PRACTICA NO. 1.

SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE

AMINOÁCIDOS.

Nicolas Rodriguez Caviedes. a

PRACTICA NO. 1. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS.

Determinación de punto isoeléctrico mediante titulación potenciométrica y separación de

una muestra problema con ácido aspártico e histidina, se complementa el estudio con

cromatografía de capa delgada.

a
Facultad de Ciencias Departamento de Química Universidad Nacional de Colombia.
nicrodriguezcav@unal.edu.co
2

ABSTRAC

The titration of an unknown amino acid sample with 0.10M NaOH was carried out with the

help of a Jenway 3510 pHmeter potentiometer and by means of the first and second

derivatives of the titration curve, in addition to statistical analysis, its acidity constants for

the carboxyl group was determined. and ammonium are 2.42 ± 0.07 and 10.59 ± 0.13

respectively in addition to an isoelectric point of 6.51 ± 0.48 which was compared with the

values reported for proline, thus presenting an error of 21.73, 3.38 and 0.48% respectively.

In the same way, a separation was carried out by means of ion exchange chromatography of

a test sample that contained two amino acids which were identified by thin layer

chromatography as Aspartic Acid and Histidine, however in the extraction process we can

only speak with certainty about the Obtaining aspartic acid in fraction 3 of the citrate buffer

pH 3.5, the verification of the presence or absence of amino acids in the fractions was

carried out by means of the ninhydrin test, which is very sensitive to the amino groups

present in them. molecules, additionally with the aid of a spectrophotometer the

chromatogram of the eluted fractions was generated.

Key Words: Titration, isoelectric point, acid constants, ion exchange chromatography,

chromatogram.

RESUMEN
 3

Se llevó a cabo la titulación de una muestra desconocida de aminoácido con NaOH 0,10M

la ayuda de un potenciómetro jenway 3510 pHmeter y mediante la primera y segunda

derivada de la curva de titulación además de análisis estadísticos, se determinaron sus

constates acidez para el grupo carboxilo y amono son 2,42±0,07 y 10,59±0,13

respectivamente además de un punto isoeléctrico de 6,51±0,48 el cual se comparó con los

valores reportados para la prolina, presentando así un error de 21,73 3,38 y 0,48%

respectivamente. De igual manera se realizó una separación mediante cromatografía de

intercambio iónico de una muestra problema que contenía dos aminoácidos los cuales

fueron identificados mediante cromatografía de capa delgada como Acido aspártico e

Histidina, sin embargo en el proceso de extracción solo se puede hablar con certeza de la

obtención del Ácido aspártico en la fracción 3 del buffer citrato pH 3,5, la comprobación de

la presencia o ausencia de los aminoácidos en las fracciones se llevó a cabo mediante la

prueba con ninhidrina la cual es muy sensible a los grupos amino presente en estas

moléculas, adicionalmente con ayuda de un espectrofotómetro se generó el cromatograma

de las fracciones eluidas.

Palabras clave: Titulación, punto isoeléctrico, constantes de acidez, cromatografía de

intercambio iónico, cromatograma.

INTRODUCCIÓN importancia conocer métodos para su

separación e identificación, estos

Los aminoácidos son las moléculas
aminoácidos pueden ser esenciales o no,
fundamentales en la composición de las
donde los esenciales son aquellos que no
proteínas, por lo tanto, es de vital
4

se pueden sintetizar por el metabolismo Precisamente gracias a la diferencia en la

humano (Motta et al., 2020). En la acidez que puede presentar cada

naturaleza se suele encontrar únicamente aminoácido, la técnica cromatográfica de

α-aminoácidos, por lo que su estructura intercambio iónico, la cual consta de una

suele ser muy conocida y estudiada, esta columna empacada con una resina de

consta de un grupo amino y uno intercambio iónico (AMBERLITE MBI),

carboxílico (como su nombre lo indica) y es una técnica muy empleada para su

hidrogeno en el carbono α y una cadena separación (Moore S., Stein H., 1951.) a

lateral denominada R; gracias a la tal punto que es una de las técnicas más

diversidad de estructuras que puede tomar usadas unto con la detección

esta cadena lateral que cada aminoácido colorimétrica mediante una tinción con

presenta propiedades casi que única, ninhidrina (Parvy et al., 1990), sin

desde su solubilidad hasta su punto embargo, hay otros métodos que se

isoeléctrico (pI), es decir, el pH en el que pueden emplear, como la detección de

la especie switteriónica con carga neta fluorescencia (Roht M., Hampay A.,

nula predomina, precisamente como cada 1973) o análisis por cromatografía HPLC

aminoácido presenta un pI diferente, las (Csapo et al., 2008).

titulaciones ácido-base son muy utilizadas

MATERIALES Y MÉTODO.b
en su reconocimiento (Nelson, D., Cox,

M.. 2014).

b
Vega, N. A., Reyes, E. A. (2021). Laboratorio de Bioquímica. Faculta
Universidad Nacional de Colombia
 5

Separación por cromatografía de una vez obtenidas las 15 fracciones tomar

intercambio iónico y prueba con la última fracción y realizar prueba de

ninhidrina. ninhidrina, en caso de ser positiva, extraer

otras dos fracciones y realizar prueba de

Preparar la columna con la resina de
ninhidrina, en caso de ser negativa, repita
intercambio iónica (AMBERLITE MBI)
el procedimiento pero ahora con buffer
y adicionar buffer citrato (pH 3,5) hasta
fosfato pH 8, y pH 12, ahora realizar
superar el nivel de la fase estacionaria,
prueba de ninhidrina a todas las
abrir la llave y lavar la columna varias
fracciones impares y a las fracciones
veces hasta obtener un pH de 3,5 en
pares que acompañen dicha prueba
solución obtenida, durante este proceso se
positiva, medir la absorbancia a 570 nm.
debe calibrar el flujo a 1 mL/minuto sin
Para la prueba con ninhidrina tomar 0,5
dejar secar la columna, una vez se
mL de ninhidrina unto con 0,5 mL de la
obtenga el pH original se debe dejar el
fracción y ajustar a pH neutro, calentar
Buffer a nivel de la resina y agregar 0,5
durante 15 minuto a baño maría dejar
mL de la muestra problema, lavar las
enfriar y diluir con 2 mL de agua
paredes con el buffer citrato pH 3,5 y
destilada.
abrir llave hasta alcanzar el nivel de la

resina, dejar 10 minutos para que la Curva de titulación ácido-base.

muestra interactúe con la columna y

Depositar 10 mL de la solución problema
extraiga 15 fracciones de 2 mL
en un vaso de 100 mL, determinar
aproximadamente con la ayuda del buffer,
primeramente el pH de dicha solución y
6

adicione HCl hasta alcanzar un pH ácido, brindada, en donde la solución tenia un

luego realizar adiciones de NaOH 0,1M pH inicial de 6,9 y se ajustó con HCl 0,1

hasta pH 12,5 aproximadamente, M hasta 2,01 para poder tomar toda la

determinar los valores de pKa para los curva de titulación completamente,

grupos ionizables del aminoácido y posteriormente con los datos obtenidos se

deduzca su estructura. procedió a determinar el punto

isoeléctrico mediante la ecuación 1, para

Detección de aminoácidos por
lo cual se empleó la segunda derivada de
cromatografía de capa delgada.
la titulación para la identificación grafica
Marcar en la palca la línea de siembra y
del pI.
colocar 10 μL de las muestras y patrones,
Para esto se empleó la herramienta Origin
dejar secar y sembrar otros 10 μL,
8, en donde se graficó en primera
introducir la placa en cámara con la
instancia la curva de titulación con NaOH
solvente previamente saturada y dejar
1M (imagen 1), en donde se observa
correr, marcar frente del solvente y secar
claramente que hay un punto de inflexión
en estufa, revelar la placa con ayuda de
muy marcado entre pH 3 y 10
una solución de ninhidrina e identificar
aproximadamente y finalmente alrededor
las muestras.
de pH 12 se ve un punto de inflexión un
RESULTADOS Y DISCUSION.
poco menos marcado, sin embargo

En primer lugar, se determinó el punto determinar los valores de pKa a partir de

isoeléctrico de la solución problema este grafico es muy poco preciso y

 7

exacto, por lo que se recurre al método de este valor con el reportado en la literatura,

la derivada, donde la primera derivada observamos que se encuentra muy

nos indica el punto isoeléctrico según los cercano al valor de pI de la prolina (6,48).

volúmenes adicionados de NaOH,

pH
14
mientras que la segunda derivada nos
12

brinda un valor más preciso (imagen 2), 10

pH
ya que el pI seria el corte con el eje X,
6

siendo así se obtiene que con la primera 4

2
derivada el pI es de 7,99, mientras que la
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Volumen NaOH 0,1M (mL)
segunda derivada nos indica que el pI es

de 6,60, como se menciono anteriormente Imagen 1. Curva de titulación para la

se utilizará el valor de la segunda muestra problema con NaOH 0,10M.
derivada como el verdadero, al comparar
8

150
pH
100 1st derivative of "pH"
2nd derivative of "pH"
50

0
pH

-50

-100

-150

-200

-250

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Volumen NaOH 0,1M (mL)

Imagen 2. Primera y segunda derivada de la curva de titulación para determinar constantes

de acidez y punto isoeléctrico.

De igual manera se determinó el punto

isoeléctrico mediante los pKa calculados

para la curva de titulación, obteniendo así

que el pKa1 es 2,48 y pKa2 es 10,62, por

lo tanto, su promedio y punto isoeléctrico

(según la fórmula 1) es 6,62. Y

finalmente se compararon estos valores

con otros grupos y se realizó el respectivo

análisis estadístico (Tabla 1).

 9

pK 1 + pK 2
pI = [1]Tabla 1. Recopilación de los datos obtenidos por los varis grupos, en
2

gris el grupo del presente trabajo.

Grupo pKa1 pKa2 pI (formula) pI (segunda derivada)

1 2,48 10,76 6,62 6,60
2 2,43 10,45 6,44 6,40
3 2,46 10,62 6,54 6,30
4 2,32 10,53 6,43 6,30
Promedio 2,42 10,59 6,51 6,40
Prolinac 1,99 10,96 6,48 --
Desviació
0,07 0,13 0,48
n 0,14
% Error 21,73 3,38 0,48 1,16
De los resultados anteriores se puede del pI con estos valores, en donde

decir que pese a que los valores de pKa 2 presentan un error un poco menor que los

fueron muy exactos y con relativa buena valor obtenidos mediante la segunda

precisión, los valores determinados para derivada, nuevamente esto se puede

el pKa1 presentan un claro error respecto explicar a que este método grafico

al valor experimental, principalmente esto requiere de adiciones muy pequeñas y

se puede asumir ya que ninguno de los controladas de NaOH, y si bien se usaron

grupos de trabo hizo un descenso del pH volúmenes bastante pequeños de la base,

hasta valores inferiores a 2, motivo por el las adiciones dejaban una ventana

cual el valor de pKa1 se desvió un poco estadística, la cual se puede observar en la

de la realidad, sin embargo, se obtiene desviación (anuqué ligera) que presentan

resultados bastante buenos para el cálculo las constantes de acidez para cada grupo.
c
Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. Seventh Edition. h. w. freeman macmillan
learning. Pp 78.
10

La siguiente sección de la practica 4, por lo tanto los resultados fueron

constaba en el estudio de la separación de favorables.

una muestra de aminoácidos mediante

Sin embargo, el siguiente aminoácido que
cromatografía de intercambio iónico, y de
era la histidina (pI 7,59) se esperaba
manera paralela, se realizaba la
saliera de la columna en el segundo buffer
caracterización por placa delgada usando
(pH 12), entre las fracciones 16 y 30, si
patrones secundarios de aminoácidos para
embargo, durante este rango no se
hacer su respectiva comparación.
presento ninguna prueba positiva tanto

Se contaba con una muestra problema que para fracciones pares como impartes, no

poseía dos aminoácidos, Acido aspártico obstante, la cromatografía se continuó

e histidina, como se ve, son aminoácidos realizando con el ultimo buffer (pH 12)

con una diferencia significativa en su en donde la última fracción (45) presento

acidez, de esta manera como el acido una coloración intensa por lo que se

aspártico presenta un pI de 2,77 se tomaron 4 fracciones mas para confirmar

esperaba que eluyera en el primer buffer si había presencia del aminoácido esta

(pH 3,5) lo que es igual a decir que se etapa final, pero la prueba de ninhidrina

encontrará una prueba positiva con dio negativo para todas las otras

histidina en las primeras 15 fracciones y fracciones.

como se puede comprobar en la imagen 3,

sucedió eluyéndo la mayoría en la

fracción 3 y un remanente en la fracción

 11

del cromatograma, se puede deber a dos

3,0 Abs a 720 nm
factores principalmente. La primera
2,5

opción es que la columna no estaba

Abs a 720 nm (UA)

2,0

1,5
interactuando bien con la fase móvil, por
1,0
lo que retuvo la muestra del aminoácido
0,5

0,0 hasta la etapa final, debido a esto dio una

0 10 20 30 40 50
# Fracción
única banda de absorbancia muy

concentrada (pese a la dilución con agua

Imagen 3. Cromatograma obtenido para
destilada); la segunda hipótesis que se
las fracciones de la cromatografía de
puede plantear, es que, debido al mismo
intercambio iónico, absorbancia tomada a
problema con la columna, la primera
720 nm.
banda obtenida en la fracción 3 contenga
Estos resultados dan a entender que
los dos aminoácidos y la segunda banda
posiblemente sucedió alguna alteración
en la región del buffer pH 12 fuera una
con la resina presente en la columna de
contaminación, de igual manera, sin
extracción, debido a que es una
importar cual de las dos opciones sea la
cromatografía de intercambio iónico esta
que realmente sucedió, se puede deducir
resina debe ser tratada y activada
que la separación no fue llevada a cabo de
previamente con ácido, sin embargo,
manera correcta.
pareciera que la columna no está en
Finalmente, para la caracterización de los
óptimas condiciones por lo que el punto
aminoácidos presentes en la muestra
que se puede observar en la fracción 45
12

problema (muestra 3) se empleo

cromatografía en capa delgada (imagen 4)

en donde se puede ver principalmente que

ante la ausencia de un patrón de Ácido

aspártico, no hay una muestra contra la

cual comparara, pero si nos fiamos en la

placa 3, en la cuales se encontraban

valina, histidina y la muestra 3, se puede

confirmar que efectivamente la histidina

Imagen 4. Cromatografía en capa
se encuentra presente en la solución
delgada, de izquierda a derecha 1).
problema (tercer punto de siembra) y
prolina, Fenilalanina, M1, 2).
adicional a esto, se ve que hay una
Fenilalanina, cisteína, M2 y 3) Valina,
sobreposición de dos puntos en esta
histidina y M3.
siembra, el cual se le puede atribuir al

acido aspártico que debido a ser un

aminoácido con carga negativa, va a ser CONCLUSIONES.

mas afín a la fase estacionaria (silica) y

Se determinó que e aminoácido de la
por lo tanto va a presentar un menor valor
solución problema era prolina con ayuda
de RF.
de la interpretación del punto isoeléctrico

obtenido a partir de la primera y segunda

derivada, además de concluyó que la

 13

separación de la muestra problema no se mediante cromatografía en capa delga se

realizo de manera adecuada por lo que las identificó que los aminoácidos presentes

fracciones en las que se presento prueba en esta solución problema eran Ácido

positiva con ninhidrina no pueden aspártico e histidina.

suponerse como puras, y finalmente,

REFERENCIAS.

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the amino acids by ion exchange column chromatography applying postcolumn

derivatization. Acta Universitatis Sapientiae Alimentaria, 1, 5-29.

Motta, C., Matos, A. S., Soares, A., Gonzales, G. B., Castanheira, I., Cabral, I., ... &

Nicolai, M. (2020). Amino acid profile of foods from the Portuguese Total Diet

Pilot Study. Journal of Food Composition and Analysis, 92, 103545.

Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. Seventh Edition. h. w.

freeman macmillan learning.

Parvy, J. Bardet, Rabier D., Gasquet M., Kamoun P., Intra- and interlaboratory quality

control for assay of amino acids in biological fluids: 14 years of the French

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14

Roth, M., & Hampaǐ, A. (1973). Column chromatography of amino acids with fluorescence

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9673(00)97051-1 

Moore S., Stein W H., Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins, J.

Biol. Chem., 192 (1951) 663–681.