Công Nghệ Nguyên Liệu Sinh Học 55 (l99fi) 167
— 170
EL SE VIE R
0 9 6 0 - 8 5 2 4 (9 5) 0 0 1 9 4 - 8
TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG TIỆN LIOUID ĐỂ SẢN XUẤT MÔI
BẰNG CANDIDA RUGOSA
Sailas Benjamin & Ashok Pandey *
Đơn vị công nghệ sinh học, Phòng thí nghiệm nghiên cứu khu vực, CounCil of Sciennfic & Industrial Research, Trivandrum
h9ñ 019, Ấn Độ
(Nhận ngày 8 tháng 7 năm 1995; sửa đổi ngày 30 tháng 11 năm 1995; chấp nhận ngày 6 tháng 12 năm 1995)
trừu tượng
Các nghiên cứu được thực hiện về sản xuất lipase
bằng cách Can- dida rugosa Men được trồng trong
môi trường Universal Yeast. Việc bổ sung dầu ô liu
vào môi trường này đã gây ra sự sản sinh lipase và ở
nồng độ 10% (vlv) thu được 9,36 Ulml enzyme. Thay
thế glucose bằng maltose cải thiện hơn nữa sản lượng
lipase. Enzyme maxi-mum (J2,5J U / ml) thu được khi
C. rugosa được nuôi cấy trong môi trường Universal
Yeast bổ sung urê (0,1%), maltose (1%), dầu ô liu
(10Wo, vlv) và các khoáng chất và ủ trên máy lắc
quay (180 vòng / phút) ở 30 1 ° C trong 72 h. Bản
quyền fi 7996 Elsevier Science Ltd.
Từ khóa: Candida nigosa, lipase, dầu ô liu, quá trình
lên men phụ.
GIỚI THIỆU
Sự thủy phân chất béo trung tính qua trung gian lipase
có hiệu quả về mặt chi phí hơn so với các phương tiện
vật lý thông thường (Macrae & Hammond, 1985).
Một quy trình enzym có vẻ hấp dẫn vì trong khi yêu
cầu về vốn và năng lượng của nó ở mức vừa phải, các
axit béo không ổn định bị phân hủy tối thiểu nhờ các
thông số quy trình nhẹ và do đó độ thu hồi của các sản
phẩm cuối cùng sẽ cao hơn và sản phẩm có chất lượng
vượt trội ( Kaur và cộng sự, 1993). Lipase đã được
tìm thấy trong các vi sinh vật khác nhau và các bằng
sáng chế liên quan đến các ứng dụng của các enzym
này đã được báo cáo trước đây (Papaparaskevas et al.,
1992). Trong số các loại nấm men, Candida mgosa
được xác định là sinh vật tạo lipase mạnh (Yamada ct
al., 1963; Rao ct al., 1993; Virto ef al., 1994).
Tính ưu việt của quá trình lên men chìm (SmF) so
với quá trình lên men ở trạng thái rắn (SSF) đang phát
triển để nuôi cấy C. rugosa đã được thảo luận
*Tác giả mà phù hợp thì nên được gắn địa chỉ. Địa chỉ
hiện tại: Laboratoire de Microbiologie et Généti- que,
Université Louis Pasteur, CNRS URA n ° D1481,
67083, Strasbourg, Pháp.
167
0 199h Elsevier Science Limited
In ở Anh. Đã đăng ký Bản quyền
(J960-5524 / 96 $ 15,0 (Tôi
(Yamada và cộng sự, 19G3; Valero và cộng sự,
1991). Các điều kiện lên men để sản xuất lipase ngoài
tế bào bởi các tế bào C. rugosa tự do trong nuôi cấy
nghi ngờ đã được nghiên cứu trước đây. Người ta kết
luận rằng sự phát triển của tế bào C. rugosa với dầu ô
liu hoặc axit oleic có vẻ tốt. Ngoài ra, ảnh hưởng
đáng kể của tốc độ sục khí, với nồng độ oxy hòa tan
tối thiểu cũng đã được báo cáo (Ferrer & Sola, 1992).
Trong nghiên cứu này, hành vi lên men của C. rugosa
trong môi trường Universal Yeast (UY), được bổ
sung các chất dinh dưỡng vĩ mô và vi lượng khác
nhau, bao gồm các nguồn nitơ và carbon vô cơ, và vai
trò gây cảm ứng của dầu ô liu, được thảo luận.
PHƯƠNG PHÁP
Vi sinh vật và môi trường tăng trưởng
Candida rugosa (DSM 2031) được trồng và thu
hoạch chính trên môi trường Universal Yeast — Agar
ở 4 ° C. Môi trường bao gồm (g / l): glucose 10,
peptone 5, dịch chiết nấm men 3, dịch chiết mạch nha
3 và thạch 15 (pH 7,0) trong nước cất.
Lên men chìm và môi trường
Môi trường với các thành phần khác nhau đã được cố
gắng để tối ưu hóa việc sản xuất lipase. Các công thức
truyền thông đã được chỉ định bằng các chữ cái. Môi
trường A là môi trường UY (không có thạch) được sử
dụng để tiền chế cấy. Trung bình B có các thành phần
trung bình UY và các nồng độ khác nhau (2, 4, 6, 8,
10, 12 và 15%, v / v) của dầu ô liu. Đối với môi
trường C, một số cải biến đã được thực hiện theo
công thức do Ferrer và Sola (1992) đưa ra: glucose,
10; 2 „2; urê, 3;
MgSO ,. 7H2, 1; CaCl ,. 2H2O, 1 (tất cả g / l) và
FeCl, .6H, O, 10; inositol, 0,004; biotin, 0,008; thia-
mỏ — HCl, 0,2 (tất cả mg / 1), và 10Hc (v / v) dầu ô
liu. Môi trường D bao gồm các thành phần của môi
trường UY và KH, PO „0,4; 2HP 4 ›0,24;
(NH4) 2SO „1,6; MgSO ‹.7H O, 0,2; CaCl-.2H, O, 0,5
(tất cả g / 1) và FeCl .6H2O, 4; inositol, 0. () 04;
biotin, 0,008; thiamine — HCl, 0,2 (tất cả mg / 1) và
10% (v / v)
168 S. Benjamin, A. Pandey
dầu ô liu. Môi trường E chứa thành phần môi trường
UY với dầu ô liu (10%, v / v) trong đó glucose được
thay thế bằng các nguồn carbon khác ở nồng độ 1%
(tinh bột, fructose, lactose, sucrose hoặc maltose).
Trung bình F chứa 1% urê hoặc amoni nitrat và các
thành phần của môi trường D. Trung bình G là môi
trường được tiêu chuẩn hóa cuối cùng và chứa (g / l):
maltose, 10; peptone, 5; chiết xuất nấm men, 3; chiết
xuất mạch nha, 3; urê, 1; khoáng cơ bản được sử dụng
trong dầu ô liu trung bình D và 10% (v / v).
Chuẩn bị chất cấy
Để chuẩn bị chất cấy, một vòng lặp lại các tế bào từ
môi trường nuôi cấy mới (thạch nghiêng) của C.
mgosa được chuyển vào một đèn flash hình nón 250
ml có chứa 50 ml môi trường UY không có thạch.
Bình được ủ ở 30 1 ° C trên máy lắc quay ở tốc độ
180 vòng / phút trong 24 giờ và sau đó tế bào được
thu hoạch bằng cách ly tâm canh thang (15 ml) ở 5 °
C trong 10 phút ở 8000 vòng / phút. Viên nén được ủ
lại trong 5 ml nước cất vô trùng (3 mg / ml sinh khối).
Lên men
Lên men được thực hiện với 50 ml môi trường trong
một bình nón 250 ml. Sau khi hấp tiệt trùng (15 psi
trong 15 phút), bình được cấy huyền phù tế bào (2%)
của C. rugosa, được chuẩn bị như trên. Trong tất cả
các thí nghiệm, pH ban đầu của môi trường được duy
trì ở mức 7,0. Các bình được ủ ở 30 + 1 ° C trên máy
lắc quay (180 vòng / phút) trong 72-120 h. Việc lấy
mẫu được thực hiện bằng cách loại bỏ các bình trùng
lặp trong khoảng thời gian quy định. Các kết quả
được báo cáo là giá trị trung bình (độ lệch chuẩn nhỏ
hơn 5% trong mọi trường hợp) của ba bộ thí nghiệm.
Phương pháp khảo nghiệm
Các mẫu được rút ra sau 12/24 h. Đối với các thử
nghiệm diNerent, một phần (20 ml) dịch canh đã lên
men được ly tâm ở 8000 vòng / phút trong 10 phút ở 5
° C. Phần nổi phía trên thu được được pha loãng, nếu
cần, đến nồng độ thích hợp. Hoạt tính lipase được xác
định bằng phương pháp sửa đổi của Satarik
(1991). Để làm điều này, một phần dầu ô liu (250 mg)
được chuyển vào một ống nghiệm chứa 2 ml dung
dịch đệm phos-phate (pH 6,5) và 1 ml mẫu được thêm
vào đó. Hỗn hợp được quay xoáy trong 15 s và ủ ở 37
+ 1 ° C trong nồi cách thủy ở điều kiện tĩnh trong 30
phút. Sau khi dừng phản ứng bằng cách thêm 1 ml
HCl đặc và tạo xoáy trong 10 s, 3 ml benzen được
thêm vào và sau khi tạo xoáy trong 90 s, các pha nước
và hữu cơ được phép tách biệt nhau. Từ đó, 2 ml lớp
benzen được rút và chuyển sang ống chứa 1 ml dung
dịch nước của axetat cupric (nồng độ 5%, pH 6,2
được điều chỉnh bằng cách sử dụng pyridin) và hỗn
hợp, sau khi xoáy trong 90 s, được ly tâm. tại
5000 vòng / phút trong 10 phút ở 5 ° C để thu được
pha hữu cơ trong. Lớp hữu cơ (benzen) được rút ra và
được sử dụng để ước tính các axit béo tự do được giải
phóng bằng cách đo mật độ quang học (OD) so với
nước cất
Thời gian ủ bệnh (h)
nước ở bước sóng 715 nm bằng máy quang phổ (UV-
160A, Shimadzu, Nhật Bản). Một đơn vị (U) hoạt độ
lipase bằng 1 micromole axit béo tự do được giải
phóng / phút / ml trong các điều kiện thử nghiệm.
Đường và protein hòa tan được ước tính trong dịch
nuôi cấy theo phương pháp của Miller (1959) và
Lowry et al. (1951), tương ứng. Khối lượng khô của
tế bào được xác định bằng cách giữ viên tế bào thu
được sau khi ly tâm nước dùng lên men (20 ml) trong
tủ sấy qua đêm ở 80 ° C.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hành vi phát triển và lên men của C. rugosa trong môi
trường UY, tức là môi trường A, được thể hiện trong
Hình 1. Việc nuôi cấy đạt được sự phát triển tế bào tối
đa sau 48 giờ (OD 2,43 và tế bào khô khối lượng 6,5
mg / ml) không thể hoàn toàn sử dụng đường có sẵn
trong môi trường và chỉ khoảng 61% glucose được
tiêu thụ sau 72 giờ (Hình 1). Độ pH của môi trường
lên men không thay đổi đáng kể và là 7,2 sau 72 giờ
(dữ liệu không được hiển thị). Trong môi trường (UY)
này, nuôi cấy nấm men không thể tổng hợp lipase.
Tuy nhiên, việc bổ sung dầu ô liu vào môi trường
(UY) này đã kích thích các tế bào tổng hợp lipase và
một lượng đáng kể lipase ngoài tế bào được tiết ra
trong môi trường này. Sản lượng lipase cho thấy sự
gia tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ dầu ô liu
lên đến 10%, khi lipase tối đa được tạo ra (Bảng 1).
Nồng độ dầu ô liu cao hơn, tuy nhiên, đã không làm
tăng sản lượng hơn nữa. Đáng chú ý, thời gian cần
thiết để đạt được sản lượng tối ưu của enzym là 72
giờ trong mọi trường hợp (bất kể nồng độ khác nhau
của dầu ô liu). Những phát hiện này có mối tương
quan tốt với báo cáo của các tác giả khác (Ota và
cộng sự, 1968; Del Rio và cộng sự, 1990).
Như được thấy rõ từ Hình 2, việc bổ sung các chất
dinh dưỡng vi lượng và vĩ mô khác nhau, như được
sử dụng bởi Ferrer và Sola (1992), vào môi trường B,
tức là môi trường UY với 10% dầu ô liu, không hữu
ích và năng suất lipase là
202,6 6,5
2,2 '5.5
T.8 4,5
Khối lượng tế bào khô, mg / ml
Tôi 3.5
.4
Đường hòa tan, mg / ml Protein hòa tan, mg / ml
O 2,5
I.0
1 .5
0,6
—0I22436486.72
o
Thời kỳ ủ bệnh
Hình 1. Hành vi lên men của C. rugosa trong môi
trường UY.
Sự sản
xuất
lipase
 của C. lipase của Candida rugosa trong môi trường B 169
rugosa Hoạt động Lipase “
Nồng độ dầu ô liu
Bảng 1. Sản xuất
02 4 68 10 12 15
480,25 1,30 1,82 2,483,13 4,99 4,70 4J8
720,33 2,58 3,15 5,817,58 8,36 8,18 5,00
960,29 2,55 3,98 5,097,49 8,28 5,17 7,98
1200,25 2,52 3,85 5,677,47 8,03 7,95 7,97
“Không tìm thấy lipase trong các mẫu 0 và 24
giờ.

Bảng 2. Sản xuất lipase của Candida nigosa trong môi

Thời gian ủ bệnh (h) trường E
Hoạt động Lipase '

Tinh bột Fructose Đường Đường Sucrose Maltose

glucoza lactose
48 0,35 4,87 4,92 5,16 5,19 5,40
72 0,75 8,29 8,30 8,74 9,7b 10,34
96 0,75 8,27 5,28 8,74 9,75 10,20
12tJ 0,748,20 5,27 8,74 d, 73 9,15
'Không tìm thấy lipase ở 0 và 24 giờ mẫu.

môi trường
ít hơn B. Tuy tiện
với phương nhiên,
nàyvới hơn
môi những
trườnggìD,thu
hiệu suất
được với sảnCác
xuấtvai
đã trò củathảo luận bởichất
được lipidtác giả (Ota
nhiều trong
và
lipase tăng lên 8,30 U / ml (có thể so sánh với môi cộng sự, 1968; Obradors ef cộng sự, 1993). Trong tất
trường B). cả các thử nghiệm hiện tại, việc bao gồm dầu ô liu
Glucose là nguồn cacbon chính trong môi trường cho năng suất enzym cao, mặc dù không thể loại trừ
UY. Với môi trường E, mục đích là chọn chất nền thích vai trò của các yếu tố khác, nguồn cacbon và nitro và
hợp nhất (nguồn cacbon). Trong số các chất nền được các chất dinh dưỡng khoáng. Hiệu suất lipase do
thử nghiệm, maltose là tốt nhất và cho ra 10,34 U / ml chúng tôi thu được trong môi trường tối ưu G (12,55
enzyme (Bảng 2). Nhìn chung, disaccharide tốt hơn U / ml) nằm giữa các giá trị được báo cáo là 5,2 U /
mono- và poly- saccharide. Năng suất trong môi trường ml trong SmF (Del Rio và cộng sự, 1990) và
tinh bột cực kỳ kém (Bảng 2) vì C. rugosa dường như 36,6 U / g trong SSF (Rao và cộng sự, 1993) bởi C.
không thể chuyển hóa tinh bột. mgosa.
Năng suất lipase với môi trường F với urê hoặc
amoni nitrat thậm chí còn tốt hơn và trong môi trường
G được tối ưu hóa cuối cùng thì năng suất lipase cao, SỰ NHÌN NHẬN
với tối đa 12,55 U / ml sau 72 giờ lên men (Hình 2).
Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ AD Damodaran, Giám đốc và
Tiến sĩ Vijay Nair, Phó Giám đốc, đã quan tâm đến công
việc hiện tại. SB trân trọng ghi nhận việc trao Học bổng
Nghiên cứu Cao cấp của Hội đồng Nghiên cứu Khoa
học và Công nghiệp, New Delhi.

NGƯỜI GIỚI THIỆU

Del Rio, JL, Serra, D., Valero, F., Poch, M. & Sola, C.
(1990). Sơ đồ phản ứng sản xuất lipase của Can- dida
rugosa trồng trên dầu ô liu. Biote ‹: hnol. Lett., 12,
335-338.
Lipase a c t i v i t y (u / ml)

Ferrer, P. & Sola, C. (1992). Sản xuất lipase bởi các tế

bào Candida rugosa cố định. Appl. Vi sinh. Công nghệ
sinh học, 37, 737-741.
Kaur, J., Ramamurthy, V. & Kothari, RM (1993). Đặc
tính của lipase yến mạch để phân giải lipid của dầu
cám gạo. Công nghệ sinh học. Lett., 14, 257-263.
Lowry, 0. H., Rosenbrough, NJ, Farr, AL & Randall,
RJ (1951). đo lường protein với thuốc thử Folin
2 phenol. J. Biol. Chem., 193, 265—275.
Macrae, AR & Hammond, RC (1985). Các ứng dụng
hiện tại và tương lai của lipase. Công nghệ sinh học.
0 12243648f ›0 Genetic Engng Rev., 3, 193—217.
Thời gian ủ (h) Miller, GL (1959). Sử dụng thuốc thử axit
Hình 2. hoạt tính (U / ml) của C. rugosa trong dinitrosalicylic để xác định đường khử. Hậu môn.
các môi trường khác nhau. Chèm, 31, 42 28.
Lipase
170 S. Benjamin, A. Pandey
Obradors, N., Montesinos, JL, Valero, F., Lafuente, F.
J. & Sola, C. (1993). Ảnh hưởng của các axit béo khác
nhau trong sản xuất lipase của Candida mgosa. Nông
nghiệp. Biol. Chem., 32, 357—360.
Ota, Y., Miyairi, S. & Yamada, K. (1968). Sterol cần thiết
để sản xuất lipase bởi Candida mgosa. Nông nghiệp. Biol.
Chem., 32, 1476—1478.
Papaparaskevas, D., Christakopoutos, P., Kekos, D. &
Macris, BJ (1992). Tối ưu hóa việc sản xuất lipase ngoài
tế bào từ Rhodotorula glutinis. Công nghệ sinh học. Chữ
cái., 14, 397—402.
Rao, PV, Jayaraman, K. & Lakshmanan, CM (1993). Sản
xuất lipase bằng Candida mgosa trong quá trình lên men ở
trạng thái rắn: tối ưu hóa môi trường và tác dụng của
aeration. Process Biochem., 28, 391—395.
Satarik, I. (1991). Một thử nghiệm máy quang phổ cho
hoạt tính lipase sử dụng triacylglyceride cố định. /. Hóa
chất sinh học. Lý sinh. Meth., 23, 249—253.
Valero, F., Del Rio, JL, Poch, M. & Sola, C. (1991). Hành
vi lên men sản xuất lipase do Candida mgosa phát triển
trên các hỗn hợp glucose và dầu ô liu khác nhau. J. Lên
men. Bioengng, 72, 399—401.
M.Virto, MD, Agud, I., Montero, S., Blanco, A., Solo-
zabal, R., Lasearay, JM, Llama, MJ, Serra, JL, Landeta,
LC & de Renbales (1994). Thủy phân mỡ động vật bằng
Candida mgosa lipase cố định. Enzyme Microb. Technol.,
16, 61—65.
Yamada, K., Machida, H., Higashi, T., Koide, A. & Ueda,
K. (1963). Sản xuất lipase từ vi sinh vật
(III) thành phần trung bình của Candida cylindracea.
Nông nghiệp. Biol. Chem., 37, 645—649.