ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN

THÍ NGHIỆM VI SINH

(Phòng thí nghiệm CNSH)

Giáo viên hướng dẫn: Ths. PHẠM THỊ KIM THẢO

Sinh viên thực hiện:
Lớp sinh hoạt:
Nhóm học phần:
Nhóm thí nghiệm:

LƯU HÀNH NỘI BỘ

Đà Nẵng, 2019-2020
NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài mở đầu: Các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh và phương pháp khử trùng

Bài 1: Làm môi trường để gieo cấy vi sinh vật

Bài 2: Phân lập và nuôi cấy vi sinh vật
Bài 3: Sử dụng kính hiển vi
Bài 4: Quan sát hình thái tế bào vi sinh vật
Bài 5: Định lượng vi khuẩn hiếu khí

Kế hoạch thí nghiệm (4 buổi)

YÊU CẦU THÍ NGHIỆM
Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm
KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM
Buổi 1(Bài 1)
Kiểm tra
Chuẩn bị môi trường và bao gói dụng cụ (Bài 1)
Buổi 2 (Bài 2)
- Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất (sv năm được thao tác chuẩn bị mẫu và gieo cấy,
làm quen với tủ cấy)
- Cấy chuyển chủng vi sinh vật thuần khiết , chuẩn bị cho bài 3 và bài 4

Buổi 3: (Bài 3 và Bài 4)

Nhận xét buổi làm đầu tiên, bao gồm kết quả
Thực hành bài 3 và bài 4
Buổi 4:
Thi kết thúc môn học
YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT
1. Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm vi sinh vật
- Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm
- Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bị
dành riêng cho mình. Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn. Tuyệt đối không lấy
của người khác.
- Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc
áo Blue khi làm việc
- Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi
chưa được hướng dẫn.
- Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọn
gàng nơi làm việc
- Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn.
Trường hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn
2. Nguyên tắc làm việc với các giống vi sinh vật
Trong điều kiện phóng thí nghiệm, các vi sinh vật được nuôi cấy trên các môi trường
dinh dưỡng đặc hoặc lỏng đựng trong các ống nghiệm, trong các bình thủy tinh hoặc
các đĩa Petri. Dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng đều đã được khử trùng
trước khi cấy, phải tiến hành theo những quy tắc nhất định để đảm bảo giữ cho các
giống nghiên cứu khỏi bị nhiễm bẩn bởi vi sinh vật ở môi trường xung quanh.
Trước khi cấy cần ghi cẩn thận lên ống nghiệm ( hoặc bình thủy tinh hoặc đĩa Petri):
- Tên môi trường
- Tên giống vi sinh vật
- Ngày cấy
Tất cả các thao tác được trực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn và tốt hơn hết là thực
hiện trong các phòng cấy vô trùng. Sau khi cấy, phải đặt ống nghiệm ( hoặc các dụng
cụ khác có nuôi cấy vi sinh vật) vào các tủ ổn nhiệt (còn gọi là tủ ấm). Đối với các
dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật đã dùng xong, cần phải khử trùng bằng nồi áp xuất, rồi
mới đem đi rửa. Phải đổ lên bề mặt môi trường đặc đã dung xong một lớp dung dịch
khử trùng và giữ yên một ngày sau đó mới đổ môi trường đi và cọ rửa sạch sẽ.
Tiến hành ghi chép thí nghiệm:
Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí
nghiệm. Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định.
Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc.
2/ Đối tượng nghiên cứu
3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm
4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng
5/Kết quả nhận được.
Các số liệu phai ghi thành từng bảng. Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ,
hình vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ.
CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ
TRÙNG

1.1. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU

Kiến thức lý thuyết: Củng cố các kiến thức sau: Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý,
hóa học đối với sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật
+ Nhân tố vật lý bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH ...
+ Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn ...
- Nguyên nhân gây nhiễm các dụng cụ là do sự tiếp xúc với không khí, các dụng
cụ hay vật phẩm có vi sinh vật.
Kỹ năng thực hành: Hình thành và rèn luyện các kỹ năng:
- Bao gói dụng cụ và làm nút bông cho ống nghiệm
- Khử trùng dụng cụ và môi trường bằng nồi hấp áp suất cao và tủ sấy
1.2. MỘT SỐ DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH
1. Các dụng cụ thủy tinh
a. Ống nghiệm: được sử dụng để chứa môi
trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút bằng gòn
không thấm nước hay bằng nhựa chịu nhiệt

Hình 1: Ồng nghiệm

b. Đĩa petri: gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp

lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm,12cm ......
c. Ống hút (pipette)
- Ống hút có chia độ
- Ống hút Pasteur
d. Micropipettes đơn kênh (Pipetman)
Đây là pipet chính xác, cho phép ta hút được một
Hình 2: Đĩa petri
lượng chất rất chính xác.
- Đặc điểm cấu tạo :
 Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) và các tip tương ứng.
- Đặc điểm phân loại:
Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành 6 loại:
Bảng 1.1: Các loại pipetman và thể tích tương ứng
STT Loại pipet Giới hạn sử dụng (l) Độ chia nhỏ nhất(l)
1 P-2 0.1-2 0.002
2 P-10 0.5-10 0.02
3 P-20 2-20 0.2
4 P-100 10-100 0.2
5 P-200 50-200 0.2
6 P-1000 100-1000 2.0

Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích

Chú ý:
- Cắm đúng loại tip của từng pipet (tương ứng với thể tích cần hút)
- Không dốc ngược pipetman khi đang hút hóa chất
- Không được chỉnh quá giới hạn thể tích qui định trên thân pipet
- Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet về trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhất hoặc nhỏ
nhất )

e. Các dụng cụ bằng thủy tinh khác: Becher, Bình cầu đáy bằng và đáy tròn, Bình
tam giác (Erlen), Bình Roux
2. Các dụng cụ thiết bị khác
a. Que cấy
- Que cấy thẳng: que cấy kim loại có đầu nhọn, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo
khuẩn ty.
- Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo
khuẩn ty.

- Que cấy vòng (khuyên cấy): que cấy kim loại đầu có vòng tròn, thường dùng cấy
chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.

- Que cấy trang: bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi
khuẩn trên bề mặt thạch rắn.

- Ống hút thủy tinh dùng để chuyển một lượng vi khuẩn nhất định lên bề mặt môi
trường rắn hoặc vào môi trường lỏng. Hiện nay, pipet cấy chuyển với những đầu
tip vô trùng có thể tháo rời để thay đổi (còn gọi là pipet đầu rời hay transfer pipet
dạng hút thông thường).

- Đầu tăm bông vô trùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi
trường rắn.
Những loại dây cấy này thường làm bằng kim loại không bị oxy hóa ở nhiệt độ cao
b. Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh vật hoặc theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật
c. Lò Pasteur (xem phần sau)
d. Autoclave (xem phần sau)
e. Nồi chưng cách thủy
1.3. BAO GÓI DỤNG CỤ
1. Nguyên tắc
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô.
- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng
cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
2. Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác
 - Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác
a. Cách làm nút bông
- Với các ống nghiệm:
+ Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại
+ Ấn vào giữa cuộn bông. Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống
nghiệm
+ Yêu cầu: Nút có kích thước và độ chặt vừa phải.
Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong.
Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng
sử dụng lượng bông nhiều hơn
b. Cách bao gói dụng cụ: Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có
nút bông bằng giấy báo để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện
vô trùng tốt hơn. Cách làm như sau:
- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói.
- Quấn quanh phần đầu có nút bông.
- Cột lại thật chặt
Yêu cầu: - Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt.
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng
hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ
1 - Khi khử trùng bằng nhiệt: các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng
trong khi các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:
- Tính chất môi trường, Số lượng tế bào, Độ pH của vật cần khử trùng
- Do vậy để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất
và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ VSV và bào tử của chúng
có trong dụng cụ cần khử trùng
- Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt
a. Phương pháp nhiệt khô
➢ Khử trùng bằng tủ sấy: Được thực hiện trong tủ sấy
- Điều chỉnh thời gian và nhiệt độ thích hợp (160 °C trong 2h hoặc 180°C
trong 30 phút)
Lưu ý: phải để nguội tới 60°C rồi mở tủ lấy dụng cụ ra. Tránh mở tủ lấy dụng cụ
khi nhiệt độ tủ còn cao sẽ làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ. Các dụng cụ sau khi sấy mà
giấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu. Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt
độ khử trùng cao làm bông và giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát
trùng) thì không thể sử dụng dụng này để nuôi cấy VSVđược.
➢ Khử trùng bằng cách đốt que lửa nóng đỏ:
Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng
bình tam giác sau khi lấy nút bông ra.
Cách khử trùng:
- Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây
mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy.
- Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi khuẩn không bị tiêu diệt
khi lấy giống.
b. Khử trùng bằng sức nóng ướt
➢ Đun sôi trong nước
Phương pháp này được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao,
kéo, kẹp, cốc ....
Cách tiến hành: - Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ
- Đun sôi từ 10 phút đến 1h
➢ Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)
Phương pháp này được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở
nhiệt độ cao, chỉ có tác dụng ức chế VSV không có bào tử.
Cách tiến hành: Đun nóng môi trường lên 65 – 70°C trong 15 – 30 phút
➢ Hấp cách quãng 100°C (phương pháp Tyndal)
Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh
mì, men gia súc, mốc làm nước chấm....
Cách khử trùng: - Hấp trong trường ở 100°C từ 30 – 40 phút.
- Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển
- Hấp môi trường lần thứ hai ở 100°C trong 30 – 40 phút tiêu diệt
các bào tử vừa nẩy mầm.
- Lặp lại quá trình này 3 – 4 lần
Kết quả: môi trường vừa được khử trùng vừa được đảm bảo không thay đổi
chất lượng.
➢ Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (Autoclave)
Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao. Đó là
thiết bị làm bằng kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả năng tự động điều chỉnh
nhiệt độ và thời gian
Nguyên tắc hoạt động:
Làm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp suất lớn hơn áp
suất khí quyển. Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ
Mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ của nồi được biểu hiện qua bảng sau:
 Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến
và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tế bào
sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.
c. Khử trùng bằng sự lọc
Sử dụng cho môi trường lỏng, trong, có độ nhầy yếu, không chịu được nhiệt
độ cao hơn 600C. Cho môi trường đi qua một màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ hơn
đường kính của vi khuẩn. Khi đó, vi khuẩn sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung dịch đi
qua sẽ vô trùng. Màng lọc thường là màng cellulose
d. Diệt trùng bằng bức xạ
- Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng nhất là tia UV. Dòng tia UV diệt trùng không khí
phòng bệnh viện, phòng vô trùng. Tia UV chỉ khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào
bên trong mẫu vật.
- Tia âm cực: Diệt trùng các dụng cụ giải phẩu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực có
thể tiêu diệt các vật đã cho vào bao gói kín.
BÀI 1
LÀM MÔI TRƯỜNG ĐỂ GIEO CẤY VI SINH VẬT

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội
bào. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có
nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH
trong môi trường.
Dựa vào nguồn gốc, trạng thái lý học, mục đích sử dụng mà người ta có nhiều cách
phân loại môi trường:
1. Phân loại theo thành phần và nguồn gốc:
- Môi trường tự nhiên: dùng các sản phẩm tự nhiên để pha chế (sữa, trứng, khoai
tây, dịch chiết nấm men…) thành phần hóa học của các sản phẩm này không được xác
định chi tiết và chính xác.
- Môi trường bán tổng hợp: Ngoài các sản phẩm tự nhiên còn thêm một số hóa chất
có thành phần nhất định.
- Môi trường tổng hợp: dùng hoàn toàn các hóa chất có thành phần xác định để pha
chế.
2. Phân loại theo trạng thái lý học:
- Môi trường lỏng: là dung dịch các chất dinh dưỡng hòa tan trong nước.
- Môi trường đặc: là môi trường lỏng có agar (1,5 – 2,5%) hoặc gelatin (10-20%)
- Môi trường bán lỏng: 0,3 – 0,7% aga.
3. Phân loại theo mục đích sử dụng:
- Môi trường cơ bản: thành phần môi trường không có gì đặc biệt, thích hợp cho
nhiều loại vi sinh vật khác nhau.
- Môi trường riêng biệt: Chỉ thích hợp cho một số loài vi sinh vật nhất định
- Môi trường phân lập và chẩn đoán: chỉ thích hợp cho từng loài vi sinh vật nhất
định hoặc để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền của vi sinh vật.
& 1.1. LÀM MÔI TRƯỜNG
❖ Nguyên tắc:
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh
dưỡng của từng loài vi sinh vật.
Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và vi sinh vật nên
cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường dinh dưỡng.
Đảm bảo các điều kiện hóa, lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
❖ Chuẩn bị dụng cụ, nguyên vật liệu và hóa chất
Dụng cụ:
 - Cốc đong: 250ml, ống đong 250ml
- Bình tam giác 250 đã làm nút bông
- Micropipette 100-1000 µl , đầu típ tương ứng
❖ Tiến hành
1. Pha chế
Tùy theo mục đích phân lập, tiến hành cân đầy đủ các thành phần môi trường được ghi rõ
trong bảng ở bảng 1 vào cốc có thể tích ứng với thể tích cần pha. Quá trình cân cần lưu
ý:
- Phải chuẩn bị dụng cụ, và hóa chất tập trung tại vị trí thao tác.
- Nếu là môi trường đặc thì bổ sung aga sau khi đã chỉnh pH
Sau khi cân đầy đủ thành phần môi trường, bổ sung nước cất khoảng 4/5 thể tích môi
trường. Tiến hành điều chỉnh pH (bước 3).
2. Điều chỉnh pH
Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển được trong một khoản pH nhất định. Khi làm môi
trường cần xác định pH và điều chỉnh cho thích hợp.
+ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaCl 10
%. Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3,
Na2CO3 ...
+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH - metre).
Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao.
3. Phân phối vào dụng cụ chứa
-Tiến hành đổ dịch môi trường vào cốc đong, bổ sung nước cất định mức lên đúng thể
tích môi trường cần pha.
- Phân phối dịch môi trường vào bình tam giác, cân và bổ sung 1,5 – 2% aga
Lưu ý khi phân phối môi trường :
- Tránh không cho dính môi trường lên miệng bình tam giác hay miêng ống nghiệm
tại vị trí làm nút bông. Có thể dùng phểu (Với việc chuẩn bị môi trường đặc phân phối
vào ống nghiệm thì bổ sung aga vào cốc chứa dịch môi trường, phải đun chảy và làm tan
đều aga, phân phối lâu thì phải dùng phểu lọc nóng để giữ môi trường luôn ở trạng thái
lỏng).
- Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại (xoay sâu vào gần hết
nút).
+ Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi
trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì
lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm.
+ Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm
1/2 - 1/3 thể tích của bình.
+ Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính
lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi
trường bị đông đặc.
 4. Tiệt khuẩn môi trường
Chế độ tiệt khuẩn môi trường cho từng loại môi trường đều có ghi sẵn cùng với cách
pha chế. Tùy loại môi trường, tùy điều kiện cụ thể mà có thể tiệt khuẩn theo một trong
những phương pháp sau:
- Phương pháp Pasto
- Phương pháp Tindal
- Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa có áp suất nhở nồi hấp (autoclave).
5. Bảo quản và kiểm tra môi trường:
▪ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh
sáng, nhiệt độ từ 0 - 5 °C và không để môi trường bị khô.
▪ Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường
đặt chúng vào tủ ấm 37 °C, trong 48 - 72h. Sau lấy ra quan sát, loại bỏ các ống
có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có
môi trường đạt yêu cầu.
Bảng 1. Công thức pha môi trường

Tên môi trường Công thức

Thạch thịt pepton Cao thịt: 5g

Pepton: 10g
(Vi khuẩn) NaCl : 5 g
Aga: 20g
Nước cất: 1000ml, pH = 7-7,2
Hansen Saccharose hoặc Maltose: 50g
- Pepton: 10g
(nấm men) - KH2PO4: 3g
- MgSO4: 3 – 5 g
- Agar: 20g, Nước cất: 1000ml
môi trường Czapek) - Saccharose: 30g
- NaNO3: 30g
(nấm mốc) - K2HPO4: 1g
- MgSO4: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
pH = 6, khử trùng 1atm/30 phút
Gauze 1 Tinh bột tan: 20g
- K2HPO4: 0,5g
(Xạ khuẩn) - MgSO4.7H2O: 0,5g
- KNO3: 1,0g
- NaCl: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
pH = 7,2 – 7,4 khử trùng 0,5 atm/30 phút
& 1.2. BAO GÓI DỤNG CỤ
❖ Nguyên tắc
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô.
- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ
trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
❖ Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông: cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que trang
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác
a. Cách làm nút bông
- Với các ống nghiệm:
Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại, ấn vào giữa cuộn bông. Đẩy cuộn bông này
gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm
Yêu cầu:Nút có kích thước và độ chặt vừa phải. Lấy ra vào dễ dàng.
Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong.
- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng
lượng bông nhiều hơn.
b. Cách bao gói dụng cụ
Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo
để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn. Cách làm
như sau:
- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói.
- Quấn quanh phần đầu có nút bông.
- Cột lại thật chặt
Yêu cầu:
- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín
- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt.
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng
hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng
BÀI 2
PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Trong thiên nhiên và trong các vật phẩm dùng để nghiên cứu thường chứa hỗn hợp
nhiều loài vi sinh vật khác nhau, ta chỉ có thể nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng, về trao
đổi chất, về di truyền học và các đặc tính khác khi ta có được những vi sinh vật thuần
khiết.
Vi sinh vật thuần khiết là giống vi vật phát triển từ một tế bào ban đầu riêng biệt.
Giống vi sinh vật thuần khiết thường được nhận từ canh trường vi sinh vật tập trung,
canh trường này thường có được nhờ việc tạo ra các điều kiện chọn lọc. Vì thế muốn có
giống thuần khiết ta phải tiến hành làm hai bước:
- Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung
- Sau đó phân lập vi sinh vật thuần khiết.
1 – Canh trường tập trung
Canh trường tập trung là canh trường trong số đó một loài (hoặc có khi vài loài) vi
sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn các loài khác về số lượng.
Phương pháp chủ yếu để nhận được canh trường vi sinh vật tập trung là dùng môi trường
chọn lọc hay điều kiện chọn lọc. Để có môi trường chọn lọc ta có thể thay đổi thành phần
môi trường, pH môi trường hoặc một vài loại nguồn dinh dưỡng chính như nguồn cacbon
và nguồn nitơ.
2 – Canh trường thuần khiết
Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả vi sinh vật trong đó đều được sinh ra
từ một tế bào ban đầu. Việc phân lập trên canh trường thuần khiết là bước đầu tiên vô
cùng quan trọng trong quá trình nghiên cứu vi sinh vật
2.1. GIỚI THIỆU VỀ PHÂN LẬP
Phân lập là khâu quan trọng trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn. Mục đích
của phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clone thuần
khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi
trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính đặc trưng
của từng loài vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần
rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn. Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có
ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.
 Hình thái khuẩn lạc

Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi
sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải
được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng
cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được
vô trùng trước khi sử dụng.
❖ Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào vi sinh vật
- Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ
Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: gồm các bước:
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu
- Phân lập các vi sinh vật thuần khiết
- Kiểm tra độ tinh khiết của vi sinh vật
❖ Các dạng mẫu cho nuôi cấy

- Dạng dịch mẫu đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa
chủng vi sinh vật cần phân tích.

- Dạng trên bề mặt môi trường rắn chứa thạch (1,5-2%) trong ống thạch nghiêng
hay trong đĩa petri.
- Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch
mềm (0,5-0,7%).

❖ Các thao tác vô trùng

Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn
cồn hoặc đèn Bunsen. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo
không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ,
ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa…
 Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, nhân viên thao tác cần mang găng tay
hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70° hoặc các dung dịch diệt khuẩn, tương tự như
vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao tác vô trùng. Sau khi hoàn
tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi
rời phòng kiểm nghiệm.
❖ Hóa chất
- Mẫu thí nghiệm chứa vi sinh vật
- Canh trường tập trung vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Canh trường thuần
khiết
- Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, Que trang Đĩa petri, bình tam giác, ống falcon 15ml,
Đèn cồn
2.2 PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT
❖ Nguyên tắc
Mọi thao tác gieo cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh
nhiễm khuẩn. Môi trường và dụng cụ cấy phải được khử trùng
❖ Phương pháp cấy chuyền vào ống nghiệm

- Cấy trên ống thạch đứng: thường nuôi cấy và bảo quản VSV yếm khí ( dùng que cấy
thẳng). Sau khi lấy sinh khối, dùng que cấy này đâm sâu vào khối thạch. Đâm sát đáy
ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường giữa và 2 đường sát thành ống. Đường
cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
- Cấy trên ống thạch nghiêng: bảo quản VSV hiếu khí hoặc tùy tiện ( dùng que cấy
nhọn hoặc que cấy vòng). Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: hình
chữ chi, vòng xoắn, vạch ngang song song
❖ Cấy trên hộp đĩa petri
• Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có được các vi khuẩn
cần phân lập.

- Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria
liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp
theo.

- Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
Sử dụng que cấy tròn cấy theo các hình dạng như sau:
- Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch
- Theo những đường song song
- Theo 4 hình chữ chi 4 góc

• Kỹ thuật cấy trang

- Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa
pettri.

- Nhúng đầu thanh gạt vào cồn, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt
nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
- Mở đĩa petri, đật nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch. Trong khi thực hiện xoay đĩa
một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi
khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.

- Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.
2.3. TIẾN HÀNH
1. Phân phối môi trường vào đĩa petri
- Đun chảy lỏng thạch, để nguội đến 50 -60 °C
- Mở giấy bọc hộp, đặt lên bàn phẳng
Tay phải cầm bình hoặc ống môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiên, dùng tay trái xoay
và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình (miệng ống nghiệm) trên đèn cồn. Dùng tay trái
hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp lượng môi trường thích hợp.
- Nhanh chóng đậy nắp hộp lại xoay tròn hộp từ từ trên bàn, để thạch dàn thành một lớp
đều trên đáy hộp. Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên. Hé mở nắp hộp và để yên
cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn. Đậy nắp hộp, lật ngược hộp cho đáy lên trên.
- Cần chú ý là thạch cho vào hộp đĩa Petri không làm vô khuẩn lại được nữa, nên khi đổ
phải làm nhanh, cẩn thận, đảm bảo không bị nhiễm khuẩn từ bên ngoài.
- Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, bằng phẳng, lớp thạch không dày hoặc mỏng quá
(thường là 2 – 4 mm)
2. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân
Chuẩn bị 6 ống fancol chứa 9ml nước muối vô trùng 0,85% (đã vô trùng). Cân chính xác
1g mẫu đất cho vào ống fancol chứa sẵn 9 ml dung dịch nước muối, vortex đều trong
khoảng 1 phút, để lắng 5 – 10 phút, như vậy nồng độ mẫu là 10-1, tiếp tục hút 1ml dịch
pha loãng ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 vortex đều và để lắng ta được nồng độ 10-2 ,
tiến hành lặp lại như vậy ta có các nồng độ khác nhau 10-4, 10-5, 10-6

3. Nuôi cấy mẫu

• Hút 100 μl dịch pha loãng ở nồng độ 10-5, 10-6, phân phối vào giữa đĩa Petri, mỗi
nồng độ sẽ cấy lên 2 đĩa. Dùng que trang, trải đều dịch mẫu lên bề mặt môi
trường nuôi cấy, đến khi thấy mặt thạch khô thì dừng lại.Ghi rõ các nội dung sau
 lên đĩa petri trước khi gieo cấy: Tên môi trường, ngày gieo cấy, mức độ pha
loãng, tên nhóm nghiên cứu.
• Đặt hộp đĩa petri đã gieo cấy vi sinh vật vào tủ ấm và ủ ở nhiệt độ 30°C, 24h
4. Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn (KL), mô tả đặc điểm khuẩn lạc mọc trên đĩa
thạch
+ Hình dạng: tròn, bầu dục hay không có hình dạng xác định.
+ Kích thước: to, nhỏ bằng cách đo đường kính khuẩn lạc
+ Bề mặt KL: nhẵn bóng hay xù xì, nhăn nheo, xếp loại S, R hay M.
Dạng S(smooth): KL xám nhạt hoặc trong, bờ đều, mặt lồi đều, bóng hơi lõm
Dạng R(rough): KL thường dẹt có bề mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô.
Dạng M ((Mucous) KL đục, tròn, lồi hơn khuẩn lạc S, quánh hoặc dính.
+ Mép khuẩn lạc phẳng đều hay lỗi lõm, răng cưa.
+ Độ chắc của KL: mền, cứng hay dai, có khả năng bám chắc vào môi trường hay
không. Màu sắc khuẩn lạc và môi trường.

5. Làm thuần
Sử dụng que ria, nhặt khuẩn lạc riêng rẽ từ canh trường tập trung cấy ria sang canh
trường thuần khiết đã được chuẩn bị cho từng vi sinh vật. Đặt hộp đĩa gieo cấy vào tử ấm
30 °C nuôi Vi khuẩn 24h; Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn 42 – 72 h. Quan sát đặc điểm
khuẩn lạc trên môi trường thuần
BÀI 3:
SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

Việc nghiên cứu hình thái tế bào của vi sinh vật mà kích thước của chúng đo bằng
micromet ( 1μm = 10-3mm), chỉ có thể thục hiện nhờ kính hiển vi có độ phóng đại đối
tương nghiên cứu lên hàng trăm lần (kính hiển vi quang học) và lên hàng vạn lần (kính
hiển vi điện tử).
Để có thể nghiên cứu hình thái, cấu tạo và trạng thái sống chết của tế bào vi sinh
vật, người ta thường dùng phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật để quan sát dưới kính
hiển vi. Có thể làm 2 loại tiêu bản: - Tiêu bản tạm thời - Tiêu bản cố định
& 3.1. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
1. Cấu tạo chính kính hiển vi quang học: gồm có 4 hệ thống
Hệ thống giá đỡ gồm:
Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu bản.
Hệ thống phóng đại gồm:
- Thị kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi mà người ta để mắt và để soi kính, có 2 loại
ống đôi và ống đơn. (Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn, dùng để
tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát)
- Vật kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi quay về phía có vật mà người ta muốn quan
sát, có 3 độ phóng đại chính của vật kính: x10, x40, x100. (Bản chất là một thấu
kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trò như kính lúp để quan sát ảnh thật).
Hệ thống chiếu sáng gồm:
- Nguồn sáng (gương hoặc đèn).
- Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua
tụ quang.
- Tụ quang, dùng để tập trung những tia ánh sáng và hướng luồng ánh sáng vào tiêu
bản cần quan sát. Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản. Di
chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng.
Hệ thống điều chỉnh:
- Ốc vĩ cấp
- Ốc vi cấp
- Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống
- Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của tụ quang
- Núm điều chỉnh màn chắn
- Ốc di chuyển phiến kính mang tiêu bản (trước, sau, trái, phải)
2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học
- Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản, nhỏ 1 giọt dầu soi để
soi chìm trên phiến kính khi soi vật kính x100.
 - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích
hợp.
- Điều chỉnh ánh sáng.
- Điều chỉnh tụ quang: đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40
để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100.
- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính.
- Hạ vật kính sát vào tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản).
- Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vĩ cấp để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình
ảnh mờ của vi trường.
- Điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét.
2. Cách bảo quản KHV
- Đặt kính hiển vi đúng chỗ, xa hơi nóng và chỗ ẩm ướt.
- Cầm kính hiển vi bằng thân kính, tay kia đỡ chân của kính. Phải để đứng kính hiển
vi, không được để kính nghiêng.
- Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay bất cứ một dung dịch nào lên bàn kính.
- Không được để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi.
- Lau thị kính và vật kính bằng giấy lau kính trước và sau khi dùng. Khi soi với vật
kính dầu, thấm giấy lau kính với một giọt xylen để lau vật kính. Sau khi lau với
xylen, phải lau khô ngay bằng giấy lau kính, nếu không xylen có thể làm bong
những thấu kính gắn trong vật kính.
- Trước khi cất kính hiển vi, để vật kính nhỏ ở vị trí quan sát và hạ thấp ống kính
bằng ốc lớn. Vặn nhẹ nhàng, đừng ấn mạnh ống kính. Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ
quang kính xuống. Nếu tụ quang kính bẩn, lau bằng giấy lau kính khô.
- Để gương nghiêng, mặt phẳng ra phía ngoài để tránh bụi.
- Che kính hiển vi bằng bao của kính. Cất kính vào đúng chỗ của kính, để lui vào
phía trong, đừng để mấp mé phía ngoài
& 3.2. TIÊU BẢN VI SINH VẬT
Vi sinh vật đem làm tiêu bản để quan sát bằng kính hiển vi có hai dạng sống hoặc chết.
Cả hai dạng đều có thể nhuộm màu hoặc không nhuộm màu.
Để quan sát khả năng chuyển động, sự tạo thành bào tử, sự sinh sản của vi sinh vật người
ta thường làm tiêu bản vi snh vật sống, có thể làm tiêu bản vi sinh vật sống theo 2 cách:
- Tiêu bản giọt ép: Dùng để xác định hình thái tế bào vi sinh vật, xác định kính thước
và sự sắp xếp của chúng, phương thức sinh bào tử, khả năng di động.

Làm tiêu bản giọt ép

 - Tiêu bản giọt treo : Dùng để quan sát sự sinh sản của vi snh vật, sự hình thành
và nảy mần của bào tử, phát hiện khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật
với các loại kích thích. Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

1 . Phương pháp làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu

2.2. Nguyên tắc :
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật, được
pha loãng ở nồng độ 0,01 – 0,001% đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt
động sau khi nhuộm màu.
2.3. Dụng cụ và hóa chất:
- Phiến kính và lá kính đã được vô trùng
- Que cấy, Đèn cồn, giấy thấm
- Nước muối sinh lý 0,85%
- Dung dịch màu xanh metylen 0,001% trong cồn
2.4. Tiến hành :
• Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính.
• Dùng que cấy hoặc pipet lấy cach trường vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính. Với
canh trường đặc cho trước lên phiến kính vài giọt nước muối sinh lí (0,5 –
0,85%) sau đó hòa canh trường vi sinh vật vào.
Lưu ý: lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều ( nếu nhiều thì sẽ bị trào ra
ngoài) hoặc quá ít ( tiêu bản khô hay tạo thành bọt khí gây khó khăn cho việc quan
sát)
• Ép lá kính lên giọt canh trường: trước tiên để lá kính nghiên 60° cạnh phiến kính
và tiếp xúc với mép giọt canh trường sao cho canh trường chảy đều trên cạnh và
bề mặt tiếp xúc giữa lá kính và phiến kính
• Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40).
• Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát
BÀI 4
QUAN SÁT HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT

Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào đa số chúng có kích thước 0,2- 2,0µm. Hình dáng tế
bào có thể là hình que, hình cầu, hình phẩy, hình xoắn, tồn tại đơn lẻ hay kết đôi, kết
chuổi, kết chùm. Quan sát vi khuẩn nói chung cần quan sát đặc điểm mang tính đặc
trưng như: hình dáng, kiểu liên kết, khả năng di động, sự hình thành bào tử, bắt màu
thuốc nhuộm.
4.1. Quan sát hình thái vi khuẩn
Vật liệu và thuốc thử:
Dịch chứa vi khuẩn bacillus subtilic
Phiến kính, lá kính
Thuốc nhuộm xanh methylen 0,001%
Làm tiêu bản giọt ép có nhuộm màu để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
Về hình dạng vi khuẩn chia thành 3 nhóm:
- Cầu khuẩn: có hình tròn, hình cầu...tùy theo kiểu phân cắt mà người ta gọi là song
cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn....
- Trực khuẩn: có hình que , chiều dài lớn hơn chiều rộng nhiều
- Xoắn khuẩn: vi khuẩn có tế bào hình xoắn: một hoặc nhiều vòng.

Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn.

Phân biệt vi khuẩn Gram (Phương pháp nhuộm Gram)
Nguyên tắc : Dựa trên khả năng bắt màu của tếbào chất và màng tế bào với thuốc
nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
+ Loại phức chất thứ nhất vẫn giữnguyên màu của thuốc nhuộm nên không bịrửa
trôi khi xửlý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương.
+ Loại phức chất thứhai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên
mất màu khi xửlý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổsung. Vi sinh vật có phức
chất này thuộc loại gram âm.
Vật liệu và thuốc thử
 Vi khuẩn bacillus subtilic; vi khuẩn E.coli (được nuôi cấy qua đêm)
Thuốc nhuộm: tím kết tinh (crystal violet); safarin; iodine
Nước cất; cồn 95%
Cách tiến hành :
- Làm tiêu bản :
• Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên phiến kính (hai đầu và
giữa phiến kính).
• Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứtựsau:
Bên trái phiến kính là Bacillus subtilis
Bên phải phiến kính là Escherichia coli
Ở giữa phiến kính là Bac.subtilis trộn lẫn với E. coli
• Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản
• Đặt 3 miếng giấy lọc lên 3 vết bôi.
• Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút
• Nhuộm lugol trong 1 phút.
• Rửa nước.
• Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏtừ từ từng giọt cồn cho
đến khi tan hết màu.
• Rửa nước.
• Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ10 - 30 giây
• Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu.
- Kết quả:
• Vết bôi của Bac. sublitis màu tím - gram dương.
• Vết bôi của Bac. sublitis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím.
• Vết bôi của E.Coli màu hồng - gram âm.
4.3. Quan sát tế bào nấm men
Để quan sát tế bào nấm men sống hoặc chết, ta dùng phương pháp nhuộm đơn giản.
Làm tiêu bản giọt ép
Tế bào nấm men có dạng hình cầu hay hình trứng. Tế bào có kích thước lớn, có khả năng
nẩy chồi.
Quan sát các dạng
- Tế bào riêng lẻ
- Tế bào ở giai đoạn nảy chồi
4.4. Quan sát nấm mốc
 Các phương pháp khảo sát của vi nấm tương tự các phương pháp khảo sát của Vi
khuẩn và kí sinh trùng nhưng đòi hỏi nghiêm khắc hơn. Sinh viên cần phải hết sức thận
trọng khi học môn vi nấm, vì các nấm sinh bào tử, những bào tử này phát tán trong
không khí, ta rất dễ hít phải bào tử nấm hoặc bào tử nấm bám vào da. Vì vậy, chúng ta
luôn theo đúng các phương pháp vô trùng để
+ Tự bảo vệ và bảo vệ những người cùng làm việc.
+ Giữ được các canh cấy nguyên vẹn, không bị bội nhiễm bởi các tác nhân khác.
– Phương pháp phát hiện vi nấm gồm có nhiều kỹ thuật khác nhau:
+ Khảo sát trực tiếp: bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Nhuộm: tiêu bản phết nấm hoặc sinh thiết mô (lát cắt).
+ Cấy nấm.
+ Xét nghiệm sinh hóa.
+ Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử.
+ Tiêm vào thú nuôi phòng thí nghiệm.
– Khảo sát trực tiếp dùng kính hiển vi có thể xác định được chẩn đoán nếu thấy được
nấm trong bệnh phẩm, nhưng không thấy nấm thì không thể loại trừ nhiễm nấm.
❖ Vật liệu
Nấm Aspergillus, nấm Trichoderma trên môi trường PDA
Lưu ý: Luôn giữ đĩa petri có nấm mốc ở trạng thái đậy nắp, nếu không môi trường
xung quanh sẽ nhiễm bào tử nấm mốc. Tuyệt đối không ngửi nấm mốc, vì bào tử có
thể gây bệnh.
❖ Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát:
- Đặc điểm của sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn.
- Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ
quan sinh sản.
- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.
Cách quan sát:
- Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu
- Vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm; vị trí, hình dạng,
cách sắp xếp của bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính của 2 giống
nấm mốc trên.
4.5 . Quan sát đặc điểm sinh học của xạ khuẩn (Actinomycetes)
Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát
- Hình dạng bào tử
- Đặc điểm cuống sinh bào tử.
- Phương thức hình thành chuỗi bào tử
Cách quan sát : Làm tiêu bản giọt ép với xạ khuẩn cấy trên thạch nghiêng.
Bài 5:
ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Định lượng vi sinh vật là xác định số lượng vi sinh vật tổng số hay số lượng vi sinh
vật riêng biệt trên một đơn vị vật phẩm đem nghiên cứu (trên gam, 1 ml dung dịch...).
Việc xác định này rất quan trọng, nó cho ta khái niệm so sánh hay khái niệm thực chất về
khu hệ vi sinh vật cũng như sinh khối của vi sinh vật riêng biệt trong khi nuôi cấy.
Ta có hai phương pháp định lượng:
- Định lượng trực tiếp
- Định lượng gián tiếp(đếm khuẩn lạc)
5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
❖ Nguyên tắc: Là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo cấy một
lượng vi sinh vật nhất định của vật phẩm nghiên cứu lên môi trường đặc trong hộp
đĩa petri sau đó đếm số khuẩn lạc mọc ra.
Phương pháp định lượng này, chỉ tính những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả
chính xác hơn, nhưng tốn thời gian, công sức.
❖ Dụng cụ và hóa chất
- Pipet, micropipet 100-1000ml, đầu típ 1ml, Ống Fancol 15 ml, Đĩa petri
- Máy vortex, Tủ ấm
- Chuẩn bị Môi trường Plate Count agar
Peptone :5.0g
Meat extract :2.5g
D(+) glucose :1.0g
Agar :20g
Nước cất vừa đủ :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0 ± 0.2, Hấp thanh trùng 121 °C/15 phút
❖ Tiến hành:
1. Đồng nhất mẫu và pha loãng
Cân 1 gam mẫu rắn hoặc hút 1ml mẫu nước vào ống falcon chứa 9ml nước muối
0.85% vô trùng, đồng nhất mẫu bằng máy vortex trong 2 phút, thu được nồng độ 10 -1.
Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng. Dùng pipet hút 9ml nước muối vô
trùng vào các ống nghiệm. Sử dụng micropipet hút 1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống
nghiệm thứ nhất, lắc đều trên máy vortex ta được độ pha loãng 10-2. Tiến hành tương tự
ta được các nồng độ tiếp theo.
Lưu ý khi pha loãng:
- Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào vệ sinh mẫu, kinh nghiệm của người thực hiện....
 - Thao tác bên ngọn lửa đèn cồn, các dụng cụ pipet, ống nghiệm phải được vô trùng. Khi
pha loãng sử dụng micropipet phải đổi đầu típ cho mỗi lần hút 1ml từ nồng độ pha loãng
đầu đến nồng độ tiếp theo để tránh sai số.
- Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều
2. Đổ hộp và cấy mẫu
Có 2 cách cấy mẫu:
Cách 1:
• Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào
ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 45 - 50°C
• Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường
• Đổ thạch này vào đĩa petri đã khử trùng
• Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều mặt đĩa
• Để yên cho môi trường đông đặc và ủ ở nhiệt độ thích hợp
Cách 2:
• Hút 0,1 ml dịch cần nghiên cứu cho vào đĩa petri có môi trường đặc
• Dùng que trang trải đều khắp mặt đĩa
• Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
- Dùng bút lông ghi chú lên đĩa ( tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng...)
- Lật ngược đĩa và đặt vào tủ ấm 30 °C 48 -72 h ( 48h mang ra đếm sơ bộ, và 72 giờ đếm
chính thức)
3. Tính kết quả
Đếm số khuẩn lạc/ đĩa/các nồng độ. Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 khuẩn lạc để
tính toán. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí:

A: tổng số tế bào /1ml (1g) mẫu (cfu/g(ml))

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa
ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa
fi : độ pha loãng tương ứng.
Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập
phân giữa 1.0 và 9.0 nhân với 10n (n là số mũ). Trường hợp khuẩn lạc mọc loang, mỗi vết
loang được tính là 1 khuẩn lạc. Nếu số khuẩn lạc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì ghi nhận và
đánh dấu kết quả nhận được.
5.2. Sử dụng buồng đếm (định lượng trực tiếp)
1. Cấu tạo buồng đếm:

2. Cách tra mẫu vào buồng đếm

3.Cách đếm:

4.Tiến hành
 - Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, tra 15 - 20 l dịch vào bề mặt buồng đếm kề với
cạnh lá kính.
- Dịch huyền phù tế bào sẽ điền đầy các ô theo cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được
chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được điền đầy
bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh xung quanh không bị dính ướt.
- Di chuyển nhẹ khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó dịch nằm
trong đó sẽ có bề dày 0.1mm.
- Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút. Đếm số tế bào trong ô vuông
lớn (corner square) tại ô trung tâm (middle square), ghi nhận rồi tính số tế bào trong 1ml
(1 gam) theo công thức sau:
N= [a/b x 400/0.1] x 103 x 10n
N: số tế bào trong 1ml (1 gam) mẫu nghiên cứu
a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô vuông nhỏ)
b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (80)
400: tổng số ô vuông nhỏ ở ô trung tâm
103 số chuyển đổi mm3 thành ml(1000 mm3 = 1 ml)
10n: độ pha loãng mẫu.
 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

THÍ NGHIỆM VI SINH

(Phòng thí nghiệm CNSH)

Giáo viên hướng dẫn: Ths. PHẠM THỊ KIM THẢO

Sinh viên thực hiện:
Lớp sinh hoạt:
Nhóm học phần:
Nhóm thí nghiệm:

Đà Nẵng, 2019-2020
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………