thời gian sử dụng và bảo vệ người sử dựng trá n h nguy
cơ nhiễm vi sinh vật có hại; m ặ t khác, cần có sự tham gia của các nhà vi
sinh vật trong sản xuất mỹ phẩm kể từ giai đoạn rấ t sớm như phát triển
sản phẩm. Sự Iihiễm và tăng trưởng của vi sinh vật có thể được phát hiện
bằng m ắt thường như sự xuất hiện khuẩn ỉạc nấm men, nấm môc trên bề
m ặt mỹ phẩm, sự trở đục hoặc lắng tụ của mỹ phẩm dạng lỏng, sự xuất
hiện màu lạ, sự tạo bọt, khí ...
Việc nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong mỷ phẩm có thể gây hậu quả
rất lớn. Ví dụ kem dưỡng tay được dùng r ấ t nhiều trong bệnh viện. Các
mỹ phẩm đã qua sử dụng r ấ t dễ bị nhiễm các loài Staphylococcus,
Micrococcus, nấm môc, nám nem. Đặc biệt trong bệnh viện dễ xảy ra dịch
nhiễm trùng máu bởi Klebsiella pneumoniae được tìm thấy bị nhiễm
trong các lọ lanolin hay kem dưỡng da. Một khảo sát về sự nhiễm vi sinh
vật trong các loại kem dưỡng da còn mới hoặc đã qua sử dụng trong một
bệnh viện cho thấy có 4/26 loại bị nhiễm vi khuẩn gram âm. Tỷ lệ này
phản ánh mức dộ thường sử dụng.các loại kem dưỡng da trong bệnh viện
và nguy cơ gây nhiễm vi sinh vật gây bệnh qua loại mỹ phẩm này, n hất
là gây nhiễm dối với bệnh n h â n là người trở nên r ấ t dễ bị nhiễm. Ngoài
ra, mỹ phẩm dùng cho m ắt cũng r ấ t dễ bị nhiễm.
Ngoài khả năng bị nhiễm khi mỹ phẩm được sử dụng như trên, vi
sinh vật có thể nhiễm vào mỹ phẩm ngay từ giai đoạn sản xuất. Nguồn
gảy nhiễm tại nơi sản xuất có thể là từ nguyên liệu, n h ất là nước là
th à n h phần chiếm tỷ trọng cao n h ất trong mỹ phẩm, từ các dạng nhựa,
cây cỏ, các nguyên liệu th iên nhiên khác, từ các dụng cụ chứa nguyên
liệu.. Môi trường sản xuát cũng có thể góp phần gây nhiễm, n h ât là
không khí có thề mang bào tử vi sinh vật. Sự nhiễm còn có thể được gây
ra thông qua tiếp xúc bề m ặt của nguyên liệu hoặc bán th à n h phẩm với
thiết bị, với cỏng nhân.

16
 Các vi sinh vật không đượcphép hiện diện trong mỹ phẩm thường là
Staphylococcus aureus, các loài thuộc họ Enterbobacteriaceac,
Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans.
Đặc điểm chính của s. aureus vàcác loài thuộc họ Enỉcrobacteriaceae
đã đươc trình bày ở mục 1 .1 .ớ đây giới thiệu một số đặc điểm của
Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans.

Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn

hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng
đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có
khả năng di động với một tiêm mao
đơn cực. Là vi khuẩn hiếu khí bắt
buộc, nhưng p. aeruginosa có thế
phát triển trong môi trường kỵ khí
nếu có NO;T làm chất n hận điện tử,
phát triển tôi ưu ở 37°c. Loài này
hiện diện phô biến trong đất, nước,
bề mặt cơ thề động thực vật, là loài
Hình 1.9 P. aeruginosa (ảnh chụp qua
vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên
kính hiển vi điện tử)
người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ
khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ. p.
aeruginosa có thế gây nhiều bệnh khác nhau ở người: gây viêm màng
trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp ở những
người có đường hô hâ'p hoặc hệ thông tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm phổi
ở những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết
tim; gây nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu ở những bệnh n h ân suy
giảm hệ thống miễn dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu
đường, bỏng nặng; gây viêm màng não mủ và áp xe não; gây viêm tai;
gây bệnh hóa sừng ở m ắt ở những người có hệ thống bảo vệ suy yếu; gây
viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da, mô mềm... p . aeruginosa là vi khuẩn
kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một
số ít các kháng sinh có tác dụng đôi với giống Pseudomonas là
fluoroquinolone, gentamicin và imipenem.
m u m •A! MOCNI-i/JPAiVG
7
Candida albicans ; r? a j y.y; . ị;

c.albicans là nâm men có thể phát triênTor^rĩìĩíỆtnđự-â0^^^ w,

pH 2,5 - 7,5, hình dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang
dạng sợi. c. albicans thường sông vô hại ở màng nhầy (miệng, ruột, âm
đạo) và không thường xuyên ở dạng đơn bào trên da người và động vật
máu nóng, ơ những điều kiện n h ấ t định, nấm men phân hóa thành dạng
sợi để xâm nhập vào màng nhầy, tăng trưởng không kiểm soát và gây

2-PHƯƠNG PHÁP PHÁN TÍCH 17

 Hình 1.10 c. albicans (dạng lưỡng hình)

những bệnh “nhiễm n ấm m en” khá nghiêm trọng. Candida albicans cùng
với một số loài khác của giống Candida như c. tropicalis và
c, parapsilopsis là tác n h ân gây bệnh candidasis hay còn gọi là
moniliasis tuy không nghiêm trọng nhưng khi lan truyền vào máu hoặc
màng não thì r ấ t nguy hiểm. Những triệu chứng bệnh gây ra do c.
albicans thuộc về các nhóm mệt mỏi mạn tính, suy yếu hệ miền dịch, dị
ứng. Một số bệnh có th ể gây ra bởi c. albicans là bệnh tưa lưỡi ở trẻ sơ
sinh, bệnh n h ân AIDS, những người sử dụng quá nhiều kháng sinh; viêm
nấm dường âm đạo ở những phụ nừ đang mang thai; bệnh nấm ở miệng
đôi với những người đeo răng giả; viêm ruột kết; thiếu hụt hormon trên
vỏ thượng th ậ n và hormon tuyến giáp, các bệnh hô hấp, bệnh về thần
kính, dị ứng; bệnh tiểu dường, h ạ đường huyết ...

2. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC

Nước được dùng cho sản xuất, sinh hoạt và thực phẩm. Tùy theo mục
đích sử dụng các chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm soát sẽ thay đổi. Đối với
nước tự nhiên, nước sả n xuất ■nông ngu nghiệp và nước sinh hoạt, cần
phải đảm bảo không bị nhiễm phân, không mang mầm bệnh bằng cách
kiểm nghiệm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân ví dụ như coliform,
coliform phân. Đốì với nước uống và các loại nước giải khát, ngoài các chỉ
tiêu về vi sinh vật chỉ thị như coliform, coliform phân, một số vi sinh vật
gây bệnh khác cũng được yêu cầu kiểm tra tùy thuộc vào nguy cơ gây
nhiễm.
Sau đây là tiêu chuẩn về nước với các mục đích sử dụng khác nhau :

2.1. N ước d ù n g ch o m ụ c đ ích sản x u ấ t, sin h h o ạ t

Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt,
tiêu chuẩn quôc gia Việt Nam (TCVN 5942 - 1995) quy định hai mức như
sau :

18
 - Loại A dùng làm nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá
trình xử lý, giới hạn tốì đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/100ml.
- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliform cho
phép là 10.000 MPN/lÒOml. Nước dùng cho nông nghiệp và nuôi thủy sản
có quy định riêng.
Đối với nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng về vi sinh vật (TCVN 5944
- 1995) được quy định là coliform không được quá 3 MPN/ 100 ml, không
cho phép có coliform phân.

2.2. Nước u ốn g
Nước uống bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có
cồn). Tiêu chuẩn N hà nước (TCVN 6096 - 1995, TCVN 5042 -1994) quy
định về vi sinh vật của các dạng nước này là như sau:

Nưởc uống đóng chai:

ị Chỉ tiêu Mức tôi đa cho phép

1. Coliíbrm (MPN(17l00ml) 0
2. Coliform phân (MPN/100ml) 0
3. E. coli. (CFƯ2ì/ 100ml) 0
Ịị 4. Clostridium khử sulphate (CFƯ/100ml) 0
Ị 5. Streptococci phân (CPƯ/lOOml) 0

- Nước giải khát không cồn:

Mức tối đa cho phép

Chỉ tiêu
Không đóng chai Đóng chai
1. Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFƯ/ml) 5 X 104 102
2. E. coli (CFU/lOOOml) 3 0
3. Clostridium perfringens 0 0
Ị 4. Leuconostoc 0 0
1 5. Nấm men - nấm mốc, (CFƯ/ml) 103 0
6. Staphylococcus aureus 0 o'

(1) MPN : Most Probable Number (xem chương ỈV, mục 3.4).

(2) CFU : Colony Forming Unit (xem chương IV, m ục 3.2).

19
 - Nước giải khát có cổn:

Mức tối đa cho phép

Chỉ tiêu
Không đóng chai Đóng chai
1 . Tống vi khuẩn hiếu khí (CFU/ml) 103 102
ị1 2. E. coỉi (CFƯ/1000ml) 0 0
3. Clostridium perfringens 0 0
4. Vi khuẩn gây đục (quan sát bằng mắt) 0
5. Nấm men - nấm mốc, (CFƯ/ml) 102 0
6 . S. aureus / vi khuẩn gây bệnh đường ruột ị 0 0

Ngoài ra, chất lượng nước biển ven bờ được quy định (TCVN 5943 -
1995) dùng cho bãi tắm, nuôi thủy sản và các mục đích khác là coliform
không quá l.OOOMPN/lOOml.
Để tham khảo, Bảng 1.1 trình bày tiêu chuẩn vi sinh vật và phân
loại chất lượng nước theo các mục đích sử dụng khác nhau tại N hật Bản.

Bảng 1.1 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI SINH VẬT CÁC LOẠI NƯỚC
CỬA NHẬT BẢN

(1) C o lifo r m

Nước sồng tối đa 50 tối đa 1.000 tối đa 5.000

(MPN/100ml) (loại AA) (loại A) (loại B)
Nước hồ tối đa 50 tốì đa 1.000
(MPN/lOOml) (loại AA) (loại A)
Nước biển ven bờ tối đa 1.000
(MPN/lOOml) (loại A)
Nước nuôi thủy sản tối đa 1.000
(MPN/lOOml)
Nước dùng cho không quy định
nông nghiệp
Nước nguồn làm tối đa 50 tôi đa 1.000 tối đa 5.000
nước máy (loại 1) (loại 2 } (loại 3)
(MPN/lOOml)
Nước máy không hiện diện
Nước thải (CFƯ/ml) tối đa 3.000
Nước hồ bơi kiểm 10ml mẫu nước, lặp ỉại 5 ô'ng, sô' ôrig dương tính
tôi đa là 2

20
 (2) C o lifo r m p h â n

Nước tắm (CFƯ/100ml) tôi đa 100 tối đa 1.000 trên 1.000

(loại tốt) (loại đạt) (loại không đạt)
(3) T ổ n g v i k h u ẩ n
1 Nước nguồn làm nước tối đa 100
máy (CFU/ml)

3. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THƯC PHAM

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu
chuẩn của Bộ Y t ế (Bảng ĩ.2) bao gồm các chỉ tiêu sau: tổng vi khuẩn
hiếu khí, Coliforms, E. coỉi, Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio
parahaemoỉyticus, Bacillus cereus, Streptococcus -faecalis, Pseudomonas
aeruginosa, Clostridium botulinum , Clostridium perfringens, tổng sô' nấm
men, nấm mốc ... Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi
theo nhóm và chủng loại thực phẩm.

Các mặt hàng thủy sản chế biến xuất khẩu được quy định bởi tiêu
chuẩn quôc gia (TCVN) và tiêu chuẩn của ngành (TCN, Bộ Thủy sản,
Bảng 1.3) và của thị trường xuất khẩu (Bảng 1.4). Các chỉ tiêu thường
được quan tâm là: tổng vi khuẩn hiếu khí, Conforms, Coliforms phân,
E. coli,• Staphylococcus aureus, Salm onella spp., Shigella spp., Vibrio
choỉerae, Vibrio parahaem olyticus, tổng sô" nấm men, nấm mốc,
Clostridia, Listeria monocytogenes.

4. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG MỸ PHAM

Hiện nay chưa có tiêu chuẩn nhà nước về vi sinh vật trong mỹ phẩm.
Một số chỉ tiêu vi sinh thường được kiểm tra là tổng vi khuẩn hiếu khí,
tổng sô" nấm men, nấm mốc, kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật
như Staphylococcus aureus, E . coỉi, Pseudomonas aeruginosa, Candida
albicans, Aspergillus niger.

21
 Bảng 1.2 TIẼƯ CHUẨN VI SINH CHO PHÉP TRONG THựC PHẨM, BỘ Y TẾ 4/1998

Giới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm)

Nhóm
thực p hẩm TVK ECO SAƯ SAL BCE COL CPE VPA NM-MO SFA PAE CBO
HK /25g
* Nhóm thịt:

- Thịt tươi, thịt đông lạnh, thịt 10° 102 102 0 102
xay n hỏ, th ịt n gh iền , th ịt ch ế
biến

- Sản phẩm chế biến từ thịt: 3.105 3 10 0 10 50 10

th ịt hun khói, patê, xúc xích
* Nhóm cá và hải sản:

- Cá và thủy sản tươi sống 106 XO2 102 0 102 102

- Sản phẩm chế biến: tôm, cá

hấp nóng hun khói, chả cá, 105 3 10 0 10 10 10 10
chả mực, các loại giảp xác,
nhuyễn thể luộc hấp.

- Thủy sản khô sơ chế: cá 106 10 102 0 102 20 102

khô
 Giới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm)
Nhóm
thực phẩm TVK ECO SAU SAL BCE COL CPE VPA NM-MO SFA PAE CBO
HK /25g
* Nhóm trứng:

- Trứng tươi, dịch trứng tươi 105 3 10 0 102

hoặc đông lạnh

- S ản phẩm c h ế b iến từ trứng

(đã tiệt trùng bằng phương 103 0 3 0 10
pháp Pasteur)

* Nhóm sữa:

- Sữa khô, sữa bột 5.104 0 0 0 10

- Sữa tươi tiệt trùng theo

5. 104 3 0 10
phương pháp Pasteur

- Sữa tươi tiệt trùng theo 10 0 0 0 0

phương pháp U.H.T.

- Sản phẩm chế biến từ sữa 104 0 0 0 10

(bơ, sữa chua, pho mát)
 Giới hạn cho phép (CFƯ/g hoặc CFU/ml thực phẩm)
Nhóm
thực p hẩm TVK ECO SAU SAL BCE COL CPE VPA NM-MO SFA PAE CBO
HK /25g
* Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc,
khoai củ, đậu dỗ:
106 102 102 10* 10‘Ẳ 102 10:ỉ
- Cần xử lý n h iệ t trước k h i
dùng: bột, miến, mì sợi.

- Dùng trực tiếp, không xử lý

104 3 10 10 10 10 ÌQ2
nhiệt: bánh bột

* Nhóm nước khoáng và nước giải

khát đóng chai: 10 0 0 0 ơ 0

- Nước giải khát có cồn

102 0 0 10 0 10 0 0
- Nước giải khát không cồn

Theo
- Nước khoáng đóng chai 0 0 0 0
G.M.P
* Nhóm gia vị
10* 3 102 0 10'2 102
 Giới hạn cho phép (CFƯ/g hoặc CFƯ/mI thực phẩm)
Nhóm
TVK ECO SAƯ SAL BCE COL CPE VPA NM-MO SFA PAE CF^O
thực phẩm
HK /25g
* Nhóm nước châm:

- Nguồn gốc dộng vật: nước 101 0 3 0 102 10 10

m ắm

- Nguồn gốc thực vật 104 0 3 0 102 10 10

* Nhóm thức ăn khô và chứa dinh

dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay
thế đặc biệt

- P hải xử ]ý n h iệ t trước khi sử 105 10 102 . 0 10" 10

dụng

- Dùng trực tiếp, không qua xử 10'1 0 3 0 10 10 10

lý nhiệt

* Kem, nước đả 5.101 0 10 0 102 10

* Nhóm đồ hộp 0 0 0 0 0

* Nhóm dầu mỡ 103 3 0 0 10 0

TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E. coli\ SAU: Staphylococcus aureus; SAL. Salmonella', BCE: Bacillus cercus; COL: Coliforms; CPE:
Clostridium perfringens; VP A: Vibrio parahaemoỉytỉcus; NM-MO: tổng sỏ’ nấm men, nám inôc; SFA: Streptococcus faecalis; PAE: Pseudomonas
aeruginosa; CBO: Clostridium botulinum , G.M.P. : Good Manufacturing Practice : quy phạm san xuãt GMP.
 1

NO _, _ ____ ~ - __ -• - - ■ ^
s B ả n g 1.3 TIÊU CHƯÂN VIỆT NAM (TCVN) VA TIÊU CHUAN NGÀNH (TON, BỘ THƯY SẢN) VE VI SINH TRÉN THUY HAI SAN
Tiêu chuẩn Tên m ặt hàng TVKHK COL FCO ECO SAU SAL SH I VCH VPA NM CLO L IS
TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực
TCVN 4381/92 Tôm vỏ đông lạnh
TCVN4380/92 Tôm th ịt đông lạnh
1.000.000 200 0 100 0 0
TCVN4546/94 Tôm mũ ni đông lạnh
TCVN5835/94 Tôm th ịt IQF
TCVN2644/93 Mực đông lạnh
TCVN5649/92 H àng khô (không ăn liền) 1.000.000 0 100 0 0 100 1000 20
TCN 118:1998 ,T hịt nghêu luộc: n:5 m: 50.000 m:100 , 0 0 0
m:10; M:10
M:500.000 M: 1000 n=5 n=5 n=5
c:2; n:5
c:2 c:2 c:0 c:0 c:0
28TCN 119/98 Surimi cá biển 10.000 100 0 100 0 0
28TCN 104/97 Mực nang fillet ăn liền 50.000 10 0 0 0 0
Sashimi

28TCN 105/97 Nhuyễn th ể hai mảnh 1.000.000 200 0 xoo 0 0

28TCN 117/98 Cá basa fillet 1.000.000 200 0 100 0 0
TCVN 6175/9 Mực. cá khô tấm gia vị 50.000 10 0 0 0 0 0 0
TCVN5526/91 Nước mắm 20.000 10/ml 0 0 0 0 2/ml

T ât cả các chỉ tiêu nêu trên đều tương ứng với 25g mầu (trừ trường hợp có chú thích riêng).
TVKHK: tống vi khuẩn hiếu khí (30°c/72h); COL: Coliforms; FCO: Faecal coliforms; ECO: E. coli; SAU: Staphylococcus aureusi SAL: Salmonella spp.\
SHI: Shigella spp.\ VCH: Vibrio cholerae; VPA: Vibrio parahaernoỉyticus; NM: tống số nấm men, 11am mốc, CLO: Clostridia; LIS: Listeria
monocytogenes; m: khoảng châp nhận. M: khoang không châp nhận, n : sô’ mẫu thử nghiệm, c : sô mầu được phép nằm trong khoảng lân cận giới hạn.
 B ả n g 1.4 MỘT s ố TIỂU CHUẦN VI SINH TRÊN THỦY HÁI SAN ở CÁC THI TRƯỜNG THẺ GIỚI

T hị
T ên m ặt h àn g TVKIỉK COL FCO ECO SAU SAL SHI VCH VPA NM CLO LIS
trư ờ n g
Giáp xác và nhuyễn th ế luộc m=0 m- 0
0
M = 10 M = 10“
Hàng dạng nguyên liệu (raw m=0
0
material) M = 10
Hàng àn liền (ready to eat) m=0
0
M = 10
Ruốc tôm bò (nguyên con) 104 1 0 2
Thủy sản thanh trùng Pasteur,
10s 0 0 0 10/46°c
CHẢƯ bảo quản sơ
ẢU Thúy sán ngâm dầu, muối 105 0 0 0 <10
Cá fillet ướp lạnh 105 10 102 0 0 0 10
Cá fillet đông lạnh 1-5 - 104 1 -1 0 102 0 0 0 2 - 10
Cá xông khói 5 > 105 0 1 0 0 0 0
Nhuyễn thế 2 m ảnh sống 300/
0 0 0
100ml 1

Giáp xác luộc nguyên con

105 1 0 0 0 2
ướp lạnh
Giáp xác / tóm luộc nguyên con
10r< 1 0 0 0 2
đông lạnh
Tôm luộc nguyên con Líớp lạ n h 105 10 102 0 0 0 10/46°c
Điệp, sò 10e 10 102 0 0 0 30
Đùi ếch ướp lạnh, đông lạnh 5 * 10'1 102 102 0 0 0 100
m = 102
© o

Nhuyễn thề' hai m ảnh m =0

1 II

500A 0 0 0
M = 10" M - 10;!
 Thị
T ên m ặt h àn g ị TVKHK COL FCO ECO SAU SAL SHI VCH VPA NM CLO LIS
tr ư ờ n g
Cá nguyên con fillet 10;i -
10 10 0 0
5 » 10A
Tôm vỏ 10 -
10 10 0 ũ 0
5 - 105

104 -
Tôm thịt 50 50 0 {) 0
5 X 106
104 -
CHÂU Mực, bạch tuộc 250 10 0 0 0
5 A 106
ÂƯ
Cá cát lát 5 X 105 102 102 0 10
Tôm th ịt luộc đông lạnh 105 10 102 0 10
3/
Hàu
100ml
Tõm luộc (5 mảu> 5 X 103 í)
Tôm 105- 10B 250 0 0/5 g 0
Điệp chín đông lạnh 104 0 10* 0 0

m =4 m - 103
Hàng luộc và ăn liền 0 0/10g
M = 40 M = 104

m =4 m = 103
BẮC Các loại khác 0
M - 40 M = 104
MỸ
Nghêu, sò, điệp, hàu đông lạnh 5 > 10s 230 0

Thít cua 3,6 0

Tôm bao bột 105 3,6 102 0

 Thị
T ên m ặt h àng TVKHK COL FCO ECO SAU SAL SH l VCH VPA NM CLO LIS
tr ư ờ n g
Cá khô tẩm gia vị, mực 5 X 104 0 0 0 0 0 0 0
Giáp xác luộc 104 9 500 0
Giáp xác đông lạnh 10G 11 Ì0Ầ 0 102
Tôm vỏ đông lạnh 106 200 0 102 0 0
Tôm th ịt đông lạnh 10° 200 0 102 0 0
Tôm th ịt IQF 1013 200 0 102 0 0
Mực đông lạnh 105 200 0 102 0 0
H àng khô (không ăn liền) 106 0 102 0 0 102 10;í 20
m =5 X 104 m = 10 m = 1Q2
0 0 0
CHÂU T hịt nghêu luộc M. = 5 X 105 M = 102 M = 103
n= 5 n= 5 n= 5
Á c=2 c = 2 n -5 c- 2
Surimi cá biển 105 100 0 102 0 0
Mực nang fillet ăn liền
5 X 104 10 0 0 0 0
Saphimi
Nhuyễn thể hai m ảnh 106 200 0 102 0 0
Cá basa fillet 106 200 0 10'2 0 0
Nước 0/100ml 0/100ml 20
Nước mắm 2 X 104 10/ml 0 0 0 0 2/ml

T ât cả các chỉ tiêu nêu trê n đều tương ứng với 25g mầu (trừ trường hợp có chú thích riêng) .
TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí (30°c/72h); COL: Coliforms; FCO: Faecal coliforms; ECO: E. coỉi; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella spp.;
SHI: Shigella spp.' VCH: Vibrio cholerae; VP A: Vibrio parahaemolyticus; NM: tổng số nấm men, nấm mốc, CLO: Clostridia; LIS: Listeria monocytogenes;
m: khoảng chấp nhận, M: khoảng không chấp nhận, n: sô..mẫu thử nghiệm, c : số mẩu được phép nằm trong khoảng làn cận giới hạn.
 CHƯƠNG II

YÊU CẦU Cơ BẢN

CỦA PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

1. CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG KIEM n g h i ệ m VI

SINH VẬT
N hân viên phòng kiểm nghiệm phải có đủ kiến thức và kinh nghiệm
về công tác kiếm nghiệm vi sinh, phải tuân thủ đúng nhừng quy tắc an
toàn trong phòng thí nghiệm.

1.1. Các y ê u cầ u v ề p h ò n g k iểm n g h iệm

Phòng kiểm nghiệm vi sinh vật phải có diện tích làm việc và cách
bô trí phù hợp. Khoảng cách làm việc phải hợp lý đế h ạn chế tối đa sự di
chuyên trong phòng; sự di chuyển làm xáo động không khí và làm tăng
nguy cơ nhiễm trong quá trình phân tích kiểm nghiệm. Thông thường
phòng kiểm nghiệm cần được phân th ành các khu vực riêng biệt như:
- Thu mầu và lưu mẫu.
- Rửa dụng cụ thủy tinh, khử trùng dụng cụ, tủ ấm ủ mầu.
- Bảo quản hóa chất.
- Chuẩn bị môi trường.
- Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu.
- Khu vực thao tác các vi sinh gây bệnh.
Ngoài ra phòng phải được chiếu sáng đầy đủ, cần có hệ thống thông
khí đảm bảo ngàn sự đóng bụi và không cho lan truyền các bào tử nấm
cũng như các vi sinh vật khác. Khu vực thao tác nuôi cây nên được lắp
đặt đèn tử ngoại để đảm bảo tiệt trùng không khí và không gian thao
tác. Khu vực này nên được tran g bị máy điều hòa không khí. Máy điều
hòa đem lại các lợi ích sau:
- Không khí đi vào luôn được lọc để làm giảm ngoại nhiễm từ môi
trường bên ngoài.
- Cửa đóng làm giảm tối thiểu sự dịch chuyển của không khí, ngăn
ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễm.

30
 - Điều hòa không khí giúp chủ động kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ theo
hướng có lợi cho quá trìn h làm việc.
Mặt khác cần lưu ý nên hạn chê hoặc không dùng quạt trong phòng
kiểm nghiệm vi sinh và trán h để môi trường, hóa chất trực tiếp dưới ánh
nắng m ặt trời.

1.2. Sổ lưu ký k iểm n g h iệm

Sổ lưu ký ghi lại các dữ liệu cho phép theo dõi, kiểm tra sự chính xác
của các kết quả thu được, c ầ n phải ghi lại tỉ mỉ các công việc đã làm, các
kết quả thu được một cách cẩn thận, rõ ràng và theo một tr ậ t tự xác
định. Ví dụ:
- Ngày tháng tiến hành thí nghiệm, ngày kết thúc.
- Tên thí nghiệm.
- Đối tượng làm việc.
- Phương pháp lựa chọn để tiến hành.
- Các kết quả thu được.

1.3. Các quy tắ c an to à n tron g p h ò n g k iểm n g h iệm vi sin h

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi
sinh vật. Khi làm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số
lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml). Nhiều
chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nên cần luôn luôn cẩn th ậ n với
tấ t cả các chủng đang thao tác. Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm cũng
phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóà
chất có độc tính. Do vậy, cần tuân thủ một số’ quy tắc an toàn để đảm bảo
an toàn cho bản th â n và -cho những người khác trong phòng thí nghiệm
như sau:
- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.
- Không ăn uổng, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm. Mang khẩu
trang khi thao tác với vi sinh vật.
- Mặc áo blouse trong thời gian làm việc.
- Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng m ặt bàn bằng giấy lau tẩm
cồn 70° hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%,
chlorox 10 %), để khô. Thực hiện tương tự cho hai tay. Chú ý chưa đốt đèn
cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô cồn. Lặp lại việc sát trùng này sau
khi hoàn th à n h công việc.
- Cần ghi chú tên chủng, ngày thán g thí nghiệm lên tấ t cả các
hộp petri, ông nghiệm môi trường, bình nuôi cấy.

31
 - Khi lỡ tay làm đô, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn
giây tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm
việc.
- Cẩn th ậ n khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa
khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao
tác. Lưu V trá n h đưa tay, tóc qua ngọn lửa. c ầ n có cách bảo vệ tóc thích
hợp trường hợp C.Ó tóc dài.
- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette),
không hút bằng miệng.
- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn th ậ n mang găng tay thu gom
tất cá m ảnh vỡ vào một túi rác riêng.
- Tách riêng chất th ả i rắn và chất thải lỏng.
- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần
được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bâi rác. Các dụng cụ, bình
chứa nhiễm ví sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn
(nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng.
- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên
nhau.
- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để trán h nhiễm vi sinh vật
vào đường hô hấp.
- Khi đốt que cấy có dính sinh khôi vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc
đầu que cấy vào chân ngọn lửa để trá n h sự văng nhiễm vi sinh vật vào
không khí.
- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm.

2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ

2.1. Các d ụ n g cụ b ằ n g th ủ y tin h

- Ông nghiệm: dược dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy vi
sinh vật. Môi trường có thể ồ dạng lỏng hoặc rắn. Miệng ông nghiệm có
thể được đậy bằng nút bằng bông không thấm nước, bằng silicon, nắp
nhôm hay inox.
- Đĩa peỉri: gồm một nắp lớn và một nắp nhỏ lồng vào nhau, đường
kính 8 , 10, 12cm. Chọn những đĩa có đáy bằng, không trầy xước đế độ
dày môi trường được đồng nhất. Đĩa petri được gói bằng giấy trước khi
đem đi hấp khử trùng. Hiện nay các đĩa petri nhựa vô trùng bán sẵn rấ t
tiện lợi được sử dụng khá phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh

32
vật. Khác với đia thủy tinh có thê tái sử dụng nhiều lần, đĩa nhựa được
chế tạo đế dùng chỉ một lần.
- C á c d ụ n g cụ b ằ n g th ủ y tinh k h á c :

+ Đèn cồn
+ Cốc thủy tinh
+ Bình cầu đáy bằng và tròn
+ Bình tam giác
+ Các loại ông đong
+ Ong hút

2.2. Các lo ạ i que cấy

- Que cấy thẳng: dùng cấy sâu hay thu lấy vi sinh vật trên môi
trường đặc.
- Que cấy vòng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập
vi sinh vật trong môi trường lỏng hoặc raôi trường đặc.
- Que cấy móc: dùng cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn.

2.3. N h iệt k ế
Các nhiệt kế thường dùng nên có khoảng chia độ đến 0,2°c hoặc ít
hơn. Các nhiệt kê chuẩn nên dùng loại chia độ đến 0,1°C, đo được nhiệt
độ từ 0"C - 100°c.
2.4. pH k ế
Sử dụng máy đo pH, độ chính xác ít n hất là 0,1 đơn vị, để xác định
pH của môi trường nuôi cấy, hoặc các dung dịch hóa chất, c ầ n phải tính
đến nhiệt độ khi đo pH, giá trị pH cuối của môi trường nuôi cây vi sinh
vật thường được xác định ồ 25°c.

2.5. Cân
Loại cân thông dụng n h ất là loại một đĩa có mức phân biệt tôi thiểu
0.0lg và mức cân tôi đa 200g. Sử dụng cân phân tích có mức phân biệt
tối thiểu 0,lm g để cân những lượng nhỏ dưới 2g. Cân cần được đặt trên
bề một phẳng, không bị rung, trá n h gió lùa.

2.6. M áy cấ t nước
Nước cất dùng để pha chế môi trường, pha các dung dịch.... Nước cất
không chứa các chất hòa tan nhưng còn chứa khí hòa tan và hợp chất hữu
cơ bay hơi. c ầ n kiểm tra, làm vệ sinh máy và binh chứa nước cất thường
xuyên để đảm bảo độ sạch của nước.

3-PHƯƠNG PHÁP PHÁN TÍCH 33

 2.7. Tủ sâ y
Tu sâv được dùng đề sấv khô dụng cụ hoặc đê khử trùng bằng
phương pháp nhiệt khô. Tủ sấy thường được đốt nóng bằng điện tro'.
N hiệt độ có thế lẽn đến 200DC. Khí nóng được quạt đều trong lò đế trán h
sự sai biệt về n h iệ t độ.

2.8. Tủ ấm
Tủ ấm được dùng cho mục đích nuôi cấv vi sinh vật. Tủ ấm phải duy
trì nhiệt độ ổn định đế cho vi sinh vật tăng trưởng. Dải nhiệt độ của tủ
âm thường ỏ' khoảng 0 - 50°c. Thường vi khuẩn được nuôi cấv ở 37°c, một
số vi khuẩn có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở cao hơn, khoảng 40 - 42°c.
Đối với mỗi đối tượng vi sinh vật cần phải điều chỉnh lại nhiệt độ nuôi
cấy cho phù họp.

2.9. Máy lắ c
Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường, tăng cường ôxi tan trong môi
trường, được dùng đế nuôi vi sinh vật hiếu khí trong môi trường lỏng.

2.10. Bế đ iểu n h iệ t
Thiêt bị nàv được sử dụng đế giữ môi trường rắn được đun chảy ổn
định ở nhiệt độ thích hợp (45°C) trước khi đổ dĩa petri.

2.11. Tủ lạ n h
Sử dụng tủ lạnh có nhiệt dộ từ 4 - 10 °c đế lưu giừ mẫu, môi trường,
hóa c h ấ t . . Ngăn tủ đông để giữ giống hoặc các hóa chất cần đế lạnh sâu.
Không giữ thực phẩm, thức uống chung với tủ lạnh dành cho vi sinh vật.

2.12. M àng lọ c vô trù n g

Màng lọc vô trùng được dùng để lọc thanh trùng môi trường có chứa
những th à n h phần không chịu được nhiệt độ cao, không thể khử trùng
bằng nồi hấp bình thường. Màng lọc có kích thước lỗ 0 ,2 |am, nhỏ hơn
đường kính của vi khuẩn. Vi sinh vật sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung
dịch đi qua sẽ yô trùng. Màng lọc có thể bằng sứ, amiante, cellulose hay
hồn hợp cellulose và muôi ester của cellulose

2.13. Đ èn tử n g o ạ i (UV)
Tia ƯV có tác dụng khử trùng không khí trong phòng, khử trùng bề
mặt, nước, các dung dịch nhạy cảm với nhiệt. Nguồn bức xạ trong đèn ư v
là tia lửa điện sinh ra trong hơi thủy ngân áp suất thấp và làm phát ra
các phổ vạch trong vùng tử ngoại. Hơn 80% năng lượng của tia tử ngoại
thuộc bước sóng 200 - 290nm. Đèn được chê tạo bằng một loại thủy tinh

34
dặc biột giữ lại các bước sóng nho hơn 20011111. Đế’ khử trùng không khí
cần chiêu tia tứ ngoại từ 30 phút đên vài giờ tùy theo mức độ nhiềm bẩn
cúa không khí.

2.14. N ồi hấp
Nồi hâp là một thiêt bị bắt buộc phải có của một phòng kiêm
nghiệm vi sinh cho phép tiêu diệt cả tế bào sinh dưỡng lần bào tử của vi
sinh vật. Nồi hâp có cấu tạo 2 vỏ và có khả năng giừ áp suất cao. Phía
trong của nồi là buồng khứ trùng, nơi đặt các vật liệu cần khử trùng.
Buồng khứ trùng có lắp van thoát không khí, áp kế để xác định áp suất
và van báo hiểm để xì hơi khi áp suất vượt quá mức yêu cầu và đảm bảo
an toàn. Khoảng trông giừa 2 lớp vỏ là nơi chứa hơi nước. Nên dùng nước
cất hoặc nước lọc, trao đổi ion cho nồi hấp để trán h bị đóng cặn. Nước
cần điíực bô sung đê 11 mức quy định.

2.15. Tủ cây vô trù n g

Tú cấy vô trùng được dùng đố đảm bảo tính vỏ trùng cao khi thao tác
vói vi sinh vật. Không khí trong tủ cấy vô trùng được bơm khử trùng qua
màng lọc vô trùng. Đèn tử ngoại có tác dụng khử trùng bề mặt bàn thao
tác trong tu câv và bề m ặt các dụng cụ thiết bị khác. Trước khi sử dụng
tu cấy vô trùng cán bật đèn tử ngoại trước 30 - 60 phút. Khi bắt đầu thao
tác, tắt đèn tử ngoại và bật bơm lọc vô trùng không khí.

2.16. Kính h iến vi

Kính hiển vi dùng để phóng đại, quan sát vi sinh vật. Kính hiền vi
cần được đặt tại nơi trá n h được bụi và chấn động. Sau khi dùng kính với
dầu soi, dùng giây lau kính chuyên dụng thấm xylol lau vật kính 100X,
sau đó lau lại bằng giây lau kính khô. Khi không dùng phải đậy kính lại.

2.17. B ình ủ kỵ khí

Bình thủy tinh hoặc nhựa kín trong đó 0-2 bị loại bàng ngọn nến
hoặc bằng túi khử ôxi do phản ứng hóa học giữa H 2 và 0) tạo H^o. Phản
ứng này có thế được thực hiện bằng các túi Gas-Pak'1' chứa bicarbonate
natri, borohydriđe natri và xủc tác. Khí C 0 2 và H 2 được tạo th à n h khi có
sự hiện diện của hơi nước. (X. ảnh 1)
Các thiết bị trong phòng kiểm định vi sinh cần được kiêm tra định
kỳ tính chính xác cùng với nhừng chương trình bảo trì, hiệu chuẩn phù
hợp. Trên đây giới thiệu chung về các dụng cụ, thiết bị tối thiểu cần có
của một phòng kiểm định vi sinh. Các phương pháp kiểm tra thiết bị cần
được tiến hành theo những quy tắc của hệ thống an toàn chất lượng
phòng thí nghiệm và theo khuyên cáo của nhà san xuất.

35
 CHƯƠNG HI

PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN

VÀ CHUẨN BỊ MẪU

1. ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU

Trong đa số các trường hợp, việc phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mỷ phẩm là nhằm xác định sự hiện diện hay không (định
tính) của một hav một scí loài vi sính vật gây bệnh nhất định trong mẫu.
Hầu h ế t các phương pháp chuẩn để phân tích vi sinh vật trong các mẫu
nước, thực phẩm và mỹ phẩm được xây dựng từ các phương pháp phân
tích vi sinh vật bệnh phẩm. Tuv nhiên khác với mẫu bệnh phẩm, các mẫu
nước, thực phẩm và mỹ phẩm có một số đặc điểm sau đây:
- Mật độ của vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm thường
thấp hơn từ vài chục đến vài triệu lần so với trong bệnh phẩm.
- Trong mẫu bệnh phẩm, vi sinh vật gây bệnh thường ở trong trạng
thái tăng trưởng tốt và hiện diện khá đồng n h ất trong mầu. Ngược lại,
trong mầu thực phẩm và mỹ phẩm, vi sinh vật hiện diện ở mật độ thấp
và không có sự phân bô' đều trong mẫu.
- Trong quá trìn h chế biến thực phẩm, sản xuất mỹ phẩm, vi sinh
vật hiện diện trong nguyên liệu và bán thành phẩm thường bị tổn thương
ít nhiều và giảm sức sông do các biện pháp vật lý (nhiệt độ, ánh sáng...),
hóa học (chât ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao của muôi, dung môi...)
được sử dụng nhằm h ạn chế thấp n h ấ t sự hiện diện và tăng trưởng của vi
sinh vật trong quá trìn h chế biến sản xuất. Sự tổn thương và sức sông
yếu của vi sinh vật cần p hát hiện có thể làm sai lệch kết quả các phản
ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinh vật.
Do vậy, khác với các quy trình phát hiện vi sinh vật dùng trong
bệnh phẩm, hầu h êt các quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh để phục hồi sức
sống của các vi sinh vật bị tổn thương và bước nuôi tăng sinh chọn lọc
nhằm làm gia tăng m ật độ tương đôi của vi sinh vật cần phát hiện, ức
chê sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác. Các
biện pháp này giúp làm độ nhạy ph át hiện của các quy trìn h phân tích vì

36
sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm cao hơn rấ t nhiều so với các
quy trình dùng cho mẫu bệnh phẩm. Độ nhạy cao là yêu cầu rất quan
trọng để đạt mức giới h ạn cho phép sự hiện diện của vi sinh vật gây
bệnh trong các mẫu nước, íhực phẩm và mỹ phẩm (trong hầu h ết các
triíờng hợp là không có vi sinh vật gâv trong 25g mẫu).

2. THU, BẢO QUẢN VÀ CHUAN b ị m a u n ư ớ c

2. 1. Phương p h áp thu m ẫu và bảo quản m ẫu nước
Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mầu thu được có tính đại diện
cho khôi nước cần kiểm nghiệm. Khi thu mẫu nước cần lưu ý :
- Sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thề dùng nhiều
lần. Trường hợp dùng bình chứa dùng nhiều lần, chất liệu của bình phải
cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra các tạp chất ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật.
- Khi cần t h iế t phải bồ sung tác chất vô trùng để trung hòa các dư
lưựng chât diệt khuẩn hiện diện trong mẫu nước. Tác chất trung hòa này
phải không ảnh hưởng đến sức sống hoặc sự tăng trưởng của vi sinh vật.
Ví dụ đôi với các mẫu nước có chứa dư lượng chlor như nước máy, cần bổ
sung 0 ,lml dung dịch 1 ,8 % sodium thiosulfate (NaỵSỵOíỉ.õHaO) vào bình
thu mẫu có dung tích 100 ml trước khi khử trùng bình này.
- Lưu ý trán h gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu mẫu, bảo quản và
vận chuyến mẫu.
Trường hợp nước mặt, mẫu nước được thu
vào bình thủy tinh dung tích 100 đến 1000 ml
đã khử trùng, c ầ n chú ý không để mẫu nước
bị nhiễm bởi tay hay bởi dây sử dụng khi thu
mầu. Để thu các mẫu nước ở độ sâu n h ất định
người ta dùng bình thu mẫu chuyên dụng như
hình bên. Trường hợp này người ta thả bình
thu mẫu xuống độ sâu cần thiết, dùng dây mở
nắp bình rồi thu mẫu. Trường hợp nước ngầm,
dùng bơm để thu mẫu. Đối với hầu h ết các
mẫu nước, cần chừa một khoảng không khí đủ
lớn giữa m ặt nước và nắp bình.
Do chủng loại và m ật độ vi sinh vật trong
nước thay đổi rấ t nhiều theo bề mặt, độ sâu và
chất lượng nước n ên cần đánh giá chất lượng
Hình 3.1 Bình thu mẫu nước

37
chung về vi sinh vật, khi thu mâu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu
khác nhau.
Trường hợp nước mặt, vi sinh vật trong nước mặt có dòng chảy như
nước sông có mật độ thay đổi rất nhiều theo lưu tốc, độ sâu. Do vậy để có
được mẫu có tính đại diện cần chọn nơi nước chảy (giữa dòng) và độ sâu
20 - 30cm đế thu mẫu. Thông thường cần thu mẫu tại nhiều điểm từ thượng
lún xuống cửa sông. Trường hợp nước ao hồ, để có số liệu về sự phân bô bề
mặt của vi sinh vật, tùy kích thước của ao hồ, cần chọn từ 5 đến 10 điếm
cách nhau những khoảng thích hợp. Đế có sô" liệu phân bố theo chiều sâu,
thông thường người ta lấy một mẫu ở đáy ao hồ và sau đó thu các mẫu theo
một khoáng cách nhất định từ điểm đáy. Trường hợp nước ngầm, cần chọn
5 đến 10 địa điểm trở lên. Trường hợp này cần lưu ý đến các yếu tố như độ
sâu, thành phần đất, khoảng cách từ nguồn ô nhiễm.
Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông till
cán thiết lièn quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu...).
Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu. Do việc
phân tích thường được tiến hành ờ tại phòng thí nghiệm nên cần vận
chuyển mẫu từ nơi thu mẫu về phòng thí nghiệm. Trường hợp nàv cán
báo quán mẫu ở nhiệt độ dưới 10°c bằng nước đá hoặc đá khô trong khi
vận chuyên. Trường hợp không thực hiện được việc phân tích ngay thì
cần bao quán mẫu ở 0 - 5°c trong tủ lạnh và liên phân tích trong vòng từ
6 - 1 2 giò'.

2.2. C huẩn bị m ẫu
Trong đa số các trường hợp, mẫu nước không cần được xử lý gi dặc
biệt trước khi phân tích vi sinh vật. Khi cần thiết, mẫu cần được pha
loãng thập phân để được các độ pha loãng cần thiết bằng nước cất, nước
muõi sinh lý hay môi trường lỏng vô trùng.

3. THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN b ị MẪ ư THựC PHAM

3.1. Phương p h áp th u m ẫu và b ảo quản m ẫu thực phẩm
Tiêu chuấn quy định về m ật độ cho phép của các vi sinh vật trong
thực phẩm thay đối tùy theo nhóm vi sinh vật cần phân tích, đôi tượng
thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của từng nước. Đối
với vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thường quy
định không cho phép có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong một
đơn vị khôi lượng thực phẩm n h ất định. Trường hợp này cần định tính sự
hiện diện của vi sinh vật. Thông thường, tiêu chuẩn quy định m ật độ vi
sinh vật cho phép hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định,

38
trong trường hợp này cần tiến hàn h định lượng mật độ vi sinh vật hiện
diện trong mẫu kiểm. Tuy nhiên, kết quả phân tích, định lượng vi sinh
vật trong từng mẫu thực phẩm thường không phản ánh chính xác m ật độ
vi sinh vật thực tế hiện diện trong mẫu. Do vậy, thông thường cần thực
hiện việc định lượng trên một sô lượng mẫu xác định và sử dụng nhừng
khoảng giới hạn quy ước để nhận định kết quả như sau:
- Khoảng Lhâp nhận: khi m ật độ vi sinh vật nằm dưới một trị số
là m.

- Khoảng không châp nhận: khi m ật độ vi sinh vật cao hơn một trị
số giới hạn là M. Thông thường, trị số giới giới hạn M lớn hơn ít n h ất 10
lần trị sô m.
~ Khoảng lân cận giới hạn: khi m ật độ vi sinh vật lớn hơn m nhưng
nhỏ hơn M.
Ví dụ tiêu chuẩn về tống số vi sinh vật trong sản phẩm trứng được
thanh trùng Pasteur được quy định như sau : n = 5 , c = 2 ; m = 5 x lo'1;
M = 106 CFU/25g; trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được
phép nằm trong khoảng lân cận giới hạn.
Dựa vào tiêủ chuẩn quy định, người phân tích cần có kế hoạch lấy
mầu thích hợp. Kế hoạch này bao gồm các thông số là khối lượng (5, 10 ,
2 0 , 25g hay nhiều hơn) và số lượng mẫu cần phân tích. Các thông sô" này
thay đổi tùy thuộc vào mức độ nguy hiểm của từng loại thực phẩm khi có
sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có môi nguy hiểm cao
là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay là
thực phẩm dành cho đôì tượng có độ mẫn cảm cao như người già, trẻ em...
Kết quả phân tích, định lượng phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp
và quy trình thu mẫu. Do vậy quy trình và phương pháp thu mẫu thường
được quy định cho từng trường hợp cụ thể để mẫu thu phản ánh đúng
tình trạng sản phẩm cần phân tích. Trong các nhà máy sản xuất, chế
biến thực phẩm, về nguyên tắc mầu cần được thu tại nhiều thời điểm và
công đoạn khác nhau trong quá trìn h sản xuất, trá n h việc thu chỉ tại 1
thời điểm, 1 vị trí hay công đoạn. Tuy có thể tập trung thu mẫu tại công
đoạn thàn h phẩm, nhưng tốt n h ấ t là thu mẫu tại một vài công đoạn
trọng yếu trong quá trình sản xuất.

3 . 1.1. Dụng cụ thu, chứa m ẫu

Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại thực phẩm. Trường hợp thực
phẩm đông lạnh, có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, các dao đã
được sát trùng để tách th à n h lượng mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo...

39
đế cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý trán h thu các mảng băng.
Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu
bằng cách chọn lấy các gói lớn từ đó lây ra các bao nhỏ hơn.
Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc sô lượng các
chỉ tiêu cần phân tích nhưng ít n hất là khoảng 100 - 250g. Mẫu cần đảm
bảo tính đại diện. Để có được khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu
tại nhiều vị trí trên nguyên liệu hay thành phẩm. Trường hợp mẫu phân
tích là bán th à n h phẩm đang được chế biến, cần thực hiện thu mẫu tại
nhiều vị trí trong cùng một công đoạn. Đôi với các loại mẫu như thịt hay
cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que
bông vô trùng quét một diện tích bề m ặt n h ất định hay cắt lát với bề dày
2 - 3mm đế thu mẫu.

Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay
bằng chât dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy
tinh đề chứa mẫu vì dễ vỡ.

3.1.2. Vận chuyển và b ào quản m ẫu

Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các
thùng bảo quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải
không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí
nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và
được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu phải
được bảo quản ở -20°c cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể
bảo quản đông, thì có th ể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 - 4°c nhưng
không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ
ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ
phòng cho đến khi phân tích.

3.2. C hu ẩn bị m ẫu
3.2.1. G iả i đông m ẫu trước khi p hân tích

Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước
khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích,
mẫu phải được giải đông bên trong các dụng cụ chứa đã được sử dụng để
thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang
dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 - 5°c trong
khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45°c trong 15
phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ
giải đông và ỉàm đồng n h ấ t nhiệt độ bên trong mẫu.

40
 3.2.2. Đ ồ n g n h ấ t m â u

Do sự phân bô không đồng đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên
mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng n h ấ t các
mầu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu
rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như thiết
bị dập mẫu (stomacher) (X. ảnh 2), trong điều kiện vô trùng.
Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chỉ tiêu phân tích, thực
hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ đôi
với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích làlOg; đối với
các chí tiêu định tính, lượng mẫu trích ra đế ph â n tích là 25g ...

3.2.3. C â n m ầ u

Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy
theo yêu cầu của chi tiêu phân tích với sai số cho phép là ± 0,lg. Lượng
mẩu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa
vô trùng.

4. THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN b ị m a u m ỹ PHAM

Việc kiếm soát vi sinh vật trong mỹ phẩm cũng như trong các loại
sán phẩm khác phải được kiểm tra cả ở khâu nguyên liệu lẫn sản phẩm,
đặc biệt là nguồn nước sử dụng. Nước phải được khử trùng sau khi đã khứ
khoáng và ion để đảm bảo hoàn toàn tinh sạch. Mẫu nước sử dụng cho
mỹ phâm được thu, bảo quản, phân tích tương tự như trường hợp nước cho
thực phẩm.

4. 1. Phương ph áp thu và b ảo quản m ẫu m ỹ phẩm

Mẫu nguyên liệu hay mỳ phẩm nên được phân tích ngay khi nhập
kho hay sau khi thu mẫu. Trường hợp không được phân tích ngay, mẫu
cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng, không được làm lạnh hay cấp đông.
Trước khi phân tích cần quan sát và ghi nhận trạng thái, hình dạng bên
ngoài đế phát hiện các hiện tượng bất thường của mẫu hay sản phẩm.
Khứ trùng bề mặt mẫu với hỗn hợp 70% ethanol và \ c/c HC1 (v/v). Trong
điều kiện cho phép, thực hiện thao tác trong tủ cấy vô trùng hay trong
không gian vô trùng của ngọn đèn và bàn làm việc. Lau khô bề m ặt mẫu
với bông vô trùng trước khi mở dụng cụ bình chứa. Thu lấy một lượng
mầu đủ lớn và đảm bảo tính đại diện đế phân tích. Đối với những sản
phẩm có trọng lượng ít hơn 1 g, tiến hành thu toàn bộ khối lượng trong
sản phẩm đế phân tích. Nếu số lượng mầu bị giới hạn (chỉ có một mẫu
nhưng cần phân tích rấ t nhiều chí tiêu như vi sinh, độc tô và các thành
phần hóa học khác), tiến hàn h thu mẫu đẽ phân tích các chỉ tiêu vi sinh
vật trước khi phân tích các th à n h phần khác.

41
 4. 2. C huẩn bị m ẫu trước k h i p h ân tích
- Trường hợp mẫu dạng lỏng: lấy lml mẫu cho vào trong 9mi môi
trường Letheen Broth cải biên chứa trong ông nghiệm để được dung dịch
mẫu có độ pha loãng 1CT1.
- Trường hợp mẫu dạng rắ n và dạng bột: chuyển 1g mẫu vào trong
ống nghiệm chứa lm l Tween 80 vô trùng, bổ sung 8 ml môi trường
Letheen Broth cải biên, trộn đều bằng máy lắc ông nghiệm để được dung
dịch có độ pha loãng 1CT1.
- Trường hợp mẩu dạng kem và nhũ dầu: chuyển 1g mầu vào trong
ống nghiệm có nắp chứa lm l Tween 80, cho vào trong ông 5 - 7 viên bi
thủy tinh. Trộn đều các th à n h phần trong ông bằng máy lắc ông nghiệm.
Bô sung 8 ml môi trường Letheen Broth cải biên để có dung dịch có độ
pha loãng 10 ”1.
- Trường hợp mẫu dạng giọt khí (aerosol), dạng bọt (foam) và các
trạn g thái khác: dùng m ảnh bông thấm cồn 70% lau th ậ t kỳ vòi phun để
khử trùng. Bơm để đẩy ra ngoài một phần sản phẩm bên trong. Chuyến
lg mẫu vào lọ chứa 9ml môi trường Letheen Broth cải biên, trộn đều
bằng máy lắc ống nghiệm để được dung dịch có độ pha loãng 10 ' \

42
 CHƯƠNG IV

KỸ THUẬT C ơ BẢN TRONG PHÂN TÍCH,

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

1. PHA CHÊ MÔĨ TRƯỜNG VÀ CÁC KỸ THUẬT VÔ TRÙNG

1.1. Các lo ạ i m ôi trư ờng n u ôi câ y vi sin h vật
Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sình vật, môi trường cần cho việc
tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh
vật. Môi trường cần chứa đầy đủ các thàn h phần về nguồn carbon, đạm,
khoáng đa lượng và vi lượng... cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng
lượng của đôi tượng vi sinh vật quan tâm. Ngoài các thành phần dinh
dường cần thiết, môi trường còn cần chứa hàm lượng nước thích hợp, có
độ pH xác định và có kết cấu lý tính thích hợp cho sự tăng trưởng của vi
sinh vật mục tiêu. Trường hợp môi trường chọn lọc, môi trường còn có thể
chứa thêm kháng sinh, chất ức chế sự tàng trưởng của các vi sinh vật
không mong muốn khác.
Môi trường có thế dược phân th à n h các loại khác nhau theo bản chất
của thàn h phần môi trường, theo tính chât vật lý và theo công dụng.
Về bản chất của th à n h phần môi trường, môi trường vi sinh vật có
thể được chia thàn h loại là môi trường tự nhiên và mỏi trường tổng hợp.
Môi trường tự nhiên có th à n h phần được sản xuất từ các sán phẩm có
nguồn gốc động, thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là
không xác định. Môi trường tổng hợp được điều chế từ các hóa chất tông
hợp tinh khiết với hàm lượng xác định. Ngoài ra còn có môi trường bán
tống hợp là môi trường tổng hợp có bổ sung một số th à n h phần có nguồn
gốc tự nhiên do vậy thực chất th à n h phần chính xác của môi trường cũng
không hoàn toàn được xác định. Hiện nay các phòng kiểm nghiệm vi sinh
vật thường sử dụng môi trường tổng hợp hoặc bán tổng hợp dạng đông
khô dạng thương phẩm của các hãng sản xuất mồi trường chuyên nghiệp
như DIFCO, BBL, MERCK, OXOID, HIGH-MEDIA...
Về tính chất vật lý, môi trường được chia thàn h môi trường lỏng,
môi trường rắn và môi trường bán rắn (xốp). Môi trường lỏng dược dùng
đê nuôi tăng sinh, thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa. Ngoài ra,

43
môi trường này còn được dùng để giữ giống và bảo quản giông nhiều loại
vi sinh vật không tàng trưởng tốt trên môi trường rắn. Môi trường rắn
được dùng đê ph ân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu các đặc điếm hình thái
khuẩn lạc, đặc điểm tăn g trưởng, đế định lượng mật độ vi sinh vật, đế
cấy chuyền, giữ giông... Môi trường bán rắn được dùng trong lên men vi
sinh trong công nghiệp.
Về công dụng, môi trường có thế dược chia thành các loại như sau:
- Môi trường tiền tăng sinh (preenrichment media): là môi trường
ỉỏng dùng đề tăng sinh không có tính chọn lọc, làm giàu mật độ của các
vi sinh vật hiện diện trong mầu. Loại môi trường này giàu dinh dưỡng,
không chứa các chất ức chế tăng trướng đặc hiệu, có tác dụng phục hồi và
giúp sự tăng trướng đồng thời của nhiều loài vi sinh vật hiện diện trong
thực phẩm nhưng ít nhiều bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo
quản thực phẩm. Ví dụ nước pepton đệm là môi trường tiền tăng sinh
trong kiểm nghiệm các loài vi khuẩn đường ruột thuộc họ
Enterobacteriaceae.
- Môi trường tăng sinh (enrichment media): là môi trường lỏng dùng
đê tăng sinh chọn lọc đôì tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm, ức chế sự
tăng trưởng của các vi sinh vật khác do chứa chất ức chê tàng trưởng đặc
hiệu. Ví dụ môi trường tetrathionate là môi trường tăng sinh chọn lọc cho
Salmonella.
- Môi trường chọn lọc (selective m edia): là môi trường rắn dùng đế
phân lập chọn lọc các khuẩn lạc đơn của đối tượng vi sinh vật mục tiêu.
Các môi trường phân lập khác nhau có mức độ chọn lọc khác nhau. Thông
thường để phân lập khuẩn lạc đơn để xác định vi sinh vật người ta sử
dụng vài môi trường có mức chọn lọc khác nhau. Mức độ chọn lọc có thế
kiểm soát bằng các chất ức chế tăng trưởng, thành phần môi trường,
nhiệt độ, ôxi...
- Môi trường phân biệt (differential media): là môi trường rắn chọn
lọc chứa các th à n h phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng
vi sinh vật mục tiêu.
- Môi trường chọn lọc - phân biệt (selective - differential media): là
môi trường k ết hợp giữa công dụng chọn lọc và phân biệt nhờ sử dụng
kết hợp các hóa chât khác nhau. Ví dụ môi trường Manitoì Salt Agar chứa
nồng độ cao của muôi (7,5%) giúp sự tăng trưởng chọn lọc của
Staphylococcus trong khi ức chế sự tăng trưởng của đa số các vi sinh vật
khác; m ặt khác manitol và chỉ thị pH trong môi trường giúp nhận diện
các khuẩn lạc Staphylococus dựa vào khả năng lên men manitol sinh acid
làm đổi màu của chỉ thị đỏ phenol.

44
 - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định
một hoặc vài đặc điêin sinh hóa của chủng vi sinh vật đã được phân lập
và làm thuần, tạo CO' sở để định danh chủng phân lập. Ví dụ môi trường
MIR (Motility Indol Red) dùng đế xác định tính di động, khả năng tạo
indol và khả năng phân giải urê của một chủng phân lập.

1.2. Pha c h ế m ôi trư ờng

Pha chê môi trường là một trong những khâu quan trọng trong kiểm
định vi sinh vật, cần được thực hiện cẩn th ậ n và chính xác. Môi trường
có thể tự điều chê từ các hóa chất, th ành phần riêng biệt dựa vào công
thức môi trường hoặc từ các môi trường đông khô dạng thương phẩm.

1.2.1. M ôi trường tự pha chế

Trình tự pha chê môi trường như sau :

- Cân, đong chính xác từng thàn h phần của môi trường.
- Đối với môi trường lỏng, các chât sau khi được cân đong, được cho
hòa tan vào nước. Đối với môi trường rắn, cần bố sung thêm agar.
- Môi trường cần phải trong để dễ quan sát, nếu cần thiết thì phải
được lọc.
- Tùy theo đôi tượng vi sinh vật được nuôi cấy và tùy theo yêu cầu
khảo sát. môi trường được điều chỉnh pH bằng HCl hoặc NaOH IN, hoặc
các dung dịch khác như H 3PO 4, H 2SO 4, KOH, NaaCOs- trước khi được khử
trùng. Việc điểu chỉnh này được thực hiện bằng máy đo pH.
- Chỉ sử dụng một phần trong dung tích tổng của bình chứa để chứa
môi trường. Với bình cầu thường dùng khoảng 1/3-1/2 dung tích bình; với
ống nghiệm thường dùng khoảng 5ml khi làm môi trường lỏng và 5 - 7ml
khi làm ống thạch nghiêng.
- Nhiệt độ và thời gian khử trùng phụ thuộc vào thành phần của
môi trường. Các cơ chất không bền với nhiệt độ ở 121°c phải được khử
trụng ở 0 ,5 atm. Các môi trường có chứa đường và vitamin được khử trùng
ở 0,5atm trong 20 - 30 phút. Các môi trường khác được khử trùng ở 121nc
(latm) trong 15 - 20 phút.
Sau đây là ví dụ về sự chuẩn bị một sô" môi trường vi sinh vật thường
dùng :
- Chuẩn bị môi trường PGA (Potato Glucose Agar) đổ đĩa để nuôi cây
nấm men, nấm mốc: cân lượng cần thiết các thành phần mồi trường (xem
phụ lục) đủ cho 50mỉ môi trường PGA. Khoai tây được gọt vỏ, cắt lát, nấu
sôi để lấy nước chiết. Cho glucose vào và làm tan hoàn toàn. Bổ sung

45
lượng nước cho đủ theo công thức. Cho agar vào, đun sòi và khuấy đều cho
đèn khi agar vừa tan. Đậy bằng giấy nhôm. Khử trùng ớ 1 atm trong
30 phút.
- Chuẩn bị môi trường nước pepton để nuôi tăng sinh vi khuẩn: cân
lượng cần th iết các th à n h phần môi trường {xem phụ. lục) đủ cho 50ml
môi trường 11ƯỚC pepton, cho vào bình tam giác. Hòa vào nước cho đủ
50ml. Đậy bình bằng nút bông. Khử trùng ở 1 atm trong 30 phút.

1.2.2. Chuẩn bị m ôi trường từ môi trường đông khô

Hiện nay hầu h ết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng
môi trường dông khô thương phẩm đế pha chê môi trường nhằm hạn chê
biến động th à n h phần môi trường ở các lần kiêm nghiệm khác nhau. Môi
trường này cần được bảo quản nơi khô mát, trá n h ánh sáng và trong bình
dậy kín để môi trường không bị hút ẩm, kết vón, thay đổi pH. Việc pha
chế các môi trường này tương đôi đơn giản với các bước cân, hòa tan,
chinh pH và hấp khử trùng. Sau đây là phương pháp pha chê các loại môi
trường này và một sô lưu ý:
- Cán lượng môi trường đông khô cần thiết trong bình chứa. Bổ sung
một thế tích nước cất hoặc nước khử khoáng bằng một nửa dung tích cần
thiết. Lắc kỳ đế hòa tan hoặc tạo th à n h huyền phù đồng nhất. Bố sung
phần nước còn lại sao cho không còn bột môi trường dính trên th ành
bình. Trường hợp môi trường chứa agar hoặc gelatin, cần phải gia nhiệt
đê làm tan môi trường. Có thể làm tan bằng cách đun trong bếp cách
thùy hoặc trong nồi hấp ở áp suất thấp. Trường hợp cần pha một dung
tích lớn (vài ìít) môi trường rắn, phương pháp hợp ỉý là hòa môi trường
vào khoảng 1/10 dung tích nước cần thiết, để trương trong 15 phút. Phần
nước còn lại dược đun sôi; đổ dung dịch môi trường bail đầu vào, sau đó
hỗn hợp được đun cho đến khi môi trường tan hoàn toàn. Một số môi
trường lỏng chứa th à n h phần không tan trong nước. Trong trường hợp
này, cần đảm bảo th à n h phần này được phân tá n đồng đều trong môi
trường và độ đục của môi trường là đồng nhất.
- Thông thường môi trường được pha chế bằng môi trường đông
khô có giá trị pH thích hợp, không cần phải thực hiện việc chỉnh pH
sau khi được pha chế. Tuy nhiên, trường hợp bât thường có th ể tiến
h ành đo và chỉnh pH sau khi pha chế. Trường hợp này cần lưu ý hiệu
chuẩn điện cực bằng các dung dịch pH chuẩn, còn mới. Nếu pH môi
trường không đạt giá trị cần thiết, tiến h àn h chỉnh pH bằng dung dịch
HC1 hoặc NaOH IN.

46
 1.2.3. Phân phôi môi trường vào dụng cụ chứa

Môi trường sau khi được pha chế được phân phối vào các dụng cụ
thích hợp tòng nghiệm, bình tam giác, hộp petri) tùy mục đích sử dụng
trước khi được khử trùng.
Đế khảo sát các phản ứng sinh hóa, lên men, tiền tăng sinh, tăng
sinh, môi trường dạng lỏng thường được chứa trong ô'ng nghiệm thủy
tinh. Môi trường sau khi pha chế được phân phôi thành lượng thích hợp
vào ống nghiệm bằng cách rót bằng phều thủy tinh, hút bằng ống hút
cùng quả bóp cao su hoặc bằng ông hút tự động (pipetman) bằng tay hoặc
dùng điện. Các ống nghiệm chứa môi trường lỏng được đậy bằng nút bông
không thấm nước, nút silicon (khi nuôi cấy lắc), bằng nút nhôm, nút inox
(nuôi cấy tĩnh).
Đê nuôi tiền tăng sinh, tãng sinh với dung tích ìớn, môi trường lỏng
thường được chứa trong các bình tam giác. Môi trường được pha chế
thành dung tích cần th iết trực tiếp trong bình chứa hoặc được pha chế
trong bình chứa lớn hơn, sau đó được đong bằng ông đong thành dung
tích cần thiết và chuyển vào bình tam giác có dung tích cần nuôi cấy
thích hợp. Các bình tam giác chứa môi trường này được đậy bằng nút
bông không thấm hoặc bằng nút silicon.
Để khảo sát khả năng tàng trưởng, hình thái khuẩn lạc trê n môi
trường chọn lọc hay phân biệt, để định lượng vi sinh vật... người ta thường
nuôi chủng trên môi trường rắn trong đĩa petri. Các hộp petri chứa inôi
trường rắn được chuẩn bị bằng phương pháp đổ đĩa. Trong trường hợp
này, môi trường rắn được pha chế và đun tan trong bình tam giảc lớn.
Binh này được đậy băng giấy nhôm (aluminum foil) hoặc bằng nút silicon
(hạn chế đậy bằng nút bông vì làm tăng nguy cơ nhiễm khi rót môi
trường). Trường hợp không có giấy nhôm hoặc nút silicon có thể sử dụng
giây dày, dai để bịt miệng bình và cột kỹ bằng dây thun. Sau khi khử
trùng, môi trường được đổ vào các đĩa petri vô trùng khi đã nguội khoảng
45 - 55°C.
Để khảo sát các khả năng tăng trưởng, tạo bào tử, một số thử
nghiệm sinh hóa, cây chuyền, bảo quản giông, người ta thường sử dụng
ống nghiệm chứa môi trường rắn có m ặt môi trường nghiêng để tăng diện
tích bề m ặt môi trường (ông thạch nghiêng). Trong trường hợp này, môi
trường rắn được chuẩn bị và đun tan trong bình tam giác hoặc bình chứa
lớn, sau đó được rót vào các ông nghiệm bằng phễu thủy tinh th à n h
nhừng phần từ 5 - 6 ml. Miệng các ống nghiệm được đậy bằng nút bông
không thấm nước. Bề m ặ t thạch nghiêng dược tạo sau khi hấp khử trùng
môi trường.

47
 Đê nuôi cấv VI sinh vật kỵ khí, ông thạch sâu (ông thạch đứng) chứa
m ôi trư ờ n g rắ n th ư ờ n g được sử dụng. O ng m ôi trường n à y được ch u ẩn bị
tương tự ống thạch nghiêng nhưng với lượng môi trường nhiều hơn
{khoảng 1/2 ống nghiệm).

1.3. Khử trù n g d ụ n g cụ v à m ôi trường

Về nguyên tắc có thể tiệt trùng vi sinh vật bằng một sô' tác nhân lý
hóa như nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất. Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi
sinh vật do tác dụng làm biến tính enzyme, m ất nước và ôxy hóa các
th à n h phần của tế bào; nhiệt độ thấp ức chê sự tầng trưởng của chúng.
Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô (sấy 170°c trong 2 giờ;
đốt) hoặc nhiệt ẩm (đun ở 63°c trong 30 phút hoặc 72°c trong 15 phút để
diệt vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm; đun
sôi 100°c trong 10 phút để diệt tế bào sinh dưỡng và hấp bằng hơi nước ở
latm, 121°c trong 15 - 30 phút để tiệt trùng hoàn toàn). Năng lượng
chiếu xạ ở bước sóng ngắn ítia X, tia gamma) có khả năng ion hóa phân
tử nước tạo gốc tự do tác dụng phá hủy DNA, màng lipid, protein trong tế
bào; tia xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng ion
hóa nhưng có thể cảm ứng việc tạo th ành dimer giữa base pyrimidine
(T, C) trong nucleic acid tạo nên (Jột biến, có thể gây chết tế bào. Các
dịch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có
kích thước giới h ạ n (0 ,2 |im), cho phép dịch lỏng đi qua và giữ lại tất cả vi
khuẩn và các vi sinh vật có kích thước lớn hơn. Nhiều hóa chất có thể
kiểm soát sự tăn g trưởng của vi sinh vật. Ethylen oxide, triethylen glycol,
chất diệt khưẩn, kháng sinh... được sử dụng để khử trùng, ức chế sự sông
và tăng trưởng của vi sinh vật.
Tác nh ân khử trùng được chọn tùy mục đích và vật liệu cần khử
trùng. Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương
pháp nhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (ở 121°c, 15 - 30 phút) thường được
sử dụng để các th à n h p h ần hữu cơ của môi trường không bị cháy, biến
tính và môi trường không bị m ất nước. Trường hợp môi trường chứa các
chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt như vitamin, amino acid
hoặc huyết th a n h chứa các protein là nhân tô' tăng trưởng, phương pháp
nhiệt ẩm có th ể làm biến tính các th ành phần này, nên các th à n h phần
này thường được khử trùng riêng bằng phương pháp lọc qua màng lọc vô
trùng. Các dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường được khử trùng
bằng phương pháp nhiệt khô trong tủ sấy. Các thanh gạt thủy tinh được
khử trùng bằng cách đôt với cồn 70° và các que cây kim loại được khử
trùng bằng cách đốt trực tiếp trên ngọn lửa.

48
 1.3.1. Khử trùng mỏi trường, dụng cụ bằng nồi hấp áp lực

Sau đây là phương pháp sử dụng

nồi hấp áp lực để khử trùng bằng
phương pháp nhiệt ẩm. Phương pháp
này dựa trên nguyên tắc làm gia tăng
nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới
một áp suât lớn hơn áp suất bình
thường của khí quyến. Khi áp suất hơi
nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng
theo. Phương pháp khử trùng bằng
nhiệt ấm này cho phép diệt cả t ế bào
sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.
Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp
lực như sau: Bổ sưng nước ở đáy nồi
đến vạch quy định, x ếp dụng cụ và vật
liệu cần khử trùng vào giá, không nên
xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ
dàng. Đậy kín nắp nồi hấp. Mở van
thông hơi nước giữa hai nồi (trường
hợp n ồ i h ấ p h a i lớp). B ậ t cô n g tắ c Hình 4.1 Nổi hấp áp lực
điện, đun nồi hâp. Khi nhiệt độ lên
đến 80uc hoặc 0,5atm, mở từ từ van xả để đuổi h ết không khí ra khỏi nồi
trong vòng 3 - 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng
van lại. Khi áp suất nồi trong lên đến áp suất cần hấp bắt đầu tính thời
gian hấp. Khi đủ thời gian khử trùng, tắ t điện, chờ nhiệt độ và áp suất
hạ xuông giá trị 0 mới được mở nắp để tránh gây tai nạn hoặc tránh áp
suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường. Một sô"nồi hấp hiện đại có thể
tự kiểm soát thời gian, áp suất và tự đuổi khí ra khỏi nồi, cho phép bỏ
qua một sô' thao tác tương ứng ở phần trên, Nồi hấp áp lực có thể được
thiết kế đứng (nắp nồi ở phía trên) hoặc nằm (nắp nồi ở bên hông).
Khi sử dụng nồi hấp áp lực dể khử trùng cần lưu ý những điểm sau
đây:
- Nồi hấp là thiết bị khử trùng bằng hơi nước, cần đảm bảo đủ nước
mới tiệt trùng tốt, m ặt khác, thiếu nước sẽ làm cháy điện trở. Do vậy,
cần kiểm tra mực nước và bổ sung lượng nước cần thiết trước khi sử dụng.
- Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo từng cặp đối xứng
để đảm bảo độ kín, tránh làm nắp bị chênh hoặc hư vòng đệm cao su.
- Tuyệt đốì không mở nắp nồi khi kim chỉ nhiệt độ và áp suất chưa
trở về sô" 0 .

4-PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 49

 Sau khi hấp khử trùng xong cần lấy sớm dụng cụ, bình chứa môi
trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng
của nhiệt lên môi trường. Các bình chứa môi trường có thế được làm
nguội n hanh dưới vòi nước chảy.
Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi
được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt nhưng
đảm bảo cho phép không khí và hơi nước thông qua bằng một trong các
phương pháp sau:
- Dùng nút bông không th ấ m nước, nút silicon, nắp nhôm (trường
hợp môi trường sẽ được dùng đế nuôi cây vi sinh vật trong cùng vật
chứa).
- Dùng giây nhôm (trường hợp môi trường được dùng để đổ đĩa petri,
trường hợp nước và các dung dịch cần vô trùng khác).
Thông thường, các đĩa petri hoặc nut bông còn được bao gói bằng
giây hoặc giấy nhôm đế giảm thiểu nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng.
Sau khi hấp, các đĩa petri vô trùng cần được sấy khô trước khi dùng.

1.3.2. Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô

Các đĩa petri thủy tinh, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể được
khử trùng bằng phương pháp sấy ở 180°c trong 2 giờ trong tủ sấy. Trong
trường hợp này, các ống hút cần được nhét nút bông không thấm nước ở
đầu hút. Đĩa petri thủy tinh, ống hút, các dụng cụ cần khử trùng khác
được gói kín bằng giấy, giấy nhôm trước khi sấy. Các ông hút có thể được
đặt chung trong một ô'ng bằng thép không rỉ trước khi cho vào tủ sấy.

1.4. C huẩn bị ô n g th ạ ch n g h iê n g và dổ dĩa

- Ông thạch nghiêng: sau khi khử trùng xong, các ống nghiệm chứa môi
trường rắn dùng để làm ống thạch nghiêng {xem mục 1.2.) được lấy ra
khỏi nồi hấp. Đầu ông nghiệm được đặt trên một vật có độ cao vừa phải
để tạo độ nghiêng sao cho chiều dài của môi trường đạt không quá 2/3
chiều cao cíng nghiệm và tuyệt đôì không để thạch chạm nút bông. Để
yên cho môi trường nguội lại và tạo th à n h m ặt thạch nghiêng.
- ĐỔ đĩa: môi trường rắn dùng để đổ đĩa petri chứa môi trường rắn
(xem mục 1.2.) cần được đổ đĩa ở nhiệt độ khoảng 45 - 55°c nhằm hạn
chế sự ngưng tụ hơi nước trên nắp đĩa petri nhưng không đế' môi trường
quá nguội làm thạch bị đông đặc cục bộ, bề m ặt môi trường không phẳng.
Cần lắc nhẹ vài vòng bình tam giác để đảm bảo môi trường đồng n h ất
trước khi đổ đĩa. Việc đổ đĩa được thực hiện trong tủ cấy vô trùng trong
không gian vô trùng của ngọn dèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tuần tự rót vào

50
mỗi đĩa một lượng môi trường thích hợp sao cho bề dày môi trường trong
đĩa đạt khoảng 3 - 4mm. Có thề loại bỏ các bọt khí xuất hiện trên bề mặt
môi trường trong đĩa bằng cách hơ nhẹ dĩa trên ngọn lửa. Sau khi đô
xong, đặt nắp trên cua đĩa lên một cạnh của nắp dưới và đê đĩa yên ở
trạng thái này cho đến khi thạch đông lại trong tủ cấy vô trùng với đèn
tử ngoại và bơm lọc khí hoạt động. Sau khi môi trường đông rắn, đậy nắp
đĩa petri. Đĩa được giữ ờ nhiệt độ thường trong tủ cấy hoặc giữ trong tủ
lạnh cho đến khi dùng. Trong trường hợp giừ trong tủ lạnh, khe giữa hai
nắp cúa đĩa môi trường cần được dán kín bằng băng keo hoặc bằng màng
paraíìn để trán h mất nước làm khô môi trường. Bề m ặt thạch bị ướt có
thê được làm khô đế trá n h hiện tượng vi sinh vật mọc loang bằng cách ủ
trong tủ ấm ở 30 - 40ƯC vài giờ hoặc qua đêm.

Nhìn
A

Nhìn

Agar
(thạch)
Môi trường Môi trường
Môi trường lỏng thạch sâu Đĩa thạch
thạch nghiêng

Hình 4.2 Một sô dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri

1.5. Các kỹ th u ậ t th ao tá c vô tr ù n g
Trong phòng thí nghiệm, vi sinh vật cần được nuôi cây vào nhiều
dạng môi trường khác nhau để tăng sinh, khảo sát đặc tính tăng trưởng
và biến dưỡng, thử nghiệm sinh hóa, định danh. Việc cấy chủng cần được
thực hiện sao cho không đưa vi sinh vật khác hay vi sinh vật tạp nhiễm
vào môi trường. Kỹ thu ật thao tác vô trùng được sử dụng để loại trừ các
vi sinh vật gây nhiễm. Môi trường, các dụng cụ chứa môi trường, dụng cụ
nuôi câv hoặc dụng cụ cần thiết khác cần được khử trùng một cách thích
hợp đế có được trạng thái vô trùng trước khi sử dụng.
Chủng vi sinh vật sẵn sàng cho nuôi cây có thể ở một trong các dạng
sau:
- Dịch nuôi cấy hoặc canh trường lỏng (broth culture), trong đó chứa
một số lượng lớn tế bào của chủng vi sinh vật quan tâm.
- Dạng trên bề mặt môi trường rắn chứa agar (1,5 - 2%) trong ống
thạch nghiêng hay trong đĩa petri.

51
 - Dạng nằm sâu trong môi trường rắn trong ống thạch sâu chứa agar
mềm (0,5 - 0,7%).
Chủng có thể được -Cấy vào môi trường lỏng hoặc lên bề mặt môi
trường rắn bằng một số dụng cụ sau:
- Que cấy thẳng: quẹ cấy kim loại có đầu nhọn, thường dùng để cấy
chủng ở dạng khuẩn lạc tỉừ môi trường rắn lên môi trường rắn hoặc lỏng.
- Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy vi sinh
vật có tạo hệ khuẩn ty.
- Que cấy vòng: que cấy kim loại đầu có vòng tròn, thường dùng để
cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.
- Ong hút thủy tinh dừng để chuyển một dung tích nhất định giống
lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng. Hiện nay, pipetman
với đầu tip vô trùng được sử dụng thay thế cho ống hút.
- Đầu tăm bông vô trùng cấy giống từ môi trường lỏng lên bề 'mặt
môi trường rắn.
Các thao tác vô trùng được thực hiện trong một không gian vô trùng
được tạo ra bởi ngọn lửa của đèn cồn hoặc đèn Bunsen trong tủ cấy vô
trùng. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng ôxi hóa không khí tạo
không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy,
miệng chai lọ, ông nghiệm khi mở nắp, nút bông.
Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, người thao tác cần mang
găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay với cồn 70° hoặc các dung dịch diệt
khuẩn, tương tự tiến hành sát trùng bề mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu
thao tác vô trùng. Sau khi thực hiện xong việc cấy chủng, tiến hành sát
trùng tay, bề mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi ra khỏi phòng
thí nghiệm. Một số kỹ thuật thao tác vô trùng được thực hiện như sau:

1.5.1. Phương phép khử trùng que cấy

Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa
và đốt nhẹ phần cán sẽ đưa vào bên trong
dụng cụ chứa vi sinh vật. Cầm thẳng đứng
que cấy lên cho que cấy nóng đều. Mở nút
bông và đưa ngay que cấy đả khử trùng vào
- Ngọn lừa dụng cụ chứa giống. Làm nguội que cấy bằng
cách áp dầu que cấy vào thành ống nghiệm,
bình chứa thủy tinh hoặc đặt nhẹ lên phần
môi trường không chứa vi sinh vật cho nguội
trước khi thu lấy một lượng nhỏ sinh khôi vi
Hình 4.3 Khử trùng que cấy
sinh vật.

52
 1.5.2. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường
lỏng

Tuần tự thực hiện các thao tác sau trong không gian vô trùng của
ngọn lửa:
- Ong nghiệm vi sinh vật được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cây.
Ngón út của tay phải dùng đế mở nút bông, sau khi khử trùng que cấy,
mở nút bông, hơ nóng miệng ống nghiệm, xoay vài vòng qua ngọn lửa.
- Đưa ngay que cấy đã khử trùng vào bên trong, làm nguội que cấy.
- Thu sinh khôi bằng cách nhúng que cây vào môi trường lỏng, rút
thẳng que cấy ra không để dính thành và miệng ống nghiệm.
- Hơ nóng miệng ông nghiệm, đậy nút bông.
- Đặt ống nghiệm này vào giá đỡ.
- Đầu que cấy có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô
trùng gần ngọn đèn.
- Dùng tay trái lấy ông nghiệm môi trường mới, mở nút bông, khử
trùng miệng ông nghiệm rồi đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.
- Khuấy nhẹ que cấy. Rút thẳng dầu lấy que cấy ra. Khử trùng
miệng ông nghiệm, đậy nút bông lại.
- Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong, trước khi trả về giá để
que cấy.

1.5.3. Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang môi trường lỏng
Tiến hành tương tự như trường hợp trên với một số khác biệt sau:
- Thu sinh khôi từ ống giống: chấm nhẹ dầu que cấy lên khuẩn lạc
trên bề mặt môi trường.
- Chuyển giống vào môi trường lỏng; khuấy mạnh đầu que cấy trong
môi trường lỏng để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.

1.5.4. Cấy ria giống từ môi trường lỏng (dịch nuôi cấy, huyển phù tế bào)
lên bề mặt ống thạch nghiêng
Thực hiện các thao tác sau trong không gian vô trùng của ngọn lửa:
- Thu sinh khối như trường hợp trên.
- Cấy giống lên bề mặt ông thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ dầu
que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ông. Dàn đều sinh khôi ở phần đáy
ống nghiệm. Sau đó cấy theo hình sin từ đáy ống nghiệm lên đến đầu
trên của mặt thạch nghiêng.

53
 1. Ghi tên chủng vi sinh vật,
ngày cấy và ten người cấy
len ống thạch nghiêng
2. Cầm ống chủng cần cấy
và ống thạch nghiêng trong
m ột tay. M ặt thoáng thạch
nghiêng hướng lên trẽn và
đặt trước m ặt người cây.
3. Khử trùng que cây vòng
(bằng tay còn lại) trên
ngọn lửa.

4. M ở nắp ông nghiệm bằng 5. Khử trùng cả hai m iệng 6. Dùng đầu que cấy vòng
cách k ẹp giừa ngón út và ống nghiệm trên ngọn lửa. chuyển một lượng môi trường
lòng bàn tay cầm que cấy. chứa vi sinh vật sang ốn? thạch
nghiêng.

7. Dàn đền vi sinh vật bằng
cách ria đầu que cấy ữên mặt
thạch theo hình zigzac từ dưới
lên Irên. Tránh không đâm đầu
que cấy vào môi trường thạch.
8. K h ử trù n g m iệ n g ống 9. Khử trùng lại đầu que cấy
n g h iệ m và đ ậy n ú t ống trên ngọn lửa.
n g h iệ m lại.

Hình 4.4 Thao tác cấy ria giống từ môi trường lòng lên bề mặt ống thạch nghiêng

í .5.5. Chuyển giống từ mồi trường lỏng bằng pipetman

Pipetman (ống hút tự động) cho phép thao tác với dung tích nhỏ và
chính xác. Trong thao tác vô trùng pipetman rất hữu dụng vì cho phép
cấy chuyển dễ dàng dịch giông lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri
để trải tạo khuẩn lạc đơn hoặc vào ông nghiệm, bình tam giác chứa môi

54

ế
trường lỏng để nuôi tăng sinh.
Bằng một pipetman người ta có thể
thực hiện với sô' lần không hạn chế
các thao tác vô trùng này do có thể
hấp khử trùng đồng loạt với số
lượng lớn các đầu tip (đầu ống hút).
Trước khi thao tác vô trùng với
pipetman, người sử dụng cần biết
các yêu cầu cơ bản và các lưu ý khi
thao tác với pipetman như sau:
- Mồi pipetman đều có giới
hạn dung tích thao tác cho phép
nhất định. Thông thường các dải
dung tích đó là: 0,1 - 10|Lil, 1 - 20|4, Hình 4.5 Cách sử dụng pipetman
20 - 200f.ll, 0,2 - lm l, 1 - 5ml,
1 - 10ml. Dải dung tích thao tác cho phép này thường được ghi rõ trên
pipetman. Trong dải dung tích cho phép, người sử dụng có thể điều chỉnh
để có dung tích chính xác cần thao tác. cầ n chọnpipetman với giới hạn
dung tích thích hợp với dung tích cần thao tác. Mỗi loại pipetman có đầu
tip tương ứng.
- C ầ n bơm pipetman thường có hai nấc: nấc 1 tương đương với dung
tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch, nấc 2 vượt quá nấc 1 dược sử
dụng khi bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipetman.
Khi sử dụng pipetman để thao tác vô trùng cấy chuyển dịch giống
cần tiến hành các thao tác sau trong không gian vô trùng của ngọn lửa
trong tủ cấy:
- Tay phải cầm pipetman, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng.
Cắm đầu pipetman vào đầu tip.
- Dùng tay trái giữ ống nghiệm, bình chứa dịch giống vi sinh vật.
Dùng ngón út và áp út của tay phải đang giữ pipetman dể kẹp giữ và mở
nút bông, hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.
- Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống, hút lấy dung tích
cần thiết.
- Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa
và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út của tay phải.
- Đầu tip có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng
gần ngọn đèn.

55
 - Dùng tay trái lấy ông nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới,
dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.
- Đưa đầu tip vào bên trong môi trường, bơm dịch giống.
- Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình, đậy
nút bông.
- Thay đầu tip vô trùng mới khi thực hiện việc cấy tiếp theo.
Thực hiện tương tự trong trường hợp cấy chuyển dịch giông lên bề
mặt môi trường trong đĩa petri.
Cần lưu ý đầu pipetman và đầu tip được chế tạo bằng polymer nên
tuyệt đối không đốt khử trùng đầu pipetman và đầu tip bằng ngọn lửa.
Tương tự, trong khi thao tác cần lưu ý tránh đưa đầu pipetman man và
đầu tip ngang qua ngọn lửa.

1.6. Kỹ th u ật tạo kh uẩn lạc đơn

Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần
thể. Việc nghiên cứu một quần thể (tập hợp các tế bào cùng loài) vi sinh
vật nhất định trong quần xã sè phụ thuộc nhiều vào khả năng phân lập,
làm thuần tế bào của quần thể, khả năng giữ giống dùng cho các nghiên
cứu tiếp theo. Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật được thực hiện trên
chúng thuần.
Hầu hết các phương pháp phân lập và làm thuần chủng vi sinh vật
đều được dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp với điều kiện nuôi
cấỹ chọn lọc tạo Ưu th ế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Có một sô"
phương pháp pha loãng như sau:
- Phương pháp hộp ria (streak plate): là phương pháp pha loãng hữu
hiệu và dễ thực hiện nhất, trong đó, hỗn hợp vi sinh vật được trải và ria
trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri sao cho các tế bào riêng biệt
tách nhau ra. Sau khi được ủ, mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc
đơn riêng biệt. Khuẩn lạc đơn này là sinh khôi từ các tế bào hậu thế của
một tế bào ban đầu.
- Phương pháp hộp trải (spread plate) hoặc hộp đổ (pour plate): là
phương pháp pha loãng liên tiếp bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các
mức pha loăng khác nhau và chuyển 0,lm l dịch ở các bậc pha loãng phía
sau lên bề mặt đĩa mồi trường rắn (hộp trải) hoặc lm l dịch tương ứng vào
môi trường rắn đun chảy (hộp đổ). Mỗi tế bào riêng biệt sẽ tăng trưởng
thành khuẩn lạc dơn.
- Phương pháp loạt ống agar mềm: là phương pháp pha loãng liên
tiếp một dung tích dịch chứa chủng trong các ống môi trường agar mềm

56
và sau đó chuyển lên bề mặt môi trường nền trên hộp petri. Mồi tế bào
riêng biệt ở những ông pha loãng phía sau sẽ tăng trưởng thành khuẩn
lạc đơn.
Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỳ
thuật pha loãng nêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên
môi trường đều đồng nhất. Mức độ thuần khiết của chủng có thể dược
kiểm tra như sau:
- Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn của chủng thuần chỉ tạo ra
một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống
với khuẩn lạc của chủng ban đầu.
- Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống
nhau khi quan sát dưới kính hiển vi.
Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ
bị nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác
vô trùng.
Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn
lạc đơn. Không có kỷ thuật nào là hoàn hảo tuyệt đối. Ngoài ra, hiệu quả
của kỹ thuật còn phụ thuộc vào người thao tác. Một sô" kỹ thuật ria
thường dùng: kỹ thuật ria chữ T (T streak) (Hình 4.6 A), kỹ thuật ria bôn
góc (quadrant streak) (Hình 4.6 B), kỹ thuật ria tia (radiant streak)
{Hình 4.6 C), kỹ thuật ria liên tục (continuous streak) (Hình 4.6 D).

Hình 4.6 Một số kỹ thuật ria thường dùng

57
 Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:
1.6.1. Kỹ thuật hộp rỉa
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu g iố n g .
- Ria các đường trên dĩa petri chứa môi trường thích hợp như hình
vẽ (ria chữ T và ria bôn góc). Sau mỗi dường ria, đốt khử trùng đầu que
cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
- Gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

1. Lắc dều ống nghiệm 2. Khử trùng đầu que cấy
nuôi cấy. trên ngọn lửa đến khi nóng
đỏ. Mỗ nắp ông nghiệm bằng
ngón út và lòng bàn tay. Khử
trùng miệng ống nghiệm.
3. Làm nguội que cấy và
lấy một vòng môi trường
nuôi cấy.
*

4. Khử trùng lại miệng
Ống nghiệm. Đậy nắp
và đặt vào giá để Ống
nghiệm.
5. Dùng một tay mở nắp
petri, một tay ria đầu que
cấy trên mặt thạch. Vị trí
bát đầu rỉa que cấy nằm ở
rìa đĩa thạch và ở phía đối
diện người cây.
6. Ria trên bề mặt thạch
theo những đường zigzac
trên khoảng 1/4 đĩa thạch.
Tránh trường hợp đầu que
cấy đâm vào môi trường.

7. Khử trùng que cấy 8. Mở nắp petri và đợi
trên ngọn lửa. Xoay đĩa que cấy nguội bằng cách
petri 1/4 vòng tròn. áp dâu que cấy lên nắp
petri. Bắt đầu ria đường
thứ hai từ một vị trí trên
đường ria đầu tiên.
gg Hình 4.7 Thao tác kỹ thuật hộp ria
9. Tiếp tục ria các đường
tiếp theo tương tự các
bước 7 và 8 đến khi ria
kín bề mặt đĩa thạch,
Khử trùng lại que cấy
sau khi ria xong.

K
 1.6.2. Kỹ thuật hộp trải
- Dùng pipetm an và đầu tip vồ trùng, thao tác vô trù n g chuyển
0,lm l dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt mồi trường trong đĩa petri
{xem mục 1.5.).
- Nhúng dầu thanh gạt (que trải) thủy tinh vào cồn 70°, hơ qua ngọn
lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của
ngọn lửa.
- Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa
petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch.
Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi
đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi
trường.
- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian
thích hợp trong tủ ấm.

, Nhúng que gạt

vào cồn
ỉên mặt thạch

Hình 4.8 Kỹ thuật trải để phân lập khuẩn lạc đơn và để định lượng vi sinh vật

1.6.3. Kỹ thuật hộp đổ

- Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển lm l
dịch chứa giông vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri (xem
mục 1.5).

- Đổ khoảng 15 - 20ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45-

55°c vào đĩa petri đã cấy mẫu.
- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần
để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên.

59
2. QUAN SÁT VI SINH VẬT BANG KÍNH HIEN VI
2.1. C ác lo ạ i k ín h h iể n vi
Tùy theo kích thước, vi sinh vật có thể được quan sát bằng m ắt
thường (quan s á t thô đại) hoặc phải cần đến những th iết bị đặc biệt như
kính lúp, kính hiển vi... (quan sát hiển vi). Kính hiển vi là công cụ quan
trọng trong nghiên cứu hình th ái và nhận diện vi sinh vật. Kính hiển vi
được th iế t kế để có tín h năng khác nhau cho phép phóng dại và quan sát
rõ, chãn th ậ t các đối tượng vi sinh vật, nội bào quan khác nhau. Một sô
kính hiển vi thường gặp là:
- Kính h iể n vi soi nổi: là dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10
lần đến 60 lần, thường dùng trong quan sát và thao tác trên những vật có
kích thước tương đối lớn. Nguồn sáng thường được chiếu trực tiếp từ phía
trên xuông vật và phản xạ vào kính, nhờ vậy có thể quan sát vật thê ở
trạn g thái không gian ba chiều. Trong vài trường hợp cũng có th ể dùng
nguồn sáng chiếu từ dưới lên.
- Kính hiến vi quang học: ỉà hệ thống dùng để p h ón g đại vi sinh vật kích
thước nho. Độ phóng đại của kính có thể từ vài chục lần đến 2000 lần. Cấu
tạo kính gồm hệ thống quang học với thị kính là nơi đặt mắt nhìn và vật
kính là phần kề sát với mẫu quan sát. Thân kính còn có một bàn mang
mẫu vật, tụ quang, hệ thống chiếu sáng và các nút chỉnh thô và chỉnh tinh.
Nút chính thô thường được thiết kế dạng nút vặn to, dùng để nâng và hạ
khoảng cách lớn giữa vật kính và bàn mang mầu vật. Nút chỉnh tinh
thường là nút nhỏ hơn, được thiết
kế bên cạnh hoặc cùng trục với
Thị kính
nút chỉnh thô. Ánh sáng của kính
chủ yếu truyền từ đáy lên, xuyên
qua mẫu để vào vật kính. Ánh
sáng được điều chỉnh bằng cách
Mẫu vật nâng hoặc hạ tụ quang, đóng
hoặc mở chắn sáng, tăng hay
giảm ánh sáng (dùng đèn) hoặc
xoay gương, dùng gương lõm hay
phẳng (dùng gương). Nhiều vi
sinh vật khó quan sát bằng kính
hiển vi với tụ quang thường, mà
lại nhìn rõ khi thay bằng tụ
quang nền đen. Với tụ quang này
ánh sáng chiếu từ dưới lên không
xuyên trực tiếp qua mẫu, mà bị
chặn lại và phản xạ vào mẫu.
Hình 4.9 Kính hiển V! quang học

60
Trong diều kiện như vậy, thi trường sè có nền đen còn các tế bào vi sinh
sè dược quan sát rõ trên nền đen này.
- Kính hiển vi đối pha: sử dụng đê quan sát vi sinh vật sông không
nhuộm màu. Khi xuyên qua vật thế có độ dày mỏng khác nhau, ánh sáng
có cường độ không thay đổi nhưng pha bị thay đổi. Có thể làm tăn g độ rõ
cua ảnh bằng cách biến sự thay đổi pha th àn h thay đổi cường độ nhờ các
bộ phận đăc biệt của kính.
- K ính h iể n vi h u ỳ n h quang: kính được trang bị bộ nguồn các ánh sáng
kích thích có độ dài sóng khác nhau để kích thích tạo huỳnh quang. Phần
lớn vi sinh vật không có khả năng p h át huỳnh quang hoặc có nhưng rấ t
yếu. Tuy nhiên, có thể nhuộm tế bào, các bào quan và các đại phân tử
trong tế bào bằng các phẩm nhuộm huỳnh quang khác nhau, nhờ vậy có
thể quan sát, theo dõi chuyên biệt bào quan hoặc phân tử đang quan tâm
trong khi tế bào vẫn sông, tăng trưởng.
Sau đâv là thao tác sử dụng kính hiển vi và kính hiển vi soi nổi đế
quan sát một sô vi sinh vật :

2.2. Cách ch u ẩ n bị p h iên k ín h (lam e) và lá k ín h (lam elle)

Phiến kính mới mua cần làm sạch bằng cách đun sôi trong dung dịch
NaOH 1% trong 10 phút, rửa bằng nước cất, HC1 loãng và sau cùng rửa
sạch bằng nước cất. P hiến kính đã sử dụng, n h ất là dùng đê nhuộm mẫu
cần được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromate (lOOg H 2S(Xị
đậm đặc, 50g K‘, Cr‘; 0 7 và 1000 ml nước cất) trước khi xả sạch bằng nước
và tráng bằng nước cất. Lá kính được rửa sạch với xà phòng, làm khô và
ngâm trong cồn 95t}.

2.3. Các th ao tá c sử d ụ n g k ín h h iể n vỉ
- Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sông hay nhuộm màu
với vật kính không quá 40X: mẫu được chuẩn bị trên phiến kính với một
giọt nước có hay không có phẩm màu. Đ ặt lá kính lên giọt nước (cẩn th ậ n
đế không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 45l’ và từ từ hạ
xuống). Đ ặt phiến kính lên bàn mẫu. Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng.
Chọn vật kính X I0, dùng nút chỉnh thô hạ vật kính hoặc nâng bàn mẫu
sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại
cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng tay di chuyển
phiến kính hoặc dùng bộ phận di chuyền bàn mẫu sao cho vùng muôn
quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính X40, điều chỉnh nút
chinh tinh để tìm ảnh.

61
 Trường hợp quan sát vi sinh vật VỚI v ật kính 100X: mẫu được cô
định trên phiên kính và nhuộm mau. Sau khi làm khô, nhò một giọt dầu
cèdre lên vết nhuộm và đưa mẫu lên bàn mang vật. N âng tụ quang, mớ
chắn sáng. N hìn vào mầu (từ ngoài) và hạ từ từ vật kính X100, sao cho
đầu vật kính chìm trong giọt dầu cèdre. N hìn vào thị kính, dùng nút
chỉnh thô nâng từ từ bàn mẫu cho đến khi thoáng thây ánh thì ngừng lại.
Sau đó, dùng nút chỉnh tin h chỉnh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét. c ầ n
lưu ý sau khi được sử dụng vật kính X100 cần được chùi ngay bằng dầu
xyloỉ, không được đế qua ngày. Đặc biệt không dùng cồn hoậc dùng giây
vệ sinh chùi vào vật kính.

2.4. Tạo tiê u b ả n qu an sá t nấm m ốc, xạ k h u ẩn dưới k ính

h iể n vi
Đê quan sá t nấm mốc và xạ khuẩn dưới kính hiển vi, cán thực hiện
một trong hai dạng tiêu bản là tiêu bản nhuộm sông và tiêu bản
phòng ấm.
- Tiêu ban nhuộm sống: cho một giot lactofuchsin lên một phiến
kính sạch. Sử dụng kim mũi giáo hoặc que cấy móc lấv một ít tơ hoặc một
m anh nhỏ thạch có khuẩn ty nấm mốc hay xạ khuấn. Rửa bớt bào tử
bằng cách đ ặt tơ nấm vào dung dịch nước xà phòng (dung dịch nước rứa
chén) pha loãng, khuấy nhẹ. Đặt sinh khối khuẩn ty đã rứa vào giọt
laetofuchsin trê n phiến kính. Dùng hai que cấy móc hoặc một que cấy móc
với một kim gút tách rời các sợi khuẩn ty trong giọt nước. Đậy bằng
một lá kính. Đ ặt tiêu bản lên bàn mang vật và quan sát ở vật. kính xxo
va X40.
- Tiêu ban phòng ấm : đ ặt vào đáy một đĩa petri một tờ giây thấm ,
sau đó là một phiến kính. Đậy nắp đĩa petri, gói giấy và hấp khử trùng.
Đun chảy môi trường dinh dường đã khử trùng trong ông thạch (môi
trường PGA cho nấm mốc và Gause cho xạ khuẩn). Mở hé nắp petri ơ gần
ngọn lửa của đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến kính bên
trong đĩa petri, sao cho thạch chảy dài một nửa bên của phiến kính. Khi
thạch trên phiến kính đã đặc lại, bổ sung một ít nước cất vô trùng vào
làm ướt đều phần giấy th ấm để giừ độ ấm. Dùng que cấy móc thu lấy
khuân ty bằng cách khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm mốc hoặc xạ khuân rồi
chấm lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm. Gói cả hộp lại và ủ
ớ nhiệt độ thích hợp từ 2 - 3 ngày (nấm mốc), 5- 7 ngày (xạ khuẩn). Lấy
phiến ra khói đĩa petri. Dùng giấy thâm chùi m ặt đáy phiến kính. Đậy
một lá kính lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi đế quan
sát VỚI vật kính có độ phóng đại 10X và 100X.

62
 2.5. Thao tác sử d ụ n g k ín h h iến vi
soi nổi
Đãc điếm khuân lac cua nấm mốc hoặc
xạ khuân có thê được quan sát bằng kính
hiển vi soi nổi (Hình 4.10). Đ ặt tiêu bán hoặc
đĩa petri có mẫu nấm mốc lên bàn mang vật
(phần đế của kính). Xoay vật kính (tùy độ
phóng đại) vào đúng vị trí và hướng về mầu
vật. Hướng về phía ánh sáng hoặc chỉnh cho
đèn soi về phía mẫu. Di chuyên hệ thông
quang học cho tới khi ảnh rõ.
Hình 4 10 Kính hiển vi soi nổi

3. PHƯƠNG PH ÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều
phương pháp khác nhau như đếm sô' lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển
vi, định lượng gian tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm sô'
khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định lượng một cách thông
kê bằng phương pháp pha loãng tới h ạn (phương pháp MPN) ...

3.1. Phương ph áp đêm trực tiếp:

Mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo ... có
thè được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm trên kính
hiển vi (X. ảnh 3). Quy trìn h đếm trực tiếp cho phép xác định nhanh
chóng m ật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng phương pháp này có một sô'
nhược điểm lả không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết, dễ
nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các h ạt vật th ể khác trong mẫu, khó đạt
được độ chính xác cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có m ật
độ thấp.

3.1.1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cẩu

Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3mm có một
vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bời một rãnh. Đĩa
đêm thấp hơn bề m ặt của phiến kính khoảng l / 10 mm, có hình trò n vì thé
khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều
nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích Im m 2 và được chia th à n h 25 ô vuông lớn
có diện tích mỗi ô là 1/25 mm“ và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện
tích l/400m m 2.
Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt
formalin vào trong mẫu, trộn đều. Pha loãng mầu cần đếm sao cho trong

63
mồi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật. Đê đạt
được độ pha loãng như vậy cần phải ước ỉượng được sô lượng vi sinh vật
trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trìn h pha loãng. Mẫu
phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0 , 1 % pepton và 0 , 1%
laurylsulphate và 0,01% methyl blue. T ất cả các dung dịch pha loãng đều
cần phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng
vào vùng đếm trê n buồng đếm, đậy bằng lá kính. Chỉnh kính hiển vi, với
vật kính X40, tìm m ạng ô đếm ỏ’ khu vực buồng đếm. Chỉnh th ị trường
sao cho một thị trường chứa trọ n một ô lớn (4 X 4 = 16 ô nhỏ). Đếm scí tế
bào hiện diện trong '1 ồ lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác.
Đếm số’ tế bào của ít n h ấ t 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình.
Cách tính m ật độ t ế bào như sau: th ể tích của một ô lớn ỉà
l/2 5 m n r X l/1 0 m m = l/2 5 0 m m 3 hay 1/250 X 103cm3= 4 X 10'6ml. N hư vậy
m ật độ tế bào của huyền phù mẫu là: N/ml = 0,25a X 106 tế bào/ml (trong
đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn)

3.1.2. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm Breed

Buồng đếm này r ấ t hữu ích trong việc đếm tổng sô" vi sinh vật bằng
phương pháp đếm trực tiếp. Buồng đếm Breed có một vùng diện tích lem 2
được đánh dấu. Dùng bơm tiêm hay que cây vòng cho khoảng 0 ,0 1 ml mẫu
cần đếm vào trong vùng này, sấy khô bằng ngọn lửa sau đó nhuộm với
methyl blue. Khi đếm, cho dầu nhúng lên diện tích vùng cần đếm. Mật độ
vi sinh vật được tín h từ sô" đếm trong các vùng đếm khác nhau là:
N /m l = 4a X lOVjid2 (tr o n g đó a là s ố t ế bào tro n g m ộ t vù n g đ ếm và d là
đường kính của vùng đếm).

3.1.3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang

Khi nhuộm mẫu chứa vi khuẩn bằng một trong các chất nhuộm phát
huỳnh quang khác nhau như acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino2-phenyl-
indol ÍDAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC), m ật độ vi khuẩn cũng có
thê được xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang, s ố đếm nhận
được từ phương pháp này luôn cho kết quả cao khoảng gấp đôi so với kết
quả n h ận được bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Sự khác biệt giữa
phương pháp đếm trực tiếp và phương pháp đếm khuẩn lạc phản án h sự
chọn lọc của môi trường, điều kiện nuôi cấy, một phần tế bào bị chết hay
bị tổn thương không th ể nuôi cây được. Giá tri của số đếm trực tiếp bằng
phương pháp ph át huỳnh quang trên kính hiển vi tương đương với số
lượng vi sinh vật th ậ t sự có trong mẫu. Giá trị này cho phép ước đoán
được số lượng th ậ t sự của tổng các loài vi sinh vật khác nhau hiện diện
trong mầu tự nhiên, trong nước biển, nước tự nhiên, mặc dù các loài

64
này có sự khác biệt lớn về sô lượng, đặc điểm sinh lý. Sô đếm này thường
phán ánh đúng với sinh khôi, vì th ế thường được dùng để ước lượng sinh
khôi vi sinh vật có trong mẫu.

3.2. Phương p h áp đếm k h u ẩ n lạc

Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc
cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong
mẫu. Tế bào sông là tế bào có khả năng phân chia tạo th àn h khuẩn lạc
trên môi trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương
pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay đếm đĩa (plate count). Phương
pháp này có đặc điếm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy
mỏi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể
được thực hiện bằng kỳ thuật hộp trải hay hộp đổ (xem mục 1.6) với các
thiết bị hỗ trợ đế đọc kết quả (X. ảnh 4). Trong phương pháp này, cần thực
hiện pha loăng mẫu th àn h nhiều độ pha loăng bậc 10 liên tiếp sao cho có
độ pha loảng với m ật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc
rièng lẻ trên bề m ặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai sô khi đếm
và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên
nhau hoặc tạo th àn h m àng sinh khối. Ngược lại sô' lượng khuẩn lạc trên
một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê. Sô' lượng khuẩn lạc tôi ưu
được đề aghị bời các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 - 250 khuẩn
lạc/đĩa.
Số lượng khuân lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử
dụng, môi trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng
và hình th à n h khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa
kịp hình th àn h khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài. Thông thường,
điều kiện nuôi cấy (môi trường, n h iệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho
sò khuần lạc xuất hiện tôi đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số
lớn nên cần thực hiện lặp lại trê n ít n h ất 2 đĩa. Ngoài ra, do có khả năng
nhiều tế bào hình th à n h chung một khuẩn lạc nên số’ đếm khuẩn lạc
không nh ất th iế t trùng lặp với sô' tế bào ban đầu được đưa lên môi trường
nên kết quả đếm và m ật độ tế bào thường được trìn h bày bằng sô" đơn vị
hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony-forming unit) thay vì sô' tế bào/ml.
Mặc dù vẫn có một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn
lạc vần là phương pháp tố t n h ất để xác định m ật độ tế bào sông. Ngoài
ra phương pháp này còn có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng
vi sinh vật ở m ật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng
rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm , bệnh
phẩm.

5'PHƯ Ơ NG PHÁP PHAN TÍCH 65

 Sau đây là quy trìn h thao tác xác định m ật độ tế bào bằng phương
pháp đêm khuẩn lạc:

3.2.1. Pha loãng mẫu theo day thập phân

Mẫu được pha loãng tuần tự th à n h dãy các nồng độ th ập phân 1/10,
1/100, 1/1000 ... Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng
lm l mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trước dó) thêm vào 9ml nước
hoặc môi trường trong một ông nghiệm. Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha
loãng 1/10. Có th ể tiến h àn h bằng các th ể tích khác, ví dụ 0,5ml + 4,5ml
trong ống nghiệm hoặc 0 ,lm l + 0,9ml trong ông Eppendorf. Để pha
loãng 100 lần có th ể thực hiện bằng tổ hợp 0,lm l + 9,9ml hay
0,05mỉ + 0,495ml. Thông thường cần thực hiện dãy nhiều nồng độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp đế được nồng độ pha loãng thích hợp.

1.000 ml =11
1 m! = 0,001 { 1 0 - M
1 mi = 1.000 fi\
Ống nuôi 1//I = 0.000001 (10-NI
cấy ban đầu
(ống gốc)

Pha loang
Độ pha loãng (1Q5) Độ pha loãng cuối

Hình 4.11 Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân

3.2.2. Tạo hộp trải hay hộp đổ

Thực hiện tương tự mục 1.6. ủ ở điều kiện n h iệt độ, thời gian
thích hợp.

3.2.3. Tính kết quả

M ật độ tê bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ
pha loãng D[ được tín h theo công thức là:
M, (CFU/ml) = Ai X Dj/V
Trong đó A, là sô' khuẩn ỉạc trung bình /dĩa, D, là độ pha loãng và V
là dung tích huyền phù tế bào cho vào mồi đĩa (ml).
M ật độ tê bào trung bình M| trong mẫu ban đầu là trung bình cộng
của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.

66
 Công thức 11Ỏ.U trên được áp đụng khi ca 2 đĩa cua cùng một độ pha
loãng cho sô' khuân iạc thích hợp. Nhu' vậy, khi chi có [ độ pha loãng co
cãp dĩa cho sò lượng khuẩn lạc thích hợp (25 - 250 khuán lạc/dĩa) thì Mi
chính là mật dộ cua vi sinh vật trong mầu. Nếu có 2 hoặc nhiều độ pha
loàng mà mỗi độ pha loãng đều có cặp dĩa cho số’ lượng khuẩn lạc thích
hợp, mật độ VI sinh trong mầu là trung bình cộng của các Mị. Trường hợp
không trường hợp nào tấ t cá các độ pha loãng có cá 2 đĩa cho số' khuẩn
lạc thích hợp thì có th ể đếm và tín h kết quá theo hướng dẫn của FDA
như sau:
- 1 độ pha loãng có 2 dĩa dưới 25 khuấn lạc: tính mật độ như công
thức nêu trên, đánh dấu trên kêt quá dế biêt đây là kết quả ước định tính
từ những đìa nằm ngoài 25 - 250.
-- 1 dô pha loãng có 2 đĩa trên 250 khuãn lạc: thực hiện tương tự như
trường hợp nêu trẽn.
- 1 độ pha loãng có 1 đĩa cỏ sò khuẩn lạc thích hợp và 1 đĩa ngoài 25
- 250: sử dụng sò khuẩn lạc cua cả 2 đĩa và tính theo công thức bình
thường.
- 2 độ pha loàng đếm được trong đó 1 độ pha loăng có cặp đìa trong
ngưỡng và độ pha loãng kia có 1 đĩa trong và 1 đĩa ngoài ngưỡng: sử dụng
sô liệu cua cà 4 đĩa đẻ tính mật. độ theo công thức bình thường.
- 2 độ pha ]oãng đếm được mồi độ pha loãng có ] đĩa trong và 1 đĩa
ngoài ngưỡng: sử dụng sổ”liệu của cả 4 đia đế tính m ật độ theo công thức
bình thường.

3.3. Phương' ph áp m àng lọc

Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị
trong mẫu nước khi tiến h àn h các thứ nghiệm môi trường nơi có m ật độ
vi sinh vật tương đôì thấp. Phương pháp
nàv gồm bước lọc đế tập trung vi sinh vật
trong một mẫu nước trên m àng lọc (X.
ảnh 5,6) và xác định sổ' tế bào vi sinh vật
dựa vào sỏ khuẩn lạc đèm đơợc sau khi
dặt màng lọc lên trên môi trường thạch
có thành phần dinh dường thích hợp cho
loai vi sinh vật cần kiếm. Dựa trên khôi
lượng mầu nước ban đầu và quy ước là
mỗi khua 11 lạc được hình th à n h từ 1 tẻ
bào vi sinh vật, người ta quy ra sô lượng
• 1 J .L ' ~ , • , 1 ỉ' 1 HÌnh 4 12 Màng ioc lưới kỵ nước
vi sinh vật có trong một. đon vị thê tích

67
nước. Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp cùa phương pháp lọc vô
trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích
thước lỗ là 0,45Ịim hoặc 0,2|im đươc chế tạo từ các nguyên liệu là sợi thủy
tinh siêu mánh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạn g thái
vô trùng.
Ngoài m àng lọc bình thường hiện nay người ta còn sứ dụng m àng lọc
lưới kỵ nước trê n đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch
clìia ó bằng vật liệu này ngăn cán sự mọc lan của các khuẩn lạc. Khác với
trường hợp m àng lọc bình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc,
m ạt độ vi sinh vật trong mẫu được tính và trình bày dưới dạng sô có xác
suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thê tích
mẫu theo cóng thức: MPN = N In (N/N - x); trong đó N là tổng số các ô
vuông, X là ô có sô k h u ấ n lạc mọc.

3.4. Phương ph áp M PN (Most P robable N um ber)

Phương pháp MPN (phương pháp sô có xác suất cao nhất, sô tôi khả)
còn được gọi là phương pháp pha loăng tới hạn hay phương pháp chuẩn
độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo sô
lượng vi sinh vật có xác suất- lớn n h ất hiện diện trong một đơn vị thê tích
mầu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết qua định tính của một
loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông
thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lẩn ở 3 độ pha loãng
bậc 10 lièn tiếp, tống cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trìn h thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau :
Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trướng
của đối tượng vi sinh v ật cần định lượng một th ể tích chính xác dung dịch
mẫu ớ 3 nồng độ pha loảng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000). ứ
ờ n h iệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh
sư tăng trưởng của vi sinh vật cẳn kiểm định trong từng ống nghiệm
íthường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục ...), ghi nhận số
lượng các ông nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số
liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra m ật độ vi sinh vật được trìn h
bày dưới dạng sô MPN/100ml hay sô M PN/lg mẫu. Độ chính xác của trị
số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha
loảng: sô lượng ông nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị sô"
MPN càng lớn. Phương pháp MPN có thè dùng đế định lượng mọi nhóm
vi sinh vật có thế được nuôi cây trong môi trường lỏng chọn lọc và cho
kết quả biếu kiến thích hợp. Ví dụ, sử dụng môi trường BGBL ở 37°c có
thé định lượng nhóm coliform, cùng môi trường này ở 45 °c cho phép
định lượng coliform phân hoặc môi trường Mannitol Salt Broth có thể
dùng để định lượng Staphylococcus ...

68
 Cần lưu ý rằng đa số các Báng MPN cung cấp số liệu ớ dạng số MPN
trong 100 ml dung dịch được sử dựng đê phân tích ở các liều lượng là
lOinl, lm ỉ và 0,lm l. Trên thực tê phân tích, chúng ta không sử dụng các
liều lượng khác nhau cùa mẳu nhu trèn do nồng độ các th àn h phần mỏi
trường sè khác nhau nhiều ơ các ông nghiệm, ảnh hưởng rấ t lớn đến kết
qua phân tích. Thông thường người ta sử dụng đồng loạt một dung tích
mảu nhât định cho các mẫu đã pha loãng ở các nồng độ thập phân khác
nhau, ví dụ dùng lm ỉ cho mẫu đà pha loãng 10 \ 10““ và 10"\ Lượng mẫu
với các độ pha loăng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo
Báng M PN/ 100 ml tính theo lượng mẩu là 10ml, lm l và 0 ,lm l nêu trên.
Điều đó có nghĩa là số liệu của Bảng M NP/ 100 ml ớ các dung tích mầu
10ml, lnil và 0,lm l là tương đươnẹ với MPN/ml mầu chưa pha loãng khi
lm l cùa các dung dịch có độ pha loãng 10 10 “ và 10 :ì được dùng đế
phân tích. Trường hợp m ật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt
nồng độ pha loăng tiếp theo cần phải nhân trị sô tra theo bảng MNP nêu
trên với hệ số pha loãng. Ví dụ sử dụng ĩm l cho mỗi độ pha loăng 10 2,
10 và 10 1 tức là chi sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng độ so với
trường hợp dùng lm l mẫu ở các độ pha loãng 10 \ 10'“ và 10 ' \ Do vậy,
trị sô tra theo bang MNP nêu trên cần được nhân them hệ số pha loãng
la 10. (X. ả n h 7).

3.5. Phương p h áp đo độ dục

Ngoài các phương pháp nêu trên , m ật độ vi sinh vật có th ể được xác
định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục. Khi một pha lỏng có chứa
nhiều phần tử không tan thì sẽ hình th àn h một hệ huyền phù và có độ
đục bơi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm
phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực th ể nên khi
hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của
huvền phù tỷ lệ với m ật độ tế bào. Trong một giới hạn n h ất định của độ
đục và m ật độ tế bào, có thề xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa
mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng m ật độ tế bào một
cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ
550 - 610nm. Trong trường hợp này, trước tiên cần phải th iết lập được
đường quan hệ tuyến tín h giừa độ đục và m ật độ tế bào bằng cách sử
dụng một số huyền phù tế bào có dộ đục xác định và m ật độ tế bào của
mỗi huyền phù được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác, ví dụ
như phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp...

69
 Ong chứng không- (không vi sinh vật)

Tế bào
quang
Ánh sáng " ':
đán sắc I đi| n
=— — *
; :
r Tl 2W 100Ó
: I___ __ J

Ong chứa vi sinh vật

trong cùng môi trường
với ống chứng không
Máy so màu

Hình 4.13 Nguyên tắc phương pháp đo độ đục

Quy trìn h xác định m ật độ tế bào bằng độ đục gồm các bước như sau:

3.5.1. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tê bào

- Pha loãng một huyền phù chứa loài vi sinh vật cần kiểm nghiệm
có m ật độ b ất kỳ th à n h các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD6i()nm
đạt các giá trị lân cận 0 , 1 ; 0 ,2 ; 0,3; 0,4 và 0,5. Đo OD6i0nm của các huyền
phù vừa được pha, ghi n h ận sô' đo thực tế.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc phương
pháp đếm khuẩn lạc, xác định m ật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù
này.
- Tính giá trị ỉog(N/ml) cho mỗi giá trị m ật độ N/ml tương ứng với
mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log(N/mì) (trục tung) theo ODeionm
(trục hoành). Xác định khoảng tuyến tín h giữa log(N/ml) và OD610nm-

3.5.2. Xác định m ật độ tế bào theo độ đục

- Đo độ đục của một huyền phù tế bào X cần xác định m ật độ.
- Từ trị số OD 61onm do được, dựa vào đường tương quan giữa log(N/ml)
và độ đục ODeionm, suy r a trị số log(N/ml) và trị số m ật độ N/ml
(N/ml = 10 a với a = log(N/ml)).

70
 Phương pháp định m ật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng đê so
sánh mức độ tăng trướng của hai hay nhiều chung vi sinh vật trong môi
trường long. Trong trường hợp không cần biết giá trị tuyệt ctôi của m ặt
độ tê bào thì không cần phải xây dựng đường tương quan tuyến tín h giữa
độ đục và m ật độ. Phương pháp này cho k ết quá nhanh thường được ứng
dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng
vi sinh vật tror»ơ phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuât tuy nhiên không
thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật.

4. THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, môi trường phân biệt,
chúng ta có thể thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết bằng các kỹ
thuật phân lập như đã được trình bày trong mục 1 của chương này. Chỏng
thuần là yêu cầu cần cho việc định danh các vi sinh vật. Việc định danh
này được thực hiện dựa vào các đặc điếm về kiểu hình, dặc biệt là các
phan ứng sinh hóa thực hiện bơi các chủng vi sinh vật. Có ba cách tiếp
cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh
lả cách truvền thông, sử dụng các bộ KĨT và dùng th iết bị tự động.
Các kết qua thứ nghiệm sinh hóa cua hàng tràm ỉoài vi sinh vật tại
nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên th ế giới được tổng hợp th àn h
nhừng Báng Sinh hóa định danh vi sinh vật. Bảng Sinh hóa bao gồm các
đặc điểm sinh hóa đặc trưng n h ất để phân biệt các loài vi sinh vật gây
bệnh thường gặp (Bảng 4.1). Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị bằng
một trị số là tỷ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho k ết quà dương
tinh theo thống kê ở một loài vi sinh vật. Như vậy, trị số 100 có nghĩa là
100 rr trường hợp của loài này đã được thử đều có cho thử nghiệm dương
tinh, ngược lại trị số 0 có nghĩa là 0% trường hợp thử nghiệm cho kết quả
dương tính hay nói cách khác 100 r/£ trường hợp thử nghiệm đặc điểm sinh
hoa tương ứng trèn loài này đều cho k ết quả âm tính. Các đặc điểm sinh
hóa có trị sô' dao động ớ mức 50% không có giá trị trong việc định danh.
Trong thực tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa
biếu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+ ): dương tính; (-): âm tính;
(+/-): khoảng trê n 70% là dương tín h và (-/+): khoảng trên 70% là âm
tính.

71
ĩo Bảng 4.1 BẢNG SINH HÓA (API 20E) DUNG ĐỂ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI THUỘC HỌ ENTEROBACTERỈACEAE
(1): Các thứ nghiệm cán để phân biệt các vi khuẩn Gram âm không thuộc họ vi khuân đường ruột.
(2): Biến dưỡng đường theo phương thức hô hâp hiếu khí.
(3): Các Yersinia bất động ở 37°c và di động ở 25°c

API 20E Các thử nghiệm bổ sung

(1) (1) (1) (1) (1)

ONPG ADH LDC ODC CiT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA ox MOB
N0z n2 MAC OF 0 OFF

Escherichia coll 98 3 83 75 0 1 0 0 97 0 0 100 100 1 94 88 42 67 9 91 : 0 100 0 62 100 100 100

E. coll A-D 47 8 32 15 0 0 0 0 98 0 0 98 93 0 42 27 1 34 2 92 0 100 0 0 100 100 100

Shigella tíysentenae 15 0 0 0 0 0 0 0 32 0 0 94 2 0 19 22 0 0 0 22 0 100 0 0 100 100 100

s. ílexnen 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 100 97 ũ 24 2 0 24 0 61 0 100 ị 0 0 100 100 100

s. boydii 8 0 0 3 0 0 0 0 32 0 0 100 94 0 : 56 1 1 14 0 76 0 100 0 0 100 100 100

s. sonnei 96 0 0 97 0 0 0 0 0 0 0 100 100 0 2 80 0 0 0 97 0 100 0 0 0 100 100

Edwardsiella tarda 0 0 100 100 0 94 0 0 100 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 1 0 100 0 98 100 100 100

Salmonella cholerae SUIS 0 18 97 97 4 65 0 0 0 0 ũ 100 100 0 89 95 0 20 0 0 0 100 0 100 100 100 100

s. typhi 0 2 100 0 0 8 0 0 0 0 0 100 100 0 100 0 0 94 0 0 0 100 0 100 100 100 100

Salmonella spp 1 69 96 95 75 85 0 0 3 ũ 0 100 98 : 33 93 93 2 78 0 94 0 100 0 94 100 100 100

S. paratyphi A 0 0 0 100 0 6 0 0 0 0 0 100 100 0 100 100 0 96 0 100 0 100 0 94 100 100 100

S. ty phi sus 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 0 5 0 27 0 94 ũ 100 0 94 100 100 100

S. galitnarum 0 0 92 0 0 8 0 0 0 0 0 100 100 0 0 57 0 0 0 100 0 100 0 . 0 100 100 100

s pullorum 0 0 91 100 0 38 0 0 0 0 0 100 100 0 11 97 ữ 5 0 61 ũ 100 0 ị 0 100 100 100

S. anzonae 98 48 96 97 50 96 0 0 0 0 0 100 100 0 100 96 0 64 0 100 0 100 0 100 100 100 100

Citrobacter freundn 100 34 0 39 62 61 0 0 7 0 0 100 100 17 98 91 68 73 42 100 0 98 0 95 100 100 : 100

Cìtrobacter dtversus
97 50 0 98 95 0 0 0 98 0 0 100 100 1 92 95 24 1 96 95 0 100 0 92 100 100 100
(levtnea)

Klebsietla pneumonia 100 0 74 0 95 0 63 0 0 92 0 100 100 96 100 97 100 100 100 100 0 100 0 0 100 100 100

K. oxyloca 100 0 86 0 86 0 60 0 100 92 0 100 100 96 100 99 100 96 100 96 0 100 0 0 100 100 100
 (1) (1) (1) (1) (1)
ONPG ADH LDC ODC e r r HjS URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX MOB
no 2 N-; MAC OF o OF F

K. ozaenae 90 23 32 1 40 0 6 0 0 0 0 97 92 61 44 66 21 83 90 67 0 92 0 0 100 100 100

K. rhinoscleromatis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 96 100 83 64 39 39 18 92 1 0 100 0 0 100 100 100

Hafnia atvei 71 1 100 100 10 0 0 0 0 15 0 100 95 0 0 71 0 2 11 95 0 100 0 93 100 100 100

Enterobacter aerogenes 100 0 98 100 88 0 2 0 0 93 3 100 100 92 100 100 98 100 100 100 0 100 0 97 100 100 100

E. cloacae 100 93 1 97 95 0 0 0 0 96 0 100 100 13 97 85 100 96 100 100 0 100 0 94 100 100 100

E. sakazaki 100 100 0 85 85 0 0 0 0 85 0 100 100 72 0 100 100 100 100 100 0 100 0 94 100 100 100

E. agglomerans 98 1 0 0 54 0 5 6 33 34 2 100 100 22 30 79 73 58 75 94 0 86 0 90 100 100 100

E. gergoviae 100 0 26 100 85 0 100 0 0 98 0 100 98 12 0 100 98 100 100 100 0 100 0 100 100 100 100

Serratia Itquefaciens 98 0 87 100 88 0 5 0 0 52 60 100 100 76 98 16 100 75 100 98 0 100 0 93 100 100 100

Ser marcescens 94 0 98 95 97 0 28 0 0 60 85 100 100 71 91 0 98 68jS, 97 15,2, 0 95 0 98 100 100 100

Ser. rusidaea 100 0 68 0 81 0 3 0 0 50 60 96 98 42 4 3 84 82 94 84 0 100 0 88 100 100 100

Ser. odorifera 100 0 100 25 87 0 0 0 100 87 100 100 100 87 100 100 25 100 100 100 0 100 0 100 100 100 100

Proleus vulgaris 0 0 0 0 31 83 98 100 88 0 52 97 0 1 0 2 89 0 65 0 0 100 0 94 00 too 100

P. mirabilis 0 0 1 98 57 83 100 98 1 3 63 96 0 0 0 0 0 0 1 0 0 93 0 95 100 100 100

P. morganii 0 0 0 100 2 0 100 91 97 0 0 97 0 0 0 0 0 0 0 1 0 88 0 87 100 00 100

P. rettgeri 1 0 0 0 70 0 100 100 97 0 0 100 75 78 0 29 34 0 11 1 0 98 0 94 100 100 100

Providencia alcalifaciens 0 0 0 0 97 0 0 100 100 0 0 100 2 2 0 0 2 0 0 2 0 100 0 96 100 100 100

Prov. stuarti! 1 0 0 0 90 0 0 91 97 0 0 100 0 100 0 0 3 0 0 3 0 100 0 87 100 100 100

Yersinia enlerocolitica 81 0 0 90 0 0 93 0 69 0 0 100 100 25 98 5 90 1 92 76 0 98 0 0(3t 100 100 100

Y. pseưdotuberculosis 77 0 0 0 13 0 96 0 0 0 0 98 97 0 0 77 0 9 0 29 0 95 0 0(3» 100 100 100

 4.1. Các th ử n g h iệm sin h h óa quan trọ n g
Các thứ nghiệm sinh hóa quan trọng thường được sử dụng trong
kiềm nghiệm vi sinh vật được trìn h bày sau đây. Trong các thử nghiệm
này, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả người ta thường thực
hiện thử nghiệm trê n các chủng đối chứng. Một số chủng dùng làm đối
chứng cho các thứ nghiệm sinh hóa thường dùng được trìn h bày trên
Bảng 4.2,

4.1.1. Thử nghiệm khả năng lên men

a. N guyên tắc
Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon
n h ất định bởi vi sinh vật để tăn g trưởng.
Vi sinh vật có khả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn
carbon khác nhau để tă n g trưởng. Các nguồn carbon này có thể được chia
th à n h 3 nhóm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo- hay
polysaccharide) và rượu (alcohol). Các nguồn carbon thường được sử dụng
trong thử nghiệm khả năng lên men gồm:
-- Glucose - Arabinose -- Trehalose - Sorbitol
- Galactose - Raffmose Melibiose - Adonitol
- Fructose - Rhamnose Salicin - Dulcitol
- Lactose - Xylose - M annitol - Inulin
- Saccharose - Cellobiose - Inositol
Trong sô' này các nguồn carbon có tên tậ n cùng bằng -ose là đường
(kể cả salicin), tậ n cùng bằng -ol là các cơ chất mang nhóm rượu -OH.
Tuy nhiên trong thực tế các cơ chất carbon này thường được gọi tên chung
là đường.
Khi sử dụng các nguồn carbon đế lên men, tùy phương thức lên men
các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ,
C 02... Trong tấ t cả các trường hợp, các sản phẩm tạo th àn h đều ỉàm giảm
pH của môi trường. Do vậy khả năng lên men được đánh giá sự làm giảm
pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi
trường. Ngoài ra, C 0 2 được tạo th à n h sẽ được bẫy lại th à n h bọt khí trong
ống chuông Durham làm nổi ông chuông này (trường hợp sử dụng môi
trường lỏng) hoặc làm vỡ thạch khi được cây trong ống thạch sâu (trường
hợp sử dụng môi trường rắn). Môi trường lỏng thường dược dùng trong đa
số các trường hợp thử nghiệm khả năng lên men.

74
 Thứ nghiệm khá nấng lên men thường được dùng để định danh các
vi sinh vật đường ruột. Ví dự mọi th à n h viên trong ho Eìiterobactcriaccac
dể LI có kha năng lèn men glucose, E. coil, Klebsiella và nhóm
Entcrobacter lên men được glucose và lactose. Ngoài ra, thử nghiệm này
còn giúp phân biệt một số giống vi sinh vật. Ví dụ Listeria monocytogenes
có salicin (+ ) trong khi đó các loài Corynebacterium có salicin (-);
Staphylococcus aureus có mannitol (+.) trong khi đó s. epỉdernùdis có
mannitol
b. Phương p h á p tiến hành
Môi trường sử dựng là môi trường Phenol Red Broth Base có pH 7,4.
Chí thị pH của môi trường này là đỏ phenol, màu đỏ sè chuyến th àn h
màu vàng khi pH môi trường dưới 6 ,8 .

B ả n g 4 .2 CÁC CHÚNG V I KHUẨN DŨNG LÀM ĐỐI CHỨNG TRONG CÁC

THỦ NGHI ÚM SINH HÓA

Tên chủng Mã số NCTC(1) Mã số ATCC(2)

(1 ) (2 ) (3)
Acinetobacter
caỉcoaceticus 7 844 15 308
Iwoffi 5 886 15 309
Aeromonas hydrophila 8 049 7 966
Alkaligenes faecalis 415 19 018
Bacillus
ccreus 10 876 7 464
subtilis 6 633 10 400
Clostridium
histoỉyticum 19 401 503
perfringens 13 124 8 237
Edwardsiella tarda 10 396 19 547
Enterobacter
aerogenes 13 048 10 006
cloacae 10 005 -
Enterococcus faecalis 29 212 -

NCTC : National C ollection of Type Cultures (Bộ SƯU tập giống chuẩn Q uốc gia).

ATCC : Am erican Type Culture Collection (Bộ SƯU tập giống chuẩn Hoa Kỳ).

75
 (1 ) m (3)

Eschericỉiia coỉi 25 922 10 418

Mycobacterium
fortuitum 10 349 6 841
kansasii 10 268 14 471
phlei 8151 19 249
terrae 10 856 15 755
Nocardia
braziliensis 11 274 19 296
otitidiscaưiarum 1934 14 629
Proteus
mìrabilis 10 975 -
rettgeri 7 475
Pseudomonas aeruginosa 27 853 10 662
Serratia marcescens 13 880 10 218
Staphyỉococc us
epidermidis 12 228 -
aureus 25 923 6 571
Streptococcus
agaỉactiae 13 813 8 181
miỉỉeri 10 708 -
pneumoniae 6 303 -
salivarius 8 681 7073

Một chỉ thị pH khác có th ể được dùng là andrade (dung dịch 0,5%
fuchsin trong NaOH 0,6%, sử dụng ở nồng độ cuối cùng là 0,1%) có màu
nâu ở pH 7,1 chuyển th à n h màu đỏ khi pH dưới 5,0 và có màu vàng trong
mồi trường kiềm.
Nguồn carbon : tùy vi sinh vật cần kiểm định, thường sử dụng các tổ
hợp khác nhau của 8 - 1 0 loại nguồn carbon nêu trên ở nồng độ 1 % (trừ
trường hợp saìicin là 0,5%). Các loại cơ chất này thường được pha chế
th à n h dung dịch mẹ có nồng độ gấp mười nồng độ sau cùng (thường được
ghi là 10X? tức là 10% cho các loại nguồn carbon và 5% cho salicin) và
được bảo quản trong tủ lạnh. Khi sử dụng, bổ sung một lượng thích hợp
dung dịch mẹ vào môi trường dể đ ạt được nồng độ cuối cùng cần th iết
(pha loãng 1/ 10 ).

76
 Môi trường đã bố sung đường được chứa trong bình tam giác được
khử trùng bằng một trong ba cách:
- Lọc vô trùng qua màng lọc có kích thước lỗ 0 ,4 5 |im hay 0 ,2 |am.
- Hâp 116 - 118°c trong 15 phút (không nên áp dụng đối với các
đường dễ bị phân hủy bởi nhiệt như lactose, saccharose, salicin, xylose,
arabinose, trehalose, maltose).
- Háp 121uc trong 15 phút. Khi sử dụng phương pháp khử trùng này
cần chu ý tiến hành thử nghiệm lên men với chủng vi sinh vật đôi chứng
đả biết đặc điểm lên men để kiểm chứng khả năng đường bị phân hủy do
nhiệt làm sai lệch kết quả lên men.
Sau khi được khử trùng và làm nguội, môi trường được phân phôi
th àn h các dung tích 4 - 5ml vào các ổng nghiệm vô trùng. Các ông
nghiệm này có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh cho
đến khi sử dụng.
Tiến hàn h cấy chủng vào các ông môi trường bằng que cấy vòng từ
các chủng đã làm thuần trê n môi trường KIA. Có thể cấy liên tục không
cần khử trùng đầu que cấy giữa các lần cấy cùng một chủng lên các ông
môi trường chứa các loại nguồn carbon khác nhau. Sau khi cấy, ủ các ống
môi trường ở 37°c trong 18 - 20 giờ. Trong trường hợp khẳng định kết
quả âm tính, thời gian ủ có th ể được kéo dài đến 30 ngày.
c. Đọc k ế t quả
Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và
sinh hơi.
Sinh acid là ( + ) khi môi trường với chỉ thị đỏ phenol chuyển th à n h
màu vàng; ngược lại nếu môi trường màu đỏ thì sinh acid là (-). Trường
hợp chỉ thị là andrade, k ết quả là (+) khi môi trường màu đỏ, là (-) khi
môi trường màu vàng hoặc không màu.
Sinh hơi là (+) khi có bọt khí trong ống Durham, ơ một scí vi sinh
vật lên men chậm, sự đổi màu không rõ ràng và không có bọt khí trong
ống Durham. Trường hợp nghi ngờ cần so sánh với ông đối chứng không
cấy vi sinh vật hoặc thực hiện làm thử nghiệm với ống nghi ngờ.

4.1.2. Thử nghiệm khả năng ôxi hóa - lên men

a. N guyên tắc
Các vi sinh vật dị dường cần được cung cấp nguồn carbon dưới dạng
chất hữu cơ, thường là carbohydrate, từ môi trường. Các carbohydrate này
được vi sinh v ật sử dụng làm nguồn năng lượng thông qua một trong 2
phương thức biến dưỡng năng lượng là lên men hoặc hô hấp.

77
 Lên men là một quá trìn h biến dưỡng năng lượng trong điều kiện kỵ
khí, năng lượng được tạo ra bơi cơ chế phosphoryl hóa cơ chất, không có
sự tham gia của chuỗi truyền điện tử và chât nhận điện tử sau cùng từ
bên ngoài tế bào. Quá trìn h lên men glucose sẽ chia phân tử này th àn h 2
phân tử đường triose (đường 3C). Sản phẩm cuôi cùng của con đường lên
men phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật và diều kiện môi trường. Tuy vậy
điểm côt yếu của con đường lên men là phân tử glucose bị phosphoryl hóa
ở bước đầu tiên đê th à n h glucose-6 -phosphate. Quá trìn h lên men cần
chât n h ận điện tử cuôi cùng là một hợp chất hữu cơ. Glucose tham gia
trong quá trìn h lên men thường được trao đổi theo con đường Embden-
M eyerhoí’ cũng có trường hợp trao đổi theo con đường Entner-Doudoroff
và con đường theo hướng trao đổi pentose.
Ngược lại, hô hấp là quá trìn h biến dưỡng năng lượng trong đó điện
tứ được truyền tuần tự từ chất cho điện tử đến chất nhận điện tử trong
chuồi truyền điện tử, trong quá trìn h này năng lượng ATP được tạo ra
theo cơ chế phosphoryl hóa ôxi hóa. Cuối chuỗi truyền điện tử là chất
nhận điện tử sau cùng cần được cung cấp từ môi trường. Quá trìn h này
được gọi là sự hô hấp hiếu khí khi chất nhận điện tử cuôi cùng là ôxi
phân tử, chỉ diễn ra trong môi trường có ôxi. Ngược lại quá trìn h Iiàv
được gọi là hô h ấp kỵ khí khi chất nhận điện tử cuối cùng không phái là
ôxi, như n itrat hav sulphate.
Trong quá trìn h hô hấp hiếu khí, phân tử glucose không bị tách th ành
2 phân tử triose như trong lên men mà bị ôxi hóa nhóm chức aldehvde
(-CHO) đế tạo th àn h acid gluconic và cũng không bị phosphoryl hóa ỏ' giai
đoạn đầu của quá trình phân giải như trong lên men. Quá trình lên men
thường tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình ôxi hóa.
Thử nghiệm ôxi hóa - lên men còn được gọi là thử nghiệm Hugh -
Leifson nhằm xác định vi sinh vật đang thử nghiệm biến dưỡng
carbohydrate theo phương thức ôxi hóa hay phương thức lên men. Thử
nghiệm này được thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trong
môi trường Hugh - Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy n h ất và chỉ
thị pH là bromothymol blue. Các sản phẩm có tính acid của quá trìn h lên
men sè làm thay đổi màu chỉ thị pH.
Chủng dùng làm đôi chứng phương thức ôxi hóa là Acinetobacter
calcoaceticus, cho lên men là E. coli, cho không khả năng biến dưỡng
glucose là Alcahgencs faecalis.
b. Phương p h á p tiến h à n h
Cây đâm sâu vi sinh vật thử nghiệm vào hai ông nghiệm môi trường
Hugh - Leifson có chứa 2-5g agar/ lít. 1 trong 2 ông được phủ lên bề m ặt

78
lm l dầu khoáng paraffin lỏng vô trùng đé ngăn cán sự tiếp xúc với ôxi
không khí. u cả 2 ông trong cùng điều kiện khoảng 24-48 giờ. Trường
hợp các chung thử nghiệm là cầu khuân Streptococci hay Micrococci, môi
trường Hugh - Leifson được thay bằng môi trường Baird - P arker cải biên
trong đó chỉ thị pH là bromocresol blue.
c. Đọc k ế t quả
Phương thức biến dưỡng carbohydrate là lên men khi cả 2 ông đều bị
acid hóa đều ở trê n m ặt và phần sâu của môi trường. Ngược lại, khi ông
kỵ khí bị acid hóa dều khắp thạch sâu, trong khi đó ông hiếu khí không
bị acid hóa trên m ặt mà chỉ bị acid hóa ở phần đáy ống thì kết luận vi
sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo phương thức ôxi hóa. (X. ảnh 8).

4.1.3. Thử nghiệm Bile Esculin

a. N guyên tắc
Thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trê n khả năng thủy phân
liên kết glucoside trong esculin th à n h esculetin và glucose khi có sự hiện
diện của muôi mật. Esculin là một dẫn xuất acetaldehyde của một
monosaccharide. Trong phản ứng này, liên kết p-glucoside trong esculin bị
thủy phân, phóng thích glucose và esculetin. Esculetin phản ứng với muôi
sắt trong môi trường tạo th àn h phức hợp màu đen hay màu nâu đen.
Chủng dùng làm đôi chứng (+) cho thử nghiệm này là Serratia
marcescens, ( —) là Edivcirdsiella tarda.
b. Phương p h á p tiên h à n h
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường Aesculin
Medium hay môi trường Edwards. Sau khi cấy chủng, nếu chủng có hoạt
tính thủy phân esculin thì làm đen môi trường.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm là (+) khi màu môi trường chuyển th àn h màu đen hay
màu nâu đen, thử nghiệm là (-) khi môi trường không đổi màu. (X. ảnh 9).

4.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

a. N guyên tắc
Một sô" vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon
duy n h ấ t để thu lấy năng lượng và vật chât. Sự biến dưỡng citrate thường
thông qua sự k ết hợp với acetylCoA th à n h oxaloacetate đế vào chu trìn h
tricarboxylic acid (chu trìn h Krebs). Sản phẩm biến dưỡng citrate thay
đổi tùy pH của môi trường. Khi pH tăng, môi trường chuyến sang kiềm,
lượng acetate và form ate tạo th à n h sẽ tăn g trong khi lactate và COo
giảm. Ớ pH trung tín h sản phẩm chủ yếu là C 0 2 và acetate. Ớ pH acid,

79
sán phẩm tạo ra chù yếu là acetoin và lactate. Như vậy sự biến dưỡng
citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CƠ2 làm kiềm hóa môi trường. M ặt khác
mọi vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy n h ât
đều có khả năng dùng muôi ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự
phân giải của muôi ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ
sinh N H 3 làm kiềm hóa môi trường. Như vậy trong môi trường thử
nghiệm khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy n h ấ t có chứa
đạm ở dạng muôi ammonium, khả năng tăng trưởng của chủng sẽ th ể
hiện qua khả năng biến dưỡng nguồn carbon citrate và nguồn đạm
ammonium làm tă n g giá trị pH của môi trường. Sự gia tăn g giá trị pH
này được chỉ th ị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Thử nghiệm này được dùng để phân biệt nhóm Klebsiella,
Enterobactcr (+ ) với E. coli {-) trong thử nghiệm IMVIC, hoặc để phân
biệt Edivardsiella (-) với Salmonella (+).
Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus
rettgeri, (-■) là Staphylococcus epidermidis.
b. P hương p h á p tiế n h à n h
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate là
môi trường rắ n Simmons C itrate Agar (SCA) hay môi trường
C hristensens C itrate Sulfide Agar (CCSA).
Môi trường SCA chứa sodium citrate hoặc potassium citrate làm
nguồn carbon duy nh ất, chỉ th ị bromothymol blue, pH 6,9. Chỉ thị này có
màu vàng ở pH dưới 6 ,0 , màu xanh lục ở pH trung tính và màu xanh
dương ở pH lớn hơn 7,6. Chủng thuần trên môi trường KIA hoặc môi
trường thích hợp khác được cấy ria trê n bề m ặt môi trường SCA rắn
trong ống thạch nghiêng. Ông thạch được ủ ở 35°c trong 24 - 48 giờ hoặc
kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết.
Môi trường CCSA chứa nguồn đạm là cystein, chỉ thị màu là phenol
red, pH 6,7. Môi trường chưa sử dụng có màu thay đổi từ màu kem đến
nâu. ơ pH acid (dưới 6,8), màu chỉ th ị trở th àn h vàng và ở pH kiềm (trên
8,4) trở th àn h màu đỏ. Chủng vi sinh v ật được cấy và ủ trong diều kiện
tương tự như trường hợp môi trường SCA.
c. Đọc k ế t quả
- Trường hợp môi trường SCA, thử nghiệm là (+) khi xuất hiện
khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương; (-) khi không có
khuẩn ỉạc và môi trường gi ừ nguyên màu xanh lục. (X. ảnh 10).
- Trường hợp môi trường CCSA, thử nghiệm là (+) khi môi trường
chuyển sang màu đỏ; (-) khi môi trường không dổi màu.

80

I
 4.1.5. Thử nghiệm khả năng biến dường maionate

a) N guyên tắc
Một số vi sinh vật có khả năng dùng malonate làm nguồn carbon duy
nhất để thu lấy năng lượng và vật chất. Malonate là một tác nhân kìm
hãm hoạt tính của enzyme succinate dehydrogenase xúc tác sự chuyển
hóa succinate th à n h fumarate cản trở sự biến dưỡng theo chu trìn h Krebs.
Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sử dụng chu trìn h Gìyoxyỉic acid
đê biến dưỡng năng lượng. Nêu không sử dụng được malonate, chất này
có tác dụng như một chất diệt khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến
dường m alonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium làm nguồn
đạm duy nhất. Sự tăng trưởng của chủng trên môi trường chứa malonate
làm nguồn carbon duy n h ât sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này làm
phóng thích NH,S và làm kiềm hóa môi trường. Do vậy khả năng biến
dưỡng m alonate của chủng có th ể nhận thấy bằng sự chuyển màu của chỉ
thị pH trong môi trường.
Chủng dùng làm đôi chứng (+) cho thử nghiệm này là Enterobacter
cloacae, (-) là Staphylococcus epidermidis.
6. Phương p h á p tiến h à n h
Môi trường sử dụng là môi trường Malonate Broth chứa chỉ thị màu
bromothylmol blue. Chỉ thị này có màu vàng ở pH dưới 6,0, màu xanh lục
ở pH trung tính và màu xanh dương ở pH lớn hơn 7,6. Môi trường được
hấp khử trùng trong điều kiện bình thường,làm nguội và phân th à n h các
dung tích 4 * 5 ml vào trong các ống nghiệm vô trùng. Chủng thuần được
cấy vào các ống môi trường. Các ông môi trường thử nghiệm được ủ qua
đêm ở nhiệt độ 37°c.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm là (+) khi môi trường chuyển sang màu xanh dương.
Ngược lại, thử nghiệm là (-) khi màu môi trường không thay đổi.

4.1.6. Thử nghiệm catalase

a. N guyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có
cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme
này là một trong các th à n h viên của hệ thông các enzyme có vai trò bảo
vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tín h cao của ôxi phân
tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các vi sinh vật này có khả năng
biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với ôxi là chất nhận
điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H 20 2. Catalase thủy phân
hydrogen peroxide (H 20 2) th à n h H 20 và 0 2, ngăn cản sự tích tụ của

6 'P H Ư Ơ N G PHÁP PHĂN TÍCH 81

phân tử có độc tín h cao này trong tế bào. Tuy nhiên, ngoài catalase,
nhiều enzyme peroxidase khác trong hệ thống các enzyme bảo vệ tế bào
khỏi stress ôxi hóa cũng có khả năng thủy phân hydrogen peroxide. Các
enzyme này cũng chỉ hiện diện ở các tế bào, vi sinh vật hiếu khí và kỵ
khí tùy ý có kh ả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp
hiếu khí. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng 0 2 dược ghi nhận
qua hiện tượng sủi bọt khí.
Thử nghiệm này thường được dùng để phân biệt các vi sinh vật hiếu
khí với vi sinh vật kỵ khí, phân biệt Bacillus {+) với Clostridium (-),
Streptococcus (-) với Micrococcus (+) và Staphylococcus (+), Listeria
monocytogenes ( + ) với Erysipelothrix (-).
Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Staphylococcus
epiderrnidis, (-) là Enterococcus faecahs.
6. P hương p h á p tiê n h à n h
Hóa chất được sử dụng là dung dịch hydrogen peroxide 30% được giữ
trong lạnh trong chai màu nâu, trá n h ánh sáng; dung dịch đệm
phosphate pH 7,0.
Có th ể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong nhửng phương
pháp sau :
- Thử trê n phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy một ít sinh khôi từ
khuẩn lạc th u ần dặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H 20 2 30%
lên sinh khôi vi sinh v ật trê n phiến kinh. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
M ặt khác có th ể thử bằng cách chuyển một ít sinh khôi của khuẩn lạc lên
phiến kính, nhỏ một giọt H 2O2 0,5% rồi đậy lại bằng một lá kính
(lamelle). Ghi n h ận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giừ lại giữa phiến
kính và lá kính.
- Thử trong ống thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp lm l H20 2 30% lên
sinh khối chủng thuần trê n bề m ặt thạch nghiêng. Ghi n h ận nếu có sự
sủi bọt quanh sinh khôi.
- Thử bằng ông mao dẫn: dùng ông mao dẫn thu lấy dung dịch H20 2
30%, sau đó châm đầu ông mao dẫn này vào tâm khuẩn lạc cần thử trên
môi trường. Ghi n h ận nếu có sự sủi bọt khí trong ông mao dẫn. Phương
pháp này có Ưu điểm là thử được trê n từng khuẩn lạc nên có th ể thực
hiện trê n các khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O9 được tạo re
ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí.

82
 4.1.7. Thử nghiệm decarboxylase

a. N guyên lắc
Các loài vi khuẩn đường ruột khác nhau trong mức độ cảm ứng tạo
thành các enzyme carboxylase có vai trò xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm
carboxyl ớ một sô' acid amin tạo ra amine hoặc diamine và c o , trong điều
kiện kỵ khí. Các enzyme này chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường
có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Họ decarboxylase gồm nhiều
thành viên, mỗi loại chỉ tác động lên một cơ chất n h ất định. Có 3 loại
decarboxylase quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật là lysine
decarboxylase (LDC), ornithine decarboxylase (ODC) và arginine
decarboxylase (ADC) có cơ chất tuần tự là lysine, ornithine và arginine.
Phản ứng được xúc tác bởi LCD sẽ loại bỏ C 0 2 khỏi lysine, phóng thích
C 02 và dẫn đến sự tạo th àn h cadaverine. Trường hợp ODC và ADC sản
phẩm tạo ra là C 0 2 và putrescine. Ngoài ra, arginine còn có th ể được
chuvển hóa th à n h citruline nhờ xúc tác của enzyme arginine clihydrolase
(ADH) trước khi dược chuyển hóa tiếp th àn h putrescine và COo. Do vậy
thử nghiệm argine decarboxylase (ADC) cùng được ký hiệu là ADH).
Trong tấ t cả các trường hợp nèu trên, C 0 2 sinh ra làm tăng pH của môi
trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.
Các thử nghiệm decarboxylase thường được dùng để phân loại và
định danh các loài vi khuẩn đường ruột họ Entcrobactcriaceae.
Chủng dùng làm đối chứng (+) đôì với thử nghiệm ADC (ADH) là
Enterobacter cloacae, (-) là Enterobacter aerogenes\ (+) dôi với LDC là
Serratia niarcescens, {-) là Proteus rettgeri; (+) đối với ODC là Scrratia
mơrcescens, (-) là Proteus rettgeri.
b. Phương p h á p tiên h à n h
Môi trường được sử dụng là môi trường Decarboxylase Basal Medium,
chứa chỉ thị bromocresol purple, pH 6,0. Chỉ thị này có màu thay đổi từ
vàng thành tím với vùng chuyển màu là pH 5,2 - 6,8.
Môi trường lỏng được pha chế và hấp khử trùng theo phương pháp
thông thường. Sau khi làm nguội, môi trường được phân th àn h các dung
tich 4 - 5ml vào các ông nghiệm vô trùng. Chủng thuần được cấy ở m ật
độ thấp vào các ống mồi trường, sau đó mỗi ống được bổ sung 2 - 3ml dầu
khoáng hoặc paraíĩn và được ủ ở 37°c trong 24 giờ đến 4 ngày, õ x i tan
trong môi trường sẽ được vi khuẩn sử dụng cho tăng trưởng và làm môi
trường trở nên cạn kiệt ôxi. Trong điều kiện này các enzyme
decarboxylase được cảm ứng do có hiện diện của cơ chất và phản ứng
chuyển hóa có th ể diễn ra.

83
 c. D ọ c k ế t q u ả
Thử nghiệm là (+ ) khi môi trường trở nên đục và có màu tím; (-) khi
mỏi trường trong có màu vàng.

4.1.8. Thử nghiệm coagulase

a. N guyên tắc
Một số^ vi sinh vật, đặc biệt là các loài thuộc giông Staphylococcus,
có khả nàng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ
các th à n h phần của huyết tương, tạo th àn h các khôi đông làm đông huyết
tương. Có nhiều giả thuyết khác nhau được đề xuất để giải thích cơ chê
làm đông huyết tương bởi coagulase nhưng không được đề cập ở đây.
Coagulase có bản chât protein nên nhanh chóng bị bất hoạt và thủy phân
bởi protease. Tuy nhiên enzyme này khá bền với nhiệt, chịu được sự xử lý
n h iệt ở 60°c trong 30 phút mà không giảm hoạt tính.
Thử nghiệm này được dùng ở bước cuổì cùng trong các chỉ tiêu thử
nghiệm để đinh danh các loài trong giỏng Staphylococcus, ví dụ s. aureus
(+ ), ố\ epiderniidis (-), s. saprophyticus (-).
Chủng dùng làm đôi chứng (+) trong thử nghiệm này là
Staphylococcus aureus, (-) là Staphylococcus epidermidis.
b. Phương p h á p tiế n h à n h
Thử nghiệm này có th ể được thực hiện với huyết tương hoặc
fibrinogen.
Trường hợp dùng huyết tương nên dùng huyết tương người hay thỏ
đông khô dạng thương phẩm . Tuy nhiên cũng có thể tự điều chế huyết
tương bằng cách ly tâm máu chứa chất chống đông để loại bỏ các tế bào
máu, thu nhận huyết tương. Trường hợp sử dụng fibrinogen, có thê tự
điều chế fibrinogen bằng cách trộn huyết tương với nước muôi bão hòa
theo tỷ lệ 1:1 để tủa fibrinogen, sau đó thu n h ận fibrinogen bằng ly tâm .
Tủa này được hoà tan vào nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1:4, được bảo quản
ớ 4°c thời gian ngắn hay -20°c trong thời gian dài. c ầ n kiểm tra chất
lượng huyết tương hoặc fibrinogen bằng các chủng dương tính
{S. aureus) và âm tín h (S. epidcrnũdis) trước khi sử dụng. Ngoài ra khi sử
dụng citrate làm chất chống đông máu để thu lấy huyết tương và
fibrinogen, khi sử dụng cần bổ sung 5 đơn vị heparin/m l huyết tương, dịch
fibrinogen để trá n h kết quả dương tín h giả thường gặp đốì với vi sinh vật
có khả năng biến dưỡng citrate. Hiện nay, EDTA thường dược dùng làm
chất chồng đông thay cho citrate để loại trừ hiện tượng coagulase dương
tính giả bởi các chủng biến dưỡng citrate.

84
 Hoạt tính coagulase có thề được thử bằng 2 phương pháp:
- Thử trên phiến kính: nhỏ lên phiến kính (lame) một giọt nước cất
hoặc nước muôi sinh lý; dùng que cấy vòng thu lấy một lượng lớn sinh
khối từ khuẩn lạc hoặc từ dịch nuôi cây chủng thuần hòa vào giọt nước để
tạo th àn h một huyền phù có m ật độ tế bào cao. Thêm vào đó một vòng
que cấy huyết tương người mới pha, hòa đều tạo huyền phù đồng nhất.
Nếu phản ứng (+) sẽ có sự xuất hiện của những đám ngưng k ết trong
vòng 20 giây. Thử nghiệm ỉà (-) nếu sau 4 phút không có phản ứng ngưng
kết xảy ra. K ết quả (-) cần được khẳng định tiếp bằng thử nghiệm trong
ống nghiệm.
- Thử trong ông nghiệm: cho vào ông nghiệm 0,5ml huyết tương
người hoặc thỏ không pha loãng, bổ sưng 0,5ml dịch nuôi cấy chủng
thuần hoặc một lượng lớn (khoảng một vòng que cấy) sinh khôi khuẩn
lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều vi sinh vật. ú ông thử nghiệm ở 37°c
trong 4 giờ. Quan sát, ghi n h ận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến
24 giờ nếu không xuất hiện khôi kết tụ.
c. Đọc k ế t quả
- Trường hợp thử trê n phiến kính: thử nghiệm là (+) khi có sự k ết tụ
rõ trong vòng 20 giây. Nếu không có k ết tụ, thử nghiệm lại trong ống
nghiệm.
- Trường hợp thử trong ống nghiệm: thử nghiệm là (+) khi có sự kết
tụ, là (-) khi hỗn hợp không có k ết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất. (X. ảnh 11).

4.1.9. Thử nghiệm urease

a. N guyên tắc
Một số vi sinh v ật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân của
urea. U rea (NH)2CO là diamide của acid carbonic. Urease thuộc nhóm các
amidase xúc tác sự thủy phân của liên k ết amide giữa C-N trong phân tử
urea để giải phóng hai phân tử NH3 và C 0 2. Enzyme này hoạt động tối
ưu ồ pH 7,0, thuộc nhóm enzyme cấu trúc, hiện diện thường xuyên trong
tế bào không phụ thuộc vào sự h iện diện hay không của cơ chất là urea.
Sự phóng thích NH3 và C 0 2 làm tăn g pH của môi trường và có th ể được
theo dõi qua sự đổi màu của chất chỉ thị pH.
Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp. và thường
được dùng để phân biệt các dạng Proteus với các th à n h viên khác của
Enterobacteriaceae.
Chủng dùng làm đối chứng (+) trong thử nghiệm này là Proteus
rettgeri, (-) là Serratia marcescens.

85
 b. P hương p h á p tiế n h à n h
Thứ nghiệm urease được thực hiện trên 2 môi trường:
- Môi trường urea lỏng Rustigian - S tu art’s Urea Broth, chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 -
8,4). Dùng que cây vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng
thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi
khuẩn và ủ ở 37°c trong 48 giờ. Quan sát và ghi nhận sự chuyến màu vào
các thời điểm sau 8, 12, 24, 48 giờ ủ.
- Môi trường rắn C hristensen Urea, chứa chỉ thị đỏ phenol như môi
trường lỏng Rustigian - Stuart. Dùng que cây vòng cấy lượng sinh khôi
lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần lên bề m ặt các ông thạch nghiêng môi
trường C hristensen Urea, ủ ở 37°c trong 24 giờ. Môi trường C hristensen
Ưrea cũng có th ể được dùng ở dạng môi trường lỏng như môi trường
Rustigian - S tu art’s Urea.
c. Đọc k ế t quả
- Trường hợp sử dụng môi trường lỏng Rustigian - Stuart's Ưrea, thử
nghiệm là (+ ) khi môi trường trở th à n h màu đỏ tím, là (-) khi môi trường
có màu vàng cam không đổi. (X. ảnh 12).
- Trường hợp sử clụng các ống thạch nghiêng C hristensen, thử
nghiệm là (+) khi màu môi trường trở th àn h màu đỏ tím. Bề dày của
phần môi trường bị đổi màu chỉ thị mức độ thủy phân urea {++++ : toàn
bộ thạch đổi màu; ++ : chỉ m ặt thạch đổi màu; + : m ặt thạch ở đinh đổi
màu, phần môi trường còn lại không đổi màu). Ngoài ra còn phân biệt:
(+ ) nhanh khi màu đổi trong vòng 6 giờ; (+) chậm khi màu chỉ đổi sau
1 - 6 ngày. Trường hợp màu môi trường màu vàng hoặc vàng n h ạt hoàn
toàn không đổi: thử nghiệm là (-).

4.1.10. Thử nghiệm gelatinase

ơ. N guyên tắc
Một số vi sinh v ật có th ể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại
bào xúc tác sự thủy phân của gelatin th àn h polypeptide và acid amin. Để
nh ận biêt khả năng làm ta n gelatin của vi sinh vật, cơ chất này được bổ
sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy. Sau khi cấy chủng, vi sinh vật có
khả năng tiế t gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy th à n h dạng lỏng.
Chủng dùng làm đối chứng (+) trong thử nghiệm này là Aeromonas
hydrophlla, (-) là E. coli.

86
 b. Phương p h á p tiến hành
Môi trường sử dụng là môi trường dinh dường chứa gelatin N utrient
Gelatin trong các ống thạch sâu. Tiên hành cấy một lượng sinh khôi lớn
chung thuần sâu vào trong ống mỏi, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày.
Thực hiện ủ song song một ống môi trường đối chứng không được cấy vi
sinh vật.
Một phương pháp thử nghiệm khác là cấy vi sinh vật lên môi trường
dinh dưỡng chứa gelatin trên đĩa petri, ủ 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Bổ
sung lên trên bề m ặt môi trường 5 -10ml dung dịch trichloacetic acid TCA
đê làm kết tủa gelatin.
c. Đọc k ế t quả
Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường bị tan chảy ớ
ống có cấy chủng trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạn g thái
đông đặc. Thử nghiệm là (-) khi cả môi trường ở cả hai ống đều không bị
tan chảy. (X. ảnh 13).
Trường hợp sử dụng dĩa petri môi trường dinh dưỡng chứa gelatin,
các khuẩn lạc có gelatinase dương tính sẽ tạo vòng phân giải gelatin
trong rô trong khi môi trường trơ nên đục khi nhuộm bởi TCA.

4.1.11. Thử nghiệm khả năng sinh H2S

a. N guyên tắc
Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự
chuyến hóa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như
cysteine, cystin, methione và phóng H 2S. Thành viên quan trọng n h ất của
nhóm enzyme này là cysteine desulfohydrase. Các acid amin này là sản
phẩm của quá trìn h thủy phân protein th àn h acid amin. Khí H 2S sinh ra
sè tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfide chứa trong môi trường nuôi cấy.
Ngoài nguồn đạm hừu cơ, H^s còn có thể được tạo ra do phản ứng khử
thiosulfate N a2s 20 3 bởi enzyme thiosulfate reductase của vi sinh vật đế
tạo ra sulfite và H^s.
Các hợp chất được sử dụng trong môi trường làm chỉ thị H 2S có thể
là các hợp chất của sắt như F eS 0 4, ammonium sulfate sắt II hoặc III. Khí
H ,s phản ứng với ion sắt sẽ tạo th à n h sulfide sắt FeS không ta n có màu
đen. Ngoài ra, acetate chì Pb(C2H ‘i0 2)^ cũng có thể được dùng làm chỉ thị
của sulfide do hợp chất, này cũng phản ứng với H 2S tạo sulfide chì PbS
khỏng tan màu đen. Chỉ thị acetate chì có độ nhạy cao cho phép phát
hiện lượng nhỏ HọS được tạo ra ở những loài vi khuẩn không thuộc họ
Enterobacteriaceae, ví dụ như Brucella.

87
 Thử nghiệm khả năng sinh H 2S thường được dùng đế phân biệt một
số loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giông Proteus.
b. Phương p h á p tiê n h à n h
Các loại môi trường có thề được sử dụng cho thử nghiệm sinh H 2S là
KIA (Kliglei’ Iron Agar), TSI (Triple Sugar Iron Agar), SIM (Sulfide Indol
Motility Agar), PIA (Peptone Iron Agar), BSA (Bismuth Sulfite Agar). Tất
cả các môi trường này được hấp khử trùng ở 121°c trong 15 phút và được
phân phối vào các ống nghiệm vô trùng đế làm ống thạch nghiêng (môi
trường KIA, TSI) hoặc thạch đứng (môi trường SIM, PIA), hoặc vào các
đĩa Petri vô trùng (môi trường BSA). Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ
khuẩn lạc của chủng th u ần sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng, ống
thạch đứng hoặc cấy lên m ặt đĩa petri. Sau khi cấy giống các ông môi
trường hoặc đĩa petri được ủ ở 37°c trong 24 - 48 giờ hoặc đến 7 ngày khi
cần thiết.
Ngoài ra, thử nghiệm này có thể được thực hiện bằng cách dùng giấy
tẩm acetate chì 5% gắn lên th à n h ống môi trường lỏng. Phương pháp này
hạn chê độc tinh của ion sắt, chì lên sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật
kiêm định, m ặt khác có độ nhạy cao (phát hiện H2S ở mức 0,01M). Trong
trường hợp này, việc k ết hợp giữa cấy lượng sinh khối lớn vào ống môi
trường và sử dụng giấy tẩm acetate chì làm chỉ thị có thể cho kết quả
trong vòng 30 phút hoặc 1 -2 giờ đối với hầu h ết vi sinh vật sinh H^s.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm khả năng sinh H^s là (+) khi xuất hiện màu đen trong
các môi trường KIA, TSI, SIM, PIA, khuẩn lạc màu đen trong môi trường
BSA hoặc xuất hiện màu nâu đen trê n giấy tẩm acetate chì. Thứ nghiệm
là (-) khi môi trường không có sự xuất hiện hoặc chuyển màu đen.

4.1.12. Thử nghiệm khả năng sinh indol

a. N guyên tắc
Tryptophan là một acid amin có thể bị ôxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Sản
phẩm trung gian chính của phản ứng ôxi hóa tryptophan là indolpyruvic
acid IPA. P hân tứ này sau đó bị biên đổi theo hướng loại nhóm amin
(deamination) th à n h indol hay theo hướng loại nhóm carboxyl
(decarboxylation) th à n h skatol. Tryptophanase xúc tác phản ứng loại
nhóm amin dể tạo th à n h indol. Việc p h át hiện indol được thực hiện bằng
phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa
p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). N hân pyrrol của indol chứa
nhóm CHv sẽ k êt hợp với n h ân benzene của p-DMABA tạo nên một phức
chất dạng quinone có màu đỏ.

88
 Thứ nghiệm này được dùng để phân biệt E. COỈI (+) với Klebsiella (-),
Proteus mirábilis (.-) với các loài Proteus khác (+), Bacillus alvei (+) với các
Bacillus khác (thường là -). Haemophilus haemoglobinophilus (+) và H.
influenzae (-) với các loài Haemophilus khác (thường là Pasteureỉỉa
nudtocida (+} và p. pneumotropica (+) với p. haemolytica (-) và p. urea (-).
Chủng dùng làm đôi chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus
rettgeriy (-) ỉà Serratia marcescens.
b. Phương p h á p tiến hành
Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này có thế là nước tryptone,
hoặc các môi trường kết hợp như MIƯ (Motility Indol Urea), SIM (Sulfide
Indol Motility)... khi cần kiểm tra cùng lúc nhiều đặc tính sinh hóa cần
thiết. Hai loại thuốc thử có thế sử dụng cho thử nghiệm này là thuôc thử
Erlich và thuốc thử Kovacs. Sinh khôi chung thuần được cấy vào ống môi
trường lỏng thuộc một trong các loại nêu trên , ủ ờ nhiệt độ 37°c trong 24
- 48 giờ. Trước khi bố sung thuòc thử có th ể bồ sung Xml ether hoặc
xylene vào ống nghiệm, lắc đều đế chiết tách indol lên lớp dung môi hửu
cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi
sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm là (+ ) khi có sự xuât hiện của lớp màu đỏ trên bề m ặt
môi trường; là (-) khi có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề m ặt môi
trường. Đôi khi có sự ximt hiện của màu cam do skatol, là tiền chất
methyl hóa của indol, tạo ra.

4.1.13. Thử nghiệm KIA, TSI

a. N guyên tắc
Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) và môi trường TSI (Triple Sugar
Iron Agar) được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử
dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S
của chủng vi sinh vật
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa hai loại đường là 1% lactose
và 0,1% glucose. Tương tự, môi trường TSI có th àn h phần như môi trường
KIA nhưng có thêm 1% sucrose (saccharose). Khả năng sử dụng cả hai
nguồn đường là glucose và lactose hay chỉ sử dụng glucose để thu lấy
năng lượng cần cho tăn g trưởng ỉà tùy thuộc vào di truyền của chủng vi
sinh vật và có th ể được theo dõi trên ông thạch chứa môi trường KIA.
Khi cấy chủng lên môi trường này, có ba trường hợp có thể xảy ra đôi với
sự tăng trưởng của chủng vi sinh v ật thử nghiệm: chỉ sử dụng glucose, sử
dụng các glucose và lactose, không sử dụng cả hai loại đường này. Khả

89
năng này của vi sinh vật có thê được xác định thông qua sự đổi màu của
chỉ thị pH trong môi trường ở trê n bề m ặt và bên trong môi trường trong
ống thạch nghiêng.
- Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, sau 18 - 24 giờ nuôi cấy phần
môi trường bề m ặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần
sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể được giải thích là lượng glucose
trong phần bề m ặt của môi trường được vi sinh vật ỏxi hóa hoàn toàn
th à n h H 20 và COy để thu năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng
cho tăng trướng, vi sinh vật tiến hành dị hóa pept-on trong môi trường
qua đó giải phóng NH;i làm phần bề m ặt của môi trường có pH kiềm.
Ngược lại, ở phần sâu trong môi trường mới có điều kiện ôxi không đầy
đủ, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của
môi trường. Nếu trong môi trường có chất chỉ thị là đỏ phenol th ì trên
mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
- Nếu vi sinh v ật có thể sử dụng cả glucose và lactose, sau
18 - 24 giờ nuôi toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến
dưỡng đồng thời cả glucose và lactose ở bề m ặt môi trường giúp vi sinh
vật đủ năng lượng để tăn g trưởng mà không cần phải sử dụng đến
pepton. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian nuôi cây quá 24 giờ, bề m ặt Iĩiôi
trường có th ể trở th à n h màu đỏ do h ết nguồn carbon và vi sinh vật phái
sử dụng đến pepton.
- Nếu vi sinh v ật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì
pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự
tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng
trong điều kiện hiếu khí n ên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diễn ra
trê n phần của bề m ặt môi trường và chỉ phần này trở nên có màu đỏ.
Trong khi dó, phần môi trường sâu trong ông nghiệm sẽ không có hiện
tượng đổi màu.
Trong các trường hợp nêu trên , Iiếu sự lên men đường tạo ra các sản
phẩm khí thì khí sê tích tụ bên trong th àn h bọt khí hay sẽ làm vờ
thạch.
Trường hợp sử dụng môi trường TSI, các hiện tượng liên quan đến sử
dụng nguồn carbon cũng xảy ra tương tự.
Thử nghiệm khá năng sinh H ,s có thế thực hiện đồng thời trên hai
mói trường này do th à n h phần môi trường có chứa sodium thiosulphate.
Vi sinh vật khử sulfate có thế khử hợp chât này đế giải phóng H 2S. Khí
H2S tạo ra sẽ được p h át hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS
giừa H 2S và ion Fe2+ cua chỉ thị ferric ammonium citrate hiện diện trong
môi trường.

90
 b. Phương p h á p tiên hành
Mòi trường KIA hay TSI được pha chế, hấp khử trùng và chuyền vào
các ông nghiệm vô trùng đế tạo óng thạch nghiêng sao cho đinh thạch
nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm và phần sâu có chiều cao
khoáng 2,5cm. Dùng que cấy thắng cấy sinh khôi từ khuẩn lạc của chủng
thuần vào sâu vào phần sâu của ông thạch nghiêng nhưng trá n h chạm đáy
ông, sau đó ria trên bề m ặt thạch nghiêng. Sau khi cấy giống, các ông
thạch nghiêng được ủ ở 37°c từ 18 - 24 giờ. Ghi nhận màu, sự sinh khí ở
phân sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo th àn h màu nâu bởi FeS.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm khả năng sử dụng đường: xem mục nguyên tắc.
- Thứ nghiệm sinh HvS: thử nghiệm là {+ ) nếu xuất hiện túa màu
nâu đen bên trong môi trường, là ( - ) nếu không xuất hiện tủa nâu đen.

4.1.14. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

a. N guyên tắc
Các vi sinh vật có khả năng khử n itrate tổng hợp hệ enzyme
nitratase xúc tác SƯ khứ n itrate th àn h n itrite và nitơ phân tử. Sự khử
nitrate còn được gọi là sự phản n itrate hóa, diễn ra trong điều kiện không
có ôxi phân tử. Đâv là cách biến dưỡng náng lượng theo phương thức hô
hấp kỵ khí. Hầu h ết các vi sinh vật khử n itrate ỉà những vi sinh vật hiếu
khí tùy ý, chỉ thực hiện quá trìn h khử n itrate khi môi trường không có sự
hiện diện cua ôxi phân tử. Sản phẩm cuổì cùng của sự khử này có th ể là
nitrite (N 02“); ammonia (NH;ì), nitơ phân tử (N2), một hydroxylamine
(NH ,OH) hay nitric oxide (NO) tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều
kiện môi trường. Hoạt tín h Iiitratase được định tính dựa trên sự tạo th àn h
nitrite và sự cạn kiệt nitrate. N itrite được tạo ra từ n itrate sẽ phản ứng
với sulphanilamide và N-napthylethylenediam ine hydrochloride ở pH acid
cho hợp châ^t có màu hồng. Tuy nhiên do nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển
hóa nitrite th àn h các hợp chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của
nitratase nhưng môi trường cũng không xuất hiện màu hồng. Trường hợp
này, tiến h àn h kiểm chứng sự cạn kiệt của n itrate bằng bụi kẽm kim loại:
n itrate sẽ phản ứng với bụi kẽm tạo màu hồng.
Chủng dùng làm đôi chứng (.+) cho thử nghiệm này là Serratiơ
í marccscens, (-) là Acinetobacter Iwoffi.
b. Phương p h á p tiê n hành
Có thể thực hiện thử nghiệm bằng một số cách như sau:
- Cách 1: môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng N itrate Broth.
Cấy sinh khôi chủng thuần và ủ ở 37°c qua đêm.

91
 - Cách 2; dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng
thuần, khuếch tá n dày đặc chủng vật thử nghiệm vào ống nghiệm chứa
dung dịch sodium n itrate 0,0IM trong dệm phosphate 20mM pH 7,0 vô
trùng, u các ống ờ 37°c trong 24 giờ.
- Cách 3: nhỏ vài giọt dung dịch sodium n itra t 19c vào dịch nuôi cấy
đã nuôi cấy vào cuôi log pha. ủ ở n h iệt độ 37°c trong 4 giờ.
Sau thời gian ủ, acid hóa môi trường bằng cách bổ sung vài giọt HC1
IN, sau đó bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide 0,2c/c và 0,5ml N-
napthylethylenediam ine hydrochloride được bảo quản trong tủ lạnh để
định tín h nitrite. Khi phản ứng định tín h n itrite ( - ) thì bổ sung một
lượng nhỏ bụi kẽm để định tín h nitrate.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm n itratase là (+) khi có xuất hiện màu hồng khi định tính
n itrite bằng sulphanilam ide và N -napthylethylenediamine hydrochloride
(X. ảnh 16). Trường hợp không có màu hồng xuất hiện, tiếp tục định tính
nitrate bằng bụi kẽm. Nếu phản ứng định tính n itrate cho màu hồng (do
sự hiện diện của nitrate) thì thử nghiệm nitratase là (-); ngược lại, nếu
không chuyển màu thì thử nghiệm n itratase là (+).

4.1.15. Thử nghiệm oxidase

a. N guyên tắc
Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxidase
ở vi sinh vật. T hành viên quan trọng n h ất của hệ thông này là
cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với 0 2
là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật
hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Số chủng loại cytochrome trong tế bào thay đổi
tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật. Hoạt tín h cytochrome oxidase được
p h át hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Trong điều kiện có sự hiện
diện của cytochrome c khử trong tế bào, thuôc thử này bị ôxy hóa th ành
một hợp chất indolphenoì có màu xanh dương.
Chủng dùng làm đối chứng (+) là Pseudomonas aeruginosa, ( - ) là
Acinetobacter Iwoffi.
b. P hương p h á p tiế n h à n h
Thứ nghiệm này có th ể được thực hiện bằng một trong 2 phương
pháp sau:
- Cây sinh khôi chủng thuần lên ông thạch nghiêng N utrien Agar, ú
ở nhiệt độ thích hợp trong 24 - 48 giờ. Nhúng một m ảnh giây lọc vào
dung dịch 1% tetram ethyl-p-phenyỉenediam ine dihydrochloride hoặc

92
oxalate. Dùng que cây vòng thu lấy sinh khõi, dàn đều lên vị trí có thuôc
thứ trên giây lọc. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương
trong vài phút.
- Cây sinh khôi chủng thuần lên ống thạch nghiêng N utrien Agar, ủ
ở nhiệt độ thích hợp trong 24 - 48 giờ. Nhỏ lên sinh khôi vài giọt mỗi
loại thuôc thử mới pha là 1c/c p-aminodim ethylaniline oxaỉate và 1% o
napthoỉ trong ethanol. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh
dương trong vài phút.
c. Đọc k ế t quả
ơ cả hai trường hợp nêu trên, thử nghiệm oxidase này là (+ ) khi
xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có xuất hiện của màu xanh
này thì phản ứng là âm tín h (-).
Một số điếm cần lưu ý ở thử nghiệm này là sử dụng dịch nuôi cấy đă
lâu sè cho kết quả không chính xác. Ngoài ra hoạt tín h oxidase còn bị
kìm hãm bởi đường. Do vậy, đối với các chủng có khả nàng lên men
đường sinh aciđ thì cần được cấy vào môi trường không đường trước khi
dùng sinh khối cho thử nghiệm oxidase.

4.1.16. Thử nghiệm ONPG

a. N guyên tắc
Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của
hai enzyme là [3-galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose và
permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. Một số vi
khuẩn không có gen mã hóa enzyme p-galactosidase nên không th ể lên
men lactose. H oạt tín h của enzyme này có thể được xác định dựa vào một
cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyỉ-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy
phân của cơ chất đường này bởi p-galactosidase sẽ phóng thích 0-
nitrophenol có màu vàng.
Chủng dùng làm đối chứng (+) là Serratia marcescens, (-) là Proteus
rettgeri.
b. Phương p h á p tiên hành
Môi trường dùng cho thử nghiệm này là ONPG Broth chứa 0,6% 0 -
nitrophenyl-D-galactopyranoside trong dung dịch N a2H P 0 4 lmM. Môi
trường được khử trùng bằng m àng lọc vô trùng kích thước lỗ 0,45|.im và
được phân th à n h các dung tích 2ml vào trong các ống nghiệm vô trùng.
Dùng que cây vòng cấy sinh khô"i từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống
môi trường, ủ ở 37°c qua đêm.

93
 c. Đ ọ c k ế t q u ả
Thử nghiệm ONPG là (+) khi có sự xuất hiện màu vàng trong
ống dịch nuôi cấy, là (-) khi không có sự chuyển màu của môi trường.
(X. ảnh 17).

4.1.17. Thử nghiệm MR (Methyl Red)

a. N guyên tắc
Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về
khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong
môi trường trong quá trìn h lên men glucose. Chỉ thị đỏ methyl red giúp
phân biệt nồng độ ion H + hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên
men glucose. Chi thị này có màu thay đổi khác nhau tùy dãy pH hay nồng
độ ion H +: đỏ khi pH thấp hơn 4,4, màu cam trong vùng pH 5,0 - 5,8, màu
vàng khi pH trên 6,0. Hàm lượng ion H + này phụ thuộc vào tỉ lệ C 0 2 và H2
và con đường chuyến hóa đường của từng loài vi sinh vật.
Đối với các vi sinh v ật dường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm
phản ứng MR thường được xác định trong khoảng 18 - 24 giờ. Tuy nhiên
các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường ngay từ khi chúng bắt
đầu tăng trưởng. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, các vi sinh vật có phản
ứng MR (+ ) có đặc tín h là tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều
hơn và độ pH trong môi trường ngày càng giảm; ngược lại, trường hợp các
vi sinh vật cho phản ứng MR {-) sẽ tiếp tục chuyến hóa các sản phẩm có
tín h acid đã được tạo ra th à n h các sản phẩm trung tính làm cho pH trong
môi trường chuyển dần về phía trung tính, Thử nghiệm MR phụ thuộc rất
lớn vào thời gian nuôi cấy và thường được tiến h àn h trong thời gian
khoảng 2 - 5 ngày ở 37°c.
Thử nghiệm này giúp phân biệt E. coỉi (+) với Klebsiella (-);
Enterobacter aerogenes (-) với Enterobacter cỉoacea (-); Yersinia spp. (+)
với các loài Bacillus Gram âm khác không thuộc đường ruột (-); xác định
Listeria monocytogenes (+).
Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus
rettgeri, ( - ) là Serratỉa marcescens.
b. Phương p h á p tiế n h à n h
Thử nghiệm được thực hiện trong các ống môi trường lỏng Glucose
Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que cấy vòng cây một lượng nhỏ sinh
khối từ khuẩn lạc chừng thuần trên môi trường KIA, ủ ở 37°c trong
khoảng 2 - 5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0,02%
trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 4°C) vào trong ống
nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay.

94
 c. Đ ọc k ê t q u ả
Thừ nghiệm MR là (+) khi môi trường có màu đồ sau khi bổ sung thuốc
thứ; là (-) khi có màu vàng (xem ảnh 18). Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ
ống môi trường có giông trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm.

4.1.18. Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer)

a. N guyên tắc
ơ vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ
glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là
pvruvic acid. Đế khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con
đường đường phân, ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục
được chuyến hóa theo các con đường sinh hóa khác nhau tạo ra các sản
phẩm lên men cuôi cùng khác nhau. Họ Enterobactcriaceae có đặc tính
chung là lên men sinh hỗn hợp acid như acid formic, acid acetic, acid
succinic, ethanol, H 2 và CO2- Họ này có thế được chia th àn h hai nhóm là
nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ như E. coli) và nhóm sinh 2,3-
butanediol (ví dụ như Klebsiella, Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có
thể được chuyến hóa qua lại th àn h acetoin: trong điều kiện có ôxi và môi
trường có tính kiềm, 2,3-butanediol bị ôxi hóa th àn h acetoin nhờ xúc tác
của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin có thè bị khử
thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase. Ngoài
ra, acetoin còn bị ôxi hóa th àn h diacetyl. Như vậy, khi có ôxi và pH kiềm,
2,3-butanediol bị chuyến hóa th àn h acetoin, đến lượt mình acetoin bị ôxi
hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử
nghiệm VP. Như vậy, thử nghiệm VP có th ể giúp phân biệt các loài trong
Enterobacteriaceae dựa trê n sự ôxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol,
AMC) từ 2,3-butanediol th á n h diacetyl. Sự ôxi hóa acetoin th àn h diacetyl
được tăng cường nhờ xúc tác của a- naphthol. Diacetyl k ết hợp với nhân
guanidine có trong pepton kết tụ th àn h phức diacetyl-guanidine có màu
đỏ. Trong thuôc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ
sung nguồn nhân guanidine.
Thử nghiệm VP được dùng để phân biệt Klebsiella pneumonia (+ ) và
Enterobacter (+) vởi E. coỉi (-), phân biệt một số’ loài của Klebsiella, để
xác định Listeria monocytogenes (+).
Chủng dùng làm đôi chứng (+) cho thử nghiệm này là Serratia
marcescens, (-) là Proteus rettgeri.
b. Phương p h á p tiế n hà n h
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng
Clark-Lubs (môi trường MR-VP), có pH 6,9. Dùng que cấy vòng cấy vào

95
các ông môi trường MR-VP một ít sinh khôi (trường hợp dùng thuôc thử
Koblenntz như dưới đây thì cây nhiều sinh khôi) từ khuẩn lạc của chủng
thuần đã ủ 18 - 24 giờ trê n môi trường KIA hoặc TSI. Ư .yên các ông môi
trường này ở 37°c trong 24 - 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Một
số loài như Enterobacter hafniae có kết quả thử nghiệm VP không ổn
định ở 37°c nhưng cho (+) ở 25 - 30°c. Do vậy, trong trường hợp nghi ngờ
nên tiến h àn h ủ các ông môi trường song song ở hai điều kiện n hiệt độ.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuôc thử trực tiếp vào ổng môi trường. Có 3 loại
thuốc thử VP là:
- Thuốc thử B arritt: gồm dung dịch A là 5c/c a-naphthol trong cồn
tuyệt đối. dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH.
- Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 59c a-naphthol trong cồn
95c/c, dung dịch B là 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH.
- Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH.
Khi sử dụng các loại thuốc thử có 2 th àn h phần, trước tiên nhỏ 6
giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đốì với thuôc thử 1
th àn h phần, bổ sung Im l thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ông 1
phút để ôxi hóa acetoin. Đọc k ết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ.
Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đôi chứng
như E. coli (VP -) và Enterobacter cloacea (VP +).
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề m ặt môi trường, ỉà (-)
khi bề m ặt môi trường không đổi màu.

4.1.19. Thử nghiệm CAMP

a. N guyên tắc
P hản ứng CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen) là phản ứng
phối hợp giữa n h ân tố protein (được gọi là n h ân tố CAMP) tiế t bởi các
loài Streptococcus nhóm B với n h ân tố p-hemolysin (còn gọi là p-lysin, (3-
staphylolysin hay p-toxin) tiế t ra bởi chủng Staphylococcus aureus gây ra
hiện tượng làm tan hồng cầu (hay tan huyết) của cừu hoặc bò trên môi
trường thạch máu. N hân tô" CAMP có vai trò tăng cường hoạt tính
phospholipase c (sphingomyelinase) xúc tác thủy phân th àn h phần chủ
yếu của m àng hồng cầu cừu hoặc bò là sphingomyelin của Ị3-hemolysin.
Phospholipase c thủy phân lecithin ở m àng ngoài tạo th à n h các
diglyceride, phosphatidyl choline và ceramide. Ceramide và dyglyceride
kết tụ với nhau th à n h những giọt đặc. N hân tô' CAMP tác dụng lên các
khôi k ết tụ này tạo ra khoảng trông trê n màng ngoài giúp cho

96
phospholipase c có điều kiện tiếp xúc và thủy phân sphigomyelin ở màng
trong làm hồng cầu trở nên dề vỡ. Trong thử nghiệm CAMP, người ta
tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm (chủng cần xác định có tạo nhân tố
CAMP hay không) cùng với một chủng Staphylococcus tạo nhiều P-lysin
lên môi trường thạch máu được bổ sung máu cừu hay bò. Nếu chủng kiểm
nghiệm là CAMP (+) thì sẽ xuất hiện đường tan huyết (phân biệt rõ với
vùng sẫm màu còn lại trong mồi trường) ở vùng lân cận chung của đường
cấy chủng kiếm nghiệm và chủng s. aureus.
Thử nghiệm này được dùng đế phân biệt các loài Streptococcus nhóm
B (+ ), ví dụ như Streptococcus agalactiae với các loài Streptococcus khác
(-); đế định danh Listeria monocytogenes.
Chủng dùng làm đôi chứng (+ ) là Streptococcus agaíactiae và (-) là
Streptococcus faecalis.
b. Phương p h á p tiến h à n h
Thử nghiệm được thực hiện trên các đĩa petri chứa môi trường thạch
máu (là một trong các môi trường cơ bản như Tryptic Soy Agar, Tryptose
Blood Agar Base, Pỉeart Infusion Agar, pH 7,3 đã được hấp vô trùng ở
121°c trong 15 phút, làm nguội đến 50°c, được bổ sung 5% máu bò hoặc
cừu đà tách tơ huyết). Các đĩa môi trường và buồng kỵ khí (sử dụng bình
nến hoặc bình với các gói khử ôxi) cần được ủ trong tủ ấm ở 37°c vài giờ
hoặc qua đêm để loại bỏ hơi nước dư. Dùng que cấy vòng cấy nhiều sinh
khôi từ khuẩn lạc chủng thuần của 5. aureus th ành một đường zigzac
thẳng đứng ở giữa đĩa (chia môi trường trong đĩa th àn h hai vùng). T rên 2
vùng môi trường của đĩa, thực hiện cấy ria nhiều sinh khôi chủng thuần
Streptococcus cần thử nghiệm th àn h các đường 2 - 3cm theo hướng vuông
góc nhưng không chạm với đường cấy của s. aureus. Trên mồi đĩa

Rhodococcus equi Staphylococcus aureus

Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii

Chủng thử nghiệm khác

Listeria innocua

1 - 2 mm

Hình 4.14 Phản ứng CAMP

7-PHƯ Ơ NG PHÁP PHÂN TÍCH.. 97

thực hiện đồng thời 2 đường cấy của chủng Streptococcus agaỉactiae làm
đối chứng (+ ) và chủng Streptococcus faecalis làm dôi chứng (-). Lật ngược
đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 35°c trong 6 giờ hoặc đên 18 giờ khi
cần thiết.
c. Đọc k ế t quả
Thử nghiệm là (+) khi có sự hình th àn h vùng tan huyết trong rõ
hình mũi tê n tại vùng tiếp giáp giữa đường cấy của chủng kiểm nghiệm
và S. aureus; ngược lại không có vùng tan huyết tại vùng tiếp giáp như
trê n là (-). (X. ảnh 19).

4.1.20. Thử nghiệm tính di động

a. Nguyên tắc
Vi sinh v ật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (ílagella) có
ờ nhiều vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động
là một trong những căn cứ có thề dùng để phân biệt vi sinh vật. Khả
năng này có th ế được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi
sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. Ngoài ra
triphenyltetrazolium chloride (TTC) có th ể được bổ sung vào môi trường
để giúp phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tê bào vi sinh v ật trong
môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử th ành
formazan có màu đỏ
Thử nghiệm này dược dùng để phân biệt Salmonella spp. (+) với s.
pulỉorum (-), s. gallinarium (-) và một số trực khuẩn Gram (-) khác; giữa
Vibrio (+) với Actinobaciỉỉus (-); giữa E. coli sinh hơi (+) với E. coli (-);
giữa Enterobacter (thường +) với Klebsiella (-); giữa Bacillus anthracis (-)
với Bacillus spp. khác (thường +).
Chủng dùng làm đô'i chứng (+) cho thử nghiệm này là Serratia
marcescens, (-) là Acinetobacter Iwoffi.
b. P hương p h á p tiế n h à n h
Sử dụng môi trường thạch m ềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun
tan, phân phôi th à n h dung tích 5ml vào các ông nghiệm vô trùng, hấp
khử trùng ở 120°c trong 15 phút. Các ông môi trường này được iàm nguội
ờ trạ n g th ái đứng và bảo quản ở 4 - 10°c. Trường hợp sử dụng TTC trong
môi trường để p h át h iện vị trí tế bào, dung dịch 1% TTC trong nước được
lọc vô trùng qua m àng lọc 0,45|.im, sau đó được bổ sung vào môi trường
thạch mềm đã hấp khử trù n g th àn h nồng độ 0,05g/l trước khi làm dông
môi trường.

98
 Dùng que cây thăng thu lây sinh khỏi từ khuẩn lạc của chủng thuán
sau khi 11 ở nhiệt độ thích hợp 18 - 24 giờ trên môi trường KIA hay mỏi
trường thích hợp khác. Chủng được cây bằng cách đâm sâu đầu que cấy
xuyên vào giữa môi trường trong ông nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm.
Các ống môi trường được ủ ở 37°c trong 24 - 48 giờ, nếu (-) thì được ủ
tiêp ở 21 - 25°c đên 5 ngày. Thực hiện song song việc ủ ớ điều kiện tương
tự một ông môi trường không dược cây vi sinh vật dùng làm ông đôi
chứng. Do nhiệt độ có ảnh hưởng râ t quail trọng đến khả năng di động
của vi khuẩn nên khi cần th iết nên thực hiện đống thời việc ủ ống môí
trường đã cây chung ò’ hai điều kiện nhiệt độ khác nhau như trên.
c. Đọc k ết quả
- Trường hợp'môi trường thạch mềm: thừ nghiệm ]à (+ ) khi vi sinh vật
mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh; là (-) khi vi
sinh vật chi mọc dọc theo dường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn
trong, ơ ống đôi chứng không có vi sinh vật táng trường, môi trường trong.
- Trường hợp môi trường thạch mềm có TTC: thứ nghiệm là (+ ) khi
vi sinh vật tạo một vùng đục màu đó lan tỏa vào môi trường hai bôn
đường cấy; là (-) khi vi sinh vật tạo th àn h một vùng màu đỏ doc theo
đường cấy. ơ ỏng đối chứng không cò vi sinh vật tăng trưởng, môi trường
trong. (X. ảnh 20).

4.2. Các bộ kit sin h hóa định danh vi sinh vật và các hệ th ôn g
định danh tự đ ộn g
Ngày nay, các thử nghiệm sinh hóa truyền thống đế định danh vi
sinh vật đã có thể được thực hiện ở các thuôc thử ở dạng đĩa giấy, que
giây. Ngoài ra, còn có các bộ kit cho phép thực hiện hàng loạt thử
nghiệm sinh hóa theo một quy trìn h hai lựa chọn để định danh vi sinh
vật. Các bộ kit này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là
tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như
mỗi bộ kit chỉ cho phép định danh được một số VI sinh vật, chi phí thử
nghiệm đắt tiền hơn ...
N g à y n ay, nhu cầu p h â n tíc h SCI lượng m ẫu lớn của thực t ế cô n g tác
kiểm nghiệm vi sinh vật y học và công nghiệp đã đặt ra yêu cầu có
phương pháp cho phép kiểm nghiệm nhanh để rút ngắn thời gian từ khi
nhận mẫu đến khi cho k ết quả. Do vậy, nhiều th iết bị được chế tạo nhăm
tự động hóa công việc kiểm nghiệm, đặc biệt là không yêu cầu kiểm
nghiệm viên luôn phải có m ặt để giám sát cỏng việc, có thế thực hiện qua
đêin. Một sô' bộ kit định danh vi sinh vật và hệ thỏng định danh tự động
được trinh bày trên Bảng 4.3.

99
 B ả n g 4.3 MỘT 8 0 BỘ KIT SINH HÓA VÀ HỆ THONG T ự ĐỘNG ĐỊNH DANH VI
KHUẨN GÂY BỆNH TRONG THựC PIlẨM đ ư ợ c b á n t r ê n t h ị t r ư ờ n g

H ệ th ôn g Đ ặc d iém
Nhà sản xuảt Đ ối tượng vi sinh vật
p hân tích p hân tích
API1 Sinh hóa bioMerieux Enterobactenaceae, Listeria,
Staphylococcus, Campylobacter, không
(Xem ảnh 21)
lên men, kỵ khí

Cobas IDA Sinh hóa Hoffmann Enterobacteriaceae

LaRoche
M icroID 1’ Sinh hóa REMEL Enterobacterỉaceae, Listeria

Knt.eroUibelI Sinh hóa Roche Enterobacteriacecie

Spectrum 10 Sinh hóa Austin Biological Enterobacieriaceae

lia pi D Sinh hóa Innovative Dìag. Enterobacterỉaceae

BBL Crystal Sinh hóa Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Vibrionaceae,
không lên men, kỵ khí
M initek Sinh hóa Becton Dickinson Enterobactenaceae
Microbact Sinh hóa Micro gen Enterobacteriaceae. Gram âm, không
; lên men, Listena
Vitek1, Sinh hóa11 bioMerieux Enterobacteriaccae, Gram âm, Gram
dương
Microlog Oxy hóa C' Biolog Enterobactenaccac, Gram âm, Grain
dương
MISb Acid béo:i Microbial-ID Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus,
Staphylococcus, Campylobacter
Sinh hóaa MicroScan Enterobacteriaceac, Listeria, Bacillus,
Staphylococcus, Campylobacter

Replianaiyzer Sinh hóan Oxoid Enterobacteriaceae, Listeria, Bacillus,

Staphylococcus, Campylobacter
Riboprinter Acid nucleic^ Qualicon Salmonella, Staphylococcus, Listeria,
Escherichia coli
Cobas Micro-ID Sình hóa:‘ Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Gram âm,
không lên men
M althusb Độ dẫn‘‘ M althus Salmonella, Listeria, Campylobacter,
E. coli, Pseudomonas, coliforms
Bactometer Trở kháng"1 bioMerieux Salmonella

Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.

■' Hệ thông tự động
b Hệ thống được AO AC chính thức chấp nhận.

100
 CHƯƠNG V

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU

VI SINH VẬT

1. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1.1. Đ ịnh n gh ĩa và n g u y ên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tàng trưởng và hình th ành
khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của ôxi phân tử. Tổng sô" vi
khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực
phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trê n cơ sở
xem 1 khuẩn lạc là sính khôi phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu
và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình th àn h khuẩn lạc (colony
forming unit, CFƯ) trong một đơn vị khôi lượng thực phẩm. Chỉ sô" này có
một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate
Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số’ vi
sinh vật sống (Total Viable Count, TVC), số' đếm đĩa chuẩn (Standard
Plate Count, SPC).
Quy trìn h phân tích bao gồm các bước cân mẫu, đồng n h ấ t mầu, pha
loãng th àn h dãy các nồng độ th ập phân, chuyển và phân phối đều một
thể tích xác định mẫu lên bề m ặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng
phương pháp hộp trả i (spread plate) hay hộp đổ (pour plate) (xem chương
IV). Ú ở điều kiện n h iệt độ và thời gian quy định. Phương pháp hộp đổ
được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.
Điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tùy theo yêu cầu phân
tích và quy định của từng quốc gia. Tiêu chuẩn của nhiều quốc gia quy
định ủ ở 30 °c trong 3 ngày. Một số tiêu chuẩn khác quy định ủ ở
20 - 22°c trong cùng th ờ i gian trên .
Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng
cua mầu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời h ạn bảo quản của sản
phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trìn h chế biến, bảo quản sản phẩm.

101
 1.2. M ôi trường và h óa ch ấ t
- Mòi trường sử dụng là Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2. Môi
trường được pha chế. phân phôi vào trong các bình thuy tinh hay trong
các ống nghiệm và hấp khử trùng ở 121°c trong 15 phút. Các bình hoậc
ỏng nghiệm chứa môi trường chưa sử dụng được bảo quản trong tu lạnh ó'
‘2 - 8°c. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ờ
45°c trong bể điều nhiệt. Ngoài môi trường trên, còn có thể sử dụng các
môi trường khác như Tryptose Glucose Agar, N utrient Agar.
- Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng đê
pha loãng chứa 8,5g NaCl và lg pept.on trong 100ml nước. Dung dịch này
được chứa trong các bình chứa 0,5 - 1,0 lít, hấp khử trùng và được phân
phối thành các thè tích chính xác 9ml vào trong các ống nghiệm vò trùng.

1.3. Quy trình p h ân tich

1.3.1 C h u ẩ n b ị m ẩ u trư ớ c k h i p h â n tích

Trước khi tiến h àn h phân tích, thực hiện việc đồng nhát mầu như
sau: Đối với mẫu dạng rắn, dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đâ được khử
trùng cân chính xác lOg (hay 25g) mẫu vào trong bao PE. Tất cá thao tác
tiêp theo cần phải tiên hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng
mầu này 90nil (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW. Thực hiện dồng
nhât mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mầu phụ thuộc
vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút. Trong trường hợp
không có máy dập mầu thực hiện thao tác đồng nhất mầu như sau: Xay
nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng. Cân chính xác trong điều kiện vỏ
trùng lOg (hay 25g) mẫu, bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay
225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc đều trong một thời gian
nhât định (ít n h ấ t là 2 phút). Đối với mẫu dạng lỏng, hút lOirtl (hay
25ml) cho vào bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được
hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được làm đồng nhất bằng một trong các
phương pháp như trên, dung dịch mầu thu được có độ pha loãng là 10 1so
với ban đầu,

Dịch mẫu đồng n h ất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân
bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với đầu tip vô trùng)
chuyến lm l dịch mẫu vào ông nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng.
Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng n h ất bằng máy rung (vortex) hoặc
dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần. Dung dịch mẫu này có
độ pha loãng là 10'2. Sau đó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetman có cùng
đầu tip chuyền lm l dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung
dịch p h a lo ã n g v à th a o tá c tương tự đế có dịch m ẫu với độ pha lo ã n g 10 ;í.
Tiêp tục thực hiện tương tự để có các độ pha loãng thập phân tiếp

1 02
theo cho đên độ pha loãng cần thiết. Lưu ý nếu pipet hoặc đầu tip
pipetman nguy cơ bị nhiễm trong quá trìn h thao tác (chạm tay, chạm m ặt
ngoài ỏng nghiệm, m ặt ngoài bình chứa...), cần phải thay pipet hoặc đầu
tip vô trùng khác.

1.3.2. C ấ y m ẫ u

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi
sinh vật trong lm l để cấy lên đĩa petri. Dùng pipet vô trừng hoặc pipet
m an với đầu tip vô tr ù n g ch u y ến lm l dịch m ẫu p h a lo ã n g đã c h ọ n vào
giừa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít n h ất 2 - 3
đĩa (tức là thực hiện 2 - 3 lần lặp lại). Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa
10 - 15ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45°c. Trộn đều
dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược
chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 lần ngay sau khi đổ môi trường. Đặt
các đĩa trê n m ặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa
trong tủ ấm ớ nhiệt độ 30 ± l°c trong 72 giờ. N hiệt độ và thời gian ủ có
thể thay đổi theo theo quy định của tiêu chuẩn.

1.4. C ách tín h k ế t quả

Đếm tấ t cả sô' các khuẩn ỉạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn
các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. M ật độ tổng vi khuẩn
hiếu khí trong lg hay lm l mẫu được tín h như sau:
N
A (CFƯ/g hay CFU/ml) - -------------------------
ĩi]Vfi +...+ niVfi
Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình th àn h khuẩn lạc) vi khuẩn trong
lg hay lm l mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trê n các đĩa đã chọn
n,: số lượng dĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
f;: độ pha loãng tương ứng
Ví dụ trong một trường hợp phân tích lg mẫu cụ th ể n h ận được kết
quả như sau:
Nồng độ pha loãng 10 3 lồ 4
iả:
Kết quả: Đĩa 1 235 26
Đĩa 2 246 21
235 + 246 + 26
= 2,4 X 105(CFU/g)
2 X 1 X 0,001 + 1 X 1 X 0,0001

103
 Các k ết quả tông số vi khuẩn hiếu khí thường được biếu diển dưới
dạng số' mũ của cơ số thập phân. Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật
mọc loang, mỗi vết loang được tín h là 1 khuẩn lạc. Nêu số khuẩn lạc
loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả
n hận được. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên
1 đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 1 0 r> số đếm lớn hơn 250, kết quả được
ghi: >2,5 X 10' CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm
được trê n 1 đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 1 0 1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả
được ghi: <2,5 X 10" CFU/g.
Quy trìn h định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm được
tóm tắ t trên H ình 5.1.

Hình 5.1 Quy trình xác định tổng vi khuẩn hiếu khí trong thục phẩm

104
2. COLIFORMS VÀ ESCHERICHIA COLI
2.1. Đ ịnh n gh ĩa Coliforms, Coliforms chịu n h iệt, Coliforms
p h â n và E. coli
Coliforms là nhừng trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ơ
37°c trong 24 - 48 giờ. Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định
nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ
khi được ủ ở 37°c trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh
Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng răi
trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là nhóm
vi sinh vật chỉ thị: sô lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng đế chỉ thị khả năng hiện diện của
các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số
Conforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật
gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mổì liên hệ giữa vi sinh vật gây
bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tran h cãi. Nhóm Coliforms
gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy n h ất là E. coli, Citrobacter,
Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này
được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-
Proskauer (VP) và C itrate (iC) thường được gọi tóm tắ t chung là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khá náng lên men
lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44°c trong môi trường
canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là
Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ỏ'
44,5°c trong canh Trypton. Coliforms phân là một th àn h phần của hệ vi
sin h đường ruột ồ người và các đ ộn g v ậ t m áu n ó n g k h á c và được sử dụng
đề chi thị mức độ vệ sinh trong quá trìn h chế biến, bảo quản, vận chuyển
thực phẩm, nước uống cũng như đế chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu
môi trường. E . coh là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là
++ - - (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer Citrate -).

2.2. Đ ịnh lượng C onform s, Coliform s chịu nhiệt, Conform s

p h â n và E. colỉ b ằn g phương ph áp MPN

2.2.1. Nguyên tắc

Số ỉượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coh

trong mẫu nước, thực phẩm chứa m ật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có
thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number).
Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng th à n h một dãy
thập phân (hai nồng độ k ế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có

105
độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ông nghiệm chứa môi
trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ
từ 3 đến 5 ông lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và dổi màu để định tính sự
hiện diện trong từng ông thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi
nhận số’ ông nghiệm cho phản ứng dương tính ở mồi nồng độ pha loãng
và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng
hiện diện trong lg (hoặc lm l) mẫu ban đầu.

2.2.2. Môi trường và hóa chẩt

- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)
- Môi trường lỏng B rilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)
- Môi trường lỏng E. coỉi (E. coỉi medium, canh EC)
Các môi trường lỏng trê n được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa
ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ông nghiệm
không có bọt khí bên trong ống Durham.
- Canh Tryptone
- Môi trường rắn Simmon C itrate Agar (thạch Simmon Citrate.)
- Dung dịch nước muôi pepton SPW (Saline Pepton Water)
- Thuốc thử Kovac’s
- Canh MR-VP
- Thuốc thử Methyl Red
- Thuốc thử a-napthol.

2.2.3. Quy trình phân tích

Chuẩn bị dịch đồng n h ấ t mẫu hoặc pha loãng mẫu để có dịch mẫu có
độ pha loãng ÌCT1 như mục 1.3 chương IV.
a. Đ ịnh lượng C onform s
Tuần tự cấy lm l dịch mẫu đã pha loãng 10'1 vào 3 ông nghiệm giông
nhau, mỗi ông chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã
pha loãng ic r 2 và 10~3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy
nồng dộ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 X 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi
ngờ số ìượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc
pha loãng cao hơn. ử các ống nghiệm ở 37°c trong 48 giờ. Ghi n h ận số
ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ
các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37°c ± l° c trong
48 giờ. Ghi nh ận sô ông cho k êt quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ
pha loãng.

106
 b. Đ ịnh lượng C onform s chịu nhiệt
Dừng que cây vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ông canh LSB
(+ ) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2°c trong 24 giờ. Đèm số' lượng
các ông cho kèt quả (+ ) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng.
c. Đ ịnh lượng Coliform s p h â n
D ùng que cấy v òn g ria dịch m ẫu từ các ống (+J trên m ôi trường canh
EC sang môi trường thạch đĩa EMB. ú các đĩa này ơ 37°c trong 24 giờ. Các
khuán lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánlí kim tím là khuẩn lạc của Coliíbrms
phân hay E. coỉi giả định. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn lm m và cấy
chuyền vào canh Trypton, ủ ở 44,5 ± 0,2°c trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử
Kovaờs vào các ống nghiệm. Ong nghiệm có sự xuất hiện của màu đỏ trong
môi trường trong vài phút là ống (+). Thực hiện tương tự cho tất cá các ống
(+ ) trên môi trường EC. Ghi nhận sô” lượng các ống cho kết quả (+) trên môi
trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loăng.
d. Định lượng E. coli
Trước tiên thực hiện tương tự như trường hợp định lượng Coliforms
phản như trên. Dùng que cây vòng ria dịch mẫu từ các ông (+ ) trê n môi
trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ư các đĩa này ớ 37°c
trong 24 giờ để tìm các khuẩn lạc E. coíi giả định (tròn, dẹt hình đĩa và
có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn lm m và cây vào các
môi trường MRVP, Simmon C itrate Agar để thực hiện các thử nghiệm
IMViC. Khưấn lạc E. coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự
là ++ — chính là E. coli. ổ n g nghiệm cho kết quả (+ ) trong môi trường
EC và khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB cho kết quá thử
nghiệm ĨMViC như trên là ống nghiệm có E. coli (+). Thực hiện tương tự
cho tấ t cả các ông nghiệm cho kết quả {+) trong môi trường EC và tạo
được khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận sô" lượng
các ông nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.

2.2.4. Cách đọc kết quả

ở tất cả các trường hợp nêu trên , từ sô' lượng các ông nghiệm có E.
COỈI (+) ỡ mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng Bảng MPN thích hợp (Bảng
3 X 3 tức 9 ống nghiệm) để tín h ra m ật độ vi sinh v ậ t trong mẫu và biểu
diền dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
(Xem thèm mục 3.4, chương IV)

2.3. Đ ịnh lư ợng C on form s, Coliform p h â n b ằ n g phương p h áp

đếm k h uấn lạc
2.3.1. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng n h ấ t hóa được cấy một lượng n h ấ t định lên mỏi
trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men

107
lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 ± l° c trong 24 “ 48 giờ. Ngoài lactose,
môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối m ật ức chê vi khuấn
gram dương và chất chỉ thị pH như neutral red, crystal violet. T rên môi
trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính
> 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng
định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc
như BGBL. Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay
đổi nhiệt độ ủ là 44°c. M ật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính
dựa trê n số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ
pha loãng mẫu trước khi cây vào đĩa.
Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị
giảm sức sông do quá trìn h chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận
này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước tiên
mầu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bố
sung môi trường chọn lọc.

2.3.2. Môi trường và hoá chất

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình
hay chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4 - 8°c. Trước khi sử
dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45°c trong bế điều nhiệt.
- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai
thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45°c trong bế điều nhiệt trước
khi sử dụng. Có thế sử dụng môi trường Desoxỵcholate Agar thay cho VRB.
- Môi trường canh B rilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được
phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp
ngược. Hấp khử trùng. Sau khi hấp kiểm tra các ông dể đảm bảo không
có bọt khí trong ống Durham.
- Môi trường canh EC Broth được chuẩn bị tương tự như trường hợp
môi trường BGBL.
- Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống
nghiệm, hâpi khử trùng.
- Thuôc thử Kovac’s hay Indol.

2.3.3. Quy trình phân tích

Mẫu được đồng n h ất hóa và pha loãng tương tự như phần định lương
tông sô vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa <100 tê bào Coliforms trong lm l
dung dịch pha loãng. Chuyển 1 inl dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa
petri. Bô sung vào mỗi đĩa dã cấy mẫư khoảng 5ml môi trường TSA đã được
đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45°c. Lắc tròn dĩa petri xuôi và
ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 - 5 lần đế trộn đều dịch mẫu với môi

108
trường. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn
thương. Bổ sung vào mồi đĩa 10 - lõinl môi trường thạch VRB ở nhiệt độ
45°c lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật
ngược đĩa và ủ ở 37 ± l° c trong 24 - 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở
2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10 - 100
khuẩn lạc và lặp lại ít nhât 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.

- Thử n g h iệ m k h ẳ n g đ ịn h C onform s

Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải
lactose, để trá n h các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon
trong mẫu đế lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms
cần thực hiện thêm bước khẳng định như sau : Chọn ít n h ất 5 khuẩn lạc
nghi ngờ, dùng que cây vòng cây chuyền sang các ông nghiệm chứa môi
trường BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường
EC (trường hợp khẳng định Coliforms phân), ủ các ống BGBL ở 37 ± l° c
và các ống EC ở 44ƯC trong 24 - 48 giờ. Kết quả khẳng định là (+ ) khi vi
khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ông Durham.
Tính tí lệ khẳng định là tỉ số' giữa số khuẩn lạc cho k ết quả (+) với số
khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định. Ngoài ra, trường hợp
thử nghiệm khẳng định Conforms phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+ )
trên ECcần được thực hiện thử nghiệm indol ở 44°c (xem chương IV).
Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+)
trên môi trường EC vừa là (+ ) trên thử nghiệm Indol.

2.3.4. Cách tinh kết quà

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tín h m ật độ của
Coliforms và Coliforms phân theo công thức sau:
N
A (CFU/g hay CFƯ/ml) = XR
n jv f! + ... + nịvf;

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

IV số đĩa có sô' khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: dưng tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
f,: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỉ lệ khẳng định

2.4. Đ ịnh lượng E. co li b ằ n g phương pháp đếm k h u ẩn lạ c

2.4.1. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng n h ấ t hóa được cấy một lượng n h ấ t định lên môi
trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 44°c trong 24 giờ, đếm

109
các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms. Khẳng đinh các
khuẩn lạc đã đếm là E. coỉi bằng các thử nghiệm IMViC.

2.4.2. M ôi trường và hóa chẩt

- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA.) và môi trường thạch
Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị tương tự phần định lượng
Coliforms.
- Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) được phân phôi
10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng
dể nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ông
Durham. Các ông EC này được bảo quản ở 2 - 8°c cho đến khi sử dụng.
- Môi trường canh Lactose Tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST
Broth) được chuẩn bị tương tự như môi trường canh EC.
- Môi trường canh Trvptone Broth được chuẩn bị tương tự phần định
lượng Coliforms.
- Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mồi ống
nghiệm, hấp khử trùng, để nguội và bảo quản ở 2 - 8°c cho đến khi sử dụng.
- Môi trường thạch Simmon C itrate được chuẩn bị dưới dạng các ống
thạch nghiêng có màu xanh lục.
- Thuốc thử Kovac’s.

2.4.3. Quy trình phân tích

Mẩu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần
Coiiforms phân với bước khẳng định được tiến hành như sau: Chọn 5
khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường canh
EC, ú ở 44 ± 0,5°c trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi)
và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh
Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate, ủ các môi trường trên ở
44 ± 0,5°c trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges
Proskauer. C itrate (xem chương IV). Ghi n h ận số' khuẩn lạc cho thử
nghiệm khẳng định E. coỉi (+) (IMViC là + T- — ).

2.4.4. Cách tính kết quả

Tính tỉ lệ khẳng định và tính m ật độ E. coỉi (CFU/ml hay CFƯ/mg)

theo công thức tương tự mục 2.3.5 ồ trên.
Hình 5.2 và Hình 5.3 sau đây tóm tắ t các bước của quy trìn h định
lượng các loại Coliforins và E. coỉi.

110
Hình 5 2 Quy trình định lượng Coliforms, Conforms chịu'nhiệt, Coliforms phân
và E. cơ//bằng phương pháp MPN

111
 Hình 5.3 Quy trình định lượng Conforms, Conforms phân và E. coíi
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

112
3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
3.1. Đ ịnh ngh ĩa và n g u y ên tắc
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình
câu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse,
phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitoỉ,
trehalose, sucrose. T ât cả các dòng s. aureus đều m ẫn cảm với
novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15%
NaCl. Một sô" dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu.
Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn
đường kính của khuẩn lạc. Hầu h ết các dòng đều tạo sắc tô vàng sau 1 - 2
ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Hầu h ết các dòng s. aureus có th ể tổng
hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15°c, nhiều n h ất khi
tăng trưởng ở 35 - 37°c. s. aureus phân bô khắp nơi, nhưng chủ yếu được
phân lập từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. s. aureus có
thê nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác
trong quá trìn h chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với m ật độ cao của
S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát n hiệt
độ kém của quá trìn h chế biến.
S. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản
ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên
môi trường phân lập.

3.2. Môi trường và hoá ch ấ t

- Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB) : môi trường này được
để phân tích định tính s. aureus hay trong định lượng bằng phương pháp
MPN.
“ Môi trường thạch máu: Máu được sử dụng là máu cừu hay bê non
dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung
chất chống đông citrate. Môi trường cần được pha chế ít n h ất 2 ngày
trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm.
- Môi trường thạch Baird P arker Agar (BPA): th àn h phần lòng đỏ
trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi
khử trùng và làm nguội đến khoảng 60°c.
- Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA)
- Môi trường Brain H eart Infusion (BHI)
- Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố' định bằng 0,1% EDTA
hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ.

8 'P H Ư Ơ N G PHÁP PHÀN TÍCH.

113
 3.3. P h ân tích d ịn h tín h Staphylococcus aureus
Cây 2ml dung dịch mẫu vào ông nghiệm chứa 8ml môi trường MSB,
trộn đều và ủ ở 37°c trong 24 giờ. Dùng que cấy vòng cấy ria dịch m ẫu từ
ống (+) (môi trường chuyển từ màu dỏ sang màu vàng) lên môi trường
phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Parker, ủ ở 37°c trong 24 giờ.
Tìm khuẩn lạc đặc trưng của s. aureus trên môi trường phân lập có màu
đen n hánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1 - l,5m m có vòng sáng chung
quanh khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ông môi trường BHI,
ủ ở 37°c trong 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết
tương và ủ ở 37°c trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực h iện song
song một ống đối chứng không dược cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết
luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện
của khối đông trong khi ông dối chứng không có).

3.4. Đ ịnh lư ơ n g s . aureu s b ằ n g phương ph áp đếm k h u ẩ n lạ c

3.4.1. Đổng nhất mẫu và pha loãng
Cân chính xác 10 ± 0 ,lg mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90 ml
dung dịch pha loãng, đồng n h ấ t mẩu bằng máy dập mầu khoảng 30 giây.
Chuẩn bị dãy pha loãng th ập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của
từng loại mầu sao cho khi cấy một th ể tích xác định lên đĩa thạch Baird
P arker sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc / đĩa.

3.4.2. Phân lập trên m ôi trường chọn lọc

Cấy 0,lm l mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa mỏi trường thạch
Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải
đều mẫu lên bề m ặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa
môi trường thạch Baird P ark er cho mỗi độ pha ìoãng. Thực hiện tương tự
với môi trường thạch máu. L ật ngược đĩa, ủ ở 37 ± l°c trong 24 - 48 giờ
đối với môi trường Baird P ark er và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
Sau 24 giờ, khuẩn lạc s. aureus trên môi trường thạch Baird P arker
có đường kính khoảng 0,5 - lm m , lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng
1 - 2 mm bao quanh (X. ảnh 22). Đ ánh dấu trên m ặt đáy của đĩa các khuẩn
lạc có đặc điểm như trê n và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc s.
aureus có đường kính khoảng 1 - 1 , 5 mm, màu đen bóng, lồi, có vòng
trắn g đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm quanh khuẩn lạc.
Khuẩn lạc một số dòng s. aureus có th ể không tạo các vòng sáng quanh
khuẩn lạc như trên , c ầ n đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc.
T rên môi trường th ạch máu sau 24 giờ ủ s. aureus cho khuẩn lạc
bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng n hạt, đường kính khoảng
1 - 2mm. Hầu h êt s. aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng
không tạo vùng ta n máu này.

114
 3.4.3. Khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc
không đặc trưng tìí môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở
37 ± l° c trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các
ống nghiệm chứa huyếttương đã ră đông, ủ ở 37 + l°c. Theo dõi kết quả
phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và
24 giờ. Tính tí lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc dặc trưng và không đặc
trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch
máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành
(mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (~) khi không có
hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.

3.4.4. Cách tính kết quả

M ật độ S. aureus trong mẫu được tính như sau:

10 (Nt Ht + N aHa)
M ật độ (CFƯ/g hay CFƯ/ml) = ------------ --------------
F] + F2
F: độ pha loãng
Nt: tống số khuẩn lạc đặc trưng
N*: tổng sô^ khuẩn lạc không đặc trưmg
Ht: tỉ số giữa sô" khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng
định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng
Ha: tỉ số giữa sô' khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm
khẳng định (+) so với số khuẩn ỉạc không đặc trưng

3.5. Đ ịnh lư ợ ng s. aureus b ằ n g phương pháp MPN

Phương pháp này được dùng để định lượng s. aureus trong mẫu có
mật độ S. aureus thấp nhưng m ật độ vi sinh vật cạnh tran h cao, khó có
thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha
loãng thập phân với ba độ pha loãng thập phân liên tiếp í ví dụ ic r 1;
ìc r ^ io -3). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể
sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng
với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ
pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng).
Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa
10% muối NaCl. c ấ y lm ỉ dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống
10ml môi trường, ủ ở 37°c trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh v ật
phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trê n
môi trường thạch Baird Parker, ủ ở 37°c trong 48 giờ. Chọn các khuẩn
lạc đặc trưng trê n môi trường Baird P arker để thực hiện thử nghiệm

115
khẳng định s. aureus tương tự trường hợp phương pháp đêm khuẩn lạc.
Các đĩa cho k ết quả khẳng định s. aureus (+) được đồi chiêu với các ông
nghiệm trong hệ thông các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại sô ống
nghiệm (+ ) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra m ật độ s.
aureus trong mầu (số’ MPN/g hay MPN/ml) (xem chương IV). Quy trình
định lượng S. aureus được tóm tắ t trê n Hình 5.4.

Hình 5.4 Quy trình định lượng s aureus

116
4. FAECAL STREPTOCOCCUS (STREPTOCOCCUS PHÂN)
4.1. Đ ịnh ngh ĩa và n g u y ên tắc
Streptococcus phân (faecal Streptococcus) là các liên cầu khuẩn có
nguồn gốc từ phân có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường
tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử,
một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu h ết các loài này sống hiếu khí tùy ý
nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá
trình tăng trướng và có thế ức chê sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác.
Khi được nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl
tetrazolium chloride (TTC), khuẩn lạc Streptococcus phân có màu hồng
đến màu đỏ dậm do sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Các loài này
không có catalase, không có các cytochrom c (nên thử nghiệm oxidase âm
tính), có thê phát triển được trong môi trường chứa 6,4% muôi NaCl,
pH 9,6 ở nhiệt độ 45°c. Nhóm Streptococcus phân bao gồm các loài nhóm
D thuộc Enterococcus như E. faecalisy E . faecicum, E. avium và E. durans,
các loài thuộc Streptococcus như s. fciecium, s. ÒOVÌS... c ầ n lưu ý trá n h
nhầm lẫn giừa faecal Streptococcus (liên cầu khuẩn từ phân) với
Streptococcus faecalis (thực ra không có tên này, chỉ có loài Enterococcus
Ịaecalis và Streptococcus faecium).
Streptococcus phân được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh
của thực phẩm. M ật độ nhóm này được xác định bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc hoặc bằng phương pháp MPN. Trong phương pháp đếm khuẩn
lạc, mẫu được cấy lên bề m ặt môi trường chọn lọc, sau khi ủ đếm các
khuẩn lạc đặc trưng và khẳng định các khuẩn lạc đă đếm bằng các thử
nghiệm sinh hóa. Trong trường hợp nghi ngờ có sự hiện diện của
Streptococcus phân nhưng có thể bị thương tổn trong quá trìn h chế biến
hay báo quản, tiến h àn h hồi phục các vi khuẩn này bằng cách cấy mẫu
vào trong một môi trường không chọn lọc, ủ ở 37°c trong 2 giờ, sau đó
phủ lên trên một lớp môi trường chọn lọc, các đĩa môi trường sau khi cấy
được ủ ở 44°c trong khoảng 48 giờ.
Trong phương pháp MPN, dịch mẫu được cấy vào môi trường canh
Azide Glucose. Streptococcus phân có khả năng sinh trưởng trong
môi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ
thị pH trong môi trường. Tất cả các ống cho kết quả (+) sẽ được cấy tiếp
sang môi trường khẳng định để loại trừ các phản ứng (+) giả gây ra
do các trực khuẩn và vi khuẩn gram dương khác. Môi trường khẳng
định được sử dụng là Bile Esculine Agar. Streptococcus phân thủy
phân esculine trong môi trường tạo sản phẩm cuối cùng là

117
6 ,7 -hydroxycoumarin, chât này kêt hợp với Fe3+ tạo th à n h hợp chất có
màu nâu đen khuêch tá n vào môi trường. Ngoài ra, việc khăng định còn
được thực hiện bằng thử nghiệm catalase.

4.2. Môi trường và hóa chất

- Thạch Enterococcus Agar
- Thạch Tryptose Soy Agar (TSA)
- Brain h eart infusion (BHI) chứa 6,5% NaCl được phân phôi 5ml
vào trong các ống nghiệm.
- Brain h e a rt infusion (BHI) có pH 9,6 được phân phối 5ml vào trong
các ống nghiệm.
- Canh Glucose Azide Broth (môi trường SF) được phân phối 5ml vào
trong các ông nghiệm.
- Thạch Bile Esculin Agar (BEA)
- Thuốc thử catalase (H 20 2), thuốc thử oxidase (N,N,N?,N’-
tetram ethyl-p-phenylenediam ine).

4.3. Đ ịnh lư ợng S trep to co ccu s phân b ằ n g phương pháp đếm

k h u ẩn lạc
Mẫu được đồng n h ấ t và pha loãng thập phân th àn h các nồng độ phù
hợp bằng dung dịch pha loãng sao cho sau khi trả i 0 ,lm l vào đĩa sè xuất
hiện khoảng 100 - 150 khuẩn lạc. Thực hiện cấy 0 ,lm l mẫu lên bề mặt
môi trường chọn lọc Enterococcus Agar, trải đều khắp bề mặt dĩa bằng
que trải thủy tinh. Trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật trong mẫu bị yếu
hay bị thương tổn do quá trìn h chế biến và bảo quản, cấy lm l mẫu vào
trong đĩa petri trống, đổ 5 - 6 ml môi trường TSA đun chảy và được làm
nguội đến 45°c. Lắc để mẫu phân tá n đều vào trong môi trường, ủ ở 37°c
trong 2 giờ. Đổ thêm 10 - 12ml môi trường Enterococcus Agar đun chảy
và làm nguội đến 45°c lên trê n m ặt mồi trường TSA. Lật ngược đĩa petri
và ủ ở 44°c trong 2 ngày. Đếm tấ t cả các khuẩn lạc có màu hồng đến
màu đỏ đậm, kích thước khoảng 0,5 - 3mm, có thể có vòng không màu
xung quanh khuẩn lạc. Từ số đêm khuẩn lạc Streptococcus phân đặc
trưng, dung tích mẫu sử dụng và độ pha loãng tính ra lượng Streptococcus
phân trong Ig hay lm l mẫu (CFƯ/g hoặc CFƯ/ml) (xem thêm chương IV).
Để khẳng định, chọn ít n h ất 5 khuẩn lạc đã đếm và dùng que cấy
vòng cấy chuyền vào môi trường TSA, lí qua đêm ở 37°c. Sinh khối vi
khuẩn trên môi trường TSA được cấy vào các môi trường thử nghiệm sinh

118
hóa như BHI chứa 6,5% NaCl, BHI có pH 9,6, thử nghiệm catalase,
oxidase... Enterococcus có phản ứng catalase và oxydase ( —), nhưng chúng
phát triển được trong các môi trường BHI chứa 6,5% NaCl và BHI có pH
9,6. Tính tỉ ỉệ khẳng định và tính mật độ theo CFƯ/g hay CFƯ/ml (tham
khảo trường hợp Conforms và E. COỈI ở các mục trước).

4.5. Đ ịnh lượng S trep to co ccu s phân b ằn g phương pháp MPN

Mảu nước hoặc mẫu thực phẩm dã được đồng n h ất và pha loãng 10“1
được pha loãng tiếp th àn h chuỗi 3 nồng độ pha loãng thập phân liên tiếp
(10~\ 10 2 và 10”J). Thực hiện cấy lm l mẫu ở các nồng độ pha loãng thập
phân liên tiếp vào ông chứa 5ml môi trường canh Azide Glucose. Thực
hiện dãy 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng và 3 ống lặp lại cho mỗi độ pha
loãng). Trường hợp cần cấy lượng mẫu lớn hơn lm l thì cần sử dụng môi
trường nồng độ gấp đôi so với bình thường và tỉ lệ giữa thế tích môi
trường và thể tích mẫu cấy vào phải là 1 :1 . Các ống nghiệm đã cấy mầu
được ủ ớ 37°c trong 24 - 48 giờ. Ong (+) có màu môi trường chuyển từ tím
thành vàng, có cặn lắng th àn h từng h ạt ở đáy ống. Ông ( - ) có màu môi
trường không đổi và không có cặn lắng ở đáy ống. T ất cả các ông nghiệm
(+) ở mổi nồng độ pha loãng được ghi nhận và được cấy ria trê n môi
trường thạch Bile Esculin Agar. Nuôi trong tủ ấm có nhiệt độ 44 ± 0,5°c
trong 48 giờ. T ất cả những đĩa cho các khuẩn lạc có màu nâu đen hay có
màu nâu hay đen ở vùng môi trường xung quanh được coi là (+). Khẳng
định lại các khuẩn lạc này bằng thử nghiệm catalase trên môi trường
thạch PCA. Chỉ có những khuẩn lạc cho phản ứng catalase ( - ) mới được
coi là Streptococcus phân. Ghi n h ận số ống cho kết quả (+) sau khi khẳng
định th à n h từng nhóm theo nồng độ pha loãng. Tra bảng MPN thích hợp
và biểu diễn m ật độ ở dạng MPN/g hoặc MPN/ml mẫu (xem thêm
chương IV).
Quy trìn h định lượng Streptococcus phân được tóm tắ t trên H ình 5.5

119
 Hình 5.5 Quy trình định lượng Streptococcus phân

5. SALMONELLA

5.1. Định nghĩa và nguyên tắc

Salmonella là trực trù n g gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, có khả
năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid
nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không
phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu
h ết các chủng đều sinh H 2S. Cho đến nay đã xác định được 2339 serotype

120
(kièu huyêt thanh) thuộc giông Salmonella. Các serotype này được chia
theo hệ thông của Kaffmann - White dựa trên công thức kháng nguyên o
(kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H iflagella). Ngoài
một sô serotype được đặt tên riêng như E nteritidis {S. enteritidis), Typhi
{S. typki), Paratyphi {S. paratyphi), Typhimurium (S. typhimurium)... hầu
hêt các serotype khác được ký hiệu bằng công thức kháng nguyên.
Salmonella có thế được phát hiện (phân tích định tính) bằng một
qưy trình gồm 4 bước ỉà tảng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng
định. Salmonella thường có m ặt trong mẫu với số’ lượng nhỏ, bị tổn
thương và cùng hiện diện chung với một sô' lượng lớn các loại vi khuẩn
khác thuộc họ Entcrobatcnaceae có tính cạnh tran h m ạnh và ức chế sự
tăng trướng của Salmonella.
- Bưởc tăng sinh: tùy theo đặc tính th àn h phần hóa học của mầu cần
chọn quy trìn h tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi
trường tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thế tỉ lệ này có thê
thay đổi.
- Bước tàng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường
dùng để ph át hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport
Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth, T etrathionate Mueler Kauffmann
Broth (TT)... Các nghiên cứu gần đây của AOAC cho thấy môi trường RV
có thế thay thê cho các môi trường khác để phân tích nhiều loại mẫu
khác nhau. Tuy vậy, môi trường. TT thường được dùng đế phân tích các
loại mẩu chứa th ịt tươi sống, các mẫu có m ật độ nhiễm cao, các loại thức
ãn gia súc... Hiện nay người ta khuyến khích việc sử dụng ít n h ất 2 loại
môi trường tãng sinh chọn lọc để tăng cường khả năng phát hiện được
tấ t cá các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.
- Bước phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể
vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử
dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc
giống này dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an
toàn thực phẩm khuyến khích việc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân
lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tấ t cả các dòng
Salmonella, đặc biệt môi trường XLD được khuyến khích sử dụng.
- Bưôc khẳng định: nhằm xác n h ận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho
Salmonella xuất hiện trê n môi trường phân lập- Bước này dựa trê n việc
sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng
cho Salmonella. Các thử nghiệm được khuyến khích sử dụng là thử
nghiệm KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC (ornithine
decarboxylase), urea, lên men m annitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết

121
thanh o và H đa giá. Thông thường các phòng phân tích vi sinh thực
phẩm không có khả năng xác định đến loài phụ hay serotype mà chỉ xác
nhận đến Salm onella spp. Việc phân tích chính xác serotype nhiễm vào
thực phẩm thường được thực hiện tạ i các trung tâm vệ sinh phòng dịch
hay các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.

5.2. Môi trường và hóa chất

- Nước peptone đệm (Buffered Peptone W ater, BPW)
- Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV)
- Canh M alachite Green Magnesium Chloride (canh RV cảí tiến)
- T etrethionate Muller-Kauffmann (TT)
- Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
- Thạch Hektoen E ntric Agar (HE )
- Thạch Bism uth Sulphite Agar (BS)
- Thạch B rilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)
- Thạch Triple Sugar Iron (TSI)
- Canh U rea
- Canh Lysine Decarboxylase
- Canh O rnithine Decarboxylase
- Canh M annitol (Phenol Red Broth Base)
- Canh Sucrose (Phenoỉ Red Broth Base)
- Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base)
- Canh Tryptone
- Thuốc thử Kovac’s
- Kháng huyết th a n h Salmonella đa giá.

5.3. Quy trình phân tích định tính S a lm o n ella trong thực phẩm
5.3.1. Tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE
vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher
trong 15 hoặc 30 giây, ú ở 37 ± l°c trong 18 - 24 giờ. Đối với một số loại
thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của
Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt như sau:
- Đôi với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào trong một bao
nhựa lớn, thêm vào 1 lít môi trường tăng sinh BPW.Lắc bằng máy lắc
khoảng 30 giây để môi trường thấm dược vào trong toàn bộ mẫu.

122
 - E)ói với sừa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung
225mJ ra ôi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho
đên khi sừa tan hoàn toàn.
- Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng
nhât mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường)
trước khi nuôi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nồng độ các hợp
chât. ức chê sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.
- Đôi với các loại mẫu như casein, pho mát, bơ và các sản phẩm
tương tự khác: thực hiện đồng n h ất mẫu trong môi trường tăng sinh đả
được làm ấm đến 40°c.
- Đối với sản phấm chứa cocoa: đồng nhất mẫu trong môi trường
Skim Milk Broth được làm ấm ở 40°c.
- Đổì với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hàm lượng chất
béo cao: đồng n h ấ t mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 - 3 giọt Triton X-100
trước khi ủ tăng sinh.

5.3.2. Tăng sin h c h ọ n lọ c

Lắc đế trộn đều dịch tăng sinh, và chuyến 0 , 1 ml sang 10 ml môi

trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến
độ 42°c. ủ ở 42 ± 0,2°c trong 18 -24 giờ. Khi cần th iết có th ể kéo dài
thời gian ủ thêm 24 giờ.
Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine
Broth, T etrathionate Muller- Kauffman cũng được dùng. Mỗi loại môi
trường chí có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của
Salm onella, một số' dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường
này nhưng lại không tăn g trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ
Salmonella typhi không tăng trướng được trong môi trường Rappaport
Vassiliadis và T etrathionate Muller-Kaufmann, Salmonella dublin không
tăng trưởng được trong môi trường Rappaport Vassiliadis. Do vậy, để tăng
khả năng phát hiện tấ t cả các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu thực
phẩm cần phải dùng ít n h ất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác
nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một
nhiệt độ nuôi cây khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42°c, môi
trường TT và s c dược ủ ở 31°c trong 22 - 24 giờ.

5.3.3, Phân lập và nhận diện

Dùng que cây vòng thực hiện kỹ th u ật cấy phân lập khuẩn lạc đơn
với giống từ dịch tăn g sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân
biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS... Cường độ chọn lọc và

123
mức độ phân biệt thề h iện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên
từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tấ t cả
các dòng Salm onella phải dùng tối thiểu 2 môi trường chọn lọc phân biệt
khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trê n từng
môi trường khác nhau như sau:
- Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không
có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rấ t lớn có
thể chiếm gần h ết khuẩn lạc. (X. ảnh 23 và 24).
- Mối trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh
dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một sô dòng
Salmonella có tâm đen bóng rấ t lớn có th ể chiếm gần h ết khuẩn lạc.
(X. ảnh 25).
- Môi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu
đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trường chung quanh
khuẩn lạc chuyển th à n h màu nâu và sau đó chuyển th àn h đen nếu kéo
dài thời gian ủ. (X. ảnh 26).
- Môi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hồng nhạt, trong
suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ.
- Môi trường s s : (X. ảnh 27).
Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37°c trong 22 - 26
giờ. Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên
để thực hiện bước khắng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử
nghiêm kháng nguyên.

5.3.4. Khẳng định

Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít n h ấ t 5
khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc ví dụ như TSA. ử ở
37°c trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trê n môi trường này dược
sứ dụng cho các thứ nghiệm sinh hóa và huyết thanh.
Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella ỉà lên
men glucose, lactose, saccharose, H 2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, sử dụng
mannitoỉ, sorbitol (xem chương IV). Các chủng Salmonella cho các k ết quả
thử nghiệm sinh hóa như sau:
- Thử nghiệm sinh H 2S (TSI hay KIA): Salmonella chỉ lên men được
đường glucose trong các môi trường trê n vì th ế phần nghiêng của môi
trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa sô" các dòng Salmonella đều
có khá năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường
này. Có thể th ấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ th ạch môi

124
trường hoặc mỏi trường bị đẩy lên trôn tạo ra một khoảng không bên
dưới đáy ông nghiệm.
Thử nghiệm LDC (+-): sau khi nuôi cấy môi trường chuyển thành
kiềm, màu mỏi trường được chuyển th àn h màu như ban đầu (màu tím hay
xanh).
- Thứ nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không
làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên
màu vàng cam.
- Lên men mannitol, sorbitoỉ (+): môi trường sau nuôi cấy bị acid hóa
và chuyên thành màu vàng.
- Thử nghiệm Indol và VP
Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thực hiện song song với mẫu
chứng không bằng dung dịch nước muôi sinh lý để loại trừ khả năng
ngưng kết giả. Hai loại kháng huyết thanh da giá cần dùng là Salmonella
Polyvalent o và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử
nghiệm tạo ngưng kết vứi kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng
ngưng kết với nước muôi sinh lý.

5.3.5. B á o c á o k ế t q u ả

Quy trìn h kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính
Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong
25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện
trong mầu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần
phai tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết th anh đơn
giá khác nhau hay cần gởi chủng Salmonella phân lập được đến các
phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm.
Do vậy cần tuân thủ triệ t để các biện pháp an toàn khi làm việc với các
chủng Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các
chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải
hấp khử trùng cẩn th ậ n trưức khi rửa.
Quy trìn h phát hiện Salmonella trong thực phẩm dược tóm tắ t trên
Hình 5.6.

5.4. Quy trình phân tích định tính S a lm o n ella trong nước
Salmonella có thể hiện diện trong tấ t cả các loại nước (nước sinh
hoạt, nước uống, nước dùng cho nông nghiệp, nước sông hồ. nước thải,
nước biển) với m ật độ thấp. Do vậy để p h át hiện Salmonella trong nước

125
cần phải qua bước lọc thu gộp tế bào qua màng lọc, làm giàu trong môi
trường tăng sinh, đế phục hồi các tê bào bị tổn thương. Quy trìn h phát
hiện cũng gồm 4 bước tương tự như trường hạp thực phẩm với một số lưu
ý ở bước tă n g sinh như sau: Nếu thế tích mẫu nhỏ hơn lOral, cho mầu vào
trong 50ml môi trường BPW có nồng độ dơn. Nếu mẫu có thể tích lớn hơn
10ml, cho. mẫu vào môi trường BPW có nồng độ kép theo tỉ lệ 1:1. Trường
hợp dùng m àng lọc để thu gộp tế bào, sau khi lọc mẫu, cho màng lọc vào
50ml môi trường BPW. Tiến h àn h ủ ở 36 ± 0,2°c trong 16 - 20 giờ, sau đó
tiếp tục bước tăn g sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định như trên.

Hình 5.6 Q uy trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm

126
6. SHIGELLA
6.1. Định nghĩa và nguyên tắc
Shigella. là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, cho thử
nghiệm catalase (+ ) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men
glucose không sinh hơi, hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ
lactose, dulcitol, không sinh H 2S, không có enzyme lysine decarboxylase.
Giông Shigella gồm 4 loài: ( 1 ) s. dysenteriae không lên men được
mannitol thuộc nhóm kháng huyết thanh A, gồm có 10 kiểu huyết thanh
(serotype); (2) s. flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B, gồm 6 kiểu
huyết th an h và có th ể được chia th à n h nhiều subserotype khác nhau
theo sự hiện diện của các k hấng nguyên khác nhau trong nhóm này;
(3) s. boydii lên men mannitol sinh acid, thuộc nhóm kháng huyết thanh
c, gồm 15 kiểu huyết thanh và (4) s. sonnei có khả năng lên men
mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh D chỉ có 1 kiểu huyết thanh.
Shigella là tác nhân gây nên bệnh shigellosis, là một bệnh nguy hiểm lây
lan rấ t nhanh trong cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm
và nước uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu là từ nguyên
liệu, từ nước hay từ công nhân chế biến. Các loại thực phẩm thường
xuyên phân lập được Shigella là các món xà lách, th ịt băm, thủy sản ...
Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rấ t thấp, có thể ờ mức
10 tê bào/g sản phẩm. Do vậy Shigella được kiểm soát rấ t nghiêm ngặt
trong thực phẩm , đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rấ t nhạy, các
quy trình kiểm soát phải chặt chẽ.
Shigella có thế được p h át hiện bằng cách cấy một lượng mầu xác
định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi
trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được
cấy phân lập trên ít n h ấ t 2 loại môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc
khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa
và kháng huyết thanh.

6.2. Môi trường và hoá chất

- Canh Tryptose Soya
- Môi trường Tergitol - 7 Agar (T7A)
- Canh Gram Negative (GN)
- Thạch MacConkey (MAC)
- Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
- Lysine Decarboxylase Broth (LD)

127
 -- Thạch Hektoen Enteric (HE)
- Thạch Deoxycholate C ítrat Agar
- M annitol Phenol Red Broth (MPR)
- Dulcitol Phenol Red Broth (DPR)
- Thuốc thử oxidase
- Thuôc thử catalase
- Thạch Triple Sugar Iron (TSI)
- Môi trường thử nghiệm tính di động
- Kháng huyết thanh: bốn loại kháng huyết thanh đa giá polyvalent
A, B, c, D

6.3. Quy trình phân tích

6.3.1. Tăng sinh

Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone Soya.
Sau khi đồng n h ất mẫu, đo pH và chỉnh về pH 7 ± 0,2. Buộc chặt miệng
túi và ủ ở 37°c trong 16 - 20 giờ. Có thế pha loãng mẫu trong bình tam
giác, sau khi chỉnh pH ủ các bình này trong điều kiện kỵ khí ỏ' nhiệt độ
và thời gian như trên.

6.3.2. Tăng sinh chọn lọc

Chuyển 0,1 ml dịch tăn g sinh sang 10ml canh tăng sinh GN, ủ ở 37°c
trong 16 - 20 giờ.

6.3 .3 . P h â n Ịập

Dùng que cây vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa
chọn lọc. Vi khuẩn Shigella rấ t nhạy cảm với điều kiện môi trường nuôi
cấy, đề có thế p h át hiện được Shigella với hiệu suất cao nhât, nên sử
dụng ít nh ất hai loại môi trường phân lập khác nhau. Một số môi trường
phân ỉập có tín h chọn lọc khác nhau cho Shigella là T7A, XLD, HE và
MAC. Sau khi cấy, ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37°c trong 24 - 48 giờ.
Biểu hiện cúa Shigella trê n các môi trường phân lập như sau:
- Môi trường T7A: môi trường ban đầu đục như sừa có màu xanh hơi
vàng nhẹ. Trên môi trường này khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt.
- Trên môi trường MAC: khuẩn lạc Shigella có màu nâu đỏ, trong suốt.
- Trên mồi trường XLD : khuẩn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt.

128
 - Trên môi trường Deoxycholate Citrate Agar, khuẩn lạc Shigella có
màu đỏ n h ạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục).
- Trên môi trường thạch HE : khuẩn lạc Shigeỉỉa có màu xanh nhạt,
trong suốt.

6.3.4. Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh

Từ các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập, chọn ít n h ấ t 5
khuẩn lạc cấy lên môi trường không chọn lọc (như TSA), ủ ở 37°c trọng
thời gian 20 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được
sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
- Thử nghiệm sàng lọc: trước tiên các dòng được nghi ngờ là Shigella
được cấy vào môi trường TSI, ủ ở 37°c trong 24 giờ. Shigeỉỉa cho phản
ứng kiềm trên m ặt nghiêng và acid ở phần sâu, không sinh hơi và không
tạo H2S trong môi trường. Các dòng có phản ứng như trên được thử
nghiệm để khẳng định Shigella.
- Thử nghiệm khẳng định: các thử nghiệm sinh hóa cần tiến h àn h để
khẳng định Shigella và các đặc trưng sinh hóa của nhóm này được tóm
tắ t như dưới đây. Chi tiết quy trìn h thực hiện các thử nghiệm sinh hóa
này được trìn h bày ở chương IV.

T hử n g h iệm sinh h ó a K êt quả T hử nghiệm sình hóa K êt quả

Simmon citrate - Salicine

Arginine decarboxylase Xylose
Lisine decarboxylase Cellobiose
Urease - Adonitoỉ
Malonate Dulcitol
MR + Inositol
VP

Các vi sinh vật có các phản ứng sinh hóa đặc trưng như trê n được
khẳng định là Shigella spp- Để xác định loài Shigella nhiềm vào trong
mẫu. cần thực hiện các phản ứng sinh hóa đặc trưng của từng loài
như sau:

9-P H U Ơ N G PHÁP PHÂN TÍCH. 129

 Đ ặ c tr ư n g sin h h ỏ a . .
s. d y s e n te r ỉa e s fle x n e ri s. b o y d ii s so n n e ỉ
_ \) _1
Sinh khí từ glucose - -
p-galactose + /-lỉ - +/- +
O rnithin decarboxylase - - _ 1) +
_1)
Indol + /-2) +/-2) -
4) 4) _
Acid từ dulcitol -
1) _1)
+'
Lactose -
M annitol - + + +
Raffinose - +/- - +:
Saccharose - - - +;
Xylose - - + /- -

l' Các dòng s. dysenteriae ỉ ưà s. sonnei ỉuỗn ỉuôn cho phản ứng dương tinh;
S.clysenteriac 1 và s. flcxnen 6 luôn luôn cho phản ứng âm tính, s. dysenteriae 2 thì dương
tinh; J>Phản ứng dương tinh chi biểu hiện 24 giờ sau nuôi cấy; 4>s. dysenteriae và s. flexneri 6
có thế cho phán ứng dương tính .

6.3.5 . Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh

Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá
A, B, c, D từ các dòng được nuôi cấy trên môi trường thạch không chọn
lọc. Tiến hành các đối chứng (-) trên nước muối sinh lý.
Một số Shigella tạo th à n h kháng nguyên bề m ặt (kháng nguyên K)
có th ể làm che m ất k h án g nguyên o và làm cho phản ứng ngưng kết
không diễn ra. Vì th ế khi không có biểu hiện ngưng kết, cần thực hiện
việc đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng nguyên
bề m ặt. Sau đó tiên h àn h lại thử nghiệm ngưng kết.

6.4. Báo cáo k ết quả

Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không phát hiện
Shigella trong 25g mẫu.
Cần lưu ý Shigella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, có
th ể gây các triệu chứng bệnh ở m ật dộ xâm nhiễm rấ t thấp. Do vậy cần
tuân thủ triệ t để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng
Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng
phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp
khử trùng cẩn th ậ n trước khi rửa.
Quy trìn h p h át h iện và định danh Shigella trong thực phẩm được
tóm tắ t trên H ình 5.7.

130
 Hình 5.7 Quy trình phát hiện và định danh Shigella trong thực phẩm

7. V IB R IO
7.1. Định nghĩa và nguyên tắc
Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo
th àn h hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và
oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H 2S, nhạy

131
cam với Vibriostaticum 0/129. Trừ V. cholerae hiện diện ở vùng nước
ngọt, tấ t cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường
xuyên được phân lập dược từ các vùng nước ven biển. Giông này có 4 loài
là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. choỉerae, V. parahaemolyticus,
V. vulnificus và V. alginolyticus được phán biệt dựa trên các đặc điểm
sau đây:
V. chulerae có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi
trường canh trypton ở 42°c, arginine dehydrolase (-), lysine
decarboxylase (+ ), lên men được sucrose (saccharose), khử n itrate th àn h
nitrite, có thể tăn g trương được trong môi trường chứa 0 - 3C'C NaCl,
không phát triển được trong các môi trường chứa 6 , 8 , 10 % muối.
V. parahaemoỉyticus có phản ứng oxidase (+ ), phát triển được trong
canh trypton ở 24°c, phản ứng ADH (-), LDC (+ ), có khả năng khử
n itrate th àn h n itrite nhưng không lên men sucrose, sử dựng được một sô”
nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, khỏng tăng
trướng được trong môi trường không có muôi, tăng trưởng tốt. trong
môi trường có đến 8 % muôi nhưng bị ức chế trong môi trường chứa
10 % muôi.

V. vulnificus khác với hai loài nêu trên là không lên men sucrose,
không tăng trưởng được trong môi trường không có muôi, bị ức chế trong
môi trường có 8 - 10 % muôi.
V. alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng
trưởng được khi trong môi trường không có muối nhưng có thể p h át triển
trong môi trường chứa đến 10 % muối
Có th ể ph át hiện các loài Vibrio dựa trê n nguyên tắc sau đây: Một
lượng mẫu xác định được tăn g sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng.
Cây phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn
lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được
khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết th an h học. Môi
trường tăng sinh chọn lọc cho Vibrio choỉerae, V. aỉginolyticus và V.
vulnificus là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Colistine
Polymicine Broth thường được dùng để tăn g sinh V. parahaemolyticus.
Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate
C itrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật lên men được sucrose trong
môi trường này sè cho khuẩn ỉạc màu vàng và làm acid hóa môi trường
bên dưới khuẩn lạc. Nêu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ
cho khuẩn lạc màu xanh.

132
 7.2. Môi trường và hoá chất
- Canh Pepton kiềm Alkaline Peptone W ater (APW)
- Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine)
- Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar)
~ Canh Tryptone
- Thạch Kligler Iron (KI)
- Canh Hugh Leifson Glucose (HLG)
- Canh Carbohydrate tím
- Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller)
- Dung dịch oxidase
- Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%)
- Kháng huyết th an h polyvalent o dùng cho V. choỉerae
- Kháng huyết th anh o
- Dung dịch NaOH IN
- Dung dịch HC1 IN
- Dung dịch dầu phủ vô trùng
- Dung dịch Bromocresol tím

7.3. Quy trình p h ân tích

7.3.1. Tổn g s in h c h ọ n lọ c

Cân 25g mẫu vào trong bao PE vô trùng, thêm 225 ml canh thang
tăng sinh chọn lọc (dùng nước pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho
trường hợp V. cholerae, V. vulnificus, V. alginolyticus; canh Colistine cho
trường hợp V. parahaemoỉyticus). Đồng n h ất mẫu bằng máy dập mẫu. u ở
37°c trong 6 - 8 giờ.

7.3.2. Phản Ịập

Dùng que cấy vòng ria váng trên bề m ặt môi trường tăng sinh chọn
lọc lên bề m ặt đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37°c trong
18 - 22 giờ. H ình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trê n môi
trường này là như sau: Khuẩn lạc V. cholerae và V. aỉginolyticus lớn,
đường kính khoảng 2 - 3 mm, láng, có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và
chung quanh khuẩn lạc có quầng trắn g dục (X. ảnh 28). Khuẩn lạc V.
parahaemoỉyticus và V. vulnificus lớn, đường kính khoảng 3 - 4mm, có
màu từ xanh đến xanh dương. Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập sang môi trường không
chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ồ nh iệt độ 37°c để thu sinh khối sử
dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.

133
 7.3.3. Thử nghiệm sinh hóa

Các thứ nghiệm sinh hóa quan trọng để p h át hiện hay phân biệt các
lo à i, Vibrio là: quan sát tín h di động trên kính hiển vi, quan sát sự dì
động trê n thạch mềm và các thử nghiệm khác. Các đặc điếm sinh hóa
của V. choỉerae là: ONPG (+), lactose (-), ADH (“ ), LDC (+), TDA (-),
Indol (+), m anose (+), sucrose (+), oxidase (+), tính ưa m ặn NaCl 0% (+),
3r/c (+), 6 % (-), 8 % (-), 10 % (-). Các đặc điểm sinh hóa của V.
parahaemoỉỵticus là: ONPG (-), lactose (-), ADH (-), LDC (+), TDA (-),
Indol <+), manose (+), sucrose (-), oxidase (+), tính ưa m ặn NaCl 0% (-),
3% (+), 6% ( +), 8% (+/-), 10% (-).

7.3.4. Thử nghiệm kháng huyết thanh

Thử nghiệm ngưng k ết huyết th an h được dùng để xác định các dòng
Vibrio có các biểu hiện kháng nguyên chuyên biệt. Trường hợp V.
choỉercie có th ể phân biệt được các dòng V. choleras Oi và V. cholerae non-
Oi (khác Oị) như sau:
- Thử nghiệm với kháng huyết th an h đa giá polyvalent 0 nhóm 1:
nhỏ một giọt kháng huyết th an h o đa giá ỉên phiến kính sạch và một
giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của phiến kính. Dùng que cấy
vô trùng chuyến vi khuẩn lên 2 giọt dung dịch trên, phân tán đều vi
khuẩn vào trong giọt dung dịch. Kết luận (+) khi có hiện tượng ngưng kết.
- Xác định kiểu kháng nguyên 0 5: dùng kháng huyết th an h đơn giá
ĩnaba và Ogawa. K háng huyết th anh Inaba (+) khi kháng nguyên chỉ
ngưng k êt với kháng huyết th an h Inaba và không ngưng k ết với các
nhóm khác hay dung dịch muối sinh lý. Kháng huyết th an h Ogawa (+)
khi kháng nguyên chỉ ngưng kết với kháng huyết th an h Ogawa và không
ngưng kêt với các nhóm khác hay dung dịch muôi sinh lý. Kháng huyết
thanh Hikojima (+) khi kháng nguyên ngưng k ết với kháng huyết th an h
Ogawa và Inaba nhưng không ngưng kết với dưng dịch muôi sinh lý.
P hản ứng kháng nguyên là (-) khi chúng không ngưng k ết với các nhóm
kháng huyêt th an h nêu trê n và không ngưng k ết với dung dịch muối sinh
lý. Trường hợp này có th ể gặp do sai lầm trong thao tác thử nghiệm hoặc
là do chủng Vibrio này trê n thuộc nhóm non-Oj. P hản ứng ngưng kết
là không đặc hiệu khi tấ t cả thử nghiệm kháng huyết th an h đều cho
kết quả (+).

Trường hợp V’ parahaemolyticus thực hiện ngưng k ết với hai loại

huyết thanh là huyết thanh o và huyết thanh K. Tuy nhiên trong một
số trường hợp kháng nguyên o bị kháng nguyên K che lấp, vì th ế cần

134
phải xử lý chủng trước khi thực hiện ngưng kết với kháng nguyên o bằng
cách dùng que cây chuyến sinh khôi của chủng trên môi trường thạch
chọn lọc vào dưng dịch nước muối 3%, hấp ở 121°c trong 1 giờ để biểu lộ
kháng nguyên 0 ra bên ngoài. Các kiểu kháng nguyên của V.
parahaemoỉyticus được tóm tắ t như sau:

N hỏm o K iểu kh á n g nguyên K N hóm o Kiểu kh á n g nguyên K

1 1, 25, 26, 23, 28, 41, 56, 58H, 64 6 18, 46

2 3, 28 7 19
3 4a, 5, 6 , 7, 29, 30a, 31, 33, 37, 8 20, 21, 22, 39, 62
43, 45, 48, 54, 57, 58a, 59 9 23, 44

4 4a, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 10 19, 24, 52

49, 53, 55, 63 11 36, 40, 50, 51

5 15, 17, 30a, 47, 60, 61

u: có cùng kiểu kháng nguyên K ở các nhóm o khác nhau

7.4. Báo cáo k ết quả

Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không phát hiện V.
choỉerae hay V. parahaemoỉyticus trong 25g mẫu.
Cần lưu ý Vibrio là nhóm chứa các dòng gây bệnh nên cần tuân thủ
triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Vibrio dùng
làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trê n các chủng phân lập được.
Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn
th ận trước khi rửa.
Quy trìn h p h át hiện và định danh V. choỉerae và V.
parahaemolyticus được tóm tắ t trê n H ình 5.8.

135
 Hình 5.8 Quy trình phát hiện và định danh V. choieraevà. V. parahaemolyticus

136
8. LISTERIA MONOCYTOGENES
8.1. Định nghĩa và nguyên tắc
L. monocytogenes là vi khuẩn có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương
sau khi nuôi cấy 20 giờ. cho thử nghiệm catalase (+ ), oxidase (-), chuyến
động xoay tròn th ành đợt trong tiêu bản giọt treo (khi nuôi cấy ở
20 -25°C), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trê n môi
trường thạch, máu, sinh acid từ rhamnose nhưng không xylose, có phản
ứng CAMP (+ ) với Staphylococcus aureus và (-) với Rhodococcus equì.
L. monocytogenes là một tác nhân gây bệnh listeriosis rấ t nguy hiểm
(nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai
nhi) có tỉ lệ tử vong rấ t cao {30 - 35c/c ở người ìớn và 70% ở trẻ em). Loài
này thường được phát hiện trong thức ăn gia súc, nước, nước thải, là loài
đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt. Các quy
định về an toàn vệ sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện
của L. monocytogenes trong 25g thực phẩm đã qua gia nhiệt nhưng cho
phép 100 CFU/g đôì với thực phẩm phải gia nhiệt trước khi sử dụng.
Quy trình phát hiện L. monocytogenes được thực hiện bằng quá trình
tăng sinh 2 giai đoạn. Mẩu được cân vào trong túi PE vô trùng, đồng n h ất
với môi trường tăng sinh sơ cấp. Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được
chuyển vào môi trường tăn g sinh thứ cấp và được ủ tiếp 24 giờ. Hiện nay
quy trình cải tiến cho phép tăng sinh một giai đoạn nhưng thời gian tăng
sinh là 48 giờ. Quy trìn h tăng sinh một giai đoạn được sử dụng khi các
mẫu có m ật độ vi sinh vật nhiễm thâp; quy trìn h tăng sinh hai giai đoạn
được sử dụng cho các mẫu có m ật độ vi sinh vật nhiềm cao. Sau bước tăng
sinh, canh khuẩn được chuyển sang bước phân lập trên môi trường chọn
lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng các đặc tính
hình thái, sinh lý và sinh hóa và miễn dịch bằng các thử nghiệm
đặc trưng. Trong p h át hiện L. monocytogenes cần sử dụng các chủng
vi sinh vật làm đối chứng như: L. monocytogenes, L. innocua,
S. aureus dung huyết [3 yếu, R. equi.

8.2. Môi trường và hoá chất

- Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichm ent Broth I (LBI)
- Canh tầng sinh thứ cấp Listeria Enrichm ent Broth II (LBII) được
chuẩn bị th àn h các ông nghiệm 10 ml
- Môi trường Enrichm ent Broth (EB) cải biên từ môi trường LB,
được sử dụng trong quy trìn h tăng sinh một giai đoạn
- Môi trường thạch Oxford Agar
- Thạch máu

137
 - Môi trường thạch mềm BHI: BHI chứa 5g agar/1, phân phối 5ml
vào trong các ống nghiệm
- Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR)
- Thuốc thử catalase, oxidase

8.3. Quy trình phân tích

8.3.1. Tăng sinh

Đồng n h ất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LBI bằng
Stom acher trong 30 giây, ủ 30°c trong 24 giờ. Chuyển 0,1 ml LBI sang
ông 10 ml LBII tiếp tục ủ ở 30°c trong 24 giờ. Quy trìn h tăng sinh một
giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB
(đà được làm ấm ở 45°c nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và ở 30°c
đối với các sản phẩm khác) và tiến hành đồng nhâ't mẫu trong 30 giây. Ư
ở 30°c trong 48 giờ.

8.3.2. Phân ìập

Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ông tăng sinh, trả i sang
1/2 đĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng
ria sang 1/2 đĩa còn ỉại. u ở 37°c trong 24 - 48 giờ. Trên môi trường này
khuấn lạc Listeria có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen,
k h u ẩn lạ c lõm , n h ỏ, đường k ín h k h o ả n g lram (X. ảnh 29).

8.3.3. Khẳng định

- Thử khả năng ta n huyết: chọn khuẩn lạc điển hình trên môi
trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường
thạch máu, ủ ở 37°c trong 24 - 48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn
lạc L. monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện
tượng dung huyết dạng [3. Trước khi tiến hành thử khẳng định, cấy
chuyền khuẩn lạc nghi ngờ L. monocytogenes sang một môi trường lỏng
không chọn lọc, ư ở 25°c trong 20 giờ.
- Thử nghiệm catalase và oxidase (xem chương IV): L. monocytogenes
có catalase (.+) và oxidase (-).
- Nhuộm gram: Listeria nhuộm gram dương.
- Khả năng đi động phương pháp giọt treo: Listeria spp. chuyến động
xoay tròn trong canh trùng ủ ở 25°c. Thử tính di động trong ống nghiệm:
cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong ống nghiệm, ủ
25°c trong 40 giờ hoặc lâu hơn, kiểm tra sự tăng trưởng của vi khuẩn
xung quanh đường cấy, Listeria spp. di động tạo hình chiếc dù cách bề
m ặt thạch vài mm.

138
 Khả năng biên dưỡng đường: ủ các ông canh trùng thử khả năng
len men đưong ớ 37°c trong 7 ngày. Kêt quả (+) (màu vàng) thường quan
sát được trong vòng 24 - 48 giờ. L. monocytogenes iên men đường
rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose.
- Thử thử nghiệm CAMP: trên đĩa thạch dùng để thử CAMP, cấy
s. aureus th àn h một đường cấy mỏng, tương tự cấy R. equi để tạo th àn h
hai đường cấy song song cách nhau 4 cm {Hình 5.9).

Hình 5 .9 Sơ đồ phân bố đường cấy các chủng trong thử nghiệm CAMP

Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai
đường cấy song song của s. aureus và R. equi. Có thế cây một hoặc nhiều
dòng vi khuẩn nghi ngờ L. monocytogenes (chủng thử nghiệm) để kiểm
tra trên cùng một đĩa. cấy chủng đối chứng (+) L monocytogenes và chủng
L. innocua như hướng dẫn trên H ình 5.9. u đĩa ở 37°c trong 20 - 36 giờ.
Phản ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới
của chủng thử nghiệm với 5. aureus hoặc giữa chủng thử nghiệm với
R. equi. Phản ứng CAMP (+) với R. equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng
(5 - 10 mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng (+) với s. aureus
thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2 mm) có dạng hình tròn.
L. monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với s. aureus và (-) với R. equi.
Ngược lại L. innocua có phản ứng CAMP (~) với cả hai loài s. aureus và
R. equi.

8.4. Báo cáo kết quả

Báo cáo p h át hiện hoặc không p h át hiện L. monocytogenes trong 25g
mẫu. Quy trìn h phát hiện L. monocytogenes được tóm tắ t trê n H ình 5.lồ.

139
 Hình 5.10 Q uy trình phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm

140
 Cần lưu ý L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh đặc biệt nguv
hiểm. Người đang mang thai, người suy yêu hệ miễn dịch... không được
trực tíêp làm việc với vi khuẩn này. c ầ n th ận trọng và tuân thủ nghiêm
ngặt các quy định an toàn khi thao tác trên vi sinh vật gáy bệnh khi tiến
hành phân tích thử nghiệm Listeria. Nêu có điều kiện nên phân riêng
khu vực dành cho phân tích Listeria. Các môi trường hay dụng cụ sau khi
nuôi cấy phải được hấp khử trùng trước khi rửa hay thải bỏ.

9. BACILLUS CEREƯS
9.1. Định nghĩa và nguyên tắc
B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di
động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả
năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5
- 50°c, tối Ưu ở 35 - 40°C; pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tứ
nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất
to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực
phẩm {sừa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô ...). Vi khuẩn có thể
tiết ra hai loại độc tố chính là điarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin
gây nôn mửa. Loài này phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1
như B. anthracis gây bệnh than ở người, B. thuringiensis tạo độc tố kết tinh
gây bệnh cho côn trùng, B. mycoidcs, B. megaterium dựa vào các đặc tính
sinh hóa được trình bày trong Báng 5.ỉ.

B ả n g 5.1 CÁC ĐẬC TÍNH CỬA BACILLUS NHÓM I

Loài
Đăc tính B. cere B. thurin B. B. B.
‘ -gicnsỉs mycoides anthracis rnegaterium
-us
Gram +<a> + + + +
Cataìase + + + + +
+/ > Jcì - + /-
Di động + /-
Khử nitrate + +/ + + Jd>
+ Jd) + /-
Phần huy tyrosine + + /-
Kháng lysozyme + + + + -
Phán ứng với lòng dỏ trứng + + + + -
Lên men glucose + + + + -
Phán ứng VP + + + + -
Sinh acid từ mannitol - - - - +
+ + _id) -
Tan máu (máu cừu)

+: 90-100% các chủng dương tính; b +/-: 50-50% các chung dương tính; c 90-100%
các chúng là âm tính; a Hầu hết các chủng là ảm tính.

141
 B. cereus được p h át hiện và định lượng bằng môi trường thạch chọn
lọc M annitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc Cereus Selective Agar
(MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitoỉ Bromothymol Blue Agar
(PEMBA). K huẩn lạc B. ccreus có hình thái đặc trưng trên các môi trường
này. Các khuẩn lạc này có thể được tiếp tục khẳng định dựa trê n các thử
nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose sinh acid trong
điều kiện kỵ khí, khử n itrate th àn h nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân
L-tyrosine, tă n g trưởng được trong 0 ,001 % lysozyme. Ngoài ra B. cereus
cũng được định ỉượng bằng phương pháp MPN.

9.2. Môi trường và hoá chất

- Nước pepton đệm Buffered Peptone W ater (BPW)
- Thạch M annitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP)
- Thạch Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA)
- Môi trường thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL)
- Nhũ lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50%
- Canh Trypticase Soy Polymycin (TSP)
- Canh Phenol Red Glucose
- Thạch Tyrosine
- Canh Lysozyme
- Mồi trường thử nghiệm Voges-Proskauer
- Canh N itrate Broth
- Thạch dinh dưỡng N utrient Agar cho B . cereus
- Thạch máu Trypticase Soy Sheep
- Môi trường kiểm tra sự di động
- Thuôc thử n itrate (dung dịch A, dung dịch B)
- Hóa chất nhuộm Gram

9.3. Quy trình phân tích

Cho 25g mẫu vào túi PE, bố sung 225mỉ môi trường pepton đệm
(BPW) đồng nhâ't để có độ pha loãng 10“l, đồng n h ất bằng Stomacher
trong 1 phút. Mẫu tiếp tục dược pha loãng th à n h dãy thập phân để có các
độ pha loãng thích hợp.

9.3.1. Định lượng B. cereus bằng phương pháp đếm khuẩn Ịạc

a. P h á t h iện bằng m ôi trườ ng chọn lọc

Trải 0,lm l mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ 24 giờ à
30°c. Do B. cereus khôn£ lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng

142
polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có màu hồng
eosin, được bao quanh bới vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo
thành. Trường hợp sử dụng môi trường MOSSE, khuẩn lạc B. cereus to,
màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cây sang
thạch nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B. cereus.
b. Các th ử nghiệm kh ẳ n g định
- Nhuộm Gram: cấy ria các khuẩn lạc chọn từ môi trường MYP hay
MOSSEL sang ống- thạch dinh dưỡng, ú ở 30°c trong 24 giờ. Sau đó tiến
hành nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiến vi. Việc nhuộm Gram có thế
được thực hiện bằng phương pháp Jensen hay phương pháp Hucker. Trước
tiên, tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính. Chọn một phiến kính sạch,
dùng bút ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính khoảng 2 cm ở mặt dưới
cùa phiến kính. Đặt ở vị trí tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của
phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt lớn. Dùng que cấy vòng chuyển
một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên phiến kính, khuấy nhẹ bằng
dầu que cấy để được huyền phù đồng nhất và bôi đều trong khu vực của vòng
tròn. Trường hợp chủng nằm trong dịch nuôi cấy thì dùng que cấy vòng
chuyến vài vòng dịch tế bào lên vùng vòng tròn ở trung tâm bề mặt phiến
kính, bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Để yên cho vệt bôi khô. Dùng tay
giừ hai cạnh của một đầu phiến kính, đưa phiến kính (ở vị trí cạnh vệt bôi)
qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen để cố định vệt bôi
trên kính. Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa. Thực hiện tương
tự dể tạo một vệt bồi chung hai chủng vi sinh vật đối chứng trong cùng một
phiến kính khác. Sử dụng E. coỉi làm chủng đối chứng cho Gram (-) và
Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+).
Theo phương pháp Jensen, nhỏ vài giọt dung dịch methyl violet lên
vệt bôi, giữ yên trong 20 giây. Dùng binh xịt nước, bơm nước lên vệt bôi
để rửa sạch phẩm nhuộm. Nhỏ vài giọt dung dich KI/1‘2 lên vệt bôi, để
yên 1 phút. Dùng bình xịt chứa cồn 95%, bơm cồn lên vệt bôi, rửa phẩm
nhuộm đến vừa m ất màu. Để yên vài giây sau đó rửa lại bằng nước.
Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước
dư bằng giấy lọc. Theo phương pháp của Hucker, bằng thao tác tương tự
như ớ phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi 1 phút bằng dung dịch crystal
violet. Rửa bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch KI/I 2 trong 1 phút. Khử
màu bằng cách xịt cồn 95% cho đến khi sạch màu. Rửa lại bằng nước và
nhuộm báng dung dịch safranin trong 2 phút.
Sau khi thực hiện xong quy trìn h nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế
bào bằng vật kính 100 X nhúng trong dầu (xem chương IV). Tế bào nhuộm
Gram (+) có màu xanh tía (S. aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ
hỏng {E. coỉi). B . cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với
nhau thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử.

143
 Dùng que cây vòng cây chuyển một lượng sinh khôi chủng thử
nghiệm trong ống thạch d in h dưỡng vào 0,5ml BPW vô trùng. Huyền phù
hóa dịch này đế sử dụng cho các phản ứng sinh hóa.
- Thử nghiệm lên m en glucose: cấy vi khuẩn vào 3 ml canh Phenol
Red Glucose Broth, ủ ở 3 5 °c, 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống
nghiệm th ậ t m ạnh và quan s á t sự phát triển thông qua độ đục và sự
chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose
trong điều kiện kỵ khí.
- Thử nghiệm khả n ă n g khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5 ml môi
trường canh N itrate Broth, ủ ỏ’ 35°c trong 24 giò*. Kiểm tra sự hiện diện
của n itrite bằng cách bố sưng vài giọt dung dịch A và dung dịch B của
thuốc thử n itrate. Nếu có m àu cam xuất hiện trong vòng 10 phút thì
chứng tỏ n itrate bị khử th à n h nitrite.
- Thử nghiệm VP: (xem chương IV)
- Thử nghiệm khả n ăn g thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch
nghiêng Tyrosine, ủ ở 35f,c trong 48 giờ. Sự xuất hiện của sinh khôi,
khuẩn lạc là chỉ thị tyrosine bị phân hủy.
- Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2,5ml môi
trường N utrient Broth chứa 0 ,0 0 1 % lysozyme. Thực hiện tương tự với môi
trường N utrient Broth k h ông chứa lysozyme. ứ ông nghiệm ở 35()c trong
24 giờ. Kiếm tr a sự tăn g trư ở n g trong môi trường chứa lysozyme và môi
trường đối chứng. Ư những ông âm tính thêm 24 giờ trước khi kết luận
kết quả thử nghiệm.
Dựa vào Bảng 5.1. để k h ẳ n g định dòng đã chọn là B. cereus hay không.
c. Các th ử n g h iệm p h â n b iệ t các loài trong B acillus nhóm 1
Để phân biệt các loài khác nhau trong Bacillus nhóm 1 cần tiến
hàn h bố sung các thử nghiệm sau:
- Thử nghiệm tín h di động: dùng que cấy vòng cấy dịch 24 giờ nuôi
cấy th ẳn g vào giữa môi trư ờng kiểm tra di động cho B. cereus. ủ ở 30°c,
từ 18 - 24 giờ và kiểm tr a dưới ánh đèn kiểu mọc dọc theo đường cấy.
Loài di động mọc khuếch tá n vào môi trường theo hướng xa đường cấy.
Loài không di động chỉ mọc tro n g và dọc theo đường cấy. Bổ sung 0 ,2 ml
nước cất vô trùng vào bề m ặ t môi trường thạch nghiêng N utrient Agar.
Cấy huyền phù vi khuẩn vào. ú thạch nghiêng từ 6 - 8 giờ ở 30°c. Nhỏ
nước vô trùng lên phiến k ín h và đặt sinh khối vi khuẩn vào. Quan sát
ngay dưới kính hiển vi để k iểm tra sự di dộng. Hầu h ết các chủng B.
cereus và B. thuringiensis là di động, B. anthracis và hầu h ết các chủng
B. mycoides không di động.

144
 - Sự hình th àn h rễ giả: chạm nhẹ que cây vòng mang huyền phù 24
giờ nuôi cấy lên giữa đĩa N utrient Agar, ú ở 30°c trong 48 - 72 giờ. Kiểm
tra sự phát triển của rề giả, đặc trưng bởi việc tạo nhừng khuẩn lạc có
cáu trúc giông như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy. B.
ccreus không tạo câu trúc rễ giả, thường tạo những nhóm khưẩn lạc xù xì
khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B. mycoides.
- Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu
Trypticase Soy. Ư ở 35IJC trong 24 giờ. B. cereus làm tan máu m ạnh và
tạo vùng tan máu hoàn toàn (p) 2 - 4mm xung quanh vùng phát triển. B.
thurm giensis và B. mycoides cũng tan máu p. B. anthracỉs thường không
làm tan máu sau 24 giờ.
- Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: cấy huyền phù tế bào 2.4 giờ
lên ống thạch nghiêng N utrient Agar, ủ 24 giờ ở 30°c, sau đó đế ở nhiệt
độ phòng 2 - 3 ngày. Thực hiện nhuộm bằng phẩm màu fuchsin. Quan sát
dưới kính hiển vi những tinh th ể độc tố hình tứ giác (dạng kim cương)
được nhuộm màu tôi nhỏ hơn bào tử. Tinh thể độc tố của B. thuringiensis
xuất hiện nhiều sau 3 - 4 ngày nuôi cấy nhưng không th ể phát hiện được
bằng kỳ thuật nhuộm cho đến khi bào tử nang vỡ ra. Do đó, nếu không
quan sát được bào tử tự do, cần để thêm vài này ở n hiệt độ phòng rồi
tiến hành kiếm tra lại. B. cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không
có tinh thê độc.
d. Cách tín h kết quả
Tính số' tế bào B. cereus trê n 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc
(tham khảo cách chọn đĩa sử dụng để đếm ở chương IV) ở mỗi độ pha
loãng và hiệu chỉnh bằng tỷ lệ khẳng định (% khuẩn lạc được xác n h ận là
B. cereus). Ví dụ, số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng l ( r 4 là 65, và có
4 trong số 5 khuẩn lạc được chọn xác n h ận là B. cereus sau khi kiểm tra
bằng các phản ứng sinh hóa. Như vậy, số tế bào B. cereus trong 1g thực
p hẩm là 65 X 4/5 X 10.000 X 10 = 5.200.000 (phải n h â n với 10 vì chỉ có
0 , 1ml mầu được sử dụng để trải đĩa).

9.3.2. Định iượng B. cereus bằng phương pháp MPN

Phương pháp MPN được sử dụng để định lượng B. cereus trong

những mầu thực phẩm không được có B. cereus nhiều hơn 10 tế bào/g.
Phương pháp này cũng dược sử dụng để kiểm tra những mẫu thực phẩm
có tinh bột khô mà phương pháp đếm khuẩn lạc không thích hợp. Cấy
Iml mẫu có độ pha loãng i c r \ 1 (T2, và 10-3 vào ống nghiệm chứa 10 ml
canh Trypticase Soy-Polymycin. Thực hiện 3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi
độ pha loãng (hệ 9 ông nghiệm), ủ ở 30°c trong 48 ± 2 giờ. Kết quả là (+)
khi có sự tăng trưởng của B. cereus. Cây ria từ các ông (+) iên môi trường
thạch MYP. ủ đĩa ở 30°c trong 24 - 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc màu

10-PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 145

hồng eosin, lecithinase (+), cây chuyến sang thạch nghiêng N utrient Agar
để tiến hành các phản ứng sinh hóa khẳng định B. cereus. Dựa vào Bảng
MPN tín h trị số MPN/g mẫu dựa vào số ông (+) B. cereus được khẳng
định: TSP (+), MYP (+), các thử nghiệm sinh hóa khác theo bảng 5.1.
(tham khảo thêm chương IV).
Quy trìn h p h át h iện và định lượng B. cereus trong thực phẩm được
tóm tắ t trê n H ình 5.11.

Cân 25g mâu, đổng nhất trong 225ml BPW, đổng

nhất bằng stom acher, độ pha lo ã n g io 1

' 7 ~ ~ ~
Pha loãng đến các độ pha loãng 10 2, 1 0 '3

T
Sử dụng các độ pha loãng 10“1,10 2, 10 3 cho loạt MPN 3 ống nghiệm.
ủ trong canh TSP, ủ ở 30°c, 48 ± 2 giờ.

Dương tính: xuất hiện sinh khối = > ĩ r a bảng MPN

•ị
Cấy ria từ những ống dương tính lên mỏi trường MYP,
ủ ở 3 0°c, 2 4 - 4 8 giờ

T
Chọn những khuẩn tạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính

_________________________ i ________________________
Cấy sang thạch nghiêng Nutrient Agar, ủ ở 30°c trong 24 giờ

I I ị . 1 r ị . r 1 ị
Phenol Gram Nitrat VP. Tyros­ Lysoz- MYP Phân
red Broth, 48 ± ine yme agar, biệt
glucose 3 5 °c 2h, agar, broth 24-48 h với c á c
24 h 24 h 35°c 48 h 35°c 3 0 °c Bacillus
35°c, 35°c 24 h nhóm 1
kỵ khí

Kết luận B. cereus

Hình 5.11 Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng B. cereus trong thực phẩm.

146
10. CLOSTRIDIUM
10.1. Đ ịnh nghĩa và n g u y ên tắc
Giông Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình quo, kỵ khí,
sinh bào tử, phần lớn di động, có thề thủy giải saccharide và protein
trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài thủy giải sacchride
có thế lên men các loại đường polysacchride tạo th ành acetic acid, butyric
và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn
toàn các acid amin tao th ành mùi rấ t khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết
giông Clostridium, thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số loài
thuộc nhóm Ưa nhiệt và một sô loài khác thuộc nhóm ưa lạnh.
Các loài Clostridium hiện diện trong đát, một sô loài trong ahóm
này gây bệnh cho người và động vật, một sô' joài khác gây hư hỏng thực
phẩm, khử sulphite th àn h sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu.
Các loài gây ngộ dộc thực phẩm quan trọng là c. botulinuni và c.
pcrfnngcns. Ngoài ra, loài c. teta.nL lả tác nhân gây bệnh uốn ván, một số
loài khác như c. novyi. c. perfringens. c. septìcum, c. sordelhi... gây hoại
tử cho các mô bị nhiễm, gáv biến chứng tại các vêt thương nhưng cho đến
nay chưa xác định được các đặc điểm bệnh lý. Đặc điểm quan trọng của
một sô* loài thuộc gióng Clostridium thường gặp ỉà như sau:
- c. botuíinum là loài sông kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được
trong- môi trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật
khác. Các dòng khác nhau trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác
nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A - F. Kiểu kháng
nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giải protein tạo nên một vòng phân
giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, trong khi đó
kiều kháng nguyên c , D, E không có các dặc tính này. Kiểu kháng
nguyên A thường được tìm thấy trong các mẫu th ịt trong khi đó kiểu E
chỉ được phân lập từ các mẫu cá.
- c. terani là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với
không khí. Loài này có đặc điểm tạo khôi kết tụ khi được nuôi cây trong
môi trường lỏng. Loài này được tìm thấy trong đât, trong phân các loài
động vật và người, là loài gây bệnh uốn ván rấ t nguy hiểm.
- c. perfringens là loài kỵ khí không b ắt buộc, rấ t ít khi tạo bào tử
trong các môi trường nuôi cấy n h ân tạo, nhưng có thể quan sát được bào
tử khi nuôi cây trong môi trường Ellner, môi trường có bổ sung muối m ật
và bicarbonate hay quinoline. Loài này có sáu kiểu kháng nguyên được ký
hiệu từ A - F. Kiểu kháng nguyên A thường gáy hoại tử cho các vết
thương và gây ngộ độc thực phẩm.

147
 M ật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi
trường có chứa ferri amonium citrate và disodium sulphite, li ở 37°c trong
1 - 2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50°c.
Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng
giửa ion sulphide (Si_) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường.

10.2. Môi trường và hoá chât

- Pepton đệm Buffered Peptone W ater (BPW)
- Iron Sulphite Agar (ISA)
- Perfringens Selective Agar (hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP)

10.3. Quy trìn h p h â n tích

Mẫu được giải đông ở nh iệt độ không quá 45°c và được phân tích
ngay sau khi giải đông. C ân lOg (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ
sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy
dập mầu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy m ật độ hiện diện
của Clostridium, trong mẫu. Trước khi cây, mẫu được xử lý nhiệt
ở 70- 80°c trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh
vật khác.
Cấy vào đĩa vồ trù n g lm l dịch mẫu đả được pha loãng thích hợp vào
một đĩa petri vô trùng. Đổ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ
ấm ở 45°c vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đồng, đổ thêm lên
trê n bề m ặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là
cho vào một ông nghiệm vô trùng lm l dịch mẫu ở nồng độ thích hợp,
thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã dược ủ ấm ở 45°c vào ổng, trộn đều
mẫu. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề m ặt 2 - 3ml ISA
hoặc SFP Agar. Đĩa hoặc ông nghiệm dã cấy mẫu được ủ ở 37°c trong 24
- 48 giờ trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực
hiện ủ song song ở 37°c và 50°c. Thông thường, việc dọc kết quả trê n đĩa
là dễ hơn trong ỏng nghiệm .
ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S
khác không phải là Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc
màu đen trê n môi trường này. Để khẳng định khuẩn lạc là Clostridium
cần thực hiện thêm những quy trìn h tiêu chuẩn để giúp khẳng định
kết quả.

10.4. Báo cáo k ế t quả

Đếm tấ t cả các khuẩn lạc đen, hoặc có th ể bao quanh bởi vòng đen.
M ật độ Clostridium trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhân

148
với hệ sô pha loãng mẫu và được trìn h bày ở dạng CFU/g hay CFU/ml
sản phẩm (xem thêm chương IV). Quy trình định lượng Clostridium được
tóm tắ t trên H ình 5.12.

Hình 5.12 Tóm tắt quy trình định lượng Clostridium

11. PSEUDOM ONAS AERUGINOSA

11.1. Đ ịnh n gh ĩa và n g u y ên tắc
P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn,
bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn
cực. Là vi khuẩn hiếu khí b ắt buộc, nhưng p. aeruginosa có th ể p h át triển
trong môi trường kỵ khí nếu có N 0 3“ làm chất n h ận điện tử, n h iệ t độ
phát triển tôi ưu ở 37°c. Loài này tăng trưởng được trên môi trường
nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn carbon thích hợp duy
n h ất như acetate, pyruvate, succinate, glucose, 2-ketogluconate, L-valine,

149
p- alanine, DL-arginine. Một số đặc điểm sinh hóa chính của
p. aeruginosa là như sau: không lên inen glucose, có khả năng thủy giải
gelatin, tinh bột, khử n itra te (+ ), oxidase (+), ADC (+), khử n itrate (+), sử
dụng citrate ( + .), sử dụng m alonate {+ ).
Khuẩn lạc của p. aeruginosa có ba dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở
những chủng hoang dại p h ân lập từ đất, nước; (2 ) khuẩn lạc to, trơn, rìa
phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhầy. Dạng (2) và (3) là đặc
điểm của các chủng được phân lập từ bệnh phẩm, là các chúng có vai trò
quan trọng trong sự hình th à n h khuẩn lạc trong vật chủ các
Pseudomonas và sự sản sinh độc tô.
Một đặc điểm khác của p. aeruginosa là sự sản xuất sắc tổ’ hòa tan
gồm 2 loại ỉà pyoverdine và pyocyanine. Pyoverdine là sắc tô" phát huỳnh
quang màu xanh vàng khi được kích thích bởi bước sóng thấp hơn 260nm.
Sắc tô này được tạo ra trong môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch
tán và có chức nàn g trong cơ chế trao đổi sắt của vi khuẩn. Pyocyanine là
sắc tô có màu xanh ở pH trung tính hay kiềm, màu đỏ trong môi trường
acid. Sắc tô" này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh là đặc tíuh gây
bệnh bởi P. aeruginosa.
P. aeruginosa hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề m ặt động thực
vật, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu
từ khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ. p.
aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim,
viêm đường hô hâp. viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiê t niệu,
viêm m àng năo mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa
sừng ớ m ắt, gây nhiễm trù n g da, mô mềm...
Loài này còn là vi khuẩn kháng thuôc phố’ biến đối với nhiều loại
kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và
các yếu tố di truyền này có th ể được lan truyền trong quần th ể thông qua
hiện tượng tải nạp và giao nạp, tạo ra những dạng đột biến kháng thuô^c
mới. Chỉ có một sô" ít các kháng sinh có hiệu nghiệm đôi với
Pseudomonas là fluoroquinolone, gentamicin và imipenem.
p. aeruginosa là một trong những chỉ tiêu được kiểm soát bởi nhiều
công ty mỹ phẩm trê n th ế giới. Loài này được p h át hiện dựa trên việc tạo
khuẩn lạc đặc trưng trê n các môi trường chọn lọc dùng cho họ
Enterobacteriaceae như EMB agar, Endo agar, Deoxycholate agar,
MacConkey agar, H ektoen Enteric agar và and XLD agar. Khuẩn lạc
Pseudomonas được khẳng định bằng thử nghiệm TSI, oxidase, các thử
nghiệm sinh hóa khác cũng như thử nghiệm tạo sắc tố dể k ết luận chủng
là P. aeruginosa.

150
 11.2. M ôi trường và hoá ch ấ t
- Môi trường canh Modified Letheen Broth (MLB)
- Môi trường chọn lọc Enterobacteriaceae (EMB Agar, Endo Agar,
Deoxycholate Agar, MacConkey Agar, Hektoen Enteric Agar và XLD Agar)
- Thạch nghiêng YE
- Môi trương canh Koser’s Citrate Broth
- Môi trường thạch Simmons C itrate Agar (SCA)
- Môi trường thạch Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA)
- Môi trường canh Malonate Broth
- Mồi trường thạch N itrate Motility Agar
- Môi trường canh N itrate Broth
- Môi trường canh Arginine Decarboxylase Broth
- Môi trường thạch N utrient Gelatin
- Môi trường thạch Pseudomonas Agar F
- Môi trường thạch Pseudomonas Agar p
- Môi trường thạch Cetrimide Agar
- Môi trường thạch TSA
- Thuốc thử thử nghiệm oxidase
- Hóa chất nhuộm Gram
- Thuốc thử nhuộm tiên mao

11.3. Quy trình phân tích

Đối với mẫu mỹ phẩm , tùy đặc tính vật lý của mẫu, mẫu được xử lý
và chuẩn bị một cách khác nhau như được trình bày trong chương III.
Thông thường, lm l mỷ phẩm dạng lỏng được bổ sung vào 9ml môi trường
canh MLB, 1 g mỹ phẩm dạng kem hoặc bột được bổ sung vào ống nghiệm
chứa lm l Tween 80, sau đó bổ sung 8 ml canh MLB để thu được mẫu pha
loãng 1 CT1.

11.3.1. Quy trình của FDA (Food and Drug Administration)

Dùng que cấy vòng tiến h àn h ria mẫu lên một trong các môi trường
chọn lọc như EMB agar, Endo agar, Deoxycholate agar, MacConkey agar,
Hektoen Enteric agar và XLD agar để phân lập họ Enterobacteriaceae và
giống Pseudomonas, ủ 37°c, 24 giờ. Các môi trường này là môi trường
chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, nhưng các giông khác nhau cho khuẩn
lạc có hình th á i đặc trưng khác nhau trê n môi trường này. Ví dụ, trên
môi trường XLD, E. coli có khuẩn lạc dẹt, màu vàng, một vài chủng còn

151
không mọc được. Salm onella cho khuẩn lạc màu đỏ có tâm đen. Shigella
và Pseudomonas cho khuẩn lạc màu đỏ không có tâm đen. Các khuẩn lạc
có hình thái đặc trưng cho Pseudomonas được dùng đế nhuộm Gram,
trước tiên được thử nghiệm TSI, oxidase, sau đó thử nghiệm các đặc trưng
sinh hóa khác (tham khảo thêm thao tác chi tiết ở chương IV) như sau:
- Nhuộm Gram: thực hiện tương tự như với Bacillus cereus.
- Thử nghiệm TSI: khuẩn lạc đặc triíiig cho Pseudomonas được cấy
chuyền sang ống thạch nghiêng TSI, ủ 24 giờ ở 35°c. p. aeruginosa cho
phản ứng kiềm hóa ở cả 2 phần thạch nghiêng và phần sâu (màu môi
trường đỏ), không sinh hơi (một vài chủng sinh H 2S nhẹ).
- Thử nghiệm oxidase: cắt một miếng giấy lọc th à n h những dải nhỏ
dài 10 X 40mm. Nhúng vào hóa chất dùng cho thử nghiệm oxidase, thâm
bớt dịch hóa chất thừa bằng giấy thấm . T ránh để giấy lọc tẩm thuôc thử
trực tiếp ngoài sáng lâu vì án h sáng phân hủy hóa chất. Để khô ở 35°c
và giữ trong chai tôi màu ở n h iệt độ phòng. Sử dụng que cấy vòng bằng
bạch kim chuyến sinh khôi lên một phần giấy lọc (dây bằng nichrome có
thê cho phản ứng (+ ) giả). Đọc k ết quả sau 10 giây, không được để vượt
quá thời gian này. P hản ứng oxidase là (+) khi có sự xuất hiện màu đỏ
tía đậm, là (-.) khi giấy lọc không màu hoặc xuất hiện màu đỏ tía sau 10
giây. Pseudomonas spp. có phản ứng oxidase (+ ).
Sau khi kiểm chứng dược chủng là Gram (-), không sinh H 2S trên
môi trường TSI và oxidase (+), các khuẩn lạc thuần này tiếp tục thử
nghiệm các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định chưng nghi ngờ là p.
aeruginosa như sau: k h ả năng ở 42°c, thử nghiệm biến dường citrate,
malonate, n itrate, thử nghiệm ADH, gelatinase.
- Khả năng tăn g trưởng ở 42°c trên môi trường YE: cây từ một
khuẩn lạc thử nghiệm ỉên 2 ông thạch nghiêng YE, 1 ống ủ ở 35°c trong
24 giờ, ống còn lại ủ ở 42°c trong 24 giờ. Ông môi trường dùng để ủ ở
42°c cần được ủ đ ạt đến n h iệ t độ này trước khi cấy chủng thử nghiệm vì
một sô' loài Pseudomonas có th ể mọc chậm ở 42ÍJC trên môi trường chưa
ủ, nhưng không th ể mọc được trê n môi trường đã được làm ấm trước đó.
Trên môi trường này, p. aeruginosa tán g trưởng được ở 42°c và tạo ra
mùi cá do tạo trim ethyl amine.
- Thử nghiệm biến dưỡng citrate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm trên
môi trường canh Koser’s Citrate Broth ở 35HC trong 24 - 48 giờ. p.
aeruginosa sử dụng được citrate để tăng trưởng và làm đục môi trường. Có
thể thực hiện thử nghiệm này bằng cách sử dụng các môi trường thạch như
SCA hay môi trường CCSA như được trình bày trong chương IV.

152
 - Thừ nghiệm biên dưỡng malonate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm
trên môi trường canh M anolate Broth ở 35"C trong 24 giờ. p. aeruginosa
sử dụng được m anolate làm nguồn carbon duy n h ât đế tăng trương và làm
môi trường chuyến từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
- Thử nghiệm sử dụng n itrate (thử nghiệm nitratase): cấv ria khuẩn
lạc thử nghiệm trên bẻ m ặt và đâm sâu xuống thạch N itrate Motility
Agar trong ông thạch sâu. ú ở 35nc trong 24 giờ. Nhỏ vài giọt sulfanilic
acid và naphthylam ine. Nếu xuất hiện màu hồng đậm hay màu đỏ chứng
tỏ có sự biên đối n itrate th àn h nitrite. Ngoài ra, nếu môi trường không
đổi màu nhưng có sự tạo th àn h bọt khí hoặc làm rạn nứt môi trường cCaig
được xem là phản ứng (+) do sự khử nitrate th ành n itrite để giải phóng
nitơ. P.aeruginosa cho k ết quả (+ ). Có th ể thực hiện thử nghiệm này trên
môi trường N itrate Broth như được hướng dẫn ở chương IV. Chú ý luôn
luôn thực hiện song song một ông đối chứng ở cùng điều kiện, không được
cấy giống. P. aeruginosa có thử nghiệm nitratase (+).
- Thử nghiệm ADH: cấy khuấn lạc thử nghiệm vào môi trường ống
nghiệm canh Arginine Decarboxylase Broth. Vặn chặt nắp ống nghiệm để
trán h thông khí. ú ơ 35°c trong 24 giờ. p. aeruginosa có ADH (+), tăng
trưởng được trê n môi trường này và không đổi màu đỏ tía của môi trường.
Ngược lại, phản ứng ADH (-) khi môi trường bị chuyển th àn h màu vàng.
- Thử nghiệm gelatinase: cấy khuẩn lạc thử nghiệm vào ông thạch
sâu chứa môi trường N utrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng ít n h ất là
72 giờ. Làm lạnh ông nghiệm và quan sát sự hóa lỏng của gelatin.
P. aeruginosa làm hóa lỏng gelatin. Chú ý luôn luôn thực hiện song song
1 ống đối chứng ở cùng điều kiện, không cấy giống.

- Thử nghiệm tạo sắc tố pyoverdine và pyocianine: cấy ria khuẩn lạc
thử nghiệm lên hai đĩa petri môi trường thạch Pseudomonas Agar F và
Pseudomonas Agar p. ú ở 25°c ít nhất là 3 ngày. Soi đìa môi trường
Pseudomonas Agar F dưới tia ƯV (260nm). p. aeruginosa tiết sắc tố'
pyoverdine phát huỳnh quang khuếch tán trong agar dọc theo đường cấy. Bẻ
vờ một m ảnh môi trường Pseudomonas Agar p bằng que thủy tinh, cho vào
ống nghiệm chứa nước cất, lắc mạnh bằng vortex để hòa đều sắc tố. Lọc
nước qua một ống khác, thêm vào ống 5 - 10ml chloroform và lắc.
P. aeruginosa tiết sắc tố màu lam pyocyanine phân tán vào lớp chloroform.
Hút lớp chloroform vào một ống nghiệm khác và bổ sung 3 ml nước cất. Nhỏ
một giọt NH 2SO4. Pyođanine trở nên đỏ và di chuyển vào pha nước.
- Thực hiện nhuộm tiên mao: sử dụng canh khuẩn chưa già, khoảng
18 - 24 giờ sau nuôi cấy. Dùng que cấy vòng chuyển vài vòng canh khuẩn
vào một ống nghiệm nhỏ chứa lm l nước cất, để yên ống nghiệm 10 phút.

153
Thao tác nhẹ nh àn g vì tiên mao dễ bị gãy. Chuẩn bị một phiến kính sạch
bằng cách xịt nước cất, sau đó xịt cồn và hơ lửa vài giây cho khô cồn. Tạo
vệt bôi bằng cách chuyển vô trùng một giọt canh khuẩn đã hòa loãng như
trên lên vùng giữa gần m ột đầu của phiến kính. Nâng đầu này của phiến
kính để tạo một m ặt nghiêng để giọt nước tự chảy về phía đầu kia của
phiến kính. Để vệt bôi khô trong gió. Nhỏ vài giọt phẩm nhuộm tiên mao
lên vệt bôi. Nhuộm trong 15 phút. Rửa bằng nước và thấm nước thừa
bằng giây lọc. Quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính 100X nhúng
trong dầu. p. aeruginosa là loài có tiên mao đơn cực.
Các thử nghiệm cần tiến h àn h và nhận định kết quả đế khắag định
P. aeruginosa được tổng hợp Bảng 5.2.

Bảng 5.2 CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA KHANG ĐỊNH p. AERUGĨNOSA

T h ử n g h iệ m s in h h ó a v à k ế t q u ả K ế t lu ậ n
1. T S Ỉ
Acid ở đáy, kiềm ở phần thạch nghiêng, Không phải P. aeruginosa
sin h hơi
Acid ở đáy, acid ở phần thạch nghiêng, ; Không phải P. aeruginosa
sinh hơi
Kiềm ở đáy vả bề mặt thạch nghiêng, P. aeruginosa
không sinh hơi
2. YE agar
1 Không phát triển ở 4 2 °c Không phải P. aeruginosa
Ị P h á t triển ớ 42°c P. aeruginosa
3. Arginine Decarboxylase
Ảm tín h Không phải P. aeruginosa
Dương tính P. aeruginosa
4. Koser’s Citrate
K hông mọc Không phải P. aeruginosa
Mọc P. aeruginosa
5. S ứ d ụ n g m an oỉate
Âm tín h Không phải P. aeruginosa
Dương tính P. aeruginosa
6. K h ử n itrate
Am tính, không sinh hơi Không phải P. aeruginosa
Dương tính P. aeruginosa
7. Kìlả năng di động
Ảm tính Không phải p. aeruginosa
Dương tín h P. aeruginosa \

154
 ------------------------—---------------------------------------------- -Ị
8. T iên m ao
T ié n m ao đơn cực ị P. aeruginosa
Các ìoại tiên mao khác I Không phài p. aeruginosa
.9. Pseudomonas Agar F
Không có sắc tô' huỳnh quan g Không phái p. aeruginosa
I Sắc tố huỳnh quang (pyoverdine) I P. aeruginosa
10. P seu d o m o n a s Agar p
I Không sắc tô' Ị Kỉ lông phải. P. aeruginosa
I Nếu có sắc tô", xác định là pyocyanine P. aeruginosa

Quy trìn h phát hiện p. aeruginosa được tóm tắ t trên Hình 5.Ĩ3

11.3.2. Q u y trin h k h á c

Ngoài quy trìn h của FDA nêu trên, một sô công ty hình th àn h quy
trình khác đế phát hiện p. aeruginosa. Sau đây là một ví dụ. Thực hiện
chuẩn bị và xứ lý mẫu như trình bày ở phần trên. CâV mẫu lên môi
trường một môi trường chọn lọc Enterobacteriaceae. Chọn khuẩn lạc đặc
trưng của Pseudomonas cấy ria bằng que cấy vòng lên môi trường thạch
không chọn lọc TSA, Ỉ1 ở 32>5°c trong 24 giờ. Sử dụng các khuẩn lạc của
Pseudomonas trê n TSA để thực hiện các thử nghiệm sau để khẳng định
P. aeruginosa.
- Nhuộm Gram.
- Nếu là Gram âm, tiến hành thử nghiệm oxidase.
- Nếu oxidase (+), cấy ria chủng lên môi trường Cetrimide Agar,
Pseudomonas Agar p và Pseudomonas agar F, ủ 3 ngày ở 32,5°c.
Kết luận P. aeruginosa dựa vào các đặc trưng hình thái của khuẩn
lạc khi soi dưới đèn u v trên các môi trường này như sau:
+ Trên môi trường Cetrimide agar: khuẩn lạc có màu xanh lá cây
(X. ảnh 30).
+ Trên môi trường Pseudomonas agar P: khuẩn lạc có màu xanh
dương.
+ Trên môi trường Pseudomonas agar F: khuẩn lạc có màu vàng
(X. ảnh 31).
 Hình 5.13 Quy trình phát hiện p aeruginosa trong mỹ phẩm

12 . TỔNG NẤM M EN NÂM M ốc

12.1. Định nghĩa và ngu yên tắc
N ấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rấ t đa dạng, cho đến nay
có hơn 400.000 ìoài nấm m en và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi
sinh v ật nhân th ậ t, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có n h ân và các bào
quan khác. T ất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh v ật dị
dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi
trường bên ngoài. Vì th ế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ
thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có th ể phân biệt nâm
men và nâm môc theo khái niệm đơn giản như sau : nấm môc là vi nấm
dạng sợi. sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty; nấm men là những tế bào
đơn tính phát triể n theo kiểu nảy chồi, th ỉn h thoảng có thể tồn tại ở
dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau th à n h chuỗi. Đơn vị hình

156
thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một
khuân lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một
tế bào hay một đoạn của khuẩn ty.
Quá trìn h tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất
nhiều yêu tô từ môi trường. Hầu hêt nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm
vi sinh vật Ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong
khoảng 20 - 28°c, một số ít trong nhóm này Ưa lạnh hay ưa nóng. Nước
hoạt tính cũng ỉà một nhân tố ảnh hưởng rấ t quan trọng đến tăng
trưởng. Hầu h ết các loài nấm mốc và nấm men phát triển tốt trong cơ
chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể
tầng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 - 70%.
Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 - 9, trong đó
pH thích hợp nh ất nằm trong khoảng 4 - 6,5. Hầu h ết nâm mốc, nấm
men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một. sô" có thể phát triển trong
điều kiện vi hiếu khí. Một số’ loài có thể tiêp nhận oxy nguyên tử từ cơ
chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần th iết cho
quá trình phát triển của nấm mốc và nâm men.
Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có th ể tăng
trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ,
làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố
gây ngộ độc thực phẩm.
M ật độ nấm mốc môc, nấm men trong mẫu dược xác định chung dưới
dạng tổng nấm mốc nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm
khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran
Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DG18 được sử
dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại
thực phẩm khô, gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm
lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu
có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm của sữa, các loại rau quả
và trái cây tươi, các loại đồ hộp ... Đối với mẫu có m ật độ nấm mốc thấp,
ví dụ như mỹ phẩm, môi trường được sử dụng là môi trường Malt Extract
Agar (ME A) hay Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm
chloramphenicol hay chlotetracyline.

12.2. Môi trường và hoá chất

- Dung dịch pha loãng (nước pepton 1%)
- Môi trường thạch Dichloran Glycerol Agar (DG18)
- Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramplenicol Agar
(DBRC)

157
 - Môi trường thạch M alt E xtract Agar (MEA)
- Môi trường thạch Potato Dextrose Agar (PDA)
- Môi trường th ạch Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
- Môi trường canh Sabouraud Dextrose Broth (SDB)
Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong các đĩa petri, làm khô
bề m ặt trong điều kiện vô trùng, trá n h ánh sáng trước khi sử dụng. Môi
trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các
ống thạch nghiêng.

12.3. Quy trìn h p h â n tích đ ịn h tín h

Đôi với mẫu có nguy cơ nhiễm và m ật độ nhiễm nấm mốc quá thâp,
việc phân tích thường được hiện một cách định tính theo quy trìn h như
sau: Mẫu được pha loãng 10 1 và đồng n h ất trong môi trường SDB. Dịch
đồng n h ất được ủ ở 30°c, theo dõi từng ngày đến 7 ngày. Nếu trong canh
trường có sự xuất hiện của nấm mốc, tiến h àn h cấy chuyền lên các đĩa
thạch SDA, MEA, hay PDA, ủ ở 30°c trong 7 ngày. Các khuẩn lạc nấm
mốc xuất hiện trê n các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề m ặt
ống thạch nghiêng SDA để định danh khi cần thiết. Quy trìn h định tính
nấm mốc được tóm tắ t trê n H ình 5.14.

12.4. Quy trìn h p h â n tích định lượng

Cân lOg mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha
loãng. Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30
phút trước khi đồng n h ấ t mẫu. Mẫu được đồng nhâ't bằng máy dập mẫu
trong 2 phút và được pha loăng th à n h các dãy nồng độ thập phân liên
tiếp thích hợp (xem chương IV). H út vô trùng 0,lm l dịch mầu lên các đĩa
môi trường DBRC hoặc DG18. Nếu m ật độ nấm men và nấm mốc trong
mẫu thấp, có th ể cấy Im l mẫu. Dùng que gạt thủy tinh trả i dịch mẫu đều
trên bề m ặt đìa môi trường cho đến khô. Đ ặt ngửa đĩa trong bao nylon,
đế hớ miệng bao, ủ ở n h iệ t độ 25°c trong 5 - 7 ngày. Đĩa dược đặt ngửa
đê tạo độ ẩm thích hợp cho sự p h át triển của nấm men mốc và h ạn chế
làm khô thạch. Thực hiện ba đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng. Đếm và
tính số lượng khuẩn lạc nấm môc và nầm men trên tấ t cả các đĩa cấy.
Khi cần th iết phải quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để
phán biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm môc. Kết quả được ghi nhận bằng
đơn vị CFƯ/g. Nêu có yêu cầu phân loại hay định danh các loài nghi ngờ
sinh dộc tô, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống
thạch nghiêng SDA đế gởi đên các phòng th í nghiệm chuyên định danh
và phân loại nấm.

158
 Cân lưu ý rằng trong thời gian ủ nâm raôc có thề tạo bào tử và p h át
tán vào trong môi trường nuôi cây tạo nên các khuẩn lạc mới. Để h ạn chế
hiện tượng này, trong suôt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di
chuyến các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm
khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào
trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cây khác.
Đốì với mẫu mỹ phẩm, việc định lượng được thực hiện trên các đĩa
môi trường Môi trường thạch MEA hay thạch PDA. Các đĩa được ủ ở 30°c
trong 7 ngày trước khi tiến hành đếm riêng lẻ số khuẩn lạc nấm men,
nấm mốc xuất hiện trên đĩa. Quy trình định lượng tổng nấm men nấm
mốc được tóm tắ t trên H ình 5.15.

Hình 5.14 Quy trình định tính nấm mốc

Hình 5.15 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc

159
13. CANDIDA ALBICANS
13.1. Đ ịnh n g h ĩa và n g u y ê n tắc
c. albicans là nấm men có th ể phát triển tố t ở nhiệt độ 20 - 38°c,
pH từ 2,5 đến 7,5, h ìn h dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục
sang dạng sợi, tế bào nhuộm Gram dương. Đây là loài eukaryote lưỡng bội
đơn giản, chưa có chu kỳ sinh sản hừu tính, có thê sản sinh ông mầm và
bào tử vách dày chiết quang rìa kép, thường được sinh ra ở đầu khuân ty
giả. Sự hình th à n h bào tử vách dày là một đặc tính hình thái rấ t quan
trọng của c. albicans.
c. albicans thường sông vô hại ớ màng nhầy của người và động vật
máu nóng (miệng, ruột, âm đạo) và không thường xuyên ơ trên da ớ dạng
đơn bào. ơ nhừng điều kiện n h ât định, nấm men phân hóa th àn h dạng
sợi đế xâm nhập vào m àng nhầy, tăn g trưởng không kiềm soát và gây
những bệnh “nhiễm nấm m en” khá nghiêm trọng, c. albicans là tác nhân
gây bệnh candidasis hay còn gọi là moniliasis tuy không nghiêm trọng
nhưng khi lan truvền vào máu hoặc màng não thì rấ t nguy hiểm. Khả
năng tồn tại ở 2 dạng hình th ái ỉà đơn bào và nấm sợi giúp loài này
nhanh chóng chuyến dổi hình thái trong điều kiện thích hợp và rấ t khó
bị tiêu diệt. Các mỹ phẩm tiếp xúc thường xuyên với da, tạo điều kiện cho
sự nhiễm và sinh trưởng của loài này trên da khi mỹ phẩm bị nhiễm.
Do vậy, hiện nav, loài này là một chỉ tiêu cần được kiếm soát trong
mỹ phâm.
c. albicans được p h át hiện bàng khuẩn lạc điển hình trên môi
trường Sabouraud Dextrose Agar. Khuẩn lạc điển hình được sử dụng để
nhuộm Gram và quan sát các dặc điểm hiến vi để khẳng định c. albicans.

13.2. Môi trường và hoá chât

- Môi trường canh Modified Letheen Broth (MLB)
- Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
- Tween 80
- Hóa chất nhuộm G ram

13.3. Quy trìn h p h â n tích

Tùy đặc tín h vật lý của mỹ phẩm , mầu được xử lý và chuẩn bị một
cách khác nhau như được trìn h bày trong chương III. Thông thường, lm l
mỹ phẩm dạng lỏng được bố sung vào 9ml môi trường canh MLB, lg mỹ
phâm dạng kem hoặc bột được bố sung vào ông nghiệm chứa lm l Tween
80, sau đó bố sung 8ml canh MLB để thu được mẫu pha loãng 10“V Mẫu
được ria bằng que cấy vòng lên đĩa thạch SDA đế phân lập khuẩn lạc

160
đơn. Đĩa môi trường được ủ 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Trên môi trường
này c. albicans có khuẩn lạc tròn, lồi, ướt, trắn g kem, rìa bằng phẳng,
m ặt dưới khuẩn lạc cắm sâu vào môi trường. Khuẩn lạc điển hình được sử
dụng để nhuộm Gram (xem phần nhuộm Gram Bacillus cereus),
c. albicans có vách tế bào nhuộm Gram (+). Dùng que cấy vòng chuyển
một ít sinh khôi khuẩn lạc để huyền phù hóa vào một giọt nước trên
phiến kính, đậy bằng một lá kính và quan sát dưới kính hiển vi ở vật
kính 40X: nêu nấm men có bào tử vách dày, khuẩn ty giả, khuẩn ty th ậ t
(có vách ngân giữa 2 tế bào), ống mầm thì k ết luận là c. albicans. Quy
trình phát hiện c. albicans được tóm tắ t trên H ình 5.16.

Hình 5.16 Tóm tắt quy trình phát hiện c. albicans trong mỹ phẩm

1Ì-PHƯONG PHÁP PHÂN TÍCH. 161

 CHƯƠNG VI

CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYEN THốNG

Những quy trìn h p h ân tích vi sinh vật được đề cập trong các chương
IV, V là các quy trìn h dựa trê n các phương pháp truyền thông đế phân
tích vi sinh v ật được xây dựng từ những năm 80 của th ế kỷ 19. Vì có một
lịch sử ph át triể n và ứng dụng lâu dài nên các phương pháp này được các
cơ quan thẩm quyền công n h ận ở mức quốc gia cũng như quốc tế. Nhược
điểm của đa số các phương pháp truyền thống là tốn nhiều thời gian,
chậm thu kết quả, m ất nhiều công sức, tôn kém ... Để khắc phục nhừng
nhược điếm này, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển
và thương mại hóa. Các phương pháp này có thể được gọi chung là các
phương pháp không truyền thông, có đặc điểm chung là cho kết quả
nhanh hơn phương pháp truyền thông.
Các phương pháp thử nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh
vật nhằm mục tiêu ứng dụng các phương pháp vi sinh, sinh hóa, hóa lý,
miễn dịch học, huyết tương học để hoàn thiện việc phân lập, phát hiện
sớm, mô tả và định lượng vi sinh vật cũng như sản phẩm của chúng trong
nhừng mẫu nước, thực phẩm , mỹ phẩm. Một biện pháp thường được sử
dụng trong các phương pháp này là những cải tiến của phương pháp
truyền thống nhằm tăn g hiệu quả của việc kiểm nghiệm. T ất cả các yêu
cầu kỹ th u ật liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, định lượng, phát hiện vi
sinh vật gây bệnh, p h át hiện độc tố ... trong thực phẩm đều được cải tiên
theo hai hướng. Hướng thứ n h ấ t là cơ giới hóa, công cụ hóa các phương
pháp và quy trìn h kiểm tra; đơn giản hóa hay mini hóa các phương tiện
kiêm nghiệm. Hướng thứ hai là nghiên cứu cải tiến nhằm thay th ế bước
tăng sinh (của phương pháp truyền thống, cần nhiều thời gian) bằng bước
làm tăng m ật độ đối tượng phân tích (như phương pháp IMS); hoặc thay
th ế phương pháp p h át hiện (chắng h ạn thay th ế phương pháp tăng sinh,
đếm khuẩn lạc cần thời gian dài, bằng phương pháp vi sinh trở kháng
hoặc ph át quang sinh học). Một scí trong các phương pháp thử nhanh đã
được các tố chức quốc tế như Association of Official Agricultural Chemists
- AOAC công n h ận (Bảng 6.1.). Hầu h ết các phương pháp nhanh và tự
động dùng trong công nghiệp hiện nay dựa trê n các phương pháp phân
tích miễn dịch (ELISA, LA, IFA, IMS ...), dùng trở kháng (impedance,
conductance), phân tích nucleic acid (mẫu dò, PCR) hoặc các kỹ thuật
ph át quang sinh học khác. Các phương pháp này có thế sử dụng độc lập
hoặc phôi hợp với nhau, ví dụ như phương pháp phân tích nhanh như
IMS có thể k ết hợp với phương pháp như ELI SA.

162
 B ả n g 6.1 MỘT s ố BỘ KIT THƯƠNG MẠI DựA TRÊN KỲ THUẬT PHẢN TÍCH
KHÁNG THẾ DỬNG TRONG PHÁT HIỆN TÁC NHÀN GÀY BỆNH VẢ ĐỘC T ố
TRONG THựC PHẨM*

Vi s in h v ậ t/
T ê n th ư ơ n g m ạ i K iể u p h â n tíc h N hà sản x u ất
Đ ộc tô
Bacillus cereus TECRA ELISA* TECRA
diarrhoeal toxin BCET RPLA" Unipath
Campylobacter Campy slide LA" Becton Dickinson
M eritec-cam py LA M eridian
M icroScreen LA Mercia
VIDAS ELFAa,i’ bioM erieux
EiaFO SS ELISAb Foss
TECRA ELISA TECRA
Clostridium ELCA ELISA Elcatech
botulinum toxin
c. perfringens PET RPLA Ưnipath
enterotoxin
Escherichia coỉi
EIIKO r 0157:117 RIM LA REMEL
E. coh 0157 LA U nipath
Prolex LA PRO-LAB
Ecolex 0157 LA Orion Diagnostica
Wellcolex 0157 LA Murex
E. coli 0157 LA TechLab
0157& H 7 sera Difco
PetrifilmHEC Ab-blot 3M
EZ COLI Tube-EIA Difco
D ynabeads Ab-beads Dynal
EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika
Assurance0 ELISA BioControl
H E C 0157 ELỈSA 3M Canada
TECRA ELISA TECRA
E. coli 0157 ELISA LMD Lab
P rem ier 0 1 5 7 ELISA Meridian

163
 E. coli 0157:H 7 ELISA Binax
E. coli R ap itest ELISA M icrogen
T ra n sia card ELISA T ran sia
E. coli 0 1 5 7 EIA/capture TECRA
V IP 1, A b-ppta BioControl
Reveal Ab-ppt Neogen
Quix Rapid 0157 Ab-ppt Universal
HealthWatch
Im m unoCardSTAT Ab-ppt M eridian
VTDAS ELFAb bioMerieux
E iaFO SS E L lSA h Foss
Shiga toxin tstx ) V EROTEST ELISA MicroCarb
P re m ie r EH EC ELISA M eridian
V erotox-F RPLA D enka Seiken
ETEC c
Labile toxin (LT) VET-RPLA RPLA Oxoid
Stabile toxin (ST) E. coli ST ELISA Oxoid
Listeria Microscreen LA Microgen
L iste ria L atex LA M icrogen
L isteria-T E K e ELISA Organon T eknika

TECRA0 ELISA TECRA

• A ssurance6 ELISA BioControl
Transia Listeria ELISA T ra n sia
P a th a le rt ELISA M erck
Listertest Ab-beads VICAM
D ynabeads Ab-beads Dynal
V IP e Ab-ppt BioConfcrol
C learview Ab-ppt U n ip ath
R A PID TEST Ab-ppt ư n ip a th
VIDASe ELFA b bioMerieux
E iaF O S S ELISA1’ Foss
U N IQ U E Capture-EIA TECRA
S alm o n ella B actigen LA Wampole Labs
S pectate LA Rhone-Poulenc

164
 M icroscreen LA M ercia
Wellcolex LA Laboratoire,
Wellcome
Serobact LA REMEL
RAP I DTE ST LA U n ip ath
D ynabeads Ab-beads D ynal
Screen Ab-beads VI CAM
C H ECK PO IN T Ab-blot KPL
1-2 Test*5 diffusion BioControl
Salm onellaT E K e ELISA O rganon T eknika
TECRAe ELISA TECRA
EQUATE ELISA Binax
BacTrace ELISA KPL
LOCATE ELISA R hone-Poulenc
A ssurance6 ELISA BioControl
Salm onella ELISA GEM Biomedical
T ra n sia ELISA T ra n sia
Bioline ELISA Bioline
V IDAS' ELFAb bioM erieux
OPUS ELISA1’ TECRA
PA TH -STIK Ab-ppt LƯMAC
Reveal Ab-ppt Neogen
C learview Ab-ppt U n ipath
U N IQ U E 0 C apture-EIA TECRA
Shigella B actigen LA W ampole Labs
Wellcolex L aboratoire
Wellcome
Staphylococcus S taphyloslide LA Becton D ickinson
aureus A ureusT este LA T risum
S tap h L atex LA Difco
S. aureus VIA ELISA TECRA
E nterotoxin SET-EIA ELISA Toxin Technology
SET-RPLA RPLA ư n ip a th
TECRA* ELISA TECRA

165
 T ra n sia SE ELISA T ran sia
RIDASCREEN ELI SA R-Biopharm
VIDAS ELFAb bioM erieux
OPƯS ELISA1’ TECRA
Vibrio cholera choleraSM A RT Ab-ppt New Horizon
bengaìSM A RT Ab-ppt New Horizon
choleraS creen A gglutination New Horizon
bengalS creen A gglutination New Horizon
E n tero to x in VET-RPLA(i RPLA U nipath

* Nguồn trích dẫn: Feng, p., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.
J Chừ viết tắt: ELISA: enzyme linked immunosorbent assay; ELFA: enzyme linked
fluorescent assay; RPLA: reverse passive latex agglutination; LA: latex agglutination;
Ab-ppt: immunoprecipitation.
b ELISA tự động
' EHEC - Enterohemorrhagic E. coli \ ETEC - enterotoxigenic E. coli
d Cùng phát hiện nội độc tô đường ruột LT của E, coll
l' Hệ thống được AOAC chính thức chấp nhận
** Chú ý: Một sô’ bộ kit chỉ đặc hiệu phát hiện chúng 0157 nhưng không hoàn toàn thuộc
serotype H7 (nhừng chủng 0157 không phải H7 thường không tạo độc tô" Shiga toxin, nên
thường không gây bệnh cho người). Một số kháng thế 0157 có thể phản ứng chéo với
Citrobactcr, E. hcrmcinii và những vi sinh vật đường ruột khác.

X. PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP TRONG GIÁM

SÁT VỆ SINH
P hân tử adenosine triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tấ t cả các
tê bào sống (tế bào Eukaryote và Prokaryote) nên sự p h át hiện ATP là
dấu hiệu để n h ận biết v ật chất sông đang tồn tại. ATP có th ể được phát
hiện một cách nhan h chóng bởi lượng ánh sáng p h át ra thông qua sự k ết
hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ th u ậ t này có th ể
phát hiện được lp g ATP (10'12g), tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi
khuẩn ( lp '15g ATP/ tế bào). Độ nhạy này có được khi sử dụng với những
hóa chất thương mại (thường đắt tiền). Sự phân tích sẽ diễn ra chỉ trong
vài phút và vì th ế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi
hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc.
Việc dùng phương pháp đo hàm ỉượng ATP để xác định rõ số vi sinh
vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương
pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc th iế t k ế máy đo lượng ánh
sáng p h át ra (giảm giá th à n h và có th ể mang đi được) và những hóa chât
ổn định sự ph át sáng. Phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực:

166
giám sát vệ sinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch
hệ thông, đánh giá chât lượng vi sinh của thực phẩm. Đế đánh giá chất
lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải
được tách chiêt ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào
cường độ ánh sáng p h át ra.
Phản ứng p h át sáng sinh học ở đom đóm trả i qua hai giai đoạn:
E + LH, + ATP 4 ___* E - LH2 a m p + pp, (1)

E - LH2 AMP + 0 2 ------► Oxyluciferin + AMP + C 0 2 + hv (2)

P hản ứng này có th ể được viết lại như sau:

E + LH2 + ATP + 0 2 ^ * Oxyluciferin + AMP + CO, + hv +PP,
{E : Luciferase, LH2 :luciferin)
P hản ứng p h át sáng của đom đóm (Photinus pyralis) là có hiệu quả
nhất, được biết đến như phản ứng p h át sáng sinh học để xác định hàm
lượng ATP. P hản ứng này đòi hỏi D-luciferin và ion Mg2+ để hoạt động,
đây là th àn h phần đ ắt tiền trong bộ kit thương mại. C hất dioxetanone thì
được hình th à n h bởi sự tạo phức hợp của luciferase với ôxi và phức hợp
Mg-ATP. Sau đó, ánh sáng vàng-xanh (bước sóng cao n h ất là 562nm)
được phát ra. Để kiếm tra tìn h trạn g vệ sinh bề m ặt th iế t bị trong sản
xuất, chê biến thực phẩm , tổng vi khuẩn hiếu khí trong th àn h phẩm ,
người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao
gồm hàm lượng ATP của tế bào eucaryote và ATP của tế bào vi sinh vật.
Thông thường ATP không có nguồn gốc là tế bào vi sinh vật thì được tách
chiết bởi những chất tẩy không ion ví dụ như Triton X-100. ATP này sau
khi được tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với
enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật
sè được ìy trích bằng chất trichloacetic acid (5%). Ánh sáng p h át ra bởi
phản ứrrg ph át sáng được đo bằng các loại máy đo án h sáng đo được
cường độ ánh sáng thấp.
Ngày nay sự p h át quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để
đánh giá chất lượng vệ sinh bề m ặt th iết bị sử dụng trong quá trìn h sản
xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm , mỹ phẩm . Quy trìn h thực
hiện rấ t đơn giản, cho k ết quả r ấ t nhanh chóng trong vài phút và có th ể
dễ dàng tự động hóa. Nguyên tắc chung của quy trìn h này là như sau :
Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích n h ất
định trê n bề m ặt dụng cụ, th iế t bị. Sau đó que bông được cho vào dung
d ịc h ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng p h át sáng (H ình
6.ỉ). Gần đây nhiều hệ thống p h át hiện được th iết kế, chế tạo chứa sẵn
những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự p h át sáng

167
xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau dó dụng cụ nàỵ được đặt
trong máy đo lượng án h sáng p h át ra (H ình 6.2).

CÊ>

ống đo Xoay tampon trong

dung địch đệm

\r Dung dịch đệm

0 Rút tampon ra bằng
cách ấn dọc theo thành
ống nghiệm cho ráo nước
ƯI ỵ - Thêm chất ly trích
Nhúng que tampon Ị c ATP và trộn đều
(vô trùng) vào dung
dịch đệm
Thêm hỗn hợp
Quẹt trên bề j phản ứng phát sáng
♦* và trộn đều
mặt cần kiểm tra

Đọc trị số ánh sáng

phát ra

Hình 6.1 Sơ đổ các bước định íượng nhanh ví sinh vật hiện diện trên bể mặt bằng
phản ứng phát sáng

....

1 2 8

Quẹt trên bể Thực hiện phản ứng Đọc kết quả trên
mặt kiẽm tra máy đo sáng
Hình 6.2 A: dụng cụ quẹt bể m ặt Clean-Trace™ ATP (Neogen Corpation, Lansing, USA);
B: quy trình phát hiện vi sinh vật bề m ặt bằng dụng cụ Clean-Trace™ ATP

168
 Đế biêt m ật độ của vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với
một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng p h át ra và m ật độ tế
bào vi sinh vật đã được biết trước.

2. PHƯƠNG PH ÁP ELI SA (Enzym e-Linked Im m uno Sorbent A ssay)

Những tiến bộ kỷ th u ậ t trong vài th ập niên vừa qua thúc đẩy sự
phát triển của nhiều kỹ th u ật chẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính
xác các bệnh truyền nhiễm. M ặt khác, sự p h át triển của những kỹ th u ật
tự động cho phép đơn giản hóa các thao tác thực hiện. Nguyên tắc của
phương pháp m iễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tê bào (kháng
nguyên) với một kháng th ể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có
thế nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên -
kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu
(bằng chât nhuộm p h át huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme).
Trong số các phương pháp phân tích m iễn dịch, phương pháp hấp
phụ miền dịch dùng enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay -
ELISA hay enzyme immunosorbent assay - EIA) được quan tâm nhiều do
có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này có th ể được sử dụng
cho hầu h ết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Nguyên tắc kỹ th u ật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên
ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng
nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trê n bề
m ặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được p h át hiện bằng cách sử dựng
kháng th ể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay
alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào
giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản
phẩm có màu hay ph át sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có th ể p h át
hiện sự hiện diện và định lượng lượng kháng nguyên {Hình 6.3.).

Cơ chất
Kháng thể
thu kháng nguyên s
< ? •
Kháng nguyên Kháng thể mang Phát quang,
enzyme đánh dấu Sandwich" Tạo màu

Hình 6.3 Nguyên tắc phản ứng ELISA

169
 ELISA đã được sử dụng rộng rã i dưới dạng các bộ hóa chất (kit)
thương mại (p h át h iện Salm onella, E. coli gây bệnh, Listeria, độc tố
Staphylococcus, thuôc trừ sâu ...) và có thế được cải tiến đế tự động hóa.
ELISA có th ể sử dụng p h á t hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm
trong thời gian vài giờ sau khi tă n g sinh. Kỹ th u ậ t này có độ nhạy
p h át hiện khoảng 10òCFU/ml (một sô' báo cáo cho rằng giới h ạn này có
thế đ ạt được 104). Tuy n h iê n trong phương pháp này vẫn cần thực hiện
bước tă n g sinh và tă n g sinh chọn lọc trước khi thực hiện các p h ản ứng
miễn dịch.
T ransia S a lm o n e lla (Diffchamb AB, Sweden) là một bộ kit phát
hiện nhanh Salm onella spp. dựa trên nguyên tắc ELISA sandwich. Khi
mầu được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu,
kháng nguyên tiên mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng th ể cố
định trê n giếng và kháng th ể tự do có gắn enzyme peroxidase tạo th à n h
một phức hợp kép (sandwich). Sau đó, các kháng thế gắn enzyme ở dạng
tự do không tạo phức hợp sandwich sẽ bị rửa khỏi phản ứng. Phức hợp
sandwich được p h át hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure
peroxide và tetram ethylbenzidine). Enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ
chất tạo sản phẩm có màu xanh dương. Phản ứng được kết thúc bằng
cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường
và chuyển màu xanh th à n h màu vàng. Sự hình th àn h màu vàng chứng
minh sự hiện diện của k h án g nguyên mục tiêu hay sự hiện diện của vi
sinh vật mục tiêu và m ật độ của vi sinh vật có thể được xác định bằng
cách đo cường độ màu bằng máy so màu.

Một ví dụ khác về sản phẩm ELISA thương mại là quy trìn h p h át

hiện độc tô" đường ruột và định danh độc tố (loại A đến E) của
S ta p h y lo c o c c i trong thực phẩm . Quy trìn h này có thời gian ngắn (4 giờ),
nhạy (lng/m l hay mg) và có thế phát hiện đồng thời sự hiện diện của
nhiều loại độc tô' của Staphylococcus (nhưng không th ể phân biệt các loại
độc tô'). P hản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kỹ thuật “sandw ich”.
Bộ kit này có tê n thương mại là TECRA™ (TECRA Diagnostic, Roseville,
2069, A ustralia, H ình 6.4.), là sản phẩm đầu tiên được chứng n h ận bởi
AOAC.

170
 Hinh 6.4 Bộ hóa chất T E C R A ỉm

3. PHƯƠNG P H Á P LAI PH Â N TỬ (H y b rid iz a tio n )

Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm ứng
dụng các th àn h tựu của kỹ th u ật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực
thực phẩm. Hiện nay, nhiều hệ thống đã được th iết lập dựa trên DNA
đê định lượng vi sinh vật và độc tổ’. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai
phản tử (hay còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes), phương pháp
PCR (polymerase chain reaction) là được thương mại hóa dưới dạng các bộ
kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tBảng 6.2). Phương
pháp sử dụng mẫu dò để p h át hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa
trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng cưa vi sinh vật. Cơ sở của việc
sử dụng mẩu dò là quá trìn h lai phân tử. Quá trìn h này bao gồm sự tách
rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi n hiệt độ vượt quá nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có
trình tự nucleotide bô sung khi n hiệt độ trở lại bình thường. Một trong
hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tê bào
vi sinh vật) được cố định trê n một giá th ể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào
hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trìn h tự nucleotide bố sung
với một vùng trìn h tự trê n DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt
và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít n h ấ t vài độ. Sự lai phân tử
còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trìn h lai phân tử chịu
anh hưởng rấ t nhiều bởi cáo yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nh iệt
độ và thời gian phản ứng, kích thước các trìn h tự lai và lực ion của
mối trường.

171
 Một ví dụ về hệ thông p h át hiện bằng mẫu dò là hệ thông Gen-trak
(Fram ingham , USA) (H ình 6.5). Hệ thông này sử dụng que thử với mẩu
dò để ph át hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. Mẫu dò là
những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chât p h át quang. Quy
trìn h phân tích có th ể được chia th à n h 6 bước: (1) phá vỡ tế bào thu nhận
rRNA; (2) mẫu dò DNA có đuôi oligodeoxyadenyỉic nucleotide (dA) và mẫu
dò ph át hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’
và 3’ của ph ân tử dược đ ặt vào phản ứng; (3) que thử được bao bọc bởi
polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò; (4) que thử
được d ặ t vào ống đo chứa mẫu dò p h át hiện được đánh dấu bằng enzyme;
(5) sau khi rửa loại p h ần enzyme thừa, que thử được đặt vào ông đo chứa
cơ chất tạo màu; (6) sau khi ủ để hiện màu, màu được p h át hiện ở bước
sóng 450 nm.
1. 2.

3. 4.

5.

Hình 6.5 Sơ đổ quy trình phát hiện Listeria vở i mẫu dò phát quang

172
 B ảng 6.2 MỘT s ố BỘ KIT THƯƠNG MẠI DựA TRÊN KỲ THƯẬT PHẢN TÍCH
NUCLEIC ACID DỬNG TRONG PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÀY BỆNH
TRONG THựC PHẨM*

Đối tượ ng T ên thươ ng m ại P hư ơng p h á p N hà sả n x u ấ t

vi sinh v ậ t p h â n tích
Clostridium botuỉinum Probelia PCR BioControl
Campylobacter A ccuProbe probe GEN-PROBE
GENE-TRAK probe GENE-TRAK
E sch erichia coli GENE-TRAK probe GENE-TRAK
E. coỉi 0157:H7 BAX PCR* Qualicon
Probelia PCR BioControl
Listeria GENE-TRAKC probe GENE-TRAK
AccuProbe probe GEN-PROBE
BAX PCR Qualicon
P robelia PCR BioControl
S a lm o n ella GENE-TRAKC probe GENE-TRAK
BAX PCR Qualicon
BIN D 1’ phage BioControl
Probelia PCR BioControl
Sta p h ylococcus a u reu s AccuProbe probe GEN-PROBE
GENE-TRAK probe GENE-TRAK
Y ersin ia enterocolitica GENE-TRAK probe GENE-TRAK

* Nguồn trích đẫn: Feng, p., App.I, FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.
■' Polymerase chain reaction
b Bacterial Ice Nucleation Diagnostics
' Hệ thống được AOAC chính thức chấp nhận

4. PHƯƠNG PH ÁP PCR (P olym erase C hain R eaction )

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp
in vitro đế’ tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trìn h tự đích DNA ban
đầu, khuếch dại, nhân số lượng bản sao của khuôn này th à n h hàng triệu
bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer)
đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ th u ật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ)
phát minh vào nám 1985. H iện nay, kỹ th u ật này được sử dụng rộng rãi
để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, p h át hiện các
mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm ...
T ất cả các DNA polym erase đều cần những mồi chuyên b iệt để
tổng hợp m ột m ạch DNA mới từ m ạch khuôn. Mạch khuôn thường là

173
m ột trìn h tự DNA của gen (gọi là trìn h tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho
loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp m ột loại
độc tô chuyên biệt của vi sinh v ật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn,
có khả năng b ắt cặp bô sung với m ột đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt
động của DNA polym erase đoạn mồi này được nối dài để hình th àn h
m ạch mới. Phương pháp PCR được hìn h th à n h dựa trê n đặc tín h này
của DNA polym erase. Khi có sự h iện diện của hai mồi chuyên biệt bắt
cặp bổ sung với hai đầu của một trìn h tự DNA trong p h ản ứng PCR, ở
điều kiện đảm bảo h o ạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa
hai mồi sê được khuếch đại th à n h số lượng lớn bản sao đến mức có thể
th ấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có th ể thu nhận
được đoạn DNA này cho các mục đích tái thao tác trê n gen. Như vậy, để
khuếch đại m ột trìn h tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối
thiểu về trìn h tự của DNA, đặc biệt là trìn h tự base ở hai đầu đoạn
DNA đủ đế tạo các mồi bô sung chuyên biệt. Các mồi này gồm m ột mồi
xuôi (sens prim er) và m ột mồi ngược (antisens prim er) so với chiều
phiên mã của gen.
P hản ứng PCR là gồm nhiều chu kỳ lặp lại nôi tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm ba bước (H ình 6.6) là:
- Bước 1 (bước biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng
bao gồm các th à n h phần cần th iết cho sự sao chép, phân tử DNA được
biến tính ở n h iệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 - 95°c trong
vòng 30 - 60 giây. Mạch dôi DNA tách ra th à n h dạng mạch đơn.
- Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp
hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực
nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°c, tùy thuộc của
các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây.
- Bước 3 (bưởc tổng hợp, elongation): nhiệt độ được tá n g lên đến 72°c
giúp cho DNA polym erase (vôn là polymerase chịu nhiệt) h o ạt động tổng
hợp tô't nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài của trìn h tự DNA
cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm ba bước trê n sẽ được lặp
đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần ỉại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần
trước. Đây là sự khuếch đại theo câp số' nhân. Theo tính to án sau 30 đến
40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao (H ình 6.7 và Bảng
6.3). Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và
có th ể quan sát th ấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel
agarose và quan sá t dưới tia ƯV (bước sóng 312 nm).

174
 N h iệt độ
(độ C)
100 h— — Chu kỳ 1 - Chu kỳ 2
- ■»\
90 \
/ Biển \
\
80 l tính \
_ 1 bản \
70 ề* X
mâu \
\
ĩ > ' Tổng hợp
60 — 1) \
1 \ dna '
~ 1
50 Mồi bắt
cặp
ỵ
/
10 —

1..... J _ i .. J _ |J .11_
.._ ỉ__ I___I__ L
3 4 5
Thời gian (phút)

Hình 6.6 Các bước của phản ứng PCR

Hiện nay có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit
thương mại dùng để p h át hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy. Một sô" ưu điểm chính của
phương pháp PCR dùng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh là:
- Thời gian cho kết quả nhanh;
- Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi
tăng sinh là đơn giản hơn và đôi khi không cần thiết;
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với
trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán
phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường;
- í t tốn kém về m ặt n h ân sự, có thể được tự dộng hóa để làm giảm
chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
Mặc dù vậy phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm cần khắc
phục:
- Sự ức chế hoạt tín h của Taq DNA polymerase bởi th à n h ph ần của
mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy
nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường
trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp
chât ức chế.

175
 d i l l kỳ 0

\s\sO DNA bàn mầu

Trình tự cần khuếch đại

Chu kỳ 1
Biến tínli và bílt cặp
t v v ''

K a/ Tống hợp
(trên mạch khuôn
là DNA bản mẫu)

Biến tính và bắt cặp

Tống hựp
{trên mạch khuôn là DNA
ỈWSữSBữuzzzzwÊÈWm£ẽ~~~ bíin nuiu vù đoạn DNA iru/i
/v \ệ
•''X'V. ư^y^Q đưực tổng hựp)
i
Chu kỳ 3

Biến tính và bát cặp

Qv/X^ Đoạn khuếch đại

f-rv \ (đoạn ngắn “ chiếm ưu thế)

fA A. nm nm m EnH I
■MMMMtO T ổ n g hợp

Đoạn khuếch đại

vvt (đoạn dài)
±S\SKQ

Chu kỳ 4 - 30 (hoặc hơn)

Hình 6.7. Sơ đố phản ứng PCR

176
 - M ật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm
thường thấp, nên trong đa SCI trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu
đế có được m ật độ đủ đế p h át hiện bằng PCR;
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sông với tế bào
chết, do vậy có thế dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào
chết. Ngược lại phưoìig pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm
sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc.

Bảng 6.3 MỘT s ố ỮNG DỤNG PCR PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG THựC PHẨM TRÊN THỂ GIỚI
■ ■■ ---- • - t
Thời gian
Gen t ă n g sin h
M ầu Độ n h ạ y
Vi sinh v ậ t m ục trư ớ c khi
thự c phẩm p h á t h iện
tiê u tá c h c h iế t
DNA
12,5CFƯ với
Camphylobacter Da gà tự 18 giờ,
16S sự hiện
coli, c. J e ju n i. c. nhiên và bị m ật độ
rRNA diện cua
lan gây nhiễm 500CFƯ/ml
I 10(i-108CFU/g
Escherichia coll
(dạng xâm
Không cần 10'CFU/g (ớ
nhiễm)
Rau diếp bị th iế t khi gảy thời điểm ngay
Shigella boydii, Gen laỉ
gây n hiễm nhiễm ỏ’ mức sau khi gây
s. dysent.eri.ae, s. l ơ lCFƯ/g nhiễm)
ỷĩexneri và s.
sonnei
Escherichia coll 2xlO'iCFU/ml
T h ịt b ăm bị
(tao đôe tố dường Gen LT 24 giờ sau khi gây
1 gây nhiêm
ruôt) nhiễm 3 CFU
1—
1 5S rRNA
I Lactobacillus
của vi Bia đã khử Không tă n g
brevis
khu ẩn trù n g Pasteur sinh, tách 30CFU/ 250ml
(Saccharomyces
sinh acid bị gây nhiễm chiết trực tiếp
cerevisiase)
lactic
\ Pho mai
mềm,
Vùng 3’ 2 x l 0 5CFƯ/ml
Listeria mayonnaise
của gen 40-48 giờ đối với pho
monocytogenes xà lách, đùi
hỉyA mai mềm
lợn muối,
1 xúc xích,...

12-phương pháp p h án Tích 177

 10CFU/mầu
Xúc xích n ấ u (đối với xúc
Listeria 24 giờ dối với
Gen h ly A c h ín v ả sừa xích) h a y 10 tế
monocytogenes mầu xúc xích
bị gây nhiễm bào/ 10ml (đối
với sừa)
Mẫu thịt tăng
2,5CFƯ/ml
Sữa và sinh qua đêm;
Salm onella sữa; 2 x l0 4
th ị t bò bị p h á t hiện
typ h im u riu m CFU/ml thịt
gây nhiễm trực tiếp trên
đồng nhât
mẫu sữa
Staphylococcus ĐỘC to
Sữa gầy bị 24 giờ sau khi
aureus đường 105CFƯ/ml
gây n hiễm gây nhiễm
1 ruột C]
ị
Thủy sản
(hàu, th ịt 10CFƯ/g hàu;
Gen
V ibrio choỉerae Oj cua), rau diếp, 6 - 8 giờ 1CFƯ/I0g rau
ctxAB
dâu bị gây diếp
n h iễ m
Gen độc
tố tế bào Hàu bị gây
Vibrio vulnificus 24 giờ 102CFƯ/g hàu
làm ta n n h iễm
m áu

Một giải pháp chung đôi với các nhược điểm trên là kết hợp một
bước tă n g sinh ngắn và m ột bước ly tâm loại bỏ th àn h phần môi trường
nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến h àn h phản ứng PCR. Việc p h át hiện
các m ầm bệnh vi sinh v ật đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp
PCR thường gây tôn kém. Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách lầm
giảm chi phí pháp bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một
phản ứng PCR (gọi là p h ản ứng multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng
thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau.
Tại Việt N am đã có m ột số' nghiên cứu ứng dụng kỹ th u ậ t PCR
trong việc p h á t h iệ n vi sinh v ậ t gây bệnh trong thực phẩm thực hiện
tạ i Trung tâ m Khoa học và Công nghệ Sinh học và Phòng thí nghiệm
Công nghệ Sinh học P h ân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học
Quôc gia TP. HCM (B ảng 6.4). Dựa trê n k ết quả nghiên cứu trê n một sô'
đôi tượng vi khuẩn gây bệnh, một quy trìn h chung cho việc p h át h iện vi
khuẩn gây bện h trong m ẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR được đề
nghị như sau:

178
 - Bước 1: tăng sinh trê n môi trường không hoặc ít chọn lọc (TSB
hoặc TSB có bố sung một sô' th àn h phần dinh dưỡng đặc biệt khác) trong
khoảng thời gian từ 10 - 20 giờ (tùy từng đôì tượng vi sinh vật, loại mẫu
thực phẩm cùng điều kiện lưu giữ mẫu).
- Bước 2\ thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ m ảnh vụn, ly tâm gộp sinh
khôi tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (lOmM Tris-
HC1 p ll 8,0, lm M EDTA) với thể tích bằng 1/10 th ể tích dịch nuôi cấy
ban đầu, xử lý bằng n hiệt ở 100 °c trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất
không tan ức chế phản ứng PCR.
- Bước 3: thực hiện phản ứng PCR.
- Bước 4: diện di trê n gel agarose 1,5%, xem kết quả trê n đèn u v .
Toàn bộ quy trìn h p h át hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm
từ khi tiếp nhận mẫu đến khi cho kết quả khoảng 14 - 24 giờ (10 -20 giờ
tăng sinh và 4 giờ thực h iện phản ứng PCR và xem kết quả) (H ình 6.8).

B ả n g 6.4 MỘT s ố ỨNG DỤNG PCR PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG THựC PHẨM TẠI VIỆT NAM (P h ò n g th í n g h iệ m C ô n g
nghệ Sin h học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên,
Đại học Quốc gia TP. HCM)

Độ n h ạ y
T h ờ i g ia n Độ n h ạ y
phương pháp
Vi s in h v ậ t M ẫ u th ự c p h ẩ m p h á t h iệ n p hản ứng PCR
phát h iện
(giờ) (CFƯ/phản ứng)
! (CFU/25g m ẫu)

E, coỉi T hịt heo, sữa, rau, cá 12 90 10

T hịt heo, sữa tươi,

E. coli (ETEC) 14 700 5
rau cải, mực
T hịt heo, sữa tươi,
E. coh 0157:H7 16 32 10
rau cái

Salmonella spp. Thịt thủy sán 12 90 3

Staphylococcus Thịt hộp, sữa tươi,

24 200 10
aureus rau cải, th ịt thủy sản

V. cholerae Thịt thủy sản 14 30 10

V. parahaemolyticus T hịt thủy sản 16 370 10

179
 Hình 6.8 Kết quả điện di phát hiện
E. coli ETEC bằng PCR theo thời
gian nuôi cấy.

Giếng 1: o x 174 RF DNA Hínc II;

Giếng 2: đoạn 195bp; Giếng 3: Nuôi
cấy 2 giờ; Giếng 4: Nuôi cấy 4 giờ;
> Giếng 5: Nuôi cấy 6 giờ; Giếng 6:
Nuôi cấy 8 giờ; Giếng 7: Nuôi cấy
10 giờ; Giếng 8: Nuôi cấy 12 giờ.
Vạch 195bp là sản phẩm khuếch
đại bởi PCR.

5. MỘT SÔ PHƯƠNG PHÁP THỬ NHANH KHÁC

5.1. Kỹ thuật phân tách và tăn g mật độ
Đế phân lập tê bào vi sinh vật mục tiêu với tế bào các vi sinh vật
khác cần thực hiện kỹ th u ậ t phân tách. Trong quá trìn h đồng n h ất mẫu,
mẫu thường được pha loãng thập phân tạo ra một th ể tích lớn nguyên
liệu (250ml), nhưng chí dùng vài Iĩil mẫu cho quy trìn h p h át hiện. Có thể
rút ngắn thời gian và tă n g hiệu quả p h át hiện bằng cách làm tăn g m ật
độ các vi sinh v ật mục tiêu trong mẫu. Một kỹ th u ật phân tách được sử
dụng rộng răi là p h ân tách m iễn dịch - từ tính (Immunomagnetic
separation - IMS). Trong phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể
được rút ngắn bằng cách thay th ế môi trường tần g sinh chọn lọc bằng
một quy trìn h tương tự nhưng không cần nuôi cấy. IMS sử dụng những
h ạt có từ tín h cao được bao bọc bên ngoài bởi những kháng th ể của vi
sinh vật mục tiêu. Các h ạ t này giúp hấp phụ chọn lọc vi sinh vật mục
tiêu và giữ chúng lại trê n h ạ t từ nhờ vậy tách chúng ra khỏi các quần thể
vi sinh vật khác hiện diện trong mẫu. Sau đó các vi sinh vật mục tiêu
này có th ể được p h át h iện bằng các quy trìn h vi sinh truyền thông.
Dynabeads® (Dynal A/s, Oslo, Norway) là m ột sản phẩm dựa trê n kỹ
thuật IMS. Quy trìn h này sử dụng nhừng h ạ t polystyrene từ tính cao có
đường kính 2,8ụm (Dynabeads® M-280) và 4,5ụm (Dynabeads® M-450).
Cả hai loại M-280 và M-450 đều có th ế được bao phủ bên ngoài bằng một
loại kháng th ể tùy chọn.

180
 5.2. Kỹ th u ậ t m àn g lọc p h á t h u ỳ n h q uang trực tiế p (D irect
E piflu orscen t T echn ique - DEFT) và m àn g lọ c lưới kỵ nước
(H y d r o p h o b ic G r id M e m b r a n e )

Đặc điểm chung của phương pháp m àng lọc là lọc thu n h ận tế bào
từ một lượng lớn th ể tích được lọc. Số lượng tế bào trong dung tích mẫu
lọc có thể xác định bằng cách quan sát và đếm trên kính hiển vi hoặc
bằng cách nuôi cây m àng và đếm khuẩn lạc xuất hiện. Phương pháp
màng lọc là một dạng cải biên của phương pháp phân tích vì sinh truyền
thông nhàm làm tăng m ật độ vi sinh vật mục tiêu, loại bỏ tác n h ân ức
chê tăng trướng. Phương pháp này rấ t thích hợp đối với mẫu có m ật độ tế
bào thấp.

Màng lọc có th ể được làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester,

nylon, polyvinyl chloride và polyester có kích thước lỗ 0,45 hoặc 0,22|.im,
đường kính m àng lọc khoảng 130 - 150mm. Sự lọc được hỗ trợ bằng hút
chân không hoặc lực ép dương. H iện nay phương pháp m àng lọc được cải
tiến về chất liệu m àng (màng lưới kỵ nước, cấu tạo polycarbonate), chất
nhuộm ph át quang. Các m àng lọc này rấ t mỏng có thề quan sát bằng
kính hiển vi. Độ nhạy của kỹ th u ật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT)
phụ thuộc vào m ật độ tế bào thu được trên m àng lọc trước khi nhuộm. Kỹ
thuật này cho phép phân biệt tế bào sông và tế bào chết bằng cách
nhuộm nhân với phẩm nhuộm p h át huỳnh quang acridine orange. Màu
sắc phát quang của tế bào bị nhuộm sẽ thay đổi trong suốt các quá trìn h
tăng trưởng. Thuốc nhuộm p h át màu đỏ với RNA và màu xanh với DNA.
Thông thường thì tế bào sông cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào
chêt cho màu xanh lục. N ăm 1991, phương pháp ISO-GRID® ứng dụng
trèn đối tượng Salmonella đã được AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại
thực phẩm. (X. ảnh 32).

5.3. Kỹ th u ậ t m àn g p etri (P etrifilm )

Trong kỹ th u ậ t này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố
định trê n một giá th ể mỏng và được phủ bằng m ột m àng bảo vệ. Khi sử
dụng, lớp m àng bảo vệ được tách m ột phần để có th ể bổ sung lm l dịch
mầu lên bề m ặt môi trường, sau đó phủ lại bằng m àng bảo vệ. Môi
trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự tă n g trưởng của vi sinh v ật trong
thời gian ủ và sô' khuẩn lạc xuất h iện có th ể được đếm trực tiếp. (X. ảnh
33 và hình 6.9).

181
 Kỹ th u ậ t này đã được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng vi
khuẩn hiếu khí, sô coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm
của kỹ th u ật này là dễ thao tác, tiế t kiệm không gian ủ và bảo quản, thời
h ạn sử dụng lâu và không cần hấp khử trùng môi trường.

Dàn đều mẫu trên màng

iP iể S s
^ ìllli
Ư Petrifilm , đếm trực tiếp hoặc phân lập

Hình 6.9 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm của 3M Microbiology

5.4. Kỹ th u ậ t R ed ig e l
Kỹ th u ậ t này sử dụng các chất dinh dưỡng và gel pectin chứa trong
một ông nghiệm. Ong môi trường này có th ể được sử dụng ngay không
cần phải đun chảy thạch. Trước tiên nhỏ lm l mẫu vào ống nghiệm, trộn
đều. Sau đó đổ tấ t cả vào một đĩa petri sđặc biệt đã được trán g sẵn một
lớp calcium. Khi chất lỏng tiếp xúc với calci, gel calcium pectate sẽ hình
th à n h và trương lên th à n h thạch như môi trường thạch thông thường.
Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp, tiến h àn h đếm khuẩn lạc giông như
phương pháp đếm đĩa thông thường. (Hình 6.10).

182
 Hình 6,10 Thao tác sử dụng hệ thống Redigel 3M

5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance ì im pedan ce)

Kỹ th u ật này nhằm p h át hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa
trên sự tăng độ dẫn điện của môi trường do sản phẩm trao đổi chât có
tính ion được tiế t vào môi trường bởi vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy
chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về độ dẫn
điện được ghi nhận bởi các th iết bị đo nhờ vậy giúp phát hiện sự hiện
diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cây. Kỹ th u ậ t này không áp
dụng được cho trường hợp môi trường nuôi cấy chứa hàm lượng ion cao (ví
dụ môi trường chọn lọc Listeria) vì giá trị độ dẫn điện nằm ngoài giới
hạn đo của th iết bị. Phương pháp này được ứng dụng rấ t sớm trong công
nghiệp thực phẩm và công nghiệp sữa. Trong nhiều trường hợp cho kết
quả của phương pháp này có tương quan tốt với k ết quả của phương pháp
đếm khuẩn lạc và có ưu điểm là thời gian phát hiện nhanh. Tuy nhiên
phương pháp này cần điều kiện môi trường chuẩn, ổn định, cần th iế t bị
và môi trường đặc biệt.
Trong m ột kỹ th u ậ t tương tự, KOH (potassium hydroxide) được cô'
định trong agar và được sử dụng làm cầu d ẫn điện, nốì với hai điện
cực của th iế t bị đo điện. Trong quá trìn h tă n g trưởng, m ột trong
những sả n p hẩm biến dưỡng của vi sinh v ật là C 0 2 sẽ làm p h ân rã
cầu nối KOH, làm giảm tín h d ần điện. Sự th ay đổi n ày được giám sá t
bằng th iế t bị đo độ d ẫn và thời gian cần th iế t để làm th ay đổi độ dẫn
được gọi là thờ i gian p h á t h iện. Các th iế t bị giám s á t thường có
chương trìn h tự dộng xác định sự h iệ n d iện của vi sinh v ật khi độ dẫn
vượt qua m ột giá trị quy ước. Giới h ạ n p h á t h iệ n của phương pháp này
đ ạt đến mức 1 t ế bào sống. H iện nay có nhiều th iế t bị giám s á t sự
thay đổi độ d ẫn điện tro n g môi trường nuôi cấy vi sinh v ật dùng cho
kỳ th u ậ t này như B actom eter 123 (Bactom atic Ltd.), M althus 2000
(M althus In stru m en ts Ltd)...

183
 5.6. Kỹ th u ậ t đo vi lư ợ n g calorie (M icro ca lo rim etry)
Kỹ th u ậ t này sử dụng th iết bị rấ t nhạy cho phép đo sự thay đổi
n h iệ t lượng rấ t nhỏ trong quá trìn h trao đổi chất của vi sinh vật. M ật độ
vi sinh v ật trong mầu có th ể để được xác định bằng cách đo lượng nhiệt
sinh ra hoặc xác định thời gian lượng nhiệt sinh ra đ ạt đến ngưỡng đo.
Kỹ th u ậ t này còn có th ể được dùng để định danh vi sinh vật dựa trê n sự
khác biệt về n h iệ t lượng tạo ra bởi một vi sinh vật trê n những nền cơ
chất khác nhau.

5.7. Kỹ th u ậ t đo m ức p h ón g xạ (R adiom etry)

Trong kỳ th u ậ t này người ta sử dụng cơ chất chứa carbon đồng vị
phóng xạ 14c trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật để khảo sát C 0 2 có
chứa 14c sinh ra trong quá trìn h trao đổi chât của vi sinh vật. M ật độ vi
sinh vật được xác định bằng cách đo lượng 14C 0 2 sinh ra hoặc thời gian
cần th iế t để lượng 14C 0 2 đ ạt đến ngưỡng phát hiện. Hệ thống p h át hiện
dựa trê n kỹ th u ậ t đồng vị phóng xạ này rấ t nhạy nhưng do tính độc hại
nên không được Ưa dùng trong công nghiệp thực phẩm.

184
 PHỤ LỤC

1. ẢNH MÀU

A nh 1: Sử dụng bình kỵ khí theo phương phap GasPak

1. Xé vỏ bao GasPak®
2. Nước được đặt vào để phóng thích H2 và C 0 2
3. Đặt nhanh vào bình và đậy kín

Ả nh 2: Thiết bị đồng nhất mẫu (stomacher)

13-PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 185

 Ả n h 3: Buồng đếm vi sinh vật

Ả n h 4: Thiết b ị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc

186
 Ảnh 5: Một số loại màng lọc vi sinh vật

14-PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 187

 Ảnh 6: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng lọc

K ế t q u ả MPN
Sô lượng ông dương tính ở mỗi độ pha loãng
MW /100mli
W' TO 7 u m 10' Ĩ0 ' 10 MPH
0 X 0 1.8 5 0 0 23
lữ 1 0 0 2.0 5 0 T 31
1 V 0 4.0 5 1 0 33
2 0 0 4,5 5 1 ì 46
2 0 T ó.8 5 2 0 49
2 1 0 68 5 2 1 70
2 2 0 9.3 5 2 2 95
3 0 0 78 5 3 0 79
5 ổng ở mỗi 3 0 1 11.0 5 3 ĩ 110
10 độ pha loâng
3 1 0 110 5 3 2 140
3 2 0 14,0 5 4 0 130
4 0 0 13.0 5 4 1 170
A 0 1 17.0 5 4 2 220
4 1 0 17.0 5 4 3 280
4 ĩ 1 21 0 5 5 0 240
4 2 0 22.0 5 5 1 350
10‘ A 2 1 260 5 5 2 540
& 3 0 27.0 5 3 3 920
5 5 4 lốOO

Ảnh 7: Ví dụ về kết quả định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN
A : Kêt quả sô ông dương tính trên loạt 5 ống nghiệm ở 3 độ pha loãng
khác nhau là: 5 : 4 : 1
(* 1 : ống dương tính; i : ống âm tính )
B : Khi tra bảng MPN, kết quả 5 : 4 : 1 cho trị số MPN là 170.
Như vậy m ật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu là 170MPN/100ml.

188
 B

Ả nh 8: Thử nghiệm khả nâng lên men hay ôxi hóa glucose của vi sinh vật
A : Môi trường trước khi cấy vi sinh vật.
B: Sau khi cấy vi sinh vật lên men glucose, các sản phẩm của quá trình lên men
làm acid hóa môi trường làm toàn bộ môi trường chuyển thành màu vàng.

Ả nh 9: Thử nghiệm khả năng thủy giải esculine

A : Phản ứng âm tính, vi sinh vật không thủy
giải esculine, môi trường vẫn giữ nguyên
màu ban đầu.
B: Phản ứng dương tính, esculine trong môi
trường bị vi sinh vật thủy giải, môi trường
chuyển thành màu nâu.

Ả nh 10: Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như nguồn

carbon duy nhất
A : Phản ứng âm tính, vi sinh vật không sử dụng citrate như
nguồn carbon duy nhất, môi trường vẫn giữ nguyên
màu ban đầu.
B: Phản ứng dương tính, vi sinh vật sử dụng citrate như
nguồn carbon duy nhất để phát triển tạo thành sinh
khối trên môi trường. Các sản phẩm trao đổi chất
được tạo ra làm kiềm hóa môi trường nuôi cấy; chất
chỉ thị trong môi trường chuyển sang màu xanh dương.

189
 Ả n h 11: Thử nghiệm Coagulase
A : Phản ứng âm tính, huyết tương vẫn ở
trạng thái lỏng.
B : Phản ứng dương tính, huyết tương
ngưng kết thành khối ở trạng thái rắn.
I
Ả nh 12: Thử nghiệm khả năng thủy g iải urease
A : Phản ứng âm tính, vi sinh vật không thủy giải urea,
môi trường vẫn giữ nguyên màu ban đầu.
B: Phản ứng dương tính, urea trong môi trường bị vi
sinh vật thủy giải tạo các sản phẩm cỏ tính kiềm
làm cho các chất chỉ thị trong môi trường chuyển
thành màu đỏ tím.

Ả n h 13: Thủ nghiệm gelatinase

Cấy vi sinh vật cần thử nghiệm vào môi
trường gelatin trong ống nghiệm.
A : Phản ứng dương tính, gelatin bị phân hủy
và tan chảy thành dạng lỏng.
B : Phản ứng âm tính, gelatin không bị phân
hủy, môi trường vẫn giữ nguyên trạng thái
rắn sau khi nuôi cấy.

Ả nh 14: Thử nghiệm Indol

1. Môi trường đối chứng.
2. Phản ứng indol dương tính
với chủng E. coli.
3. Phản ứng indol dương tính
với chủng proteus vulgaris.
4. Phản ứng indol dương tính
với chủng Enterobacter
aerogenese.

190
Ảnh 15: Thử nghiệm TSI agar
(Triple Sugar Iron agar)
1. Môi trường TSI đối chứng.
2. Chủng Salmonella
typhim urium trên môi
trường TSI.
3. Chủng E. colitrên môi
trường TSI.
4. Chủng Shigella plexneri trên
môi trường TSI.
5. Chủng Salmonella typhi trên
môi trường TSI.

Ả nh 16: Thử nghiệm nitratase

Dịch canh khuẩn sau khi nuôi cấy được
thêm vào sulphanilamide và
N-napthylenediamine.
A : Phản ứng âm tính, canh khuẩn
không chuyển màu sau khi thêm
thuốc thử vào.
B: Phản ứng dương tính, sau khi thêm
thuốc thử, canh khuẩn chuyển thành
màu hồng hay đỏ.
C: Thử nghiệm đối chứng, khi thêm
thuốc thử vào môi trường không nuôi
cấy vi sinh vật.

Ả nh 17: Phản ứng ONPG

A : Phản ứng dương tính, môi trường
cỏ màu vàng.
B: Phản ứng âm tính, môi trường
không đổi màu.

A B

191
 Ả nh 18: Thử nghiệm MR
(Methyl Red)
1. Môi trường đối chứng.
2. Phản ứng dương tính
với chủng E. coli.
3. Phản ứng dương tính
với chủng Proteus
vulgaris.
4. Phản ứng âm tính với
chủng Enterobacter
aerogenes.

Ả n h 19: Listeria monocytogenes

phản ứng CAM P (+) với
Staphylococus aureus

Ả nh 20: Thử nghiệm tỉnh di động

của vi sinh vật
Môi trường thạch mềm có chứa
2,3,5-T riphenyltetrazolium chloride.
Muối này không có màu (A), khi bị
vi sinh vật khử thì biến thành
formazan, một chất không tan có
màu đỏ (B và C).
B : Thử nghiệm âm tính, vi sinh vật
không di động, màu đỏ chỉ xuất
hiện dọc theo đường cấy.
C: Thử nghiệm dương tính, vi sinh
vật di động vào khắp môi
trường, màu đỏ xuất hiện khắp
môi trường.

192
 Ể

(00 », 0Ọ~ ịỊ* 'fm, . -~0* t i* m.i :<** pt , &«* <*+•+ 4ựj 'jT0 mmé «*K ««r r*/t **..

« W Í «&>* <jât <3ẫ£ ££ ->»4 ■>* 'ữ * «WỈ te ĩ âf . -> ' + ** **'■ V# *■* <*r 4* «

Ả n h 21: Thử nghiệm sinh hóa trên bộ kit API

Bộ kit nhằm rút ngắn thời gian xác định vi sinh vật bằng phản ứng sinh hóa do sử
dụng lượng môi trường trong các giếng thử nghiệm nhỏ.
A: Các giếng trước khi cấy vi sinh vật vào.
B: Các biểu hiện sinh hóa sau khi cấy và ủ vi sinh vật cần thử nghiệm.
C: Biểu hiện của bộ kit API nhằm khẳng định s. aureus.

Ả nh 22 : Khuẩn lạc Staphylococcus

aureus trên m ôi trường Baird Parker
agar
Khuẩn lạc tròn lồi, đen bóng, có
quầng trong và quầng sáng xung
quanh. Đôi khi chỉ xuất hiện một
trong hai quầng trên.

193
 Ả n h 23 : Khuẩn lạc Salmonella
typhimurium trên m ôi trường
XLD agar
Khuẩn lạc trong suốt, nhuốm
m àu hồng, có tâm đen, tâm có
thể chiếm gần hết khuẩn lạc,
m ôi trường dưới khuẩn lạc
chuyển thành kiềm.

Ả n h 24 : Trên m ôi trường XLD agar

(xem trên nền t ố i) :
Escherichia coli tạo khuẩn lạc có màu
vàng
Salmonella typhimurium tạo khuẩn lạc
có tâm đen
Shigella flexneri tạo khuẩn lạc có màu

Ảnh 25 : Khuẩn lạc Salmonella

typhimurium trên m ôi trường
Hektoen Entric Agar
Khuẩn lạc có màu xanh lá cây,
trong suốt, có tâm đen.

Ả n h 26 : Khuẩn lạc Salmonella

typhimurium trên m ôi trường Bismuth
Sulphite Agar
Khuẩn lạc có màu xám đen, môi
trường xung quanh khuẩn lạc màu nâu
đen, có ánh kim.

194
 Ả nh 27 : Trên m ôi trường ss agar :
Escherichia c o litạo khuẩn lạc màu hồng
Salmonella enteritidis tạo khuẩn lạc có tâm đen
Shigella flexneri tạo khuẩn lạc có màu

Ảnh 28 : Khuẩn lạc Vibrio cholerae trên môi

trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose)
agar
Khuẩn lạc hình đĩa có màu vàng hoa cau, môi
trường xung quanh khuẩn lạc cũng chuyển
thành vàng.

Ả nh 29 : Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên

m ôi trường Oxford Agar
Khuẩn lạc có màu xám hay nâu xám, lõm ở
giữa, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển
thành màu đen.

Ảnh 30 : Khuẩn lạc Pseudomonas

aeruginosa trên môi trường Cetrimide Agar
(xem trên nền tối)

195
Ả nh 33 : Màng Petri film
 2. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ THÕNG DỤNG

1. A cetam id e
Môi trư ờ ng cơ bản
KH 2P 0 4 0,5M I4ml
K 2HPO 4 0,5M 6 ml
Agar 0,5 g
Nước cất 400ml
Làm nóng và lắc để làm tan agar. Thêm lm l PR-CV (nồng độ 500X).
Dung dịch acetamide 1%
Acetamide 1g
Nước cất 100ml
Giừ trê n CHCI3 trong chai có nắp vặn. On định không giới h ạn ở
nhiệt độ phòng.

PR-CV (nồng độ 500X)

Phenol red 2g
Crystal violet 0 ,2 g
Nước cất 200ml
Thêm NaOH 5 N cho đến khi các th àn h phần được hòa tan.

Môi trư ờ ng cuối cùng

Cho 0,8ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm 13 X 100mm. Thêm vào
đó 0,2ml dung dịch acetamide 1%. Hấp ở 100°c trong 10 phút. Làm nguội.

2. Nước A lk alin e P ep to n e
Peptone 10 g
NaCl 10ể
Nước cất 1 lít
Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp pH đ ạt 8,5 ± 0,2. Hấp ở 121°c
trong 10 phút.

3. A naerob e A gar
Môi trư ờ ng cơ bản
Trypticase (tryptic) soy agar 40g
Agar
Cao nấm men 5g
L-cysteine (hòa tan trong 5ml NaOH IN) 0,4g
Nước cất 1
Làm nóng và lắc để làm tan agar. Chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. H ấp ở
121°c trong 15 phút. Làm nguội đến 50°c.

15-PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 197

 Dung dịch hemin
Huyền phù hóa lg hemin trong 100 ml nước cất. Hâ'p ở 121°c trong
15 phút. Giữ lạnh ở 4°c.

Dung dịch vitam in K ị

Hòa tan 1 g vitamin Kị (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) trong
100ml 95% ethanol. Thỉnh thoảng lắc dung dịch, có thể cần 2-3 ngày để
hòa tan vitamin. Giữ lạnh ở 4°c.

Môi trường cuối cùng

Đối với 1 lít môi trường cơ bản, thêm 0,5ml dung dịch hemin và lm l
dung dịch vitamin Kị. Trộn và đổ 20 ml vào trong các đĩa petri 15 X
100mm. Môi trường sẽ được khử bằng cách ủ kỵ khí trong 24 giờ trước
khi nuôi cây.

4. A ndrade's C arb o h y d rate B roth và c h ât chỉ th ị

Môi trường cơ bản
Cao thịt 3g
Peptone hoặc gelysate lOg
NaCl 10 g
Nước cất 1 lít
Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Hấp ở 121°c trong 15 phút.

Chỉ thị Andrade

Acid fuchsin 0,2 g
Nước cat 10 ml
NaOH 1 N 16ml
Để dung dịch mất màu trước khi sử dụng. Thêm l-2m l NaOH IN nếu
cần. Sử dụng 10 ml chỉ thị này cho 1 lit môi trường cơ bản.
Dung địch carbohydrate
Chuẩn bị dextrose, lactose, sucrose và mannitol trong các dung dịch
10 %. Chuẩn bị dulcitol, salicin và các carbohydrate khác trong các dung
dịch 5%. Vô trùng bằng cách lọc qua màng 0 ,20 ụm. Pha loãng môi trường
cơ bản và chỉ thị Andrade theo tỉ lệ 1:10 để đạt được nồng độ mong
muốn. Trộn nhẹ.

5. B aird -P ark er, pH 7,0

Môi trường cơ bản
Tryptone lOg
Cao thịt 5g
Cao nấm men lg

198
 Sodium pyruvate lOg
Glycine 12g
Lithiumchloride.6H20 5g
Agar 20g
Hấp ớ 121°c trong 15 phút. pH cuối là 7,0 ± 0,2. Nếu muôn sử dụng
ngay, giữ môi trường nóng chảy ở 48-50°C trước khi thêm Bacto EY
tellurite enrichment. Ngược lại, giữ môi trường rắn ở 4 ± l° c cho đến 1
tháng. Làm nóng chảy trưđc khi sử dụng.
Môi trường hoàn chỉnh
Thêm một cách vô trùng 5ml Bacto EY tellurite enrichment được làm
ấm (45-50°C) vào 95ml môi trường cơ bản được làm nóng chảy. Trộn đều
(tránh tạo bọt khí) và đổ 15-18ml vào trong các hộp petri 15 X 100mm vô
trùng. Môi trường phải đục. Làm khô đĩa trước khi sử dụng. Có thể giữ
các dĩa dã được chuẩn bị ở 20-25°C cho đến 5 ngày.

6. Bile Esculỉn Agar

Cao thịt 3g
Peptone 5g
Esculin lg
Oxgall 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan. Phân phôi vào trong các ống nghiệm,
hấp ở 121°c trong 15 phút và đặt nghiêng cho đến khi đông đặc. pH cuối
là 6,6 ± 0 ,2 .

7. Bism uth Sulfite A gar (Wilson an d Blair)

Polypeptone (hay peptone) lOg
Cao thịt 5g
Dextrose 5g
Na 2H P 0 4 (anhydrous) 4g
P eS 0 4 (anhydrous) 0,3g
Bismuth sulfite 8g
Brilliant green 0,025g
Agar 20g
Nước Qất ‘ 1 lit
Đun sôi trong một phút và lắc để hòa tan agar, làm nguội đến 45-
50°c. Đổ vào đĩa petri, để khô trong 2 giờ với nắp petri mở, pH môi
trường là 7,7 ± 0,2.

199
16-PHƯƠNG Ph a - ('HAN riCH.
 Chú ỷ: Môi trường không hấp khử trùng; chuẩn bị trước khi dùng 1
ngày và bảo quản trong tôi. Hoạt tính chọn lọc của môi trường giảm sau
48 giờ.

8. Blood A gar cơ b ả n (T hạch m áu cơ bản)

(Có thể sử dụng môi trường thạch máu cơ bản thương mại sẵn có)
Dịch chiết từ tim bò 500g
Tryptose lOg
NaCl 5g
Agar 15g
Máu cừu (vô trùng, loại bỏ sợi tơ huyết) 50ml
Nước cất 1 lít
Hòa tan các thành phần của môi trường (ngoại trừ máu). Hấp ở
121 °c trong 15 phút. Để nguội đến 45-50°C. Thêm 50ml máu (nhiệt độ
phòng) và trộn. Phân phôi vào trong các hộp petri vô trùng. pH cuối là
6,8 ± 0,2.

9. Blood A gar (Thạch m áu)

Tryptone ' 15g
Phytone hoặc soytone 5g
NaCl 5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Đun sôi trong 1 phút và lắc để hòa tan agar. Hấp ở 121 °c trong
15 phút, làm nguội đến 50°c. Chuyển 5ml (hoặc 10ml) máu cừu vào 100ml
môi trường thạch đang nóng chảy. Đổ vào dĩa petri; pH môi trường là
7,3 ± 0,2.

10. B rain H e a rt Infusion (BHI) B ro th và Agar

Dịch não dê 200 g
Dịch tim bò 250g
Proteose peptone (Difco) hoặc
polypeptone (Bioquest) 10 g
NaCl 5g
Na 2H P 0 4 2,5g
Dextrose 2g
Nước cất 1 lít
Hòa tan các thành phần của môi trường 1 trong nước cất bằng cách
lắc có gia nhiệt nhẹ.

200
11. B rilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL)
Peptone lOg
Lactose lOg
Mật bò 20g
Brilliant green 0,0133g
Nước cất í lít
Hòa tan peptone và lactose vào trong 500ml nước cất, mật bò vào
trong khoảng 200 ml và brilliant green trong khoảng 100 ml nước cất.
Trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối là 1 lít; chỉnh pH môi trường
khoảng 7,4. Rót vào mỗi ông nghiệm có chứa ống Durham 10ml môi
trường BGBL. Hấp ở 110°c trong 15 phút. pH 7,2 ± 0,2 ở 25°c.

12. B rilliant G reen Phenol Red Lactose Sucrose A gar (BPLS)

Môi trường cơ bản
Cao thịt 5g
Peptone lOg
Cao nấm men 3g
Na 2H P0 4 lg
NaH 2P 0 4 0 ,6 g
Agar 15g
Nước cất 900ml
pH 7,0 ± 0,1
Phân phối môi trường vào erlen 500ml, hấp khử trùng 15 phút ở 121°c.

Dung dịch Sugar Phenol Red

Lactose 10g
Sucrose lOg
Phenol red 0,09g
Nước cất đến thể tích cuôi 100 ml
Hòa tan các thành phần trong nước. Đun nóng ở 70°c trong 20 phút.
Để nguội đến 55 °c và sử dụng ngay.

Dung dịch B rillian t green

Brilliant green 0,5g
Nước cất 100 ml
Hòa tan các thành phần, giữ trong tối ít nhất 24 giờ trước khi sử
dụng (để dung dịch tự khử trùng).

201
 Môi trường hoàn chỉnh
Môi trường cơ bản 900ml
Dung dịch Sugar phenol red 100 ml
Dung dịch Brilliant green 1ml
Bổ sung vô trùng dung dịch Brilliant green và Sugar phenol red vào
môi trường cơ bản (để nguội ở 50 - 55°C). Lắc dều và đổ đĩa. Môi trường
giữ được 7 ngày ở nhiệt độ 4 ± 2°c.

13. B u tte rfie ld ’s p h o sp h ate-b u ffer

Dung dịch gốc
KH2P 0 4 34g
Nước cất 500ml
Chỉnh về pH 7,2 bằng NaOH IN. Thêm nước cất cho đủ 1 lít. Khử
trùng 15 phút, 121°c, giữ trong tủ lạnh.
Sử dụng: pha loãng l,25m l dung dịch gốc thành llít bằng nước cất.
Khử trùng 15 phút, 121°c.

14. C etrỉm ỉde agar

Gelatin Pancreatic Digest 20g
MgCl2 l,4g
Potassium sulphate 10g
Agar 13,6g
Cetrimide (Cetyl trimethyl amraoniưmbromide) 0,3g
Hòa 45,3g các thành phần trên hoặc môi trường thương mại vào 1 lít
nước cất. Thêm vào 10ml glycerol, trộn dều. Đun sôi trong 1 phút, khuây
thường xuyên. Hấp khử trùng ồ 115°c trong 15 phút. pH cuối 7,2 ± 0 ,2 .

15. C hristensen's U rea Agar

Môi trường cơ bản
Peptone lg
NaCl 5g
Dextrose lg
KH2P 0 4 2g
Phenol red 0,012g
Agar 15g
Nước cất 900ml
Hòa tan tất cả các thành phần trong 900ml nước (môi trường cơ bản).
Thêm 15g NaCl (nồng độ cuối của NaCl, 2 %) cho các chủng Vibrio spp .
Hấp ở 121 °c trong 15 phút. Để nguội đến 50 - 55°c.

202
 Dung dịch Urea
Urea 20 g
Nước cất 100 ml
Hòa tan urea trong 100ml nước. Lọc vô trùng. Thêm một cách vô
trùng vào môi trường cơ bản dược làm nguội. Trộn. pH cuối 6,8 ± 0,1.
Phân phôi vào trong các ống nghiệm vô trùng hoặc đĩa petri. Đặt nghiêng
các ông nghiệm.

16. Colỉstỉne Polym yxin B roth

Cao nấm men 3g
Tryptone 10 g
NaCl 20 g
Nước cất đến 1 lít.
Hòa tan các thành phần trong nước cất, không làm nóng môi trường.
Điều chỉnh về pH 7,4. Trước khi sử dụng thêm polymyxin E vào để đạt
nồng độ 500u/ml. Giữ ở nhiệt độ dưới 5°c.

17. D ecarboxylase cơ b ả n
(Arginine, Lysine, Ornithine)
Môi trường cơ bản
Peptone hoặc gelysate 5g
Cao nấm men 3g
Glucose lg
Bromocresol purple 0 ,02 g
Nước cất 1 lít
Chỉnh pH sao cho sau khi hấp là 6,5 ± 0 ,2 . Phân phôi 5ml vào các
ống nghiệm 16 X 125mm có nắp. Hấp các ống nghiệm được vặn lỏng nắp
ở 121°c trong 10 phút. Vặn chặt nắp lại sau khi hấp để lưu trữ và sau khi
cấy. Để đối chứng, sử dụng môi trường dối chứng không được bổ sung.

Đế có 1 lit môi trường cơ bản:

Canh Arginine thêm 5g L-arginine
Canh Lysine (Falkow) thêm 5g Lrlysine
Canh Ornithine thêm 5g L-omithine
Đối với các chủng Vibrio spp. chịu mặn thêm NaCl đến nồng độ 2-3%.

18. Di động cho B. cereus

Trypticase lOg
Cao nấm men 2,5g
Dextrose 5g

203
 Na 2H P 0 4 2,5g
Agar 3g
Nước cất 1 lít
Hấp ỏ 121°c trong 15 phút. pH cuối 7,4 ± 0,2.

19. D ỉch lo ran 18% glycerol (DG 18) agar

Glucose lOg
Peptone 5g
KH2P 0 4 lg
M gS0 4 0,5g
Dichloran (0,2% trong ethanol, w/v) lml
Agar 15g
Chloramphenicol 0 ,lg
Glycerol 220 g
Nước cất 800ml
pH cuôì 5,6 ± 0,2. Trộn đều các thành phần với nhau, ngoại trừ
glycerol và chloramphenicol, đun nóng để hòa tan agar. Bổ sung nước cất
đến 1000ml. Thêm vào 220ml glycerol và hấp khử trùng ở 121°c, 15 phút.
Sau khi hấp, để nguội đến 50°c. Bổ sung lm l dung dịch kháng sinh
chloramphenicol 100 X vào 100ml môi trường, lắc đều rồi đổ vào petri.

Pha dung dịch gốc kháng sinh 100X

Hòa tan lg chloramphenicol trong 100 ml nước cất vô trùng. Lọc qua
màng lọc vô trùng. Giữ ồ -2 0 °c.
Hoạt tính nước thấp của môi trường làm giảm khả năng nhiễm bệnh
của vi khuẩn và những nấm mọc nhanh. Khi định lượng cả nấm men lẫn
nấm mốc, sử dụng môi trường DRBC,

20. D ỉchloran Rose B engal C hloram phenicol (DRBC) ag ar

Glucose 10 g
Peptone 5g
k h 2p o 4 lg
M gS0 4 0,5g
Rose béngal (dung dịch 5%, w/v) 0,5ml
Dichloran (0,2%(w/v) trong ethanol) 1ml
(2i6-dichloro-4-nitroaniline)
Chloramphenicol 0,1 g
Agar 15g
Nước cất 1 lit
pH cuối 5,6 ± 0 ,2 .

204
 Trộn lẫn các thành phần, ngoại trừ chloramphenicol, đun nóng để
hòa tan hêt agar, hấp khử trùng ồ 121°c, 15 phút. Để nguội đến 50°c, bổ
sung lm l dung dịch kháng sinh 100X vào lOOml môi trường (như môi
trường DG18).

Chú ỷ
1. DRBC agar dặc biệt hữu dụng trong việc phân tích những mẫu
có hoạt tín h nước cao, dễ lan truyền nấm mốc (Mucor, Rhizopus).
Vì dichloran và rose bengal làm ngăn cản sự phát triển của những nấm
mọc nhanh, do đó cho phép phát hiện những nấm men và nấm mốc
mọc chậm.
2. Rose bengal nhạy sáng, do đó cần giữ môi trường trong tối, mát
trước khi sử dụng

21. EC B roth (canh EC)

Trypticase or tryptose 20 g
Muối mật No. 3 l,5g
Lactose 5g
k 2h p o 4 4g
k h 2p o 4 l,5g
NaCl 5g
Nước cất 1 lít

Rót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Hấp ở 121°c
trong 15 phút. pH 6,9 ± 0,2.

22. E n rich m en t B roth cải b iên (từ mồi trư ờ ng L isteria

E n rich m en t Broth)
Môi trường cơ bản
Tryptone soya Broth 30g
Cao nấm men 6g
Nước cất 1 lít
pH cuối 7,3 ± 0,1. Khử trùng 15 phút ồ 121°c.

Thành ph ẩn bổ sung 1
Nalidixic acid 40mg
NaOH 0,05M 10ml
Hòa tan nalidixic acid trong dung dịch NaOH, vô trùng bằng lọc qua
màng lọc 0 ,2 |IIEL

205

i
 Thành phần bổ sung 2
Acriflavine hydrochloride 15mg
Nước cất 10 ml
Hòa tan acriflavine hydrochloride trong nước. Vô trùng bằng lọc qua
màng lọc 0 ,2 |am.

Thành phần bổ sung 3

Cycloheximide 50mg
Ethanol 4ml
Nước cất 6 ml
Hòa tan cycloheximide trong hỗn hợp ethanol/nước.

Môi trường hoàn chỉnh

Trước khi sử dụng, thêm 2,5ml mỗi dung dịch bể sung 1 , 2 , 3 vào
225ml môi trường cơ bản.

23. E sculỉn A gar được cảỉ b iên (CDC)

Infusion agar 40g
Esculin 1g
Ferric citrate 0,5g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar. Làm nguội đến 55°c. Chỉnh pH
đến 7,0 ± 0,2. Phân phối 4ml vào các ô'ng nghiệm 13 X 100mm. Hấp ở
121°c trong 15 phút. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng.

24. Glucose Azide B ro th (môỉ trư ờ n g SF)

Tryptone 20 g
Dextrose 5g
k 2h p o 4 4g
KH2PƠ4 1,5 g
NaCl 5g
Sodium azide 0,5g
Bromocresol purple 0,032g
Nước cất 1 lít
pH cuối 6,9 ± 0,2.
Hòa tan các chất trong 1 lít nước cất, hấp khử trùng 15 phút ở 121°c.

25. H ugh-Leifson Glucose B ro th (HLGB)

Peptone 2g
Cao nấm men 0,5g
NaCl 30 g

206
 Dextrose 10g
Bromocresol purple 0,015g
Agar 3g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar. pH cuo'i là 7,4 ± 0,2. Hấp ở 121°c
trong 15 phút.

26. Indole
L-tryptophan lg
NaCl 1g
K2HP04 3,13g
KH2P04 0,27g
Nước cất 200ml
Hòa tan các thành phần. Phân phối lml vào các ống nghiệm
13 X 100mm có nắp. Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH cuối 7,2 ± 0,2.

27. King’s B
Proteose peptone No. 3 20g
Glycerol 10ml
K2 HPO4 l,5g
MgS04 l,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Cho vào tất cả các thành phần ngoại trừ MgS04. Làm nóng và lắc để
hòa tan agar. Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Thêm MgS04 từ từ và trộn. Phân
phối 4ml vào các ông nghiệm 13 X 100mm. Hấp ở 121°c trong 15 phút.
Nghiêng ông nghiệm.

28. King’s O/F cơ b ản

Môi trường cơ bản
Trypticase (hoặc casitone) 2g
Phenol red, dungdịch 1,5% 2ml
Agar 3g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar. Chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2. Phân phối
100ml vào các bình. Hấp ở 121°c trong 15 phút. Làm nguội đến 50°c.

Carbohydrates , 10%
Hòa tan lOg các carbohydrate trong 100ml nước cất. Lọc vô trùng
qua màng 0 22ụm. Thêm lOml này vào 9Ọml môi trường cơ bản được nấu

207
chảy và trộn. Phân phối một cách vô trùng 3ml vào các ống nghiệm
13 X lOOmm.

29. K ligler Iro n A gar

Polypeptone peptone 20 g
Lactose 20 g
Dextrose lg
NaCl 5g
Ferric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulfate 0,5g
Agar 15 g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar, rót vào các ông nghiệm. Hấp ở
121°c trong 15 phút. pH cuối là 7,4 ± 0,2. Làm ống nghiệm thạch
nghiêng. Đối với Vibrio ưa muối, cho thêm vào môi trường NaCl với nồng
độ khoảng 2-3%.

30. K oser's C itrate B ro th

NaNH 4H P 0 4.4H20 l,5 g
k h 2p o 4 lg
M gS047H20 0,2 g
Sodium citrate.2H20 3g
Nước cất 1 lít
Phân phối vào các ống nghiệm có nắp vặn. Hấp ở 121°c trong 15
phút. pH CUỐI 6,7 ± 0,2.

31. Lactose T ryptone L au ry l S ulphate B roth (LST B roth)

Tryptose hoặc trypticase 20 g
Lactose 5g
k 2h p o 4 2,75g
k h 2p o 4 2,75g
NaCl 5g
Sodium lauryl sulfate 0 ,lg
Nước cất 1 lít
Phân phôi môi trường vào các ống nghiệm có chứa ông Durham. Hấp
khử trùng 15 phút ở 121 °c, pH cuối 6,8 ± 0 ,2 .

208
32. Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)
Tryptose 20 g
Lactose 5g
Sodium chloride 5g
k h 2p o 4 2,75 g
K 2H P 0 4 2,75g
Lauryl sulphate 0 ,lg
Nước cất 1 lít
Hấp ở 121°c trong 15 phút, pH môi trường là 6,8 ± 0 ,2 .

33. L etheen Broth

Peptamin 10 g
Cao thịt 5g
Lecithin 0,7 g
Sorbitan monooleate 5g
NaCl 5g
Nước cất 1 lít
pH 7,0 ± 0,2

L etheen Agar
Cao thịt 3g
Tryptone 5g
Dextrose lg
Agar 15g
Sorbitan monooleate Vg
Lecithine lg
pH 7,0 ± 0,2

L etheen Agar cải b ỉên

Letheen agar (Difco hay BBL) 32g
Trypticase peptone 5g
Thiotone peptone 10 g
Cao nấm men 2g
NaCl 5g
Sodium bisulfite 0 ,lg
Agar 5g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar. Hấp ở 121°c trong 15 phút. Phân
'i một cách vô trùng 20ml vào các hộp petri 15 X 100mm. pH cuối
± 0 ,2 .

209

ấ
36. L etheen B roth cảỉ b ỉên
Letheen Broth 25,7g
Trypticase peptone 5g
Thiotone peptone 10 g
Cao nấm men 2g
Sodium bisulfite 0 ,lg
Nước cất 1 lít
Phân pho'i 90ml vào các lọ có nắp. Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH
cuối 7,2 ± 0,2.

37. L isteria E n ric h m e n t B roth I

Môi trường cơ bản
Proteose peptone 5g
Tryptone 5g
Cao thịt 5g
Cao nấm men 5g
NaCl 20 g
k h 2p o 4 l,35g
Na 2H P 0 4 12 g
Esculin lg
Nước cất 1 lít
Thành phần bổ sung 1
Nalidixic acid 40mg
NaOH 0,05M 10 ml
Hòa tan acid nalidixic trong dung dịch sodium hydroxide. Bổ sung
5 ml thành phần bổ sung 1 vào môi trường cơ bản. Hấp khử trùng 15 phút
ở 121°c, không hấp quá thời gian. Sau khi hấp, làm nguội môi trường
ngay.

Thành phần bổ sung 2

Acriflavine hydrochloride 25mg
Nước cất 10ml
Hòa tan acriflavine hydrochloride trong nước. Vô trùng bằng lọc qua
màng lọc 0 ,2 nm.

Môi trường hoàn chỉnh

Trước khi sử dụng, bổ sung l,lm l thành phần bổ sung 2 vào 225ml
môi trường cơ bản.

210
38. Lỉsterỉa Enrichm ent Broth II
LB II có cùng thành phần với LB I nhưng nồng độ acriflavine cao
hơn: trước khi sử dụng, bổ sung 0 ,lm l thành phần bổ sung 2 vào 10 ml
môi trường cơ bản.

39. Lysine D ecarboxylase (LDC)

(cho vi khuẩn Gram âm không lên men)
L-Lysine HC1 0,5g
Dextrose 0,5g
KH2PO4 0,5g
Nước cất 100 ml
Hòa tan các thành phần. Chỉnh pH đến 4,6 ± 0 ,2 . Hấp ỏ 121°c trong
15 phút. Phân phối lm l một cách vô trùng vào các ông nghiệm
13 X 100mm vô trùng.

40. Lysine Iron Agar (Edwards và Fife)

Gelysate hoặc peptone 5g
Cao nấm men 3g
Glucose lg
L-Lysine hydrochloride 10 g
Ferric ammonium citrate 0,5g
- Sodium thiosulfate (khan) 0,04g
Bromocresol purple 0 ,02 g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Làm nóng để hòa tan các thành phần. Phân phối 4ml vào các ông
nghiệm 13 X 100mm có nắp vặn. Hấp ở 121°c trong 12 phút. Để nghiêng
ông nghiệm. pH CUÔ1 6,7 ± 0,2.

41. Lysozyme Broth

Chuẩn bị môi trường Nutrient Broth bình thường, hấp khử trùng 15
phút ở 121°c.
Dung dịch Lysozyme
Hòa 0 ,lg lysozyme trong 65ml HC1 0,01 N vô trùng. Đun sôi trong 20
phút. Hòa đến thể tích 100 ml bằng HC1 0,01 N.
Có thể thực hiện bằng phương pháp khác: hòa 0 ,lg lysozyme trong
100ml nước cất. Khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc Q,45ụm.
BỔ sung lm l dung dịch lysozyme vào 99ml Nutrient Broth. Trộn đều
rồi chia nhỏ vào các ống nghiệm vô trùng.

211

i
42. M acConkey Agar
Proteose peptone hoặc polypeptone 3g
Peptone hoặc gelysate 17g
Lactose lOg
Muôi mật No. 3 hoặc hỗn hợp muối mật l,5g
NaCl 5g
Neutral red 0,03g
Crystal violet 0,00 lg
Agar 13,5g
Nước cất 1 lit
Đun sôi 1-2 phút và lắc để hòa tan các thành phần môi trường. Hấp
ở 121°c trong 15 phút, để nguội đến 45-50°C và đổ 20ml vào hộp petri
15 X 100mm vô trùng. Làm khô ở nhiệt độ phòng. Không sử dụng đĩa ướt.
pH cuối 7,1 ± 0,2.

43. M alonate Broth

Cao nấm men lg
(NH 4)2s o 4 2g
k 2h p o 4 0 ,6 g
KH2P 04 0,4g
NaCl 2g
Sodium malonate 3g
Glucose 0,25g
Bromthymol blue 0,025g
Nước cất 1 lít
Hòa tan bằng cách gia nhiệt, nếu cần. Phân phối 3ml vào các ống
nghiệm 13 X 100mm. Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH cuối 6,7 ± 0,2.

44. M alt E xtract Agar

(Cosmetics-General Microbiology)
Cao malt 30g
Agar 20 g
Nước cất 1 lít
Đun sôi để hòa tan các thành phần. Tránh làm nóng quá mức, nó sẽ
làm mềm agar và làm đen môi trường. Hấp ở 121°c trong 15 phút. Phân
phối 20-25ml vào các đĩa peri 15 X 100mm vô trùng. pH cuối 5,5 ± 0,2.

Sử đụng cho mỹ phẩm

Làm nguộị môi trường đến 47-50°C sau khi hấp vô trùng. Phân phối
4ml dung dịch chlortetracycline HC1 (lg/100ml) vô trùng cho 1 lít môi

212
\
trường để có nồng độ cuối là 40 ppm chlorotetracycline HC1. Trộn đều và
phân phôi 20ml vào các petri 15 X 100mm.

45. M annỉtoỉ Salt Agar

Cao thịt lg
Polypeptone 10 g
NaCl 75g
Mannitol 10 g
Phenol red 0,025g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar và đun sôi 1 phút. P hân phôi 20ml
vào trong các đĩa petri 15 X lOOmm. Hấp ở 121 °c trong 15 phút. pH cuối
7,4 ± 0,2.

46. M otỉlỉty-Indoỉe-Ornỉthỉne (MIO)

Cao nấm men 3g
Peptone 10g
Tryptone 10g
L-Omithine HC1 5g
Dextrose lg
Agar 2g
Bromocresol purple 0 ,02 g
Nước cất 1 lít
P hân phối 4ml vào các ống nghiệm 13 X 100mm. Hấp ở 121°c trong
15 phút. pH cuốỉ 6,5 ± 0,2.

47. M otility N itrate

(Dùng cho các mỹ phẩm )
(Dùng cho vi khuẩn Gram âm không lên men)

Tryptose 10g
H eart infusion agar (Difco) ổg
Potassium (/sodium) nitrate lg
Glucose 0,5 g
Nước cất 1 lít

Làm nóng và lắc để hòa ta n agar. P h ân phối 4ml vào các ống
nghiệm 13 X 100mm có n ắp vặn. H ấp Ở121°c trong 15 phút.

213
48. MR-VP Broth
Môi trường 1
Buffered peptone-water powder
(Difco hoặc BBL) 7g
Glucose 5g
K 2H PO 4 5g
Nước cất 1 lit

Môi trường 2
Casein Pancreatic Digest 3,5 g
Peptic digest of animal tissue 3,5g
Dextrose 5g
Potassium phosphate 5g
Nước cất 1 lit
Hòa tan các thành phần trong nước, làm nóng nhẹ nếu cần. Phân
phối 10ml vào các ống nghiệm 16 X 150mm và hấp vô trùng ở 118-121°c
trong 15 phút. pH cuối 6,9 ± 0 ,2 .

Môi trường 3
Peptone 5g
Glucose 5g
Phosphate buffer 5g
Nước cất 1 lit
Hòa tan các thành phần trong nước. Phân phôi 10 ml vào các ống
nghiệm 16 X 150mm và hâp ở 121°c trong 15 phút. pH cuối 7,5 ± 0,2.
Đốì với Salmonella: Phân phôi 10ml vào các ống nghiệm 16 X 150mm
và hấp ở 121°c trong 12-15 phút.
Để sử dụng cho các Vibrio spp. chịu mặn, thêm NaCl đến nồng độ
cuối 2-3%.

49. MYP cho B. cereu s

Cao th ịt lg
Pepton 10 g
M annitol lOg
NaCl 10 g
Phenol red (1% trong ethanol 90%) 2,5ml
Agar 15g
Nước cất 900ml
pH 7,2 ± 0 ,2 . Khử trùng 15 phut, 121°c. Để nguội đến 50°c.

214
 Dung dịch Polymixin B 0,1%
Hòa tan 500 000 đơn vị polymixin B sulfate trong 50ml nước cất. Lọc
vô trùng và cất trong tốì ở 4°c cho đến khi dùng.
Egg yolk emulsion 50%
Sản phẩm thương mại.

Môi trường cuối cùng

Bổ sung 2,5m1 dung dịch polymixin B vàl2,5m l lòng đỏ trứng (egg
yolk emulsion) vào 225ml môi trường đã khử trùng và để nguội đến 50°c.
Trộn đều và đổ vào các đĩa petri.

50. N itrate Broth

Cao thịt 3g
Peptone 5g
kno3 1g
Nước cất 1 lít
Khử trùng 15 phút, 121°C; pH cuo'i 7,0 ± 0 ,2 .

51. N itrate Broth, làm giàu (CDC)

Infusion Broth 25g
K N 0 3 (không có nitrite) 2g
Nước cất 1 lít
Phân phối 4ml vào trong các ống nghiệm 13 X 100mm có ống
Durham đảo ngược. Hấp ở 12 rc trong 15 phút. pH cuối 7,3 ± 0 ,2 .

52. N utrient G elatin (CDC)

(dùng cho các vi khuẩn Gram âm không lên men)

Infusion Broth 25g

Gelatin 120 g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan. Để nguội đến 55°c và chỉnh pH đến
7,4 ± 0,2. Phân phối 4ml vào các ống nghiệm 13 X 100mm có nắp vặn.
Hấp ỏ 121 °c trong 15 phút.

53. Oxford Agar

Môi trường cơ bàn
Columbia blood agar base 39 g
Esculin lg
Ferric ammonium citrate 0,5g

215
 Lithium chloride 15g
Nước cất 1 lít
Dung dịch bổ sung
Cycloheximide 400mg
Colistin sulfate 20 mg
Acriflavin 5mg
Cefotetan 2 rag
Fosfomycin lOmg
Ethanol 5ml
Nước cất 5ml
Hòa tan các thành phần trong hỗn hợp ethanol/nước. Vô trùng bằng
cách lọc qua màng lọc 0 ,2 |im.

Môi trường hoàn chỉnh

Hòa tan thành phần môi trường cơ bản trong nước bằng cách đun
cẩn thận cho đến sôi. Điều chỉnh pH sao cho pH sau khi hấp là 7,0 ± 0,2.
Khử trùng 15 phút ở 121°c. Để nguội môi trường đến 45 - 50°c, bổ sung
vô trùng dung dịch bổ sung (10ml) vào, trộn đều, đổ vào đĩa petri. Gói đĩa
và để trong tôi, giữ ở 4°c không quá 2 tuần.

54. P h en ol R ed Carbohydrate Broth

Trypticase hoặc proteone peptone No. 3 10g
NaCl 5g
Cao thịt (lựa chọn) 1g
Phenol red
(7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g
Nước cất 1 lít
Carbohydrate *
(Có thể dùng 5g dulcitol, hoặc lOg lactose, hoặc lOg sucrose - nhất là
đối với thử nghiệm Salmonella - trong môi trường cơ bản trên)
Rót 2,5ml môi trường vào các ống nghiệm chứa ống Durham kiểm
tra sự lên men. Hấp ở 118°c trong 15 phút. pH cuốỉ là 7,4 ± 0 ,2 .
Hòa tan carbohydrate trong 200ml nước cất, khử trùng bằng cách lọc
qua màng lọc. Thêm 0,5ml dịch lọc vô trùng vào mỗi ông nghiệm môi
trường đã khử trùng, lắc đều.
Đối với giông Vibrio spp. ưa muối, thêm NaCl sao cho nồng độ cuối
đạt 2 - 3%.

216
55. P h enylalanine D eam inase Agar
Cao nấm men 3g
L-Phenylalanine lg
D ir Phenylalanine 2g
Na 2H P0 4 1g
NaCl 5g
Agar 12g
Nước cất 1 lit
Làm nóng nhẹ để hòa tan agar. Phân phối vào các ống nghiệm và hấp
ở 121°c trong 10 phút. Đặt nghiêng các ống nghiệm. pH cuối 7,3 ± 0,2.

56. P o tato D extrose A gar

Potato infusion 200 g
Dextrose 20 g
Agar 20 g
Nước cất H it
Để chuẩn bị nước chiết khoai tây, đun sôi 200g lát cắt khoai tây
không gọt vỏ trong 1 lít nước cất trong 30 phút. Lọc qua vải mỏng. Trộn
trong các thành phần khác và đun sôi để hòa tan. Hấp ở 121°c trong 15
phút. Phân phôi 20-25ml vào trong các đĩa petri 15 X 100mm vô trùng.
pH cuối 5,6 ± 0 ,2 .
Môi trường không nên ỉàm tan trở lại nhiều hơn 1 lần. Đối với
potato dextrose salt agar, chuẩn bị potato dextrose agar như trên và thêm
75g NaCl cho 1 lít.

57. Pseudom onas A gar F

Proteose peptone No. 3 (Difco) 20 g
Tryptone (Difco) lOg
Dipotassium phosphate l,5g
Magnesium sulfate 0,73g
Glycerol (Difco) lOg
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Cho các thành phần môi trường vào nước, trộn. Đun sôi để hòa tân
các thành phần. Hấp ở 121 °c trong 15 phút. pH cuối 7,0.

58. Pseudom onas A gar p

Peptone (Difco) 20g
Potassium sulfate 10g

17-PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĨÍCH. 217

 Magnesium chloride 1,4g
Glycerol (Difco) lOg
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Chuẩn bị như được mô tả cho Pseudomonas Agar F.

59. R a p p a p o rt-V a ssỉlỉa d ỉs

Môi trường cơ bản
Tryptone 5g
NaCl 8g
KH 2P 0 4 l , 6g
Nước cất 1 lít

Dung dịch Magnesium chloride

MgCl2.6H20 400g
Nước cất 1 lít

Dung dịch Malachite green oxalate

Malachite green oxalate 0,4g
Nước cất 100 ml

Môi trường hoàn chỉnh

Môi trường cơ bản 1000ml
Dung dịch MgCl2 100 ml
Dung dịch Malachite green oxalate 10ml
Tổng thể tích 1110ml
Môi trường cơ bản phải được chuẩn bị cùng ngày kết hợp các thành
phần để có môi trường hoàn chỉnh. Vì MgCl2 hút ẩm rất mạnh và nồng
độ chính xác của MgCl2 trong môi trường RV là rất quan trọng nên hòa
tan hết lượng MgCl2 trong lọ mới mở vào nước cất. Dung dịch MgCỈ2 giữ
trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 1 nàm. Dung dịch Malachite
green oxalate giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng.
Phân phối 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào ống nghiệm. Hấp khử
trùng ở 115°c, 15 phút. pH cuối 5,5 ± 0,2. Giữ trong tủ lạnh và sử dụng
trong vòng 1 tháng.

Môi trường này nên chuẩn bị từng thành phần riêng biệt. Không
nên sử dụng môi trường thương mại dạng khô. Môi trường thương mạỉ
dạng khô cũng giữ trong tỏ lạnh (4 - 8 °C), thời gian 1 tháng.

218
60. Sabouraud's D extrose Broth và Agar
Polypeptone hoặc neopeptone lOg
Dextrose 40g
Nước cất 1 lít
Hòa tan hoàn toàn và phân phôi 40ml vào các lọ có nắp vặn. pH cuối
5,8. Hấp vô trùng ở 118-121°c trong 15 phút. Không vuợt quá 121°c.
Đối với Sabouraud’s Dextrose Agar, chuẩn bị môi trường lỏng như
trên và thêm 15-20g agar. pH cuôì 5,6 ± 0,2. Phân phối vào trong các ông
nghiệm để làm thạch nghiêng hoặc vào các lọ để đổ vào đĩa petri. Hấp vô
trùng ở 118-121°c trong 15 phút.

61. Simmons Citrate Agar

Sodium citrate 2g
NaCl 5g
k 2h p o 4 lg
n h 4h 2p o 4 lg
MgSŨ4 0 ,2 g
Bromothymol blue 0,08 g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1-2 phút cho đến khi hòa
tan. Phân phối vào 1/3 ông nghiệm có nắp 13 X 100 hoặc 16 X 150mm.
Hấp ở 121°c trong 15 phút. Đặt nghiêng ống nghiệm. pH cuối 6,8 ± 0,2.

62. Starch Agar

Nutrient agar 23g
Tinh bột khoai tây lOg
Nước cất 1 lít
Làm nóng để hòa tan agar trong 500ml nước. Hòa tan tinh bột trong
250ml nước. Kết hợp và pha loâng đến 1 lít. Hấp ở 121°c trong 15 phút.

63. T etrathỉonate Broth (TT)

Môi trường cơ bản
Polypẹpton 5g
Muôi mật lg
CaC0 3 10 g
Sodium thiosulfate.5 H 20 30g
Nước cất 1 lit

219

í
 Hòa tan các chất trong 1 lít nước cất, đun sôi, không hấp khử trùng
(cặn sẽ không hòa tan hoàn toàn). pH 8,4 ± 0,2. Giữ ở 5 - 8°c.

Dung dịch Iodine-Potassium Iodide (I2‘KI)

Potassium iodide 5g
Iodine tinh thể 6g
Nước cất vô trùng 20ml
Hòa tan Potassium iodide trong 5ml nước câ't vô trùng. Thêm iode
vào và khuấy cho tan. Pha thành 20ml.

Dung dịch B rillian t green

Thuốc nhuộm Brilliant green 0 ,lg
Nước cất vô trùng 100 ml
Đến lúc sử dụng, thêm 20ml dung dịch Ỉ2-KI và 10ml dung dịch
brilliant green vào 1 lít môi trường cơ bản. Hòa tan các chất và phân
phôi vô trùng vào các ông nghiệm đã khử trùng. Không làm nóng môi
trường sau khi dã thêm I2-KI và thuốc nhuộm vào.

64. T hỉosulfate-C ỉtrate-B ỉle Salts-Sucrose (TCBS) Agar

Cao nấm men 5g
Peptone 10 g
Sucrose 20 g
Sodium thiosulfate.75H20 10 g
Sodium citrate. 72H20 10 g
Sodium cholate
Ệ 3g
Oxgall 5g
NaCl 10 g
Ferric citrate lg
Bromothymol blue 0,04g
Thymol blue 0,04 g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Chuẩn bị trong erlen có thể tích lớn hơn ít nhất là 3 lần so với thể
tích cần dùng. Cho các chất vào nước cất dã làm ấm và đun nóng để hòa
tan. Chỉ để vừa sôi rồi nhấc ra ngay. Không hấp khử trùng. Để nguội đến
50°c rồi đổ đĩa.

220
 65. Triple Sugar Iron Agar (TSI)
Môi trường 1 Môi trường 2
Polypeptone 20 g Cao thịt 3g
Na C1 5g Cao nấm men 3g
Lactose 10g Peptone 15 g
Sucrose 10g Proteose peptone 5g
Glucose lg Glucose lg
Fe(NH 4)2(S 04 )2.6 H20 0,2 g Lactose 10 g
Na 2s 20 3 0 ,2 g Sucrose 10g
Phenol red 0,025g FeS0 4 0,2 g
Agar 13g NaCl 5g
Nước cất 1 lít Na 2S 203 0,3 g
Phenol red 0,024g
Agar 12 g
Nước cất 1 lit

Hai môi trường này có thể thay đổi cho nhau để sử dụng.
Huyền phù hóa các thành phần của môi trường 1 trong nước cất,
trộn đều, đun nóng và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi khoảng 1 phút để hòa
tan các thành phần. Phân phối môi trường đến 1/3 ông nghiệm
16 X 150mm có nắp để duy trì điều kiện hiếu khí. Hấp môi trường 1 ở
118°c trong 15 phút.
Chuẩn bị môi trường 2 theo như cách của môi trường 1 và hấp ở
121°c trong 15 phút. Nghiêng các ống nghiệm để có 4-5 cm mặt nghiêng
và 2-3 cm cách nắp. pH cuối 7,3 ± 0,2 cho môi trường 1 và 7,4 ± 0,2 cho
môi trường 2 . Để sử dụng cho các Vibrio spp. chill mặn, thêm NaCl đến
nồng độ cuối là 2-3%.

66. Trypticase (Tryptic) Soy Agar (TSA)

Trypticase peptone 15g
Phytone peptone 5g
NaCl 5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Đun nóng để hòa tan agar, phân phối vào các erlen. Hấp khử trùng
15 phút ở 121 °c. pH cuôì 7,3 ± 0 ,2 . Để sử dụng cho các chủng Vibrio spp.
ưa muối, cộng thêm NaCl vào để nồng độ cuối đạt 2 - 3 %.

221

L
67. T rypticase (Tryptic) Soy Broth
Trypticase peptone 17g
Phytone peptone 3g
NaCl 5g
K2H P 0 4 2,5g
Glucose 2,5g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc nhẹ để hòa tan. Phân phối 225ml vào các bình
erlen 500ml. Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH cuối 7,3 ±0, 2. Đôi với môi
trường trypticáse soy Broth không có dextrose (còn gọi là glucose), chuẩn
bị như trên, nhưng không thêm 2,5g dextrose. Để sử dụng cho các Vibrio
spp. chịu m ặn, th êm NaCl đến nồng độ cuối là 2-3%.

68. T rypticase Soy - Polym ixin Broth

Chuẩn bị môi trường Trypticase Soy Broth đã khử trùng.

Dung dịch Polymixin B solution Of15%

Hòa 500 000 đơn vị polymixin B trong 33,3ml nước cất. Lọc vô trùng
và giữ trong tối ở 4°c cho đến khi dùng. Trước khi sử dụng, thêm 0 ,lm l
polymixin B 0,15% vô trùng vào 15ml môi trường Trypticase Soy Broth và
trộn đều.

69. Tryptone (Tryptophane) Broth, 1%

Tryptone hoặc trypticase lOg
Nước cất 1 lít
Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH 6,9 ± 0,2.

70. nước Tryptone (Tryptọne Water)

Tryptone hoặc trypticase 20 g
Nước cất 1 lít
Chỉnh pH đến 7,3 ± 0 ,2 . Phân phôi 4ml vào các ống nghiệm
13 X lOOmm. Hấp ở 121°c trong 15 phút. pH cuối 7,2 ± 0,2.

71. Urea Broth

Urea 20g
Cao nấm men 0 ,lg
Na 2HPG4 9,5g
K2HPO4 9,1 g
Phenol red 0,01g
Nước cất 1 lít
 pH cuối 6,8 ± 0 ,2 . Hòa tan các thành phần trong nước cất. Không
đun nóng. Vô trùng bằng lọc qua màng lọc 0,45 ụm. Phân phối vào các
ống nghiệm vô trùng.

72. Urea Broth R ustỉgỉan - Stuart (Rustigian - Stuart's Urea Broth)

Cao nấm men 0 ,lg
Urea 20g
KH2P 0 4 9,1g
Na2HPO 4 9,5 g
Phenol red 0,0lg
Nưóc cất 1 lít
Môi trường cơ bản không chứa urea được hòa tan trong 4/5 của tổng
dung tích nước cần thiết và hấp khử trùng ở 121°c trong 15 phút. Dung
dịch urea 10% được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng và 1/5
của tổng dung tích được bổ sung vào môi trường cơ bản đă hấp khử trùng
và làm nguội. Môi trường đầy đủ được phân thành 3ml vào trong các ống
nghiệm vô trùng.

73, Ưrea rắn C hristensen (Christensen's Urea Agar)

Pepton 1*
NaCl 5g
k h 2p o 4 2g
Glucose
Urea 20g
Phenol red 0,012g
Agar 15g
Nước cất 1 lit
Môi trường cơ bản không chứa urea được hòa tan trong 4/5 của tổng
dung tích nước cần thiết, đun cho tan agar và hấp khử trùng ở 121°c
trong 15 phút. Dung dịch urea 10% được khử trùng bằng cách lọc qua
màng lọc vô trùng và 1/5 của tổng dung tích được bổ sung vào môi trường
cơ bản đã hấp khử trùng và làm nguội đến 55°c. Lắc đều. Môi trường đầy
đủ được phân thành 4 - 5ml vào trong các ông nghiệm vô trùng, đặt trên
một giá đỡ để tạo mặt thạch nghiêng.

74. Violet R ed B ile A gar (VRBA)

Cao nấm men 3g
Peptone hoặc gelysate 7g
NaCl 5g
Muôi mật 1,5g
Lactose 10g

223
 Neutral red 0,03g
Crystal violet 0 ,002 g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh về pH 7,4 ± 0 ,2 . Đun
sôi trong 2 phút, không hấp khử trùng. Sử dụng làm môi trường đổ đĩa.

75. V ogel-Johnson (VJ) Agar (M176)

Trypticase lOg
Cao nấm men 5g
Mannitol lOg
K2H P 0 4 5g
Lithium chloride 5g
Glycine 10g
Phenol red 0,025g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Làm nóng và lắc để hòa tan agar. Hấp ở X21°c trong 15 phút. Làm
nguội đến 50°c. Thêm 20 ml dung dịch Chapman tellurite 1%. Trộn và đổ
vào đĩa. pH cuô'i 7,2 ± 0,2.

76. Xylose Lysine D esoxycholate (XLD) Agar

Cao nấm men 3g
Lrlysine 5g
Xylose 3,75g
Lactose 7,5g
Sucrose 7,5g
Sodium desoxycholate 2,5g
Ferric ammonium citrate 0 ,8 g
Sodium thiosulfate 6 ,8 g
NaCl 5g
Agar 15g
Phenol red 0,08g
Nước cất 1 lít
pH cuối 7,4 ± 0,2. Đun sôi môi trường. Không hấp. Để nguội đến
50°c rồi đổ đĩa. Không giữ quá 1 ngày.

77. Y east E xtract (YE) Agar

Proteose peptone 10g
Cao nấm men 3g

224

I
 NaCl 5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
Chỉnh pH đến 7,2-7,4. Hấp ở 121°c trong 15 phút.

78. Thuốc thử Catalase

Dung dịch 3% H 20 2 (hydrogen peroxide)

79. Thuốc thử Erlich

p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) 2g
Ethanol tuyệt đôi 190ml
HC1 đậm đặc 40ml
Hòa tan p-DMABA trong cồn tuyệt đôi, bổ sung và khuấy từng phần
nhỏ HC1 cho đến khi dủ lượng. Thuôc thử được chứa trong chai màu tối
tránh ánh sáng ở 4°c.

80. Thuốc thử Kovacs

p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) lOg
Isoamyl alcohol 150ml
HC1 đậm đặc 50ml
Hòa tan p-DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ
HC1 cho đến khi đủ lượng. Thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh
ánh sáng ở 4°c. Có thể thay th ế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc
butanol.

81. Thuốc thử M ethyl red

Methyl red 0 , 10 g
Ethanol 95 % 300ml
Nước cất (đủ) 500ml
Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ thể
tích 500ml.

82. Thuốc th ử nhuộm G ram

Phưtmg ph áp Jensen
~ Đung dịch 0,25% methyl violet trong nước cất.
- Dung dịch iodine - potassium iodide: hòa tan 2 g KI trong 20ml
nước cất. Bổ sung Ig iodine dã nghiền nhuyễn, dể qua đêm. Thêm nước
cất cho đủ 300mỉ.
- Dung dịch safranin : 1% safranin (hoặc 1% neutral red) trong nước
cất.

225
 Phương ph á p Hueker
- Dung dịch crystal violet: hòa tan 2g crystal violet vào 20ml ethanol
95%. Hòa tan 0,8g ammonium oxalate trong 80ml nước cất. Trộn chung
hai hỗn hợp này với nhau, để yên 24 giờ, lọc.
- Dung dịch iodine - potassium iodide: hòa tan 2g KI trong 20ml
nước cất. Bổ sung lg iodine đã nghiền nhuyễn, để qua đêm. Thêm nước
cất cho đủ 300ml.
- Dung dịch safranin: nghiền 0,25g safranin trong cối sứ với 10 ml
ethanol 95%. Chuyển vào ống đong, rửa bằng nước cất và thu gộp nước
rửa vào ống dong. Bổ sung nước cất cho đủ 100ml.

83. T huốc th ử nhuộm tỉê n mao

Dung dịch 1 (thành phần trong lOOmỉ)
Bột tannic acid lOg
Dung dịch 5% phenol trong nước 50ml
Dung dịch bão hòa aluminium potassium sulphate (12H 20 ) 50ml
Dung dịch 2
12% crystal violet trong cồn 95%
Thuốc nhuộm được chuẩn bị 3 ngày trước khi dùng bằng cách trộn 10
phần của dung dịch 1 với 1 phần của dung dịch 2 .

84. Thuốc thử p h át h ỉệ n n ỉ tri te

Dung dịch acid sulfanilic (dung dịch A)
Acid sulfanilic lg
Acid acetic 5N 125ml
Dung địch N-(l-naphthyl)ethylenediamine (dung dịch B)
N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride 0,25g
Acid acetic 5N 200ml
Dung dịch cc-Naphthol (dung dịch C)
oc-Naphthol lg
5N acetic acid 200ml
(Chuẩn bị acid acetic 5N bằng cách cho 28,75ml acid glacial acetic
vào 71,25ml nước cất vô trùng).
Trữ những dung dịch trên trong chai thủy tinh màu tối.

226
 BẢrtỉà TRA MPN
BẢ N G TR A M P N D Ù N G CHO L O Ạ T 3 Ố n g N G H IỆ M Ở 3 N ồ N G ĐỘ
P H A LO Ẵ N G L IÊ N T IẾ P

SỐ lượng ống Số lượng ống

dương tính Số dương tính Số
MPN/ MPN/
S ố ml mẫu sử dụng S ố ml mẫu sử dụng
100ml 100ml
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 - 2 0 0 9
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 . 0 * 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
/
2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 -

227
 B Ả N G TR A M P N D Ù N G C H O L O Ạ T ồ ỔNG N G H IỆ M Ở 3 N ồ N G ĐỘ
P H A LO Ã N G L IÊ N T IẾ P
...

SỐlượng Ống Số lượng ống

dương tính SỐ dương tính SỐ
SỐ ml mẫu sử dụng
MPN/ S ố ml mẫu sử đụng
MPN/
100ml lOOmỉ
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 0 4 0 2 20
0 0 1 2 4 0 3 25
0 0 2 4 4 1 0 17
0 1 0 2 4 1 1 20
0 1 1 4 4 1 2 25
0 1 2 6 4 2 0 20
0 2 0 4 4 2 1 25
0 2 1 6 4 2 2 30
0 3 0 6 4 3 0 25
1 0 0 2 4 3 1 35
1 0 1 4 4 3 2 40
1 0 2 6 4 4 0 35
1 0 3 8 4 4 1 40
1 1 0 4 4 4 2 45
1 1 1 6 4 5 0 40
1 1 2 8 4 5 1 50
1 2 0 6 4 5 2 55
1 2 1 . 8 5 0 0 25
1 2 2 10 5 0 1 30
1 3 0 8 5 0 2 45
1 3 1 10 5 0 3 60
1 4 0 11 5 0 4 75
2 0 0 5 5 0 35
2 0 1 7 5 1 1 45
2 0 2 9 5 1 2 65
2 0 3 12 5 1 3 85
2 1 0 7 5 1 4 115
2 1 1 9 5 2 0 50
2 1 2 12 5 2 1 70
2 2 0 9 5 2 2 95
2 2 1 12 5 2 3 120
2 2 2 14 5 2 4 150
2 3 0 12 5 2 5 ””1 175

228
2 3 1 14 5 3 0 80
2 4 0 15 5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 175
3 0 2 13 5 3 4 200
3 1 0 11 5 3 5 250
3 1 1 14 õ 4 0 130
3 1 2 17 5 4 1 170
3 1 3 20 5 4 2 225
3 2 0 14 5 4 3 275
3 2 1 17 5 4 4 350
3 2 2 20 5 4 5 425
3 3 0 17 5 5 0 250
3 3 1 20 5 5 1 350
3 4 0 20 5 5 2 550
3 4 1 25 5 5 3 900
3 5 0 25 5 5 4 1600
4 0 0 13 5 5 5 1800
4 0 1 17 - - - -

229
 TÀI LIỆU THAM KHÀO

1. BRUCE A. WHITE, PCR Protocol, Humana Press, New Jersey, 1993,

2. COLLINS, LYNE, Microbiological Methods, 7th ed., Butterworth - Heinemann
Ltd., Great Britain, 1995.
3. Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology, Difco Manual, 10th
ed., Difco Laboratories, USA, 1984.
4. GEORGE A. WISTREICH, Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications,
Prentice Hall, Inc., USA, 1997.
5. HÓ HƯỲNH THỪY DƯƠNG, Sinh học phân tử; NXB Giáo Dục, 1997.
6. HUGH G. GRIFFIN, ANNETTE M. GRIFFIN, PCR Technology Current Innovations,
CRC Press, 1994.
7. I. EDWARD ALCAMO, Fundamentals of Microbiology, 3th ed., The
Benjamin/Cummings, 1991.
8. JEAN F.MC FADDIN, Biochemical Test for Identification of Medical Bacteria, 2nd
ed., Williams & Wilkins, 1980.
9. JOHNSON CASE, Laboratory Experiments in Microbiology, 4th ed., The
Benjamin/Cummings, 1995.
10. LÊ ĐÌNH HỬNG, Đại cương về Phương Pháp Kiểm Tra Vị Sinh Vật Thực Phẩm,
Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng khu vực III, Tp. Hồ Chí Minh,
1998.
11. Microbiology Manual, Merck, 1998.
12. Nordic Committee on Food Analysis (NMKL)
13. P.J QUINN, M.E. CARTER, B.K. MARKEY, G.R. CARTER, Clinical Verterinary
Microbiology, Mosby, 1994.
14. PHẠM HỪNG VÂN, cẩm Nang Các Kỹ Thuật Xét Nghiệm Vi Sinh Lâm Sàng ,
Trường ĐH Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, 2000.
15. PELCZAR, CHAN, Laboratory Exercises in Microbiology, 4th ed., McGraw-Hill
Book, Inc., USA, 1977.
16. Rapid Methods in Microbiology and Biotechnology, UNESCO Southeast Asia
Regional Trailing Workshop, Kasetsart University, Bangkok, Thailand, 1994.
17. ROBER A. SAMSON, ELLEN s. HOEKSTRA, JENS c. FRISVAD, OLE FILTENBORG,
Introduction to Food-borne Fungi, 4th ed., Wageningen, the Netherland, 1990.
18. RONALD M. ATLAS, LAWRENCE c. PARKS, ALFRED É. BROWM, Laboratory
Manual of Experimental Microbiology, Mosby-Year Book, Inc., USA, 1995.
19. Standard Organisms & Results, HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., India, 1996.

230
20. STEPHEN A. NORRELL, KAREN E. MESSLEY, Micobiology Laboratory Manual,
Principles an d Applications, Prentice Hall, 1997.
21. Tiêu chuẩn Việt Nam các số 6189 (1;2), 6187 (1;2), 6191 (1;2). 6404.
22. TRẦN LINH THƯỚC (chủ biên ), Thực Tập Vi Sinh Vật Học, N XB Đ ại học Quốc
gia Tp. Hồ Chí Minh, 2001.
23. w. ANDREWS, Manual of Food Quality Control Microbiological Analysis, 4. Rev.l,
FAO Food and Nutrition Paper, Rome, 1992.

Tài liệu tham khảo Internet

http://seafood.ucdavis.edu/haccp/compendium/compend>htin
http://seafood.ucdavis.edu/organize/rapid.html
http://vm.cfsan.fda.gov/~mow/intro.html
http://www.ag.iastate.edu/departmen.t8/foodsci/classes/fshn420/bcereu3.htm
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html
http://www.epa.gov/OGWDW/certlab/ĩabfront.html#toc
http://www.neogen.com/isogridgen.htm
http ://www. siue.edu/~cbwil so/250graphics 00. htm

231
 Chịu trách nhiệm xuất bản :
Chủ tịch HĐQT kiêm Tổng Giám đốc NGÔ TRÂN ÁI
Phó Tổng Giám đốc kiêm Tổng biên tập NGUYÊN QUÝ THAO

Chịu trách nhiệm xuất bản :

Phó Tổng G iá m đốc kiêm Giám đốc NXBGD tại TP. Hồ Chí Minh
v ữ BÁ HOÀ

Biên tập lẩn đầu :

TRẦN MINH HƯƠNG
Bỉên tập kĩ th u ật:
TRAN THÀNH TOÀN
Trình bày bìa và biên tập m ĩ thuật :
VÕ THANH HÙNG
Sửa bản ỉn :
MINH HƯƠNG
Sắp chữ t ạ i :
PHÒNG SCĐT - NXBGD TẠI TP. Hồ CHÍ MINH

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỞC,

THỰC PHẨM VÀ Mĩ PHẨM
Mã số: 7K49917 - DAI
In 1.500 bản, khổ 16 X 24 cm tại Công ty cổ phần in Sách giáo khoa tại TP - Hà Nội.
Số xuất bản: 11-2007/CXB/270-2119/GD. In xong và nộp lưu chiểu tháng 3 năm 2007.

232