Current 

Cancer Drug Targets, 2005, 5, 249-266 249

The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Model System for the
Study of Tumor Angiogenesis, Invasion and Development of Anti-Angiogenic
Agents
A. Cevik Tufan*,1,3 and N. Lale Satiroglu-Tufan2,3

Pamukkale  University  School  of  Medicine,  1Department of Histology and Embryology,  2Department  of  Medical

Biology,  3Pamukkale  University  Research  Center  for  Genetic Engineering and  Biotechnology,  Kinikli Kampusu
Morfoloji  Binasi,  TR-20020  Kinikli,  Denizli-Turkey
Abstract: Angiogenesis, the formation of new blood vessels, is essential for tumor growth, progression and
metastasis. The development of agents that target tumor vasculature is ultimately dependent on the availability
of appropriate preclinical screening assays. The chorioallantoic membrane (CAM) assay is well established and
widely used as a model to examine angiogenesis, and anti-angiogenesis. This review 1) summarizes the
currently used angiogenesis assays and the importance of CAM model among them; 2) summarizes the current
knowledge about the development and structure of the CAM’s capillary bed; 3) reports findings regarding the
role played by molecular signaling pathways in angiogenesis process; 4) discusses the use, advantages and
limitations of the CAM as a model for studying tumor angiogenesis and invasiveness, as well as development of
angiogenic and/or anti-angiogenic agents; 5) discusses the importance of standardization of the major
methodologies for all aspects of the use of the CAM in angiogenesis-related studies; 6) and finally, summarizes
major findings regarding the agents developed by the use of CAM model in the study of tumor angiogenesis,
invasion and development of anti-angiogenic agents.

INTRODUCTION
Angiogenesis is a fundamental process by which new
blood vessels are formed as extensions from the existing
vasculature [1]. It plays an essential role in reproduction,
development, wound repair and a wide range of pathological
conditions termed “angiogenic  diseases”. Under the
physiological conditions, such as reproduction,
development, and wound repair, angiogenesis is highly
regulated, i.e. turned on for a specific period of time and then
turned off. However, many diseases are driven by persistent
unregulated angiogenesis. In arthritis new capillary blood
vessels invade the joint and destroy cartilage, where as in
diabetic  retinopathy  new  capillaries  in  the  retina  invade the
vitreous, bleed, and cause blindness [2]. Among the
angiogenesis-dependent disease conditions, however, tumor
growth and metastasis are the most dramatic and lethal
clinical problems [1-4]. A tumor must continuously
stimulate the growth of new capillary blood  vessels for the
tumor itself to grow. Furthermore, the new blood vessels
embedded  in  a  tumor  provide  a  gateway  for tumor cells to
enter the circulation and to metastasize to distant sites, such
as liver, lung, or bone.
The  development of agents that target tumor vasculature
is ultimately dependent on the availability of appropriate
preclinical screening assays. One of the most significant
technical problems in the research field of angiogenesis/anti-
angiogenesis,  however,  is the accurate interpretation of the
highly varied results obtained from the many experimental
*Address correspondence to this author at the Department of Histology
and Embryology, and Research Center for Genetic Engineering and
Biotechnology, Pamukkale University, School of Medicine, Kinikli
Kampusu, Morfoloji Binasi, 20020 Kinikli-Denizli-Turkey; Tel: +90 258
213 40 30/ext. 1395; Fax: +90 258 213  28 74; E-mail:
actufan@pamukkale.edu.tr
assays currently in use to evaluate this process [5-9]. It is
against this background that this review will present a
summary of information available from the literature
regarding experimental evaluation of angiogenesis/anti-
angiogenesis with special emphasis on the chick embryo
CAM as a model system.
MOST  FREQUENTLY   USED   ANGIOGENESIS
ASSAYS
During angiogenesis, new blood vessels emerge and
grow from preexisting ones through  an  invasive  process  that
requires proteolysis of the extracellular matrix, migration and
proliferation of endothelial cells, and recruitment of cell
types, such as pericytes and smooth muscle cells, todifferent
segments of the vasculature [1, 10]. Each of the elements
during this process, i.e., basement membrane disruption,
cell migration, cell proliferation, and tube formation, can be
a target for intervention, and each can be tested  in vitro.
However, the critical tests for angiogenesis/anti-angiogenesis
require a more complex assessment, and several in vivo
assays have been developed that permit a more realistic
evaluation of the angiogenic/anti-angiogenic response than
can be obtained in vitro. Detailed information regarding
available angiogenesis assays can be found in a recent review
by Staton  et  al. [11]. This review provides a short summary
of frequently used angiogenesis assays in the context of in
vitro and  in  vivo assays.
In  Vitro Assays
Endothelial  Cell  Culture  Assays
In  vitro culture of endothelial cells enables the
measurement of essential properties, i.e. cell proliferation,
cell migration, and  tube  formation,  of  these  cells  during  the
process of angiogenesis.
250   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
Cell  Proliferation  Assay
Among the numerous well-established assays for
measuring cell proliferation the most frequently used is the
thymidine incorporation assay that serves to examine several
of the key aspects of validating in vitro angiogenesis [12,
13]. The source of endothelial cells used to evaluate
angiogenic proliferative action plays an important role in
these assays. The bovine aorta and the human umbilical vein
derived endothelial cells have been the  two  principal  sources
of endothelial  cell  proliferation  assays  [14].  It  has  also  been
shown, however, in the literature that not only are there
differences between large-vessel-derived endothelial cells and
endothelial cells of microvascular origin, but there are unique
properties of endothelial cells  obtained  from  different  organ
sites and even within single organs [15-20]. There might
also  be  species  differences affecting the results of the assay
[14]. Finally, but probably most importantly, it is a fact that
endothelial cells used in the laboratory are different from
endothelial cells that lie quiescent in the existing established
vasculature. It is well known that cells  in  vitro  alter some of
their characteristics found  in  vivo, and it is generally not
realistic to use truly primary, i.e. not passaged, endothelial
cells in these angiogenesis assays.
Cell  Migration  Assay
Among the several tests existing to evaluate the
migratory response of endothelial cells to angiogenesis-
inducing or -inhibiting factors [21], blind-well chemotaxis
chamber assay is the most frequently used. In this assay
endothelial cells are placed on the upper layer of a cell-
permeable filter in Boyden chambers and permitted to
migrate in response to a test factor placed in the medium
below the filter. A labor-intensive process of cell recording is
required after separation of the retained cells from the cells
that have migrated across the filter for the most accurate
measurements. A 96-well, two-dimensional cell migration
assay has been developed by Obeso et  al. [22, 23] that
measures epithelial cell motility and can be readily
quantified. In this assay monolayer of 1 m beads is
deposited on the bottom of 96-well plates and endothelial
cells (100 cells/well) are then placed in the well, along with
test medium. Cell movement is scored after 24 h by
phagokinetic track assay, and the assay lends itself to
computer-assisted quantification.
Tube  Formation  Assay
Since, endothelial cells of all origins are practically able
to form tubules on appropriate extracellular matrix
components spontaneously, tube formation assay is one of
the most specific tests for angiogenesis in vitro [24].
Collagen or fibrin clots on plastic culture dishes enhance the
tube formation and the establishment of tight  junctions can
be confirmed by electron microscopy. Furthermore, Matrigel,
a  matrixrich  product  whose primary component is laminin
[24, 25], can induce endothelial  tube formation within 24 h.
increasing the value of tube formation assays in the range of
angiogenesis  measures  [24-27].  Caution  has  to be taken in
terms of cultured cells of nonendothelial origin, such as
fibroblasts, which may also display a response to Matrigel
[14, 23]. Also not all commercial preparations of Matrigel
may promote tube formation in  vitro  [14].
Tufan and Satiroglu-Tufan
Organ Culture Assays
The fact that angiogenesis in vivo involves not only
endothelial cells but  also their surrounding cells and tissues
has urged the development of organ culture methods to
assess angiogenesis  in  vitro.
The  Aortic  Ring  Assay
Among the organ  culture  assays  the  rat  aortic  ring  assay
has become the most widely used [28, 29]. It involves the
isolation and segmentation of a rat aorta, where each segment
is cultured in a matrix-containing environment such as
Matrigel. The effect of test substances on the outgrowth of
endothelial cells from the explants simulating the
angiogenesis process  in  vivo is then monitored over the next
7-14 days. Labeling by fluorescein incorporated BSL-I or
BSL-B4, endothelium-selective markers, or staining of the
cultures with labeled antibodies to CD31 enables the
measurement of length and abundance of vessel-like
extensions from the explants [30, 31]. The use of defined
media during this assay may allow an even shorter culture
period. The advantage of using this assay system is the fact
that angiogenic cells have not been preselected like those
used in endothelial culture assays, thus are not in a
proliferative  state  at  the  time  of  explantation  simulating  the
real-life situation. Including the extracellular components
besides endothelial tissues in the culture strengthens this
condition. On the other hand, angiogenesis is primarily a
microvascular event, making the aorta a less than ideal
choice.
The  Chick  Aortic  Arch  Assay
The  chick  aortic  arch  assay  is  a  modified  version  of the
rat aortic ring assay. The assay avoids the use of adult
laboratory animals instead uses the aortic arches dissected
and cut into rings from day 12–14 chick embryos. It is rapid
with an assay time of 1-3 days, and can be carried out in
serum-free medium [32]. Unlike the adult aorta, embryonic
arch endothelial cells share  many properties with
microvascular endothelial cells. However, like preselected
endothelial cells, they are in a highly proliferative state at the
time of explantation and exposure to angiogenic/anti-
angiogenic substances, since they are obtained from growing
embryos and are therefore undergoing rapid cell division.
In  Vivo Assays
The history of  in  vivo assays to measure the angiogenesis
has started with the use of diffusion chambers made with
Millipore filters [33], as well as various other chamber
techniques designed to monitor visually the progress of
neovascularization  of implanted tumors. Classical  in  vivo
models include the rabbit ear chamber, hamster cheek pouch,
dorsal skin  chamber,  dorsal  skin  and  air-sac  model,  anterior
chamber/iris and avascular corneal pocket assays, and CAM
assay [extensively reviewed in ref. 34].  More  recent  methods
involve the implantation of preloaded Matrigel or alginate
plugs, or collagen or polyvinyl sponges [34] to living
laboratory animals. Some of these methods are more
frequently used and are briefly summarized in this review.
The  Corneal  Angiogenesis  Assay
The  fact that  cornea itself is  avascular, thus, any vessels
seen in the cornea after stimulation by angiogenesis-inducing
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
tissues or factors are new vessels, places this system among
the most populer in vivo assay systems. The original
method was developed for rabbit eyes [35], but has been
adapted to mice [36, 37], now among the most frequently
used laboratory animal. It involves the introduction of test
tissues or substances in to a pocket made in the cornea to
stimulate the ingrowth of new vessels from the peripheral
limbal vasculature. If cornea is locally induced by angiogenic
growth factors (e.g., by FGF, VEGF) or tumor cells, it is
also possible to  test effects  of inhibitors  of angiogenesis on
induced events. The test inhibitors can be administered
orally or systemically, the latter either by bolus injection or,
more effectively, by use of a sustained release method such as
implantation of osmotic pumps loaded with the test
inhibitor [38, 39]. The vascular response can be best
monitored by the injection of fluorochrome labeled high-
molecular weight dextran [40]. Thus, computerized
histogram analysis or pixel counts above a specific threshold
would be the easiest method for quantification. The
advantages of this assay include the ability to monitor
progress of angiogenesis, the absence of an existing
background vasculature in the cornea, and the ability to use
mice  as the experimental animal. The demanding surgical
procedures involved in this assay, on the other hand, limit
the animal number for a given experiment and also the
practical use of this assay model. In addition, the space
available for introducing test material is limited, and
inflammatory reactions are difficult to avoid.
Matrigel  Plug  Assay
The principal of this assay is subcutaneous injection of
Matrigel containing test cells or substances where it
solidifies  to  form  a  plug [41]. This plug can be recovered
after 7–21 days in the animal and examined histologically to
determine the extent to which blood vessels have entered it.
Quantification of  the vessels in histologic sections is labor
intensive but accurate [41]. Fluorescence measurement of
plasma volume can also be achieved using fluorescein
isothiocyanate (FITC)-labeled dextran 150 [42].
Quantification can also be achieved by measuring the amount
of hemoglobin contained in the plug [41]. However,
hemoglobin content depends on the blood content, which is
directly proportional to the vessel size. Thus, due to
possible stagnant pools of blood in the tested tissue
hemoglobin measurement may be misleading. The major
advantage of this assay is that it does not require surgical
skills, however the evaluation process is demanding
compared to the corneal angiogenesis assay.
The  Sponge/Matrigel  Assay
This is a modified version of the Matrigel plug assay that
allows clearer demarcation of neovascularization [39]. In
brief, Matrigel  alone  is first  introduced subcutaneously into
the mouse. A sponge soaked with the test material or
tumoral tissue fragment is then inserted into the plug. New
vessels can  then  be  measured  by  injection  of  FITC-dextran.
The greatest disadvantage of  the sponge/Matrigel assay, on
the other hand, is that it is more time-consuming than the
standard Matrigel plug assay.
The  CAM  Assay
According  to  a  recent  publication  [43]  the  first evidence
of the tumor-induced angiogenesis  in vivo by using the
252   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 251
CAM assay dated 1913. However, its use for the testing of
angiogenic or antiangiogenic substances  and tumor
angiogenesis has become popular during the last three
decades [11, 14, 44-46]. During 2003-2004 over 150
publications had used the CAM as their model system to
evaluate angiogenesis/anti-angiogenesis. CAM assay is an
alternative to animal models and provides a natural
environment of growing blood vessels and all the
components of the complex host interaction. The principal of
the CAM assay is to explant cells/tissues/biomaterials etc.
on CAM or expose a local area on CAM directly to test
substances implicated in angiogenesis or antiangiogenesis
mechanisms in order  to  evaluate  alterations  in  its  natural  or
induced angiogenic capacity. It involves a straightforward
procedure of either windowing the eggshell to  have  access  to
the CAM or preparation of shell-less cultures of avian
embryos, which increases the CAM area available for
multiple tests on a single CAM. With its many advantages
compared  to  the previously described  in vitro and  in vivo
assay models, i.e. will be discussed later in this review,
CAM assay has the difficulty in standardization of measuring
the angiogenic/anti-angiogenic response to an experimental
compound/tissue in an objective and quantifiable manner. In
addition, the difficulty in identifying the molecular basis for
these changes has been the greatest challenge in this field.
From this point onward this review aims to discuss current
knowledge about CAM assay in angiogenesis starting with
the embryonic development of the avian CAM.
EMBRYOLOGICAL ORIGIN OF THE CAM, ITS
STRUCTURE AND FUNCTION
Four extraembryonic membranes form during avian
development: the amnion, chorion, allantois, and yolk sac
(Fig. (1A)). Two of these membranes, the chorion and
allantois, fuse together and form the chorioallantoic
membrane (Fig. (1J)). The chorion arises from somatopleure
(ectoderm and adjacent somatic mesoderm), and the allantois
from splanchnopleure (endoderm and adjacent splanchnic
mesoderm) [46-50]. The chorion together with amnion
develops as 4 folds of somatopleure, i.e., head fold,  tail  fold,
and two lateral folds, and these folds ultimately fuse together
to enclose the embryo in an inner covering of amnion and
outer covering of chorion, with its somatic mesoderm
towards the amnion and an investing layer of ectoderm (Fig.
(1J)).
The allantois develops as an outgrowth of the hindgut
appearing at about 60 hours of incubation. On about 4th day
of  incubation  it  pushes  out  of  the  body  of  the embryo into
the space between the amnion  and chorion, the
extraembryonic coelom. Its proximal portion lies parallel
and just caudal to the yolk sac. When the distal portion
grows clear of the embryo it becomes enlarged. The narrow
proximal portion is known as the allantoic stalk, and the
enlarged distal portion as the allantoic vesicle (Fig. (1A)).
Fluid accumulation distends the allantois. The allantoic
vesicle enlarges very rapidly between days 4–10 of
incubation (Fig. (1)). In this process, the mesodermal layer
of the allantois becomes fused with the adjacent mesodermal
layer of the chorion to form the CAM.
In this double layer of mesoderm an extremely rich
vascular network, which is connected to embryonic
Tufan and Satiroglu-Tufan
Fig. (1). The development of CAM in shell-less culture. A) Schematic diagram of a day 4/5 chick embryo in  ovo. B-I) CAM
development in shell-less culture from day 4 trough day 10. J) Schematic diagram of a day 9/10 chick embryo  in  ovo.

circulation by the allantoic arteries and veins, becomes The general vascular  system  of  the  CAM  consists  of  the

functional in 1) providing a large reservoir for the storage of
nitrogenous wastes; 2) transporting calcium from the shell
back to the embryo, where it is utilized in bone formation;
3) respiration, namely, the transport of CO2 from the embryo
through pores in the shell to the outside environment, and
the transport of O2 in the opposite direction [51]. The
allantois also takes part in the absorption of the albumen.
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
capillary layer located adjacent to the chorionic epithelium,
which is closest to the shell, and deeper larger vessels free-
floating within the CAM and moving with spontaneous
movements of the embryo [46]. Immature blood vessels
lacking a complete basal lamina and smooth muscle cells are
spread  in  the  mesoderm  and  grow  very  rapidly  until day 8
and give rise to the capillary plexus associated with the
Current Cancer Drug Targets,  2005, Vol.  5,  No. 4 253

overlying chorionic epithelial cells and mediating gas exchange with the outer environment [47, 49]. Parallel 
to
this there is continues rapid growth in the surface area of the
CAM until day 9 [48, 52] (Figure-1). The endothelial cell
mitotic index declines rapidly after day 11 [47-49]. The
fused CAM covers the entire surface of the inner shell
membrane of the chicken by day 12 of incubation. Thus,
approximately 6 cm2 surface area of CAM on day 6 of
incubation reaches to almost 65 cm2 surface area on day 14
[53]. At day 14, the capillary plexus is located at the surface
of the ectoderm adjacent to the shell membrane. The
ultrastructural morphology of the  capillary  system  of  16  day
CAM was described as a dense plexus consisting of a single
network of capillaries lined by a continuous endothelium
with  some  pericytes  embedded  in the chorionic epithelium
[54]. The vascular system attains its final arrangement on
day 18, just before hatching (on day 21) [55].
Schlatter  et  al. [48]  have  demonstrated  that  by  means  of
morphometric  analysis CAM angiogenesis undergoes three
phases of development. In an early phase,  from  day  5  to  day
7, the major mechanism of capillary network growth is
sprouting. In an intermediate phase, from day 8 to day 12,
intussusceptive  microvascular  growth  (IMG)  is  dominating,
and at days 13 and 14, CAM structure is undergoing
expansion with only a small increase in complexity. By this
time chorionic artery undergoes 6-7 generations of branching
[56]. These findings are important in view of experimental
protocols using the CAM as a model for testing angiogenetic
factors. Indeed, care has to be taken not to misinterpret
normal age-dependent alterations of the CAM vascular
architecture as specific responses to tested agents.
As the major component of the double-layered mesoderm
the extracellular matrix of the CAM expresses fibronectin,
laminin, collagen type I, collagen type IV, bone
morphogenic protein receptor Type II (BMPR II), and
specific glycosaminoglycans (GAGs) in its composition
favoring the angiogenic process [46, 57, 58]. At early stages
of development, when the subepithelial capillary plexus is
not yet formed, fibronectin appears in the extracellular matrix
beneath the chorion, and may promote the migration of
endothelial cells merging by  sprouting from the mesodermal
blood vessels [58]. Fibronectin has also been implicated in
the vasoproliferative processes induced by angiogenic stimuli
in the CAM [59, 60]. Laminin, on the other hand, is present
during  all  stages  of  vessel  formation  in CAM development
[58] and is implicated in the early formation and later
differentiation of the subendothelial basement membrane
[60]. Maximum collagen synthesis is seen between days 7
and  10  with  a  decrease  at  day  12,  when  vascular  density  is
considered to have reached a plateau. Collagen-degrading
enzyme  activity  peaks at days 8-10, which coincides with
the maximum angiogenesis [61]. BMPR II, which is
involved in the interaction of endothelial cells and  collagen
type I, is expressed during days 1-10 and  is  down-  regulated
by day 18 [62]. Collagen type IV appears in the late stages
of CAM vascular development and may play an important
role in the terminal differentiation of endothelial cells, i.e.,
progressive slow down of microvascular endothelial cell
proliferation, gradual reduction in endothelial migration,
establishment of cell polarity, lumen formation, and
maturation of the basement membrane [58, 63, 64]. The
distribution  of  hyaluronic  acid  and  sulfated GAGs peaks at
254   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
are structurally related, having a 53% absolute sequence
days 10 to 14 [57]. Hyaluronic acid is important in the
formation, alignment, and  migration  of  the  capillary  plexus,
while heparan sulfate, chondroitin sulfate, and dermatan
sulfate are implicated in the differentiation and development
of arterial and venous vessels of the CAM [57].
THE MECHANISMS AND MAJOR SIGNALING
EVENTS INVOLVED IN ANGIOGENESIS PROCESS
Two distinct mechanisms,   vasculogenesis and
angiogenesis establish the formation of the vascular network
in the CAM. While vasculogenesis refers to in situ
differentiation and growth of blood vessels from mesodermal
derived hemangioblasts, angiogenesis  comprises two
different mechanisms: endothelial sprouting and IMG [65].
The sprouting process is based on endothelial cell
migration, proliferation and tube formation. IMG divides
existing vessel lumens by formation and insertion of tissue
folds and columns of interstitial tissue into the vessel lumen.
The latter are termed interstitial or inter-vascular tissue
structures and tissue pillars or posts. Intussusception also
includes the establishment of new vessels by in situ loop
formation in the wall of large veins.
Numerous inducers of angiogenesis have been identified,
including members of the fibroblast growth factor (FGF)
family, vascular permeability factor/vascular endothelial
growth factor (VPF/VEGF), angiogenin, transforming
growth factor alpha and beta (TGF- and -), platelet-
derived growth factor (PDGF), platelet-derived endothelial
cell growth factor (PDECGF), tumor necrosis factor alpha
(TNF-), interleukins, chemokines, and angiopoietins [66].
In this review the molecular regulation of angiogenesis
mechanisms is discussed in respect to the best-characterized
positive regulators, i.e. VEGF and its receptors flk-1 (KDR)
and flt-1, FGF signaling, the Angiopoietin/TIE system, and
the ephrin-B/EpH-B system.
VEGF is a heparin-binding angiogenic molecule with
endothelial target specificity in the CAM [67]. VEGF, also
termed VEGF-A, belongs to the VEGF–PDGF supergene
family. Alternative exon splicing of the VEGF gene yields 5
isoforms, i.e., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, and
VEGF-E [68]. They display differential interactions with
three related receptor tyrosine kinases, i.e., VEGFR-1/Flt-1,
VEGFR-2/Flk-1/KDR, and VEGFR-3/Flt-4 [69]. However,
the angiogenic effects of VEGF are initiated  via its binding
to two of these receptor tyrosine kinases, i.e., VEGFR-1 and
VEGFR-2 [68, 69], that are found primarily on vascular
endothelial cells. Although VEGFR-1 binds VEGF with
higher affinity than does VEGFR-2, VEGFR-1 is thought to
act primarily as an intermediate receptor on endothelial cells,
modulating the availability of VEGF to VEGFR-2, the
principal receptor for VEGF signaling [68, 70]. As an
endogenous angiogenic ligand VEGF promotes endothelial
cell proliferation and migration, stromal degradation,
increased vascular permeability, and possibly the formation
of an extravascular fibrin substrate for endothelial and tumor
cell growth [68, 70-72]. VEGF also acts as a crucial survival
factor for endothelial cells in newly formed vessels by
inhibiting apoptosis [68, 73].
The two most extensively investigated proteins of the
FGF family implicated in angiogenesis, on the other hand,
are FGF-1 (acidic FGF) and FGF-2 (basic FGF) [49]. They
Tufan and Satiroglu-Tufan
homology [74]. They stimulate endothelial cell mitosis a
nd
migration  in vitro, are among the most potent angiogenic
proteins  in vivo, have high affinity for heparin and heparan
sulfate, are stored in the extracellular matrix, but lack a
signal sequence for secretion [49, 75]. FGF-2 exists in four
forms, one low-molecularweight (18 kDa) and three high-
molecular-weight forms, resulting from alternative initiations
of translation [49, 66]. FGF-2 has been isolated from a
variety of tissues and cell lines [76].
Synergistic  angiogenesis  of  VEGF  and  FGF-2 has been
demonstrated both in vitro and  in vivo [77-79]. The
coordination  of  signals  from  these  two  important classes of
angiogenic growth factors requires the interaction of them
with the extracellular matrix (ECM), i.e., integrin ligation,
to  support  endothelial  cell  proliferation  and  migration [73].
Integrins can directly associate with growth factor receptors,
thereby regulating the capacity of integrin–growth-factor-
receptor complexes to propagate downstream signaling. It
has recently been shown that this synergy involves FGF-
2/v3 and VEGF/v5 interactions differentiallyactivating
Ras-Raf-ERK signaling (Fig. (2)). ERK is likely playing a
general role in both pathways of angiogenesis because it
regulates  gene  transcription,  cell  cycle  progression,  and  cell
migration, which are critical to the growth anddifferentiation
of  new  blood  vessels [73, 80]. However, in this proposed
model each of these signaling pathways also accounts for
protection of endothelial cell from distinct mediators of
apoptosis [68, 73, 80]. The v3 pathway promotes an
ERK-independent survival mechanism preventing stress-
mediated death based on Raf coupling to the  mitochondria,
whereas the v5 pathway prevents receptor-mediated death
in an ERK-dependent manner [73, 80] (Fig. (2)).
Another family of growth factors specific for the vascular
endothelium is Angiopoietins [81-87]. Similar to VEGF,
the specificity of the Angiopoietins for the vascular
endothelium results from the  restricted distribution of their
receptors, TIE-1 and TEI-2, to these cells. Thus, the
receptor tyrosine kinases with immunoglobulin and
epidermal growth factor homology domains (TIE)-1 and
TIE-2 have critical roles in angiogenesis process  [88].  TIE-2
has at least  four known ligands, Angiopoietin-1,
Angiopoietin-2, Angiopoietin-3 and   Angiopoietin-4.
Ligands for the TIE-1 have not been well characterized up to
date. The function of TIE-1 is related to endothelial cell
differentiation and the establishment of blood vessel
integrity, i.e. vasculagenesis related events [89], where as
TIE-2 appears to play a role in hematopoiesis and
angiogenesis [90]. Angiopoietin-1 and Angiopoietin-2 are
secreted glycoproteins that share 60% amino acid identity
and bind with similar affinity to TIE-2. Angiopoietin-1
induces autophosphorylation of TIE-2, which is naturally
blocked by Angiopoietin-2. Angiopoietin-1  mediates
reciprocal interactions between the endothelium, surrounding
matrix and mesenchyme inducing endothelial  cells  to  recruit
pericytes and smooth muscle cells to become  incorporated in
the vessel wall [91]. Angiopoietin-2 blocks the TIE-2
receptor and acts to repel pericytes and smooth muscle cells.

Fig. (2). Sinergy of VEGF and FGF signaling pathways in angiogenesis. This synergy involves FGF-2/v3 and VEGF/v5
interactions differentially activating Ras-Raf-ERK signaling. ERK is likely playing a general role in both pathways of angiogenesis
because it regulates gene transcription, cell cycle progression, and cell migration, which are critical to the growth and differentiation
of new blood vessels. However, in this proposed model each of these signaling pathways also accounts for protection of endothelial
cell from distinct mediators of apoptosis. ECM, extracellular matrix; PM, plasma membrane; EC, endothelial cell.
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane Current Cancer Drug Targets,  2005, Vol.  5,  No. 4 255

Thus, function of the Angiopoietin/TIE -2 pathway seems to involves remodeling and maturation of the vascular networ
be restricted to later stages of vascular development and k.

A receptor tyrosine kinase family recently implicated in
neovascularization consists of the Eph family of receptor
tyrosine kinases that play a prominent role in endothelial
cell assembly and migration [85]. The Eph family of receptor
tyrosine kinases and their membrane-tethered ligands, known
as ephrins, constitute the largest receptor tyrosine kinase
sub-family, with at least 14 receptors and 9 ligands [92, 93].
This family is subdivided into class A receptors that bind
GPI-tethered A class ephrins, and B class receptors that bind
transmembrane-tethered B class ephrins [94]. Gene targeting
studies have established several class B Eph family
members, i.e., EphB-mediated signaling, as key regulators
of embryonic angiogenesis [85, 94]. Class A Eph receptors,
on the other hand, have been shown to regulate post-natal
angiogenesis in adults [94].
In  addition,  regulation  of  cell–cell  adhesion by vascular
For example, VE-cadherins mediate endothelial barrier
function,  angiogenesis  and  can  also  support cross-talk with
VEGF receptors [95, 96]. The role of VE-cadherins in
angiogenesis has recently been reviewed [97-99].
Signals from phosphoinositide (PI) 3-kinase and its
target AKT are also implicated as regulators of angiogenesis
[100]. Activated PI 3-kinase and AKT are strong inducers of
neovascularization and endothelial cell proliferation [100].
Inhibition of PI 3-kinase signaling interferes  with
angiogenesis [100]. PI 3-kinase signaling also mediates
VEGF expression in endothelial cells [101]. AKT signaling
plays also a role in FGF-1-stimulated angiogenesis in  vivo
[102]. Thus, the AKT pathway may also serve as a
therapeutic target for angiogenesis-associated diseases.
THE USE OF CAM ASSAY
Culture Methods Used in CAM Assay
shell-less culture [48]. Each of these methods has benefits

Fig. (3). The sequence of events during the preparation of shell-less cultures of the chick embryo. A) Collection and preincubation of
fertilized eggs at 37°C in a humidified egg incubator. B) Cleaning and cooling of eggs prior to explantation. C-E) Explantation of
embryos in to the presterilized culture containers at aseptic conditions. F) Incubation of shell-less cultures at 37°C in a humidified
incubator for the desired amont of time.
256   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 Tufan and Satiroglu-Tufan

and disadvantages depending on the characteristics of a given significant difference between data derived using  in ovo 

study. However,  there is  no  clear  evidence that  there is  any or
shell-less culture method [103]. In order for the chick
embryos to develop, eggs must be maintained at 37  oC, in a
humidified atmosphere [103-108]. The first day in these
conditions is considered to be day 1 of embryonic
development. Full term is 21 days, and the  age  of  the  CAM
in days refers to the number of days of embryonic
development.
In ovo culture involves windowing of the eggshell
allowing free access to the CAM in situ. This technique may
preserve a more physiological environment for the
experiments on CAM; however, it limits the CAM area
available for use and observation, and extensive recording of
intervention-induced alterations are difficult in this system.
Usually the CAM is  fixed  with aldehyde and removed  prior
to  evaluation  of  the  response.  There  are  two  main methods
for preparing the CAM for in  ovo studies. In a more
successfully used approach, a small hole is made in the shell
on day 3 or day 4 of embryonic development using a 5 cc
syringe and 18-gauge needle to extract 2 to 3 ml of albumin
from the egg [50]. By extracting the albumen, the CAM of
the  fertilized  egg  is separated from  the top  part of the shell
allowing for a small, i.e. 1.5-2 cm2, window to be cut
without damaging the embryonic structures and membranes.
The window is then sealed with transparent adhesive tape or
wax  film  and  the  egg  is  placed  back  in the incubator until
day 7-10, when test materials are going to be introduced to
the CAM [50, 109]. The other  in  ovo method is described as
the “dropped” CAM method [110]. CAM of eggs at day 10-
14 of embryonic development is “dropped” by aspirating
albumin over the area of interest, and aspirating air from the
Table 1. Assays Used in Testing Angiogenesis
In  vitro Assays*
1.   Endothelial cell proliferation
2.   Endothelial cell DNA synthesis
3.   Endothelial cell migration
a. chemokinesis (colloidal gold)
b. chemotaxis (Boyden chamber)
4.   Endothelial cell tube formation
5.   Endothelial apoptosis
6.   Endothelial cell viability (trypan blue)
7.   Angiogenesis factor-transfected endothelial cell lines
8.   Magnetized microbeads on endothelial cells
9.   Endothelial cell outgrowth (Aortic ring)
* These assays use preselected endothelial cells, i.e., human umbilical vein, aortic or capillary driven endothelial cells.
natural air sac [110]. Then the shell is removed over the
dropped CAM to form a window. However, it has been
documented that the size of the  window  and  the  success  rate
of dropped CAM assay are inversely correlated and the rate
for false-positive response increases with larger window size
[111].
Ex  ovo culture method is a modification of the in  ovo
method described above. This technique, also known as the
shell-less culture technique, involves the transfer of the entire
egg contents to a container simulating the eggshell after 72 h
of  in  ovo incubation [48, 111].  After  cracking  and  transfer,
the CAM develops on the surface of the yolk sac for an
additional 4-7 days [corresponding to gestational days  7-10],
thus permitting the whole of the organ to be available for the
observation of morphogenesis and growth or a response to an
intervention.
A brief outline of the sequence of events for the
preparation of shell-less cultures may be summarized as
follows [103-105, 112] (Fig. (3)). Fertilized eggs are
preincubated for 72 h at 37 °C in a humidified egg incubator
to bring them to stage 20/21 of Hamburger and Hamilton
[113] (Fig. (3A)). Prior to explantation eggs are placed
horizontally, sprayed with 70% ethanol and permitted to air-
dry for 10 min to reduce contamination from the egg surface
and also to ensure that the embryo is properly positioned
[108] (Fig. (3B)). This also allows the eggs to cool,
reducing the occurrence of yolk ruptures on explantation
[114].  Yolk  leakage  is the only feature considered to be a
reliable indicator of a poor chance of embryo survival [108,
115]. The egg contents are then transferred under aseptic
conditions (in a laminar flow hood) into the culture container
by cracking the underside against an edge (Fig. (3C-E)).
Preferably, only cultures with the blastodisc positioned to
In  vivo Assays
1.   Transparent chamber
a.  rabbit ear
b.   hamster cheek
c.  cranial window
d.   dorsal skin
2.   Anterior eye/iris chamber implant
3.   Cornea micropocket
a.  rabbit
b.   rodent
4.   Matrix implants
a.  subcutaneous injection using sodium alginate
b.   subcutaneous disc (polyvinyl foam implant)
c.  rat dorsal air sac
d.   sponge implant
5.   CAM (chick chorioallantoic membrane)
a.  in  ovo CAM assay
b.   ex  ovo CAM assay
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
uppermost  side  of  the  yolk  are  included  in the experiment,
since contact with container surface may cause developmental
delay on yolk  sac  [Tufan  et  al. unpublished data]. Also the
embryos with ruptured yolk sacs have to be  excluded  from
experiment [116]. Each shell-less culture is then covered
with a sterile plastic Petri dish lid, transferred to an
incubator at 37°C and saturation humidity, and incubated for
the desired amount of time (Fig. (3F)).
When shell-less technique was first described plastic
culture dishes (Petri dishes)  were  used  as  the  whole  embryo
culture container [108]. Other types of containers  used  in  the
literature include plastic slings [52, 117, 118], plastic weigh
boats [119, 120], foam cups [121], and plastic dishes [115].
However, later it has been demonstrated that survival rate of
eggs  cultured  ex  ovo is the major success limiting step in
this culture technique and it is significantly improved when
plastic wrap allowing increased permeability to air is used as
the container material [117]. A very simple and cost efficient
container used in our laboratory is shown in Fig. (3F).
These culture containers are consisted of clear,
semipermeable polyethylene film (stretch-film can be used)
secured with elastic rubber bands in the mouth of a
cylindrical plastic cup (diameter = 7 cm; height = 7 cm)
covered with a sterile plastic Petri dish lid and presterilized
under UV light at least for an hour. The lids are opened only
under aseptic conditions  for  a  very short period of time to
allow explantation  of CAMs in to these containers. Using
these containers and the described technique we achieved
survival rates as 100 %, 81.3 %, 59.3 %, and 50 % at
gestational days 4, 7, 10, and 14  ex  ovo,  respectively  [103].
These survival rates are much higher than those reported
previously [117, 118, 122]. Embryos can be maintained
under these conditions, i.e.  ex  ovo, until full term (until
gestational  day  21),  however,  they  are  smaller  compared to
embryos  grown  in  ovo  especially  after 7 days ex  ovo (after
Shell-less chick embryo CAM model
1.    Cost efficient (eggs, time, labor, etc.)
2.        In  vivo assay
3.    No mature immune system Carrier
4.    No surgery required to test materials
1.               Methyl cellulose discs
2.               Elvax™ polymer (Elvax-40, ethylene acetate copolymer, 40%vinyl acetate content)
5.    Allows multiple tests on individual CAMs
3.               Matrigel
6.    Allows direct and continuous visualization and recording of test site
4.               Agarose discs or agarose beads
7.    Animals do not need to be restrained
5.               External gels (collagen gel inside parallel nylon meshes)
8.    Implantation and test time is limited with days
6.               Gelatin sponges
9.    Tissue and blood sampling is easily done
7.               Filter discs (e.g. Millipore dics soaked in the solution)
10. Biology/physiology of this model is well known
8.               Plastic cover slips (e.g. Thermanox cover slips onto which the stimulant had been dried)
9.               Rings composed of silactic, teflon, or glass
11.    Cost-effective model for utilization of expensive and limited reagents 11. Cost-ineffective model for utilization of expensive and limited reagents
(e.g., cytokines, antibodies)
10.             Flooding the surface
12.    Easily reproducible
11.             Direct inoculation into the cavity of the allantoic vesicle
13.    Allows large-scale screening
12.             Direct application of cells and tissues
Table 2. Comparison Between the Shell-Less Chick Embryo CAM Model and Mammalian Models for Testing Angiogenesis
258   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
Current Cancer Drug Targets,  2005, Vol.  5,  No. 4 257
gestational day 10) [52, 103], and generally die before
hatching is possible (at gestational day 19-20) [108].
Advantages and Limitations of CAM Assay
Among the most valuable features of CAM assay are the
low cost, relative ease of preparation and carrying out the
assay, the absence of a mature immune system in avian
embryos, simplicity, reliability, reproducibility, the ready
availability of experimental material, and for the explant
method, the feasibility of carrying out multiple tests on
individual CAMs as well as of monitoring the reaction
throughout the course of the assay, thus it lends itself to
large-scale screening. One other major advantage of the CAM
assay is the use of various stimulators alone or in
combination with an anti-angiogenic agent to examine the
effectiveness of an inhibitor. All of these features are
important determinants of the choice of a method. A
comparison  of  the  shell-less  chick embryo CAM model to
other mammalian models is also given in Table 2.
However, there are also limitations to the CAM model.
The tests are run on CAM, which itself is undergoing rapid
changes both morphologically and in terms of endothelial
cell proliferation and neovascularization during the course of
embryonic development. Thus, it may be hard to
distinguish the effects of the test substance from the natural
process if the timing and duration of the assays are not
standardized according to the current literature, which will be
discussed later in this review. Another limitation to this
system  is  the  nonspecific  inflammatory reaction due to the
implant [123]. However, nonspecific inflammatory reactions
are much less  frequent,  when  the  implant  is  made  relatively
early in CAM development and the host’s immune system
is relatively immature [47].
Mammalian models
1.    Moderate to high cost (laboratory animals, per diem, time, labor, etc.)
2.        In  vivo assay
3.    Mature immune system [Referance]
4.    Complex surgery to place implants (i.e., requires anesthesia, operating
room, etc.) [132, 151]
5.    One animal per test [151]
[152]
6.    Usually does not allow visualization of implant or test site
7.    Animals often have to be restrained [122]
8.    Implantation and test time is longer [153, 154]
[133]
9.    Tissue and blood samples are available in larger quantity but require
more invasive procedures [110, 121, 155]
10. Biology/physiology of these models are also well known, but are also
[156, 157]
more complex
[158-160]
(e.g., cytokines, antibodies) [161, 162]
12. Reproducibility is expensive and requires more time and labor
[163]
13. Large-scale screening is difficult [164]
Tufan and Satiroglu-Tufan
THE IMPORTANCE OF STANDARDIZATION OF
THE CAM
It is difficult to quantify an angiogenic or anti-angiogenic
response with reasonable speed, ease and accuracy,especially
in an  in  vivo system like CAM [44, 124-127]. Even though
the pitfalls, including non-specific responses have been
adequately described [123, 128, 129], their importance is not
generally acknowledged either. Furthermore, a wide range of
methodologies is employed in culturing the CAM. Some of
the decisions to be made before starting the assay include the
choice of avian CAM, i.e. chicken or quail CAM, the
method of CAM assay, i.e.,  in  ovo or shell-less  culture (if  in
ovo, dropped CAM or small hole; if  shell-less, age  to crack,
and container for culture), the method of application of a test
material/tissue,  i.e.,  carriers  for  interventions, the choice of
age of the CAM at which the intervention is applied and the
duration of the intervention, as well as the methods for
quantification of responses.
As described earlier, we achieved high survival rates with
the use of a chick embryo shell-less culture technique
involving the described modified culture containers allowing
diffusion of air through the material [103-105].
The age of CAM at the time of application and the
duration of application of the intervention plays a critical role
when it  comes  to  evaluation  of  angiogenic  responses  of  test
agents or  tumor  material,  since  CAM  itself  undergoes  rapid
changes during the course  of  its  maturation.  The  window  of
testing should preferentially be a period during which
neovascularization due to tested application can be
distinguished from natural process. The application time
reported in the literature varies from as early as day 3 [130]
to as late as day 15  [131].  However,  as  discussed  earlier  the
rapid growth of the surface area of the CAM continues until
day 9 [48, 52] and the endothelial cell mitotic index declines
rapidly after day 11 [47-49]. In addition, at days 13 and 14,
CAM structure is undergoing expansion with only a small
increase in complexity [48]. Thus, the period starting from
day 9/10 up to day 14/15 is generally considered to be a
suitable window of application.
Table 3. Carriers for Testing Interventions on CAM
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
the growth inhibition zone as 0 to 4 grades of vessel growth
from the  center  of  each  intervention  application  point  to  the
furthest contiguous area in which tertiary vessels are absent.
Zones with a radius greater than 1 mm are interpreted as
evidence of significant inhibition of angiogenesis [141].
Morphometric  Evaluation  of  Vessel  Response
Length, diameter, area, branching patterns, and/or branch
points of vessels can be determined under this category.
Ribatti et  al.  [142]  described  a  method  for  the  Quantitative
evaluation of a vasoproliferative response using
morphomertic parameters. According to them, vessel density
is quantified by morphometric evaluation of histologic CAM
Table 4. Substances that Inhibit Angiogenesis
Pharmacological
  amiloride [165]
In studies of inhibition of angiogenesis, on the other
hand, there are two approaches, which differ fundamentally in
the target vessels, i.e. those which examine the response in
the rapidly growing CAM [104, 132] and those that evaluate
the inhibition of growth induced by a known stimulant, such
as FGF-2 [133]. It is important to remember that inhibition
has rarely  been  described  in studies  of CAMs older than 8
days other than those in which a stimulus such as FGF-2
was used.
There have been a variety of application methods or
carriers described in the literature to test angiogenic or anti-
angiogenic activity  of relevant substances and some of the
most frequently used are previously discussed during the
description of most frequently used assay methods. In
addition, a more comprehensive list of these carriers is given
in Table 3. However, The CAM may also be used to test
the growth and invasiveness of a variety of tumors by
implanting them onto the CAM and by comparing tumor
growth and vascularization  with or without the
administration of an anti-angiogenic substance [127, 134-
136].
In terms of quantification of responses  an  outline  of  most
frequently used methods can be given as follows:
Scoring
Evaluation may be made by direct observation of the
presence or absence of a feature, or based on an arbitrary
score, i.e. + to 4+ or 0 to 3 or as “positive”, “negative” or
“questionable”. The features evaluated for alteration in
angiogenesis  include  vessel density, new vessel formation,
vessels tortuosity (bending or looping and corkscrew), vessel
disorganization, characteristics of vessel branching, number
of intersepts of vessels with a series of concentric circles, and
the size, surface area, number etc. of an avascular zone, where
angiogenesis is inhibited [46, 137-141]. The scoring method
is considered as a “semiquantitative” evaluation of the
response. An example of its use in testing of the inhibition
of angiogenesis, most important in anti-cancer research, is
that where two independent observers determine the radius of
Current Cancer Drug Targets,  2005, Vol.  5,  No. 4 259
sections fixed at regular intervals after implantation. The
total number of vessels in 6 randomly chosen fields is
counted. Vessel density is evaluated planimetrically with a
12-line by 12-line reticule inserted in the eyepiece of a
photomicroscope. The total number of intersection points in
6 randomly chosen fields occupied by transversally sectioned
microvessels 3 to 10 mm in diameter are counted. Vessel
number and density are determined by two independent
observers  and  processed  statistically.  Quantitative assays of
agiogenesis for CAM are also reviewed recently [143].
Finally, angiographic techniques are developed to evaluate
the morphometric parameters of treated CAMs. In such a
study the fluorescence intensity of FITC-dextran injected
Growth Factor-Related
  anti-bFGF antibody [203]
   anthracyclines and titanocene bichloride [166]   VEGI, (a protein of the TNF superfamily) [144]
  doxorubicin [162]
  bleomycin [162]   VEGF- diphtheria toxin conjugate [121, 159]
  DFMO (inhibitor of ornithine decarboxylase) [159]   TGF 1 [204]
  suramin and suramin anlogues [167, 175]   anti-VEGF antibody [205]
  retinoids [168, 158]   PDGF-AA and PDGF –BB [206]
  synthetic retinoid:fenretinide [169]   hepatocyte growth factor-like basic peptides [207]
  aminopeptidase-N antagonists [170]
  purine analogue [171]   Anti-PlGF-1 antibody [208]
  cyclosporin [172]
  protamine [173] Cell Biology-Related
  somatostatin and somatostatin analogue [174]   Anti-angiogenin antibody [209-213]
  kininostat [176]   angiostatin [214]
  aspirin [168]   angiotensinogen and cleaved derivatives [215]
  sulindac derivatives [168]   cortisone and heparin [161, 166]
  thalidomide [168]   steroids [216, 217]
  Tamoxifen [168]   homocysteine [218]
  motuporanines (extract of marine sponge) [177]   Endostatin [219]
  1,4-Pheylwnebis (methylene) selenocyanate [178]   Protamine sulfate [116, 217]
  NAMI-A (ruthenium red based compound) [179]   Platelet factor-4 [220]
  kininogen and kininogen derived polypeptides [180]   Heparanase inhibitors [221]
  indinavir and saquinavir (HIV protease inhibitors) [181]   Antagonists of adhesion molecules [222]
  thymidine phosporylase inhibitor [223]
  a-Thymosin peptides [182]   prothrombin fragments 1 and 2 [224]
  2-aroylindole derivatives (Synthetic tubulin inhibitors) [183]   PAI-1 [225]
  dominant-negative p65 PAK peptide [226]
  pentosan polysulfate (inhibitor of HIV-1 Tat) [184]   Interleukin-2 [227]
  apomorphine: a dopamine receptor inhibitor [185]
  non- or low-sulfated saccharides [186] Connective Tissue-Related
  lactacystin inhibition of the proteasome [187]   Matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors [228]
  p38 MAP kinase [188]
  goniodomin A (an antifungal polyeter macrolide) [189]   MMP-3 [228]
  inhibitors of collagen deposition [229]
  GM 1474 [190]   Heparan sulfate [230]
  Inhibitor of arylsulfatase [191]
  Alpha, beta, gamma-cyclodextrin [192] Cartilage-Related
  Spironolactone [193]   squalamine [231]
  Tyrosine kinase inhibitors [194-197]   U-995, Shark Cartilagederived peptide [229]
  Nitric oxide [198-202]   growth plate chondrocytes conditioned medium [232]
  metastatin(a hyaluronanbinding protein from cartilage) [233]
260   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 Tufan and Satiroglu-Tufan

into the CAM circulation was evaluated as an index of cells must be  located  near  blood  vessels  in  order  to  survi
angiogenesis [144]. ve
Biochemical  Evaluation  of  Angiogenesis and grow. In 1971, Folkman [148] proposed
that
In this group collagen production, DNA and/or protein neovascularization of a tumor was required to provi
synthesis, BrdU/3H-thymidine uptake, size of CAM, and de
alterations in  the  expression  patterns  of  signaling  molecules essential nutrients beyond the limit of simple diffusion a
involved in the angiogenesis process, such as FGF-2, nd
VEGF, integrins etc. [previously discussed in this rewiev], to allow for growth beyond 1 to 2 mm. The growth a
can be evaluated [46]. nd
This outline of quantification methods can be further metastatic capacity of malignant tumors have been shown 
extended, however, it is a fact that all recently suggested to
methods of quantification are based on these classical be  highly dependent on the ability to develop new blo
techniques with some modifications [145-147]. od
vessels. Thus, this process has long been evaluated as 
a
ANTI-ANGIOGENIC AGENTS  DEVELOPED BY candidate target for treating primary tumors and reduci
THE USE OF CAM MODEL ng
Development of a vascular supply is critical for most their metastases. Angiogenesis inhibitors are described 
normal physiologic as well as neoplastic processes. Most as
specific/semi-specific (class-1) and non-specific (class-2),
depending on whether they inhibit proliferation and/or
migration of endothelial cells only (non-specific), or are also
toxic for tumor cells (specific) [149].
As a complex, and multistep process angiogenesis
presents several key target mechanisms for therapeutic
interventions. These include interference with angiogenic
stimulators, angiogenic receptors, the extracellular matrix,
the control of angiogenesis by hypoxic signaling,
proteolysis, and vascular targeting. Among many
interventions that are proposed for clinical testing some
inhibitors are currently being tested in human trials, i.e., in
phase I, II, or III clinical studies [150]. Some of these
substances developed by the use of CAM assay are
summarized in Table 4.
CONCLUSIONS
As it is very important to develop model systems to test
angiogenic or anti-angiogenic activity of new interventions,
the perfect experimental model system does probably not
exist. However, in the history of angiogenesis research some
assay systems have been more successfully used compared to
the rest among which is the CAM assay. However, CAM
assay has to be standardized as much as possible to be able
to compare and combine findings from differentlaboratories
especially in the field of anti-tumor drug development.
Combination of CAM assay with in  vitro assay systems
may strengthen the findings regarding a new intervention.
With its many advantages and reasonable limitations CAM
assay has hosted key break troughs in this field, and
promises many more in the future.
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
[18] Zetter, B. R. The cellular basis of site-specific tumor metastasis.
N.  Engl.  J.  Med.  1990,  322, 603-612.
ABBREVIATIONS
BMPR II   = Bone morphogenic protein receptor Type II
CAM      = Chorioallantoic membrane
ECM      = Extracellular matrix
FGF       = Fibroblast growth factor
GAGs     = Glycosaminoglycans
IMG       = Intussusceptive microvascular growth
PDGF     = Platelet-derived growth factor
PDECGF   = Platelet-derived endothelial cell growth
factor
TGF-    = Transforming growth factor alpha
VE        = Vascular endothelial
VEGFR    = Vascular endothelial growth factor receptor
VPF/VEGF = Vascular permeability factor/vascular
endothelial growth factor
REFERENCES
[1]      Allen, W. E.; Wilson, D. J. Early embryonic angiogenesis in the
chick area vasculosa.  J.  Anat. 1993,  183, 579-585.
[2]      Augustin, H.G. Translating angiogenesis research into the clinic:
the challenges ahead.  Br.  J.  Radiol. 2003,  76, S3-S10.
[3]      Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis
dependent?  J.  Natl.  Cancer  Inst. 1990,  82, 4-6.
[4]      Folkman, J. In Cancer  Medicine; Holland, J. F., Frei, E., Bast, R.
C., Kufe, D. W., Morton, D. I., and Weichselbaum, R. R. Eds.; BC
Decker Inc; Hamilton, Ontario, 1992.
[5]      Jain, R. K.; Schlenger, K.; Hockel, M.; Yuan, F. Quantitative
angiogenesis assays: progress and problems. Nat.  Med. 1997,
3,1203-1208.
[6]      Auerbach, R.; Popp, B. L.; Kiley, L. M.; Gilligan, B. J.
Angiogenesis assays: problems, pitfalls and potential. In:
Therapeutic implications and mechanisms of angiogenesis
inhibitors and stimulators; Hori, W., Ed.; IBC USA Conferences,
Inc: Westborough, MA, 1996, pp. 131-139.
[7]      Auerbach, R.; Auerbach, W.; Polakowski, I. Assays for
angiogenesis.  Pharmacol.  Ther. 1991,  51, 1-11.
[8]      Auerbach, W.; Auerbach, R. Angiogenesis inhibition: a review.
Pharmacol.  Ther. 1994,  63, 265-311.
[9]      Folkman, J.; Browder, T.; Palmblad, J. Angiogenesis research:
guidelines for translation to clinical application.  Thromb. Haemost.
2001,  86, 23-33.
[10]     Risau, W. Mechanisms of angiogenesis.  Nature  1997,  386, 671-
674.
[11]     Staton, C. A.; Stribbling, S. M.; Tazzyman, S.;  Hughes,  R.;  Brown,
N. J.; Lewis, C. E. Current methods for assaying angiogenesis  in
vitro and  in  vivo.  Int.  J.  Exp.  Pathol.  2004,  85, 233-248.
[12] Ho, P. Y.; Liang, Y. C.; Ho, Y. S.; Chen, C. T.; Lee, W. S.
Inhibition of human vascular endothelial cells proliferation by
terbinafine.  Int.  J.  Cancer 2004,  111, 51-59.
[13]     Cao, Y. Antiangiogenic cancer therapy.  Semin.  Cancer  Biol.
2004,  14, 139-145.
[14]     Auerbach, R.; Lewis, R.; Shinners, B.; Kubai, L.; Akhtar, N.
Angiogenesis assays: a critical overview. Clin.  Chem. 2003,  49,
32-40.
[15]     Auerbach, R. Vascular endothelial cell differentiation: organ-
specificity and selective affinities as the basis for developing
anticancer strategies.  Int.  J.  Radiat.  Biol. 1991,  60, 1-10.
[16]     Gumkowski, F.; Kaminski, G.; Kaminski, M.; Morisset, L. M.;
Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium: In
vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular
endothelial cells.  Blood  Vess. 1987,  24, 11-23.
[17]     Auerbach, R.; Auerbach, W. In Tumor angiogenesis and
microcirculation, Assays  to  study  angiogenesis. Voest, E. E.;
D’Amore, P. A., Eds.; Marcel Dekker: New York, 2001, pp. 91-
102.
Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 261
[19] Arap, R. D.; Hagbedorn, M.; Koivunen, E.; Pasqualini, 
R.;
 Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium
revealed by  in  vivo phage display.  J.  Clin. Invest. 1998, 102, 430-
437.
[20] Kolonin, M.; Pasqualini, R.; Arap, W. Molecular addresses in
blood vessels as targets for therapy.  Curr.  Opin.  Chem. Biol. 2001,
5, 308-313.
[21] Schor, A. M.; Ellis, I.; Schor, S. L. In  Angiogenesis  protocol:
Chemotaxis and  chemokinesis in  3D  macromolecular matrices.
Murray, J. C. Ed.; Humana Press: Totowa, NJ, 2001, pp. 163–204.
[22] Obeso, J. L.; Auerbach, R. A new microtechnique for quantitating
cell movement in  vitro using polystyrene bead monolayers. J.
Immunol.  Methods 1984,  70, 141-152.
[23] Obeso, J.; Weber, J.; Auerbach, R. A hemangioendothelioma-
derived cell line: its use as a model for the study of endothelial
cell biology.  Lab.  Invest. 1990,  63, 259-269.
[24] Madri, J. A.; Pratt, B. M.; Tucker, A. M. Phenotypic modulation of
endothelial cells by transforming growth factor-beta depends
upon the composition and organization of the extracellular matrix.
J.  Cell  Biol. 1988,  106, 1375-1384.
[25] Grant, D. S.; Kibbey, M. C.; Kinsella, J. L.;  Cid,  M.  C.;  Kleinman,
H. K. The role of basement membrane in angiogenesis and tumor
growth.  Pathol.  Res.  Pract. 1994,  190, 854-863.
[26] Grant, D. S.; Kleinman, H. K.; Leblond, C. P.; Inoue, S.; Chung, A.
E.; Martin, G. R. The basement-membrane-like matrix of the
mouse EHS tumor: II. Immunohistochemical  quantitation of six of
its components. Am.  J.  Anat. 1985,  174, 387-398.
[27] Grant, D. S.; Kinsella, J. L.; Fridman, R.; Auerbach, R.; Piasecki,
B. A.; Yamada, Y.; Zain, M.; Kleinman, H. K. Interaction of
endothelial cells with a laminin a chain peptide (SIKVAV)  in vitro
and induction of angiogenic behavior  in vivo.  J.  Cell  Physiol.
1992,  153, 614-625.
[28] Nicosia, R. F.; Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free
matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in
vitro.  Lab.  Invest. 1990,  63, 115-122.
[29] Burbridge, M. F.; West, D. C. In  Angiogenesis  protocols.  Rat
aortic  ring:  3D  model  of angiogenesis in vitro. Murray, J. C. Ed.;
Humana Press: Totowa, NJ, 2001, pp. 85-204.
[30] Plendl, J.; Hartwell, L.; Auerbach, R. Organ-specific change in
Dolichos biflorus lectin binding by myocardial endothelial cells
during  in  vitro cultivation. In  vitro Cell Dev. Biol. 1993,  29A, 25-
31.
[31] Plendl, J.; Gilligan, B. J.; Wang, S. J.; Lewis, R.; Shinners, B.;
Vandenbroeck, K. Auerbach, R. Primitive endothelial cell lines
from the porcine embryonic yolk sac.  In vitro  Cell  Dev.  Biol.
Anim. 2002,  38, 334-342.
[32] Muthukkaruppan, V. R.; Shinners, B. L.; Lewis, R.; Park, S. J.
Baechler, B. J., Auerbach, R. The chick embryo aortic arch
assay: a new, rapid, quantifiable  in  vitro method for testing the
efficacy of angiogenic and anti-angiogenic factors in a three-
dimensional, serum-free organ culture system.  Proc.  Am.  Assoc.
Cancer  Res. 2000,  41, 65.
[33] Algire, G. H. An adaptation of the transparent chamber technique
to the mouse.  J.  Natl.  Cancer  Inst. 1943,  4, 1-11.
[34] Murray, J.C. Ed. Angiogenesis protocols. Methods in molecular
medicine; Humana Press: Totowa, NJ, 2001.
[35] Gimbrone, M. A. Jr.; Leapman, S. B.; Cotran, R. S.; Folkman, J.
Tumor dormancy  in vivo by prevention of neovascularization.  J.
Exp.  Med. 1974,  136, 261-276.
[36] Muthukkaruppan, V. R.; Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse
cornea.  Science 1979,  205, 1416-1418.
[37] Muthukkaruppan, V. R.; Kubai, L.; Auerbach, R. Tumor-induced
neovascularization in the mouse eye.  J. Natl.  Cancer Inst. 1982,
69, 699-708.
[38] Kisker, O.; Becker, C. M.; Prox, D.; Fannon, M.; D’Amato, R.;
Flynn, E., Fogler, W. E.; Sim, B. K.; Allred, E. N.; Pirie-Shepherd,
S. R.; Folkman, J. Continuous administration of endostatin by
intraperitoneally implanted osmotic pump improves the efficacy
and potency of therapy in a mouse xenograft tumor model.
Cancer  Res. 2001,  61, 7669-7674.
[39] Akhtar, N.;  Dickerson, E. B.; Auerbach, R. The sponge/Matrigel
angiogenesis assay.  Angiogenesis 2002,  5, 75-80.
[40] Kenyon, B. M.; Voest,  E.  E.;  Chen,  C.  C.;  Flynn,  E.;  Folkman,  J.;
D’Amato, R.J. A model of angiogenesis in the mouse cornea.
Invest.  Ophthalmol.  Vis.  Sci. 1996,  37, 1625-1632.
262   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
[63] Form, D. M.; Pratt, B. M.; Madri, J. A. Endothelial cell
proliferation during angiogenesis.  In  vitro modulation by basement
[41]     Passaniti, A.; Taylor, R. M.; Pili, R.; Guo, Y.; Long, P. V.; Haney,
J. A; Pauly, R. R.; Grant, D. S.; Martin, G. R. A simple,
quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic
agents using reconstituted basement membrane, heparin and
fibroblast growth factor.  Lab.  Invest. 1982,  67, 519-528.
[42] Johns, A.; Freay, A. D.; Fraser, W.; Korach, K. S.; Rubanyi, G. M.
Disruption of estrogen    receptor gene prevents 17beta-
estradiolinduced angiogenesis in transgenic mice.  Endocrinology
1996,  137, 4511-4513.
[43]     Ribatti, D. The first evidence of the tumor-induced angiogenesis
in  vivo by using the chorioallantoic membrane assay dated 1913.
Leukemia 2004,  18, 1350-1351.
[44]     Ribatti, D.; Vacca A. Models for studying angiogenesis in  vivo.
Int.  J.  Biol.  Markers 1999  14, 207-213.
[45]     Thompson, W. D.; Reid, A. Quantitative assays for the chick
chprioallantoic membrane.  Adv.  Exp. Med. Biol. 2000,  476, 225-
236.
[46] Richardson, M.; Singh, G. Observations on the use of the avian
chorioallantoic membrane (CAM) model in investigations into
angiogenesis. Curr.  Drug  Targets-Cardiovasc.  Haematol.  Disord.
2003,  3, 155-185.
[47] Ribatti, D.; Nico, B.; Vacca, A.; Roncali, L.; Burri P. H.; Djonov,
V.; Chorioallantoic membrane capillary bed: a useful target for
studying angiogenesis and anti-angiogenesis  in  vivo.  Anat.  Rec.
2001,  264, 317-324.
[48]     Schlatter, P.; Konig, M. F.; Karlsson L. M.; Burri, P. H.
Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the
chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo.
Microvasc.  Res. 1997,  54, 65-73.
[49]     Ribatti, D.; Presta, M. The role of fibroblast growth factor-2 in the
vascularization of the chick embryo chorioallantoic membrane.  J.
Cell  Mol.  Med. 2002,  6, 439-446.
[50]     Valdes, T. I.; Kreutzer, D.; Moussy, F. The chick chorioallantoic
membrane as a novel  in  vivo model for the testing of biomaterials.
J.  Biomed.  Mater.  Res. 2002,  62, 273-282.
[51]     Miller, S. A.; Bresee, K. L.; Michaelson, C. L.; Tyrell, D. A.
Domains of differential cell proliferation and formation of amnion
folds in chick embryo ectoderm.  Anat.  Rec. 1994,  238, 225-236.
[52]     Dunn, B. E.; Boone, M. A. Photographic study of chick embryo
development  in  vitro.  Poult.  Sci. 1978,  57, 370-377.
[53]     DeFouw, D. O.; Rizzo, V. J.; Steinfeld, R.; Feinberg, R. N.
Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic
membrane during normal angiogenesis.  Microvasc.  Res. 1989,  38,
136-147.
[54]     Wangenstein, D.; Weibel, E. R. Morphometric evaluation of
chorioallantoic oxygen transport in the chick embryo.  Respir.
Physiol. 1982,  47, 1-20.
[55]     Ausprunk, D. H.; Knighton, D. R.; Folkman, J. Differentiation of
vascular endothelium in the chick chorioallantois: a structural and
autoradiographic study.  Dev.  Biol.  1974,  38, 237-248.
[56]     Fuchs, A.; Lindenbaum, E. S. The two- and three-dimensional
structure of the microcirculation of the chick chorioallantoic
membrane.  Acta  Anat. 1988,  131, 271-275.
[57]     Ausprunk, D. H. Distribution of hyaluronic acid and sulfated
glycosaminoglycans during blood-vessel development in the chick
chorioallantoic membrane.  Am.  J.  Anat. 1986,  177, 313-331.
[58]     Ribatti, D.; Bertossi, M.; Nico, B.; Vacca, A.; Ria, R.; Riva, A.;
Roncali, L; Presta, M. Role of basic fibroblast growth factor in the
formation of the capillary plexus in the chick embryo
chorioallantoic    membrane. An   in situ    hybridization,
immunohistochemical and ultrastructural study.  J. Submicrosc.
Cytol.  Pathol. 1998,  30, 127-136.
[59] Ribatti, D.; Vacca, A.; Costantino, F.; Minischetti, M.; Locci, P.;
Becchetti, E.; Roncali, L., Dammacco, F. Exogenous heparin
induces fibronectin overexpression parallel to angiogenesis in the
extracellular matrix of the chick embryo chorioallantoic
membrane.  Tissue  Cell 1997,  29, 131-136.
[60]     Risau, W.; Lemmon, V. Changes in the vascular extracellular
matrix during embryonic vasculogenesis and angiogenesis. Dev.
Biol. 1988,  125, 441-450.
[61]     Missirlis, E.; Karakiulakis, G.; Maragoudakis, M. E. Angiogenesis
is associated with collagenous protein synthesis and degradation in
the chick chorioallantoic membrane.  Tissue  Cell 1990,  22, 419-
426.
[62]     Regazzoni, C.; Winterhalter, K. H.; Rohrer, L. Type I collagen
induces expression of bone morphogenetic protein receptor type
II.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 2001,  283, 316-322.
Tufan and Satiroglu-Tufan
membrane components.  Lab.  Invest. 1986,  55, 521-530.
[64] Nicosia, R. F.; Madri, J. A. The microvascular extracellu
lar
matrix. Developmental changes during angiogenesis in the aortic
ring-plasma clot model.  Am.  J.  Pathol. 1987,  128, 78-90.
[65] Poole, T. J.; Coffin, J. D. Vasculogenesis and angiogenesis: two
distinct morphogenetic mechanisms establish embryonic vascular
pattern.  J.  Exp.  Zool. 1989,  251, 224-231.
[66] Ribatti, D.; Vacca, A.; Presta, M. The discovery of angiogenic
factors: A historical review.  Gen.  Pharmacol. 2000,  35, 227-231.
[67] Ferrara, N.; Houck, K.; Jakeman, L.; Leung, D. W. Molecular
and biological properties of the vascular endothelial growth factor
family of proteins.  Endocr.  Rev. 1992,  13, 18-32.
[68] Ferrara, N. Role of vascular endothelial growth factor in the
regulation of angiogenesis.  Kidney  Int. 1999,  56, 794-814.
[69] Malik, A. K.; Gerberü, H. P. Targeting VEGF ligands and
receptors in cancer.  Targets 2003,  2, 48-57.
[70] Ferrara, N. Role of vascular endothelial growth factor in
regulation of physiological angiogenesis.  Am.  J. Physiol. Cell
Physiol. 2001,  280, C1358-C1366.
[71] Ferrara, N.; Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial
growth factor.  Endocr.  Rev. 1997,  18, 4-25.
[72] Hagedorn, M.; Balke, M.; Schmidt, A.; Bloch, W.; Kurz, H.;
Javerzat, S.; Rousseau, B.; Wilting, J.; Bikfalvi, A. VEGF
coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during
vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev. Dyn. 2004,
230, 23-33.
[73] Hood, J. D.; Frausto, R.; Kiosses, W. B.; Schwartz, M. A; Cheresh,
D. A. Differential alphav integrin-mediated Ras-ERK signaling
during two pathways of angiogenesis.  J.  Cell  Biol. 2003,  162, 933-
943.
[74] Esch, F.; Baird, A.; Ling, N.; Veno, N.; Hill, F.; Denoroy, L.;
Klepper, R.; Gospodarowicz, D.; Bohlen, P.; Guillemin, R.
Primary structure of bovine pituitary basic fibroblast growth
factor (FGF) and comparison with the amino-terminal sequence
of bovine brain acidic FGF.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA 1985,  82,
6507-6511.
[75] Ribatti, D.; Nico, B.; Vacca, A.; Roncali, L.; Presta, M.
Endogenous and exogenous fibroblast growth factor-2 modulate
wound healing in the chick embryo chorioallantoic membrane.
Angiogenesis 1999,  3, 89-95.
[76] Bikfalvi, A.; Klein, S.;  Pintucci,  G.;  Rifkin,  D.  B.  Biological  roles
of fibroblast growth factor-2.  Endocr.  Rev. 1997,  18, 26-45.
[77] Pepper, M. S.; Ferrara, N.; Orci, L.; Montesano, R. Potent
synergism between vascular endothelial growth factor and basic
fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in  vitro.
Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 1992,  189, 824-831.
[78] Goto, F.; Goto, K.; Weindel, K.; Folkman, J. Synergistic effects of
vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth
factor on bovine capillary endothelial cells within collagen gels.
Lab.  Invest. 1983,  69, 508-571.
[79] Asahara, T.; Bauters, C., Zheng, L.; Takeshita, S.; Bunting, S.;
Ferrara, N.; Symes, J. F.; Isner, J.M. Synergistic effect of vascular
endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on
angiogenesis  in  vivo.  Circulation 1995,  92, S365- S371.
[80] Alavi, A.; Hood, J. D.; Frausto, R.; Stupack, D. G.; Cheresh, D. A.
Role of Raf in vascular protection from distinct apoptotic stimuli.
Science 2003,  301, 94-96.
[81] Davis, S.; Aldrich, T. H.; Jones, P. F.; Acheson, A.; Compton, D.
L.; Jain, V.; Ryan, T. E.; Bruno, J.; Radziejewski, C.;
Maisonpierre, P. C.;    Yancopoulos, G. D. Isolation of
Angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap
expression cloning.  Cell 1996,  87, 1161-1169.
[82] Suri, C.; Jones, P. F.; Patan, S.; Bartunkova, S.; Maisonpierre, P. C.;
Davis, S.; Sato, T. N.; Yancopoulos, G. D. Requisite role of
Angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic
angiogenesis.  Cell 1996,  87, 1171-1180.
[83] Maisonpierre, P. C.; Suri, C.; Jones, P. F.; Bartunkova, S.;
Wiegand, S. J.; Radziejewski, C.; Compton, D.; McClain, J.,
Aldrich, T. H.; Papadopoulos, N.; Daly, T. J.; Davis, S.; Sato, T.
N.; Yancopoulos, G. D. Angiopoietin-2, a natural antagonist for
Tie2 that disrupts  in  vivo angiogenesis.  Science 1997,  277, 55-60.
[84] Valenzuela, D. M.; Griffiths, J. A.; Rojas, J.; Aldrich, T. H.; Jones,
P. F.; Zhou, H.; McClain, J.; Copeland, N. G.; Gilbert, D. J.;
Jenkins, N. A.; Huang, T.; Papadoupoulos, N.; Maisonpierre, P. C.;
Davis, S.; Yancopoulos, G. D. Angiopoietins 3 and 4: diverging
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
[105]  Satiroglu-Tufan, N. L.; Tufan, A. C. Amelioration of ethanol-
induced growth retardation by all-trans-retinoic acid and alpha-
gene counterparts in mice and humans.  Proc.  Natl. Acad. Sci.USA
1999,  96, 1904-1909.
[85]     Patan, S. Vasculogenesis and angiogenesis as mechanisms of
vascular network formation, growth and remodeling.  J.
Neurooncol. 2000,  50, 1-15.
[86] Jones, P. F.; McClain, J.; Robinson, D. M.; Sato, T. N.;
Yancopoulos, G. D. Identification and characterisation of chicken
cDNAs encoding the endothelial cell-specific receptor tyrosine
kinase Tie2 and its ligands, the angiopoietins.  Angiogenesis 1998,
2, 357-364.
[87] Tournaire, R.; Simon, M. P.; Le Noble, F.; Eichmann, A.; England,
P.; Pouyssegur, J. A short synthetic peptide inhibits signal
transduction, migration and angiogenesis mediated by Tie2
receptor.  EMBO  Rep. 2004,  5, 262-267.
[88]     Sato,  T. N.; Tozawa, Y.; Deutsch, U.; Wolburg-Buchholz, K.;
Fujiwara, Y.; Gendron-Maguire, M.; Gridley, T.; Wolburg, H.;
Risau, W.; Qin, Y. Distinct roles of the receptor tyrosine kinases
Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation.  Nature  1995,  376, 70-
74.
[89]     Puri, M. C.; Partanen, J.; Rossant, J.; Bernstein, A. Interaction of
the TEK and TIE receptor tyrosine kinases during cardiovascular
development.  Development 1999,  126, 4569-4580.
[90] Takakura, N.; Huang, X. L.; Naruse, T.; Hamaguchi, I.; Dumont,
D. J.; Yancopoulos, G. D.; Suda, T. Critical role of the TIE2
endothelial cell receptor in the development of definitive
hematopoiesis.  Immunity  1998,  9, 677-686.
[91]     Suri, C.;  Jones.  P.  F.;  Patan,  S.;  Bartunkova,  S.  ;  Maisonpierre,  P.
C. ; Davis, S.; Sato, T. N.; Yancopoulos, G. D. Requisite role of
angiopoietin-1, a ligand  for the TIE2 receptor, during embryonic
angiogenesis.  Cell 1996,  87, 1171-1180.
[92]     Cheng, N.; Brantley, D. M.; Chen, J. The ephrins and Eph
receptors in angiogenesis.  Cytokine  Growth  Factor  Rev. 2002,  13,
75-85.
[93]     Kullander, K.; Klein, R. Mechanisms and functions of Eph and
ephrin signalling.  Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol. 2002,  3, 475-486.
[94]     Brantley-Sieders, D. M.; Caughron, J.; Hicks, D.; Pozzi, A.; Ruiz,
J. C.; Chen, J. EphA2 receptor tyrosine kinase regulates
endothelial cell migration and vascular assembly through
phosphoinositide 3-kinase-mediated Rac1 GTPase activation. J.
Cell  Sci. 2004,  117, 2037-2049.
[95]     Corada, M.; Liao, F.; Lindgren, M.; Lampugnani, M. G.;
Breviario, F.; Frank, R.; Muller W. A.; Hicklin, D. J.; Bohlen, P.;
Dejana, E. Monoclonal antibodies directed to different regions of
vascular endothelial cadherin extracellular domain affect
adhesion and clustering of the protein and modulate endothelial
permeability.  Blood 2001,  97, 1679-1684.
[96]     Liao, F.; Li, Y.; O’Connor, W.; Zanetta, L.; Bassi, R.; Santiago, A.;
Overholser, J.; Hooper, A.; Mignatti, P.; Dejana, E. Hicklin, D. J.;
Bohlen, P. Monoclonal antibody to vascular endothelial-cadherin
is a potent inhibitor of angiogenesis, tumor growth,  and metastasis.
Cancer  Res. 2000,  60, 6805-6810.
[97] Dejana, E.; Bazzoni, G.; Lampugnani, M. G. Vascular endothelial
(VE)-cadherin: only an intercellular glue? Exp.  Cell Res. 1999,
252, 13-19.
[98]     Carmeliet, P.; Collen, D. Molecular basis  of angiogenesis. Role of
VEGF and VE-cadherin.  Ann.  NY  Acad.  Sci. 2000,  902, 249-264.
[99]     Hicklin, D. J.; Witte, L.; Zhu, Z.; Liao, F.; Wu, Y.; Li, Y.; Bohlen,
P. Monoclonal antibody strategies to block angiogenesis. Drug
Disc.  Today 2001,  6, 517-528.
[100]  Jiang, B. H.; Zheng, J. Z.; Aoki,   M.; Vogt, P. K.
Phosphatidylinositol 3-kinase signaling mediates angiogenesis and
expression of vascular endothelial growth factor in endothelial
cells.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2000,  97, 1749-1753.
[101]  Jiang, B. H.; Aoki, M.; Zheng, J. Z.; Li, J.; Vogt, P. K. Myogenic
signaling of phosphatidylinositol 3-kinase requires the serine-
threonine kinase Akt/protein kinase B.  Proc.  Natl. Acad. Sci. USA
1999,  96, 2077-2081.
[102]  Forough, R.; Weylie, B.; Patel, C.; Ambrus, S.; Singh, U. S.; Zhu, J.
Role of AKT/PKB signaling in fibroblast growth factor-1 (FGF-
1)-induced angiogenesis in the chicken chorioallantoic membrane
(CAM).  J.  Cell.  Biochem. 2005,  94, 109-116.
[103]  Tufan, A. C. Shell-less culture of the chick embryo: Procedure of
the technique and its scientific implication areas. J.  Fac.  Med.
Pamukkale  Univ. 2002,  8, 4-9.
[104]  Tufan, A. C.; Satiroglu-Tufan, N. L. The effect of ethanol
exposure on extraembryonic vascular development in the chick
area vasculosa.  Cells Tissues Organs 2003,  175, 84-97.
Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 263
tocopherol in shell-less culture of the chick embryo.  Repr
od.
 Toxicol. 2004,  18, 407-412.
[106]  Dunn, B. E.; Fitzharris, T. P. Differentiation of the chorionic
epithelium of chick embryos maintained in shell-less culture.  Dev.
Biol. 1979,  71, 216-227.
[107]  Narbaitz, R.; Jande, S. S. Ultrastructural observation on the
chorionic epithelium, parathyroid glands and bones from chick
embryos developed in shell-less culture. J.  Embryol. Exp.
Morphol. 1978,  45, 1-12.
[108]  Auerbach, R.; Kubai, L.; Knighton, D.; Folkman, J. A simple
procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.  Dev.
Biol. 1974,  41, 391-394.
[109]  Lawrence, R. S.; Groom, H.; Ackroyd, D. M.; Parish W. E.; The
chorioallantoic membrane in irritation testing. Fd. Chem. Toxic.
1986,  24, 497-502.
[110]  Brooks, P. C.; Montgomery, A. M. P.; Cheresh, D. A. Use of the
10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.
Methods  Mol.  Biol. 1999,  129, 257-269.
[111]  Peek, M. J.; Norman, T. M.; Morgan, C.; Markham, R.; Fraser, I.
S. The chick chorioallantoic membrane assay, an improved
technique for the study of angiogenic activity.  Exp. Pathol. 1988,
34, 35-40.
[112]  Hamamichi, S.; Nishigori, H. Establishment of a chick embryo
shell-less culture system and its use to observe change in behavior
caused by nicotine and substances from cigarette smoke.  Toxicol.
Lett. 2001,  119, 95-102.
[113]  Hamburger, V.; Hamilton, H. L. A series of normal stages in the
development of the chick embryo.  J.  Morphol. 1951,  88, 49-92.
[114]  Giles, J. J.; Bannigan, J. G. The effects of lithium on vascular
development in the chick area vasculosa.  J.  Anat. 1999,  194, 197-
205.
[115]  Jakobson, A. M.; Hahnenberger, R.; Magnusson, A. A simple
method for shell-less cultivation of chick embryos. Pharmacol.
Toxicol. 1989,  64, 193-196.
[116]  Tanaka, N. G.; Sakamoto, M.; Tohgo, A.; Nishiyama, Y.; Ogawa,
H. Inhibitory effects of anti-angiogenic agents on
neovascularization and growth of the chorioallantoic membrane
(CAM). The possibility of a new CAM assay for angiogenesis
inhibition. Exp.  Pathol. 1986,  30, 143-150.
[117]  Dunn, B. E.; Fitzharris, T. P.; Barnett, B. D. Effects of varying
chamber construction and embryo preincubation age on survival
and growth of chick embryos in shell-less culture. Anat.  Rec.
1981,  199, 33-43.
[118]  Dugan, J. D. Jr.; Lawton, M. T.; Glaser, B.; Brem, H. A new
technique for explantation and  in  vitro cultivation of chicken
embryos.  Anat.  Rec. 1991,  229, 125-128.
[119]  DeFouw, L. M.; DeFouw, D. O. Modulation of angiogenic
endothelial permselectivity by the cAMP pathway.  Microvasc.
Res. 1999,  57, 19-29.
[120]  DeFouw, L.M.; DeFouw, D.O. Vascular endothelial growth factor
fails to acutely modulate endothelial permeability during early
angiogenesis in the chick chorioallantoic membrane.  Microvasc.
Res. 2000,  60, 212-221.
[121]  Ramakrishnan, S.; Olson, T. A.; Bautch, V. L.; Mohanraj, D.
Vascular endothelial growth factor-toxin conjugate specifically
inhibits KDR/flk-1-positive endothelial cell proliferation in  vitro
and angiogenesis  in  vivo.  Cancer  Res. 1996,  56, 1324-1330.
[122]  Danesi, R.; Del Bianchi, S.; Soldani, P.; Campagni, A.; La Rocca,
R. V.; Meyers, C. E.; Paparelli, A.; Del Tacca, M. Suramin inhibits
bFGF-induced endothelial cell proliferation and angiogenesis in
the chick chorioallantoic membrane.  Br.  J.  Cancer 1993,  68, 932-
938.
[123]  West, D. C.; Thompson, R. W.; Sells, P. G.; Burbridge, M. F. In
Angiogenesis assays using chick  chorioallantoic membrane:
Methods  in  Molecular  Medicine,  Angiogenesis  Protocols. Murray,
J. Ed.; Humana Press Inc: Totowa, NJ, 2001, pp.107-129.
[124]  Knighton, D. R.; Fiegel, V. D.; Phillips, G. D. The assay of
angiogenesis.  Prog.  Clin.  Biol.  Res. 1991,  365, 291-299.
[125]  Jain, R. K.; Schlenger, K.; Hökel, M.; Yuan, F. Quantitative
angiogenesis analysis, Progress and problems.  Nat. Med. 1997,  3,
1203-1208.
[126]  Ribatti, D.; Vacca, A.; Roncali, L.; Dammacco, F. The chick
embryo chorioallantoic membrane as a model for  in  vivo research
on anti-angiogenesis.  Curr.  Pharm.  Biotechnol. 2000,  1, 73-82.
264   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
[147]  Borges, J.; Tegtmeier, F. T.; Padron, N. T.; Mueller, M. C.; Lang,
E. M.; Stark, G. B. Chorioallantoic membrane angiogenesis model
for tissue engineering: a new twist on a classic model.  Tissue  Eng.
[127]  Ribatti, D.; Vacca, A.; Roncali, L.; Dammacco, F. The chick
embryo chorioallantoic membrane as a model for  in  vivo research
on angiogenesis.  Int.  J.  Dev.  Biol. 1996,  40, 1189-1197.
[128]  Barnhill, R. L.; Ryan, T. J. Biochemical modulation of
angiogenesis in the chorioallantoic membrane of the chick
embryo.  J.  Invest.  Dermatol. 1983,  81, 485-488.
[129]  Jakob, W.; Jentzsch, E. D.; Mauersberger, B.; Heder, G. The
chick embryo chorioallantoic membane as a bioassay for
angiogenesis factors, Reactions induced by carrier materials.  Exp.
Path. 1978,  15, 241-249.
[130]  Raab, U.; Lastres, P.; Arévalo, M. A.; López-Novoa, J. M.;
Cabañas, C.; de l Rosa, E.J.; Bernabéu, C. Endoglin is expressed in
the chicken vasculature and is involved in angiogenesis.  FEBS
Lett. 1999,  459, 249-254.
[131]  Kurz, H.; Wilting, J.; Sandau, K.; Christ, B. Automated evaluation
of angiogenic effects mediated by VEGF and PlGF homo- and
heterodimers.  Microvasc.  Res. 1998,  55, 92-102.
[132]  O'Reilly, M.  S.;  Holmgren,  L.;  Shing,  Y.;  Chen,  C.;  Rosenthal,  R.
A.; Moses, M.; Lane, W. S.; Cao, Y.; Sage, E. H.; Folkman, J.
Angiostatin, A novel angiogenesis inhibitor that mediates the
suppression of metastses by a Lewis lung carcinoma.  Cell 1994,
79, 315-325.
[133]  Ribatti, D.; Gualandris, A.; Bastaki, M.; Vacca, A.; Iurlaro, M.;
Roncali, L.; Presta, M. New model for the study of angiogenesis
and antiangiogenesis in the chick embryo chorioallantoic
membrane, The gelatin sponge chorioallantoic assay.  J.  Vasc.
Res. 1997,  34, 455-463.
[134]  Ossowski, L.; Reich, E. Experimental model for quantitative study
of metastasis.  Cancer  Res. 1980,  40, 2300-2309.
[135]  Chambers, A. F.; Shafir. R.; Ling, V. A model system for studying
metastasis using the embryonic chick.  Cancer  Res. 1982,  42,
4018-4025.
[136]  Nishikawa, K.; Sasaki, T.; Tanaka, M.; Uchida, H.; Endo, Y.;
Fukuma, H.; Chuman, H.; Beppu, Y.; Matsumoto, K.; Nitta, K.
Experimental model for predicting metastatic ability of tumors
using chick embryo.  Jpn.  J.  Clin.  Oncol. 1987,  17, 319-325.
[137]  Harris-Hooker, S. A.; Gajdusek, C. M.; Wight, T. N.; Schwartz, S.
M. Neovascular responses induced by cultured aortic endothelial
cells.  J.  Cell.  Physiol. 1983,  114, 302-310.
[138]  Vu, M. T.; Burger, P. C.; Klintworth, G. K. Angoigeneic activity in
injured rat corneas as assayed on the chick chorioallantoic
membrane.  Lab.  Invest. 1985, 53, 311-319.
[139]  Palczak, R.;  Splawinski, J. Angiogenic activity and
neovascularization in adenocarcinoma of the endometrium.  Int. J.
Gynecol.  Obstet. 1989,  29, 343-357.
[140]  Klagsbrun, M.; Knighton, D.; Folkman, J. Tumor angiogenesis
activity in cells grown in tissue culture. Cancer  Res. 1976,  36,
110-114.
[141]  Barrie, R.; Woltering, E. A.; Hajarizadeh, H.; Mueller, C.; Ure,
T.; Fletcher, W. S. Inhibition of angiogenesis by somatostatin and
somatostatin-like compounds is structurally dependent.  J. Surg.
Res. 1993,  55, 446-450.
[142]  Ribatti, D.; Vacca, A.; Bertossi, M.; De Benedicts, G.; Roncali, L.;
Dammacco, F. Angiogenesis induced by Bcell non-Hodgkin's
lymphomas. Lack of correlation with tumor malignacy and
immunologic phenotype.  Anticancer  Res. 1990,  10, 401-406.
[143]  Thompson, W. D.; Reid, A. Quantitative assays for the chick
chorioallantoic membrane.  Adv.  Exp. Med. Biol. 2000,  476, 225-
236.
[144]  Zhai, Y.; Yu, J.; Iruels-Arispe, M. L.; Huang, W. -Q.; Wang, Z.;
Hayes, A. J.; Lu, J.; Jiang, G.; Roias, L.; Lippman, M. E.; Ni, J.;
Yu, G. -L.; Li, L. -Y. Inhibition of angiogenesis and brear cancer
xenograft tumor graft growth by VEGI, a novel cytokine of the
TNF superfamily.  Int.  J.  Cancer 1999,  82, 131-136.
[145]  Miller, W. J.; Kayton, M. L.; Patton, A.; O'Connor, S.;He, M.; Vu,
H.; Baibakov, G,; Lorang, D.; Knezevic, V.; Kohn, E.; Alexander,
H.  R.;  Stirling,  D.;  Payvandi,  F.;  Muller,  J. W.; Libutti, S. K. A
novel technique for quantifying changes in vascular density,
endothelial cell proliferation and protein expression in response to
modulators of angiogenesis using the chick chorioallantoic
membrane (CAM) assay.  J.  Transl.  Med. 2004,  2, 4.
[146]  Gonzalez-Iriarte, M.; Carmona, R.; Perez-Pomares, J. M.;
Macias, D.; Angel Medina, M.; Quesada, A. R.; Munoz-Chapuli,
R. A modified chorioallantoic membrane assay allows for specific
detection of endothelial apoptosis induced by antiangiogenic
substances.  Angiogenesis 2003,  6, 251-254.
Tufan and Satiroglu-Tufan
2003,  9, 441-450.
[148]  Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications.  N. E
ngl.
 J.  Med. 1971,  18, 285, 1182-1186.
[149]  Voest, E. E. Inhibitors of angiogenesis in a clinical perspective.
Anticancer  Drugs 1996,  7, 723-727.
[150]  Gasparini, G. The rationale and future potential of angiogenesis
inhibitors in neoplasia. Drugs 1999,  58, 17-38.
[151]  Form, D. M.; Auerbach, R. PGE2 and angiogenesis.  Proc.  Soc.
Exper.  Biol.  Med. 1983,  172, 214-218.
[152]  Kisker , O.; Onizuka, S.; Banyard, J.; Komiyama, T.; Becker, C.
M.; Achilles, E. G.; Barnes, C. M.; O'Reilly, M. S.; Folkman, J.;
Pirie-Shepherd, S. R. Generation of multiple angiogenesis
inhibitors by human pancreatic cancer.  Cancer  Res. 2002,  61,
7298-7304.
[153]  Nguyen, M.; Shing, Y.; Folkman, J. Quantitation of Angiogenesis
and Antiangiogenesis in the Chick Embryo Chorioallantoic
Membrane.  Microvasc.  Res. 1994,  47, 31-40.
[154]  Pasqualini, R.; Koivunen, E.; Kain, R.; Lahdenranta, J.; Sakamoto,
M.; Stryhn, A.; Ashmun, R. A.; Shapiro, L. H.; Arap, W.; Ruoslati,
E. Aminioeotidase N is a receptor for tumor-homing peptides and
a target for inhibiting angiogenesis. Cancer  Res. 2001,  60, 722-
727.
[155]  Arora, N.; Masood, R.; Zheng, T.; Cai, J.; Smith, L.; Gill, P. S.
Vascular endothelial growth factor chimeric toxin is highly active
aginst endothelial cells.  Cancer  Res. 1999,  59, 183-188.
[156]  Oh, S. J.; Jeltssch, M. M.; Birkenhäger, R.; McCarthy, J. E.;
Weich, H. A.; Christ, B.; Alitalo, K.; Wilting, J. VEGF and VEGF-
C.specific induction of angiogenesis and lymphangiogenesis in the
differentiated avian chorioallantoic membrane.  Dev. Biol. 1997,
188, 96-109.
[157]  Wilting, J.; Christ, B.; Bokeloh, M.; Weich, H. A.  In  vivo effects
of vascular endothelial growth  factor on the chicken
chorioallantoic membrane.  Cell  Tissue  Res. 1993,  274, 163-172.
[158]  Oikawa, T.; Hirotani, K.; Nakamura, O.; Shudo, K.; Iwaguchi, T.
A highly potent antiangiogenic activity of retinoids. Cancer Lett.
1989,  48, 157-162.
[159]  Takigawa, M.; Enomoto,  M.; Nishida, Y.; Pan, H. -O.; Kinoshita,
A.; Suzuki, F. Tumor angiogenesis and polyamines,    -
difluoromethylornithine, an irreversible inhibitor of ornithine
decarboxylase, inhibit B16 melanoma-induced angiogenesis  in
ovo and the proliferation of vascular endothelial cells in  vitro.
Cancer  Res. 1990,  50, 4131-4138.
[160]  Bo, W. J.; Mercuri, M.; Tucker, R.; Bond, M. G. The human
carotid atherosclerotic plaque stimulates angiogenesis on the
chick allantoic membrane.  Atherosclerosis 1992,  94, 71-82.
[161]  Folkman, J.; Langer, R.; Linhardt, R. J.; Haudenschilde, C.;
Taylor, S. Angiogenesis inhibition and tumor regression caused by
heparin or a heparin fragment in the presence of cortisone.
Science 1983,  121, 719-725.
[162]  Splawinski, J.; Michna, M.; Palczak, R.; Konturek, S.; Splwinska,
B. Angiogenesis, quantitative assessment by the  chick
chorioallantoic membrane assay.  Methods  Find. Exp.  Clin.
Pharmacol. 1988,  10, 221-226.
[163]  Ribatti, D.; Roncali, L.; Nico, B.; Bertossi, M. Effects of
exogenous heparin on the vasculogenesis of the chorioallantoic
membrane.  Acta  Anat. 1987,  130, 257-263.
[164]  Min, J. K.; Han, K. Y.; Kim, E. C.; Kim, Y. M.; Lee, S. W.; Kim,
O. H.; Kim, K. W.; Gho, Y. S.; Kwon, Y. G. Capsaicin inhibits  in
vitro and  in  vivo angiogenesis.  Cancer  Res. 2004,  64, 644-651.
[165]  Knoll, A.; Schmidt, S.; Chapman, M.; Wiley, D.; Bulgrin, J.; Blank,
J.; Krichner, L. A comparison of two controlled-release delivery
systems for the delivery of amiloride to control angiogenesis.
Microvasc.  Res. 1999,  58, 1-9.
[166]  Maragoudakis, M. E.; Peristeris, P.; Missirlis, E.; Alaetras, A.;
Andriopoulou, P.; Haralabopoulos, G. Inhibition of angiogenesis
by Anthracyclins and Titaanaocene dichloride.  Ann.  NY  Acad. Sci.
1994,  732, 280-293.
[167]  Gagliardi, A. R.; Kassack, M.; Kremeyer, A.; Muller, G.; Nickel,
P.; Collins, D. C. Antiangiogenic and antiproliferative activity of
suramin analogues. Cancer  Chemother. Pharmacol. 1998,  41,
117-124.
[168]  Sharma, S.; Ghoddoussi, M.; Kelloff, G. J.; Steele, V.E.;
Kopelovich, L. A quantitative angiogenesis model for efficacy
The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
Escherichia  coli K5 polysaccharide derivatives. J. Biol. Chem.
2001,  276, 37900-37908.
testing of chemotherapeutic agents.  Anticancer  Res. 2001,  21,
3829-3838.
[169]  Ribatti, D.; Alessandri, G.; Baronio, M.; Raffaghello, L.; Cosimo,
E.; Marimpietri, D.; Montaldo, P. G.; De Falco, G.; Caruso, A.;
Vacca, A.; Ponzoni, M. Inhibition of neuroblastoma-induced
angiogenesis by fenretinide.  Int.  J.  Cancer 2001,  94, 314-321.
[170]  Bhagwat, S. V.; Lahdenranta, J.; Giordano, R.; Arap, W.;
Pasqualini, R.; Shapiro, L. H. CD13/APN is activated by
angiogenic signals and is essential for capillary tube formation.
Blood 2001,  97, 652-659.
[171]  Presta, M.; Rusnati, M.; Belleri, M.; Ziche, M.; Ribatti, D. Purine
analogue 6-methylmercptopurine riboside inhibits early and late
phases of the angiogenic process. Cancer Res. 1999,  59, 2417-
2424.
[172]  Iurlaro, M.; Vacca, A.; Minischetti, M.; Ribatti, D.; Pellegrino, A.;
Sardanelli, A.; Giacchetta, F.; Dammacco, F. Antiangiogenesis by
cyclosporine.  Exp.  Hematol. 1998,  26, 1215-1222.
[173]  Shing, Y.; Folkman, J.; Haudenschilde, C.; Lund, D.; Crum, R.;
Klagsbrun, M. Angiogenesis is stimulated by a tumor-derived
endothelial cell growth factor. J Cell. Biochem. 1985 ,  29, 275-
287.
[174]  Sheu, J. R.; Yen, M. H.; Kan, Y. C.; Hung, W. C.; Chang, P.T.;
Luk, H. N. Inhibition of angiogenesis  in vitro and  in vivo:
comparison of the relative activities of triflavin, an Arg-Gly-Asp-
containing peptide and anti-alpha(v)beta3 integrin monoclonal
antibody.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 1997,  1336, 445-454.
[175]  Danesi, R.; Agen, C.; Benelli, U.; Di Paolo, A.; Nardini, D.; Bocci,
G.; Campagni, A.; Del Tacca, M. Inhibition of experimental
angiogenesis by the somatostatin analogue Octerotide acetate
(SMS-995).  Clin.  Cancer  Res. 1997,  3, 265-272.
[176]  Colman, R. W.; Jameson, B. A.; Lin, Y.; Johnson, J. T.; Mousa, S.
A. Domain 5 of high molecular  weight kininogen
(kininostatin)down-regulates endothelial cell proliferation and
migration and inhibits angiogenesis.  Blood 2000,  95, 543-550.
[177]  Roskelley, C. D.; Williams, D. E.; McHardy, L. M.; Leong, K. G.;
Troussard, A.; Karsan, A.; Andersen, R. J.; Dedhar, S.; Roberge,
M. Inhibition of tumor cell invasion and angiogenesis by
motuporamines.  Cancer  Res. 2001,  61, 6788- 6794.
[178]  Schumacher, J. J.; Upadhyaya, P.; Ramakrishnan, S. Inhibition of
vascular     endothelial cells by 1, 4-phenylenebis
(methylene)selenocyanate, a    novel chemopreventive
organoselenium compound.  Anticancer  Res. 2001,  21, 1945-1951.
[179]  Vacca, A.; Bruno, M.; Boccarelli, A.; Coluccia, M.; Ribatti, D.;
Bergamo, A.; Sartor, L.; Sava, G. Inhibition of endothelial cell
functions and of angiogenesis by the metastasis inhibitor NAMI-
A.  Br.  J.  Cancer 2002,  86, 993-998.
[180]  Zhang, J. C.; Qi, X.; Juarez, J.; Plunkett, M.; Donate, F.; Sakthivel,
R.; Mazar, A. P.; McCrae, K. R. Inhibition of angiogenesis by
two-chain high molecular weight kininogen (Hka) nd kininogen-
derived polypeptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2002,  80, 85-
90.
[181]  Sgadari, C.; Barillari, G.; Toschi, E.; Carlei, D.; Bacigalupo, I.;
Baccarini, S.; Palladino, C.; Leone, P.; Bugarini, R.; Malavasi, L.;
Cafaro, A.; Falchi, M.; Valdembri, D.; Rezza, G.; Bussolino, F.;
Monini, P.; Ensoli, B. HIV protease inhibitors are potent
antiangiogenic molecules and promote regression of Kaposi
sarcoma.  Nat.  Med. 2002,  8, 225-232.
[182]  Koutrafouri, V.; Leondiadis, L.; Avgoustakis, K.; Livaniou, E.;
Czarnecki, J.; Ithakissios, D. S.; Evangelatos, G. P. Effect of
thymosin peptides on the chick chorioallantoic membrane
angiogenesis model.  Biochim.  Biophys.  Acta 2001,  1568, 60-66.
[183]  Mahboobi, S.; Pongratz, H.; Hufsky, H.; Hockemeyer, J.; Frieser,
M.; Lyssenko, A.; Paper, D. H.; Burgermeister, J.; Bohmer, F. D.;
Fiebig, H. H.; Burger, A. M.; Baasner, S.; Beckers, T. Synthetic 2-
aroylindole derivatives as a new class of  potent  tubulin-inhibitory,
antimitotic agents. J.  Med.  Chem. 2001,  44, 4535-4553.
[184]  Rusnati, M.; Urbinati, C.; Caputo, A.; Possati, L.; Lortat-Jacob, H.;
Giacca, M.; Ribatti, D.; Presta, M. Pentosan polysulfate as an
inhibitor of extracellular HIV-1 Tat. J. Biol. Chem. 2001,  276,
22420-22425.
[185]  Kim, H. J., Koh, P. O.; Kang, S. S.; Paik, W. Y.; Choi, W. S. The
localization of dopamine D2 receptor mRNA in the human
placenta and the anti-angiogenic efect of apomorphine in the
chorioallantoic membrane.  Life  Sci. 2001,  68, 1031-1040.
[186]  Leali, D.; Belleri, M.; Urbinati, C.; Coltrini, D.; Oreste, P.;
Zoppetti, G.; Ribatti, D.; Rusnati, M.; Presta, M. Fibroblast growth
factor-2 antagonist activity and angiostatic capacity of sulfated
Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4 265
[187]  Oikawa, T.; Sasaki, T.; Nakamura, M.; Shimamura,
 M.;
Tanahashi, N.; Omura, S.; Tanaka, K. The proteasome is involved
in angiogenesis.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 1998,  246, 243-
248.
[188]  Matsumoto, T.; Turesson, I.; Book, M.; Gerwins, P.; Claesson-
Welsh, L. p38 MAP kinase negatively regulates endothelial cell
survival, proliferation, and differentiation in FGF-2-stimulated
angiogenesis.  J.  Cell  Biol. 2002,  156, 149-160.
[189]  Abe, M.; Inoue, D.; Matsunaga, K.; Ohizumi, Y.; Ueda, H.;
Asano, T.; Murakami, M.;  Sato, Y. Goniodomin A., an antifungal
polyether macrolide, exhibits antiangiogenic activities    via
inhibition of actin reorganization in endothelial cells. J. Cell
Physiol. 2002,  190, 109-116.
[190]  Tressler, R. J.; Wee, J.; Storm, M.; Fugedi, P.; Perto, C.; Stack, R.
J.; Tyrrell, D. J.;  Killion,  J.  J.  In  Molecular,  Cellular  and  Clinical
Aspects  of  Angiogenesis (M.E. Maragoudakis Ed.), Plenum Press:
New York, 1996, pp. 199-211.
[191]  Chen, N. T.; Corey, E. J.; Folkman, J. Potentiation of angiostatic
steroids by a synthetic inhibitor of arylsulfatase.  Lab. Invest. 1988,
59, 453-459.
[192]  Folkman, J.; Weisz, P. B.; Joullié, M. M.; Li, W. W.;Ewing, W. R.
Control of angiogenesis with synthetic heparin substitutes.  Science
1989,  243, 1490-1493
[193]  Klauber, N.; Browne, F.; Anand-Apte, B.; D’Amato, R. J. New
activity of spironolactone. Inhibition of angiogenesis  in  vitro and
in  vivo.  Circulation 1996,  94, 2566-2571.
[194]  Ashino, H.; Nakamura, O.; Kanayasu, T.; Morita, I.; Murota, S.
Inhibition of angiogenesis by staurosporine, a potent protein
kinase inhibitor.  J.  Antibiot. 1992,  45, 1155-1160.
[195]  Oikawa, T.; Ashino, H.; Shimamura, M.; Hasegawa, M.; Morita,
I.; Murota, S. I. Inhibition of angiogenesis by erbstatin, an inhibitor
of tyrosine kinase.  J.  Antibiot. 1993,  46, 785-790.
[196]  Takano, S.; Gately, S.; Jiang,  J. B.; Brem, S. A
diaminoantraquinone inhibitor of angiogenesis.  J.  Pharmacol.
Exp.  Ther. 1994,  271, 1027-1033.
[197]  Eliceiri, B. P.; Klemke, R.; Stromblad, S.; Cheresh, D. A. Integrin
alphavbeta3 requirement for sustained mitogen-activated protein
kinase activity during angiogenesis.  J.  Cell  Biol. 1998,  140, 1255-
1263.
[198]  Pipili-Synetos, E.; Sakkoula, E.; Maragoudakis, M. E. Nitric oxide
is involved in the regulation of angiogenesis. Brit. J. Pharmacol.
1993,  108, 855-857.
[199]  Pipili-Synetos, E.; Sakkoula,  E.; Haralabopoulos, G.;
Andriopoulou, P.; Peristeris, P.; Maragoudakis, M.E. Evidence that
nitric oxide is an endogenous antiangiogenic mediator. Br. J.
Pharmacol. 1994,  111, 894-902.
[200]  Pipili-Synetos,  E.;  Papageorgiou,  A.; Sakkoula, E.; Sotiropoulou,
G.; Fotsis, T.; Karakiulakis, G.; Maragoudakis, M.E. Inhibition of
angiogenesis, tumour growth and metastasis by the NO-releasing
vasodilators, isosorbide mononitrate and dinitrate.    Br. J.
Pharmacol. 1995,  116, 1829-1834.
[201]  Sakkoula, E.; Pipili-Synetos, E.; Maragoudakis, M. E. Involvement
of nitric oxide in the inhibition of angiogenesis by interleukin-2.
Br.  J.  Pharmacol. 1997,  122, 793-795.
[202]  Pipili-Synetos, E.; Kritikou, S.; Papadimitriou, E.; Athanassiaddou,
A.; Flordellis, C.; Maragoudakis, M. E. Nitric oxide synthase
expresion,  enzyme activity and NO production during
angiogenesis in the chick chorioallantoic membrane.  Br. J.
Pharmacol. 2000,  129, 207-213.
[203]  Ribatti, D.; Urbinati, C.; Nico, B.; Rusnati, M.; Roncali, L.; Presta,
M. Endogenous basic fibroblast growth factor is implicated in the
vascularization of the chick embryo chorioallantoic membrane.
Dev.  Biol.  1995,  170, 39-49.
[204]  Parsons-Wingerter, P.; Lwai, B.; Yang, M. C.; Elliott, K. E.;
Milaninia, A.; Redlitz, A.; Clark, J. I.; Sage, E. H. A novel assay
of angiogenesis in the Quail chorioallantoic    membrane,
Stimulation by bFGF and inhibition by angiostatin according to
fractal dimension and grid intersection.  Microvasc.  Res. 1998,  55,
201-214.
[205]  Vitaliti, A.; Wittmer, M.; Steiner, R.; Wyder, L.; Neri, D.;
Klemenz, R. Inhibition of tumor angiogenesis by a single-chain
antibody directed against vascular endothelial growth factor.
Cancer  Res. 2000,  60, 4311-4314.
[206]  De Marchis, F.; Ribatti, D.; Giampietri, C.; Lentini, A.; Scoccianti,
M.; Capogrossi, C.; Facchiano, A. Platelet derived growth factor
inhibits basic fibroblast growth factor angiogenic properties  in
vitro and  in vivo through  its   receptor.  Blood 2002,  99, 2045-
2053.
[207]  Fazekas, K.; Janovics, A.; Dome, B.; Koska, P.; Albini, A.; Timar,
J. Effect of HGF-like basic hexapeptides on angiogenesis.
Microvasc.  Res. 2001,  62, 440-444.
[208]  Ziche,  M.; Maglione, D.; Ribatti, D.; Morbidelli, L.; Lago, C. T.;
Battisti, M.; Paoletti, I.; Barra, A.; Tucci, M.; Parise, G.; Vincenti,
V.; Granger, H. J.; Viglietto, G.; Persico, M. G. Placenta growth
factor-1 is chemotactic, mitogenic, and angiogenic.  Lab. Invest.
1997,  76, 517-531.
[209]  Shapiro, P.; Vallee, B. L. Human  Placental Ribonuclease Inhibitor
Abolishes Both Angiogenic and Ribonucleolytic Activities of
Angiogenin  Proc.  Natl.  Acad.  Sci. 1987,  84, 2238-2241.
[210]  Shapiro, R.; Vallee, B. L. Site-directed mutagenesis of histidine-13
and histidine-114 of human angiogenin: Alanine derivatives inhibit
angiogenin-induced angiogenesis.  Biochemistry 1989,  28, 7401-
7408.
[211]  Rybak, S. M.; Auld, D. S.; StClair, D. K.; Yao, Q. Z.; Fett, J. W. C-
terminal angiogenin  peptides inhibit the biological and enzymatic
activities of angiogenin. Biochem. Biophys. Res.  Commun. 1989,
162, 535-543.
[212]  Fett, J. W.; Olson, K. A.; Rybak, S. M. A monoclonal antibody to
human angiogenin. Inhibition of ribonucleolytic and angiogenic
activities and localization of the antigenic epitope.  Biochemistry
1994,  33, 5421-5427.
[213]  Gho, Y. S.; Chae, C. B. Anti-angiogenin activity of the peptides
complementary to the receptor-binding site of angiogenin. J. Biol.
Chem. 1997,  272, 24294-24299.
[214]  Scapini, P.; Nesi , L.; Morini, M.; Tanghetti, E.; Belleri, M.;
Noonan , D.; Presta, M.;  Albini, A.; Cassatella, M. A. Generation
of biologically active angiostatin kringle 1-3 by activated human
neutrophils.  J.  Immunol. 2002,  168, 57-98.
[215]  Célérier, J.; Cruz, A.; Lamande, N.; Gasc, J. M.; Corvol, P.
Angiotensinogen and its cleaved derivatives inhibit angiogenesis.
Hypertension 2002,  39 , 224-228.
[216]  McNatt, L. G.; Weimer, L.; Yanni, J.; Clark, A. F. Angiostatic
activity of steroids in the chick embryo CAM and rabbit cornea
models of neovascularization.  J.  Ocul.  Pharmacol.  Ther. 1999,  15,
413-423.
[217]  Crum, R.; Szabo, W.; Folkman, J. A new class of steroids inhibits
angiogenesis in the presence of heparin.  Science 1999,  230, 1375-
1378.
[218]  Nagai, Y.; Tasaki, H.; Takatsu, H.; Nihei, S.; Yamashita, K.;
Toyokawa, T.; Nakashima, Y. Homocystein inhibits angiogenesis
in  vitro and  in vivo.  Biochem.  Biophys.  Res. Commun. 2001,  281,
726-731.
[219]  O’Reilly, M. S.; Boehm, T.; Shing, Y.; Fukai, N.; Vasios, G.; Lane,
W. S.; Flynn, E.; Birkhead, J. R.; Olsen, B. R.; Folkman, J.
Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor
growth.  Cell 1997,  88, 277-285.
[220]  Maione, T. E.; Gray, G. S.; Petro, J.; Hunt, A. J.; Donner, A. L.;
Baver, S. I.; Carson, H. F.; Sharpe, R. J.  Inhibition of angiogenesis
by recombinant human platelet factor-4 and related peptides.
Science 1990,  247, 77-79.
[221]  Lapierre, F.; Holme, K.; Lam, L.; Tressler, R. J.; Storm, N.; Wee,
J.; Stack, R. J.; Castellot, J.; Tyrrell, D. J. Chemical modifications
of heparin that diminish its anticoagulant but preserve its
heparanase-inhibitory, angiostatic, anti-tumor and anti-metastatic
properties.  Glycobiology 1996,  6, 355-366.
[222]  Nguyen, M.; Eilber, F. R.; Defrees, S. Novel synthetic analogs of
sialyl Lewis X can inhibit angiogenesis in  vitro and  in  vivo.
Biochem.  Biopys.  Res.  Commun. 1996,  228, 716-723.
[223]  Liekens, S.; Bilsen, F.; De Clercq, E.; Priego, E. M.; Camarasa, M.
J.; Perez-Perez, M. J.; Balzarini, J. Antiangiogenic activity of a
novel multi-substrate analogue inhibitor of    thymidine
phosphorylase.  FEBS  Lett. 2001,  510, 83-88.
[224]  Rhim, T. Y.; Park, C. -S.; Kim, E.;  Kim,  S.  S.  Human  prothrombin
fragment 1 and 2 inhibit bFGF-induced BCE cell growth.
Biochem.  Biophys.  Res.  Commun. 2001,  252, 513-516.
[225]  Stefansson, S.; Petitclerc, E.; Wong, M. K.; McMahon, G. A.;
Brooks, P. C.; Lawrence, D. A. Inhibition of angiogenesis in  vivo
by plasminogen activator inhibitor-1.  J.  Biol.  Chem. 2001,  2001,
8135-8141.
[226]  Kiosses, W. B.; Hood, J.; Yang, S.; Gerritsen, M. E.; Cheresh, D.
A.; Alderson, N.; Schwartz, M. A. A dominantnegative p65 PAK
peptide inhibits angiogenesis.  Circ.  Res. 2002,  90, 697-702.
266   Current  Cancer  Drug  Targets, 2005,  Vol. 5, No.  4
[227]  Cozzolino, F.; Torcia, M.; Lucibello, M.; Morbidelli, L.; Ziche, M.;
Platt, J.; Fabiani, S.; Brett, J. and Stern, D. Interferon-alpha and
interleukin 2 synergistically enhance basic fibroblast growth
factor synthesis and induce release, promoting endothelial cell
growth.  J.  Clin.  Invest. 1991,  91, 2504-2512.
[228]  Anand-Apte, B.; Pepper, M. S.; Voest, E.; Montesano, R.; Olsen,
B.; Murphy, G.; Apte, S. S.; Zetter, B. Inhibition of angiogenesis
by tissue inhibior of metalloproteinase-3. Invest. Opthal. Vis. Sci.
1997,  38, 817-823.
[229]  Lee, K.; Iwamura, M.; Cockett, A. T. Cortisone inhibition of tumor
angiogenesis measured by a quantitative colourimentic assay in
mice.  Cancer  Chemother.  Pharmacol. 1990,  26, 461-463.
[230]  Jackobson, A. M.; Hahnenberger, R. Antiangiogenic effect of
heparin and other sulphated glycosaminoglycans in the chick
Tufan and Satiroglu-Tufan
embryo chorioallantoic membrane. Pharmacol. Thoxicol. 1991,
69, 122-126.
[231]  Sills, A. K.; Williams, J. I.; Tyler, B. M.; Epstein, D. S.; Sipos, E.
P.; Davis, J. D.; McLane, M. P.; Pitchford, S.; Cheshire, K.;
Gannon, F. H.; Kinney, W. A.; Chao, T. L.; Donowitz, M.;
Latarra, J.; Zasloff, M.; Brem, H.    Squalamine inhibits
angiogenesis and solid tumor growth in vivo and perturbs
embryonic vasculature.  Cancer  Res. 1998,  58, 2784-2792.
[232]  Sheu, J. R.; Fu, C. C.; Tsai, M. L.; Chung, W. J. Effect of U-995, a
potent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor, on anti-
angopgenesis and anti-tumor activities. Anticancer Res. 1998,  18,
4435-4442.
[233]  Cheung, W. H.; Lee, K. M.; Fung, K. P.; Leung, K. S. Growth
plate chondrocytes inhibit neo-angiogensis. Cancer  Lett. 2001,
163, 25-32.
View publication stats