MỞ ĐẦU

Thực tập VI SINH THỰC PHẨM nhằm vừa cung cấp những kiến thức cơ bản vừa cung
cấp những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực kiểm tra, phân tích sự hiện diện của vi sinh vật
trong thực phẩm từ đó giúp sinh viên có được khả năng làm việc trong phòng thí nghiệm, có
khả năng phân tích và đánh giá chất lượng thực phẩm nhanh với độ tin cậy cao. Nắm được
các phương pháp và thao tác sinh viên có thể độc lập trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm.

1
 BÀI 1. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ
và MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

I. MỤC ĐÍCH
Điều kiện sống của các loại vi sinh vật khác nhau thường không giống nhau, sự tồn
tại và phát triển của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như nhiệt độ, aw, pH,
ánh sáng, các chất tẩy rửa, muối kim loại, cồn…Vì vậy mục đích của bài thí nghiệm
này là giúp rèn luyện kỹ năng rửa dụng cụ, bao gói, khử trùng, pha các loại môi trường
nuôi cấy vi sinh vật cũng như khử trùng, bảo quản các môi trường nuôi cấy vi sinh vật
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu:
Hoá chất và dụng cụ được chuẩn bị để sử dụng cho các bài thực tập từ 1 đến 6
- Cồn 5 lít
- Bông không thấm nước 0,5 kg
- Bông thấm nước 0,5 kg
- Nước cất vô trùng 15 lít
- Giấy báo
- Xà bông 1,0kg
- Găng tay y tế (sử dụng 1 lần) 20 đôi ( 1 sinh viên / 1 đôi)
- Băng keo 4 cuồn
- Diêm quẹt 1 cái quẹt gas
- Chổi rửa dụng cụ lớn 10 cây
- Chổi rửa dụng cụ nhỏ 10 cây
2.2 Hóa chất
Các môi trường nuôi cấy dùng trong các bài thực tập 2, 3, 4, 5 và 6
Bảng 1.1. Các loại môi trường cần chuẩn bị

Môi trường nuôi cấy Khối lượng / 2 nhóm

- Nutrient Agar 0,25kg

- VRBL Agar 0,125kg

- Brilliant Green Bile Lactose 0,125kg

- Desoxycholate Agar 0,125kg

- Canh MRVP 0,125 kg

2
 - Nước pepton đệm 0,125lit

- Canh tetrathionate 0,125kg

- Sabouraud 0,125 kg

- Mannitol Salt Broth (MSB) 0,125 kg

- Tellurite Glycerin Agar (TGA) 0,125 kg

- Brain Heart Infusion (BHI) 0,125 kg

- Eosine Methylene Blue Agar (EMB) 0,125 kg

- Tryptic soy broth (TSB) 0,125 kg

- Iron Sulphite Agar 0,25 kg

- Xanh methylen 0, 010g

- Dầu soi kính 100 ml

2.3 Dụng cụ thí nghiệm

- Hộp đựng phiến kính, lá kính, đĩa petri
- Ống nghiệm, ống hút, ống đong các loại
- Đũa thuỷ tinh, que gạt, que cấy, đèn cồn
- Bình tam giác các loại
- Cốc (beaker) các loại
- Giá để ống nghiệm
- Bình chứa môi trường
- Dao, kẹp inox, bếp gas, bếp điện
- Viết không xoá
- Nhãn dán mẫu
2.4 Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy
- Nồi hấp tiệt trùng
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Xử lý dụng cụ
Nguyên tắc
Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, sạch. Vì vậy
khâu xử lý dụng cụ bao gồm hai giai đoạn: trung tính dụng cụ và rửa dụng cụ.

3
 Phương pháp
a. Trung tính dụng cụ
- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH= 7 để kiểm tra độ trung tính.
- Nếu pH > 7 ngâm vào trong dung dịch HCl 2%, rửa lại thật kỹ bằng nước sạch.
- Nếu pH<7 ngâm vào trong xà bông, rửa lại thật kỹ bằng nước sạch.
b. Rửa dụng cụ
- Nếu dụng cụ có dính dầu, mỡ hoặc vazơlin thì phải dùng vải chùi sạch, sau đó
ngâm vào trong nước xà bông, đun sôi khoảng 15 phút. Sau đó rửa lại bằng nước sạch,
để ráo rồi ngâm vào trong cồn 900, lấy ra lau khô.
- Nếu dụng cụ bị nhiễm khuẩn, phải tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó đổ hết
các vật phẩm (nếu có), ngâm vào trong nước ấm, rửa lại bằng xà bông và bằng nước
sạch, cuối cùng sấy khô ở 370C.
3.2 Bao gói dụng cụ
Nguyên tắc
Dụng cụ sử dụng trong kiểm tra vi sinh vật phải thật sạch và khô. Nên việc bao gói
dụng cụ phải được thực hiện, bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử
trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
Phương pháp
Làm nút bông: sử dụng bông không thấm nước để làm nút bông. Nút bông có kích
thước, độ chặt vừa phải, đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong nút lấy ra
hay đóng lại dễ dàng
Giấy bao phải chặt và kín. Sử dụng giấy dầu với dụng cụ khử trùng nhiệt ướt và
giấy báo với các dụng cụ khử trùng nhiệt khô.
3.3 Khử trùng dụng cụ
Nguyên tắc
Vật phẩm và dụng cụ cần phải đạt được độ vô trùng tuyệt đối, không làm thay đổi
chất lượng mẫu vật.
Phương pháp
a. Khử trùng nhiệt khô
Dụng cụ được bao gói cẩn thận. Sấy ở nhiệt độ 1600C trong 2 giờ hay 1800C
trong 30 phút. Tắt tủ sấy, để nguội đến 600C rồi mới lấy dụng cụ.
b. Khử trùng nhiệt ướt
Thường dùng để khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
- Cho nước vào ngập điện trở của autoclave.
- Xếp dụng cụ vào hộp inox và đưa vào thiết bị tiệt trùng.
- Điều chỉnh nhiệt độ, thời gian khử trùng, thời gian sấy (thông thường nhiệt độ
khử trùng là 1210C, thời gian 15 phút, thời gian sấy là 15 phút).

4
 - Sau khi khử trùng xong chờ kim áp kế về 0 mới mở nắp thiết bị khử trùng rồi
lấy dụng cụ, vật liệu đã khử trùng ra.
3.4 Pha các môi trường đông khô
- Cân chính xác lượng môi trường theo hướng dẫn trên bao bì.
- Dùng bình định mức để đong thể tích nước cần sử dụng
- Sử dụng một lượng nhỏ nước để hoà tan lượng môi trường vừa cân, chuyển huyền
phù này vào trong bình đựng môi trường. Phần nước còn lại dùng để tráng dụng cụ
chứa môi trường nhiều lần sao cho không còn môi trường dính trên thành dụng cụ.
- Đun cách thuỷ môi trường trong bình chứa đến khi tan hoàn toàn.
- Chuyển môi trường vừa pha vào các bình chứa với thể tích thông thường khoảng
300ml rồi đem đi khử trùng.

IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM

1 Trình bày các nguyên tắc cơ bản của việc xử lý , bao gói các dụng cụ
2. Thực hành rửa và bao gói các loại dụng cụ: ống nghiệm, ống hút, que gạt, đĩa
Petri, bình tam giác, phiến kính….
3. phân tích cơ sở vi sinh vật học của các phương pháp khử trùng: Pasteur, Tyndal,
tủ sấy.
4. Tóm tắt cách sử dụng nồi hấp áp suất cao
5. Thực hành lọc khử trùng môi trường bằng bình lọc Seilz và kiểm tra độ vô trùng
của dịch lọc
6. Trình bày nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của tủ cấy vô trùng
7. Trình bày các bước tiến hành khi pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật
8. Trình bày phương pháp khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy vi sinh vật

5
 BÀI 2. KIỂM TRA SỐ LƯỢNG VÀ QUAN SÁT HÌNH
DẠNG TẾ BÀO NẤM MEN BẰNG KÍNH HIỂN VI

I. MỤC ĐÍCH
Một trong những phương pháp định lượng vi sinh vật là sử dụng kính hiển vi,
phương pháp này được áp dụng rất nhiều khi kiểm tra mật số vi sinh vật trong quá
trình lên men nhằm cho kết quả nhanh, tạo điều kiện cho nhà sản xuất có phương pháp
xử lý thích hợp. Vì vậy mục đích của bài thực tập này giúp sinh viên hiểu và nắm được
cấu tạo, chức năng của các bộ phận chính của kính hiển vi quang học và nắm được các
kỹ năng như kỹ năng sử dụng kính hiển vi quang học, đặc biệt là sử dụng vật kính dầu;
kỹ năng bảo quản thường xuyên và định kỳ kính hiển vi; kỹ năng xác định số lượng vi
sinh vật trên đơn vị mẫu bằng buồng đếm hồng cầu (Goriaep); kỹ năng xác định số
lượng vi sinh vật trên đơn vị mẫu bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa.
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu:
- Khóm
- Đường
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae
2.2 Hóa chất
- Xanh methylen
- Dầu soi kính
- Cồn
2.3 Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml
- Buồng đếm hồng cầu
- Micropipette 1ml, 5ml
- Cối, chày sứ, quẹt gas, que gạt….
2.4 Thiết bị sử dụng
- Kính hiển vi quang học
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị dịch nuôi cấy
Khóm  Xử lý Ép  Lọc  Phối chế  Thanh trùng  Lên men.
Kiểm tra mật số nấm men, tỉ lệ tế bào nảy chồi, tỉ lệ tế bào chết theo thời gian

6
3.2 Thực hành sử dụng kính hiển vi quang học thông thường
Nguyên tắc
Ảnh thực của mẫu vật mà ta quan sát được thông qua vật kính và thị kính có độ
phóng đại của ảnh bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của
thị kính.
Ví dụ:
- Độ phóng đại của thị kính là 10 lần (X 10)
- Độ phóng đại của vật kính là 40 lần (X 40)
- Như vậy độ phóng đại của ảnh là 10 X 40 = 400 lần
Cấu tạo (hình 2.1)
Kính hiển vi quang học thông thường gồm có 2 bộ phận chính
Bộ phận cơ học
Có cấu tạo khá đơn giản gồm 3 phần chính: giá kính, ống kính và bàn kính
- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để làm chỗ dựa chủ yếu cho rất nhiều bộ phận
như ống kính, trụ mang ống kính và bàn kính
- Ống kính là một ống tròn (kính 1 mắt) hay hai ống tròn (kính 2 mắt). Ống này
có thể di động theo hướng của người sử dụng. Phía trên ống kính là 1 hoặc 2 thị
kính. Phần dưới ống kính là một bàn quay có gắn nhiều vật kính khác nhau.
Ống kính có thể di chuyển lên hay xuống nhờ các ốc điều chỉnh theo hai chiều
ngược nhau
+ Ốc di chuyển nhanh (ốc chỉnh thô): có nhiệm vụ tìm ảnh của vật
+ Ốc di chuyển chậm (ốc chỉnh tinh): sau khi thấy ảnh của vật mới điều chỉnh
ốc này để thấy ảnh rõ nét hơn
- Bàn kính: bàn kính dùng để đặt tiêu bản. trên bàn có 2 ốc để di chuyển tiêu bản
theo 2 chiều khác nhau và có 2 kẹp bằng thép để giữ tiêu bản.

7
 Thị kính

Ống kính

Tay cầm
Vật kính

Bàn kính

Kẹp
Ốc chỉnh thô
Kính tụ quang
Ốc chỉnh tinh
Nguồn sáng

Bệ đỡ

Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo của kính hiển vi quang học thông thường

Bộ phận quang học

Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi. Cấu tạo của nó
gồm : vật kính, thị kính, kính tụ quang và gương phản chiếu .
- Vật kính
Gồm nhiều thấu kính ghép lại có vai trò phóng đại mẫu vật. Có 4 loại vật kính
với 4 độ phóng đại khác nhau là (X 10), (X 20), (X 40), (X 100). Các chỉ số này
được ghi rõ trên vật kính, (X 10 là độ phóng đại 10 lần,… X 100 là độ phóng đại
100 lần ).
Vật kính dầu là những vật kính có độ phóng đại lớn (X100). Khi quan sát tiêu
bản phải sử dụng dầu, Vật kính khô (X 10,X 20, X 40) là vật kính khi quan sát
không phải sử dụng dầu.
Muốn có ảnh rõ và sáng thì khi quan sát mẫu vật trên kính hiển vi ở bội giác lớn
thì cần bổ sung một loại dầu có độ chiết quang tương đương với độ chiết quang của
thuỷ tinh. Nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản, dầu sẽ chiếm khoảng không gian giữa tiêu
bản và vật kính thay cho không khí. Nhờ đó, giữa thuỷ tinh và dầu tạo thành một

8
 môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sang đi qua không bị khúc xạ mà chiếu
thẳng vào kính
- Thị kính
Được lắp ở phần đầu của ống kính, thị kính được cấu tạo từ hai thấu kính. Mỗi
loại thị kính có độ phóng đại khác nhau, được ghi ở ngoài của thị kính (7X, 15X).
Ảnh quan sát được là ảnh ảo và ngược của vật với độ phóng đại bằng tích số giữa
độ phóng đại của vật kính và thị kính đang dùng.
- Kính tụ quang
Kính này nằm dưới bàn kính, gồm 1 hệ thống thấu kính ghép lại có tác dụng tập
trung ánh sang nên rất cần khi sử dụng vật kính dầu. Kính tụ quang có thể điều
chỉnh lên hoặc xuống. Đây là hệ thống chắn ánh sáng cho phép ta điều chỉnh lượng
ánh sang đi vào nhiều hay ít
- Gương phản chiếu
Lắp dưới kính tụ quang, có nhiệm vụ hướng chùm tia sáng vào kính tụ quang.
Gương này gồm hai mặt lõm và phẳng, có thể quay các hướng để thu ánh sang từ
nguồn sáng
Cách sử dụng
Các thao tác điều chỉnh nguồn ánh sáng
- Đưa vật kính vào vị trí có thể nhận được nguồn sáng
- Cắm điện và bật công tắc đèn
- Mắt nhìn vào thị kính đồng thời dùng tay phải để điều chỉnh gương phản chiếu
để tập trung nguồn ánh sang vào tâm điểm của thị trường quan sát
- Điều khiển kính tụ quang bằng tay trái
Các thao tác điều chỉnh vật kính và quan sát tiêu bản
- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại
- Nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu bản để chọn được vùng quan sát
Cách bảo quản kính sau khi sử dụng
- Bảo quản kính sau khi sử dụng kính
- Bảo quản định kỳ trong năm
3.3 Tiến hành thí nghiệm: xác đinh trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phiến
kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu)
1. Pha loãng dịch nấm men đã được nuôi cấy thuần chủng sau 0, 1, 2, 3 và 4 ngày lên
men
2. Quan sát hình dạng, đo kích thước và đếm mật số tế bào nấm men
3. Đếm số tế bào nảy chồi
4. Đếm số tế bào chết

9
IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM
1. Trình bày cấu tạo và chức năng của các bộ phận chủ yếu trong kính hiển vi
quang học
2. Vẽ và chú thích hình dạng, kích thước của nấm men theo thời gian lên men
3. Áp dụng công thức để tính số lượng nấm men trong huyền phù nuôi cấy chúng
ở các ngày lên men khác nhau, từ đó vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men
theo thời gian lên men.
4. Tính số lượng tế bào nấm men nảy chồi và số lượng tế bào nấm men chết ở các
ngày lên men khác nhau. Thảo luận kết quả thu được.

10
 BÀI 3. KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM RẮN

I. MỤC ĐÍCH
Giúp cho sinh viên làm quen, nắm được các thao tác cũng như áp dụng lý thuyết đã
học vào trong quá trình kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm.
Nội dung bài thực tập giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường, mẫu,
cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong các sản phẩm thực
phẩm. Từ đó xác định mức độ nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm.
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu:
- Thịt
- Cá
- Đồ hộp
- Cồn
- Bông gòn
- Nước cất vô trùng
- Muối tinh khiết
2.2 Hóa chất
- Môi trưòng Nutrient Agar
- Môi trường Endo
- Môi trường Sabouraud
- Mannitol Salt Broth (MSB)
- Tellurite Glycerin Agar (TGA)
- Brain Heart Infusion (BHI)
2.3 Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri - Đèn cồn. - Que cấy
- Bình cầu 200ml - Kính hiển vi - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu.
- Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm.
2.4 Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy

11
 - Tủ ủ
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị môi trường
Cân các môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác định
trong bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình cầu.
Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong nước.
Pha loãng dung dịch nước muối 0,85%. Dùng ống đong đong 90ml nuớc muối đã
pha loãng cho vào bình cầu. Bịt kín miệng bình cầu bằng bông gòn.
Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm, pipette. Dùng giấy bịt kín (chuẩn bị thanh trùng)
Thanh trùng các môi trường, dụng cụ thủy tinh, bình chứa mẫu pha loãng.
3.2 Chuẩn bị mẫu
Tiến hành cân 10g mẫu từ các nguồn nguyên liệu. Cho mẫu đã cân vào bình cầu
đựng 90ml nước muối 0,85%(Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1/10).
3.3 Tiến hành thí nghiệm
a. Tổng số vi sinh vật
Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật. Thường sử
dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để xác định chỉ tiêu này.
- Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một
lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất.
- Môi trường nuôi cấy: Nutrient Agar
- Tiến hành
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi
đĩa khoãng 15ml thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi
chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên.
Khi môi trường đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở chế độ nhiệt 37 0C trong thời
gian 24-48h.
- Đọc kết quả:
Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng
và qui ra lượng vi sinh vật trong 1 ml (hay một gam) mẫu.
b. Coliforms
Coliforms là những trực khuẩn đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí
hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong
vòng 24h.
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường Endo.
- Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa
petri. Rót vào mỗi đĩa khoãng 15ml môi trường. Có thể sử dụng 2 nồng độ pha loãng
liên tiếp. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt
phẳng ngang cho đông tự nhiên.
Lật úp đĩa và ủ ở 370C trong 24-36h.
12
 - Đọc kết quả
Sau 24 h nuôi cấy trên môi trường, các khuẩn lạc coliforms có màu đỏ đặc
trưng, đường kính khoãng 0.5mm. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng trên điã có số đếm
phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các nồng độ pha loãng để qui về số coliforms trong
1ml (hay một gam) mẫu

.
Hình 3.1. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường dinh dưỡng
c. Staphylococcus aureus
Định nghĩa: Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gam dương đường kính
khoảng 0,7m, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm hoặc ghép
đôi, lên men mannitol sinh sắc tố vàng, chịu mặn 7,5% NaCl và có khả năng đông
huyết tương.
Nguyên tắc: S. aureus được xác định trên cơ sở thử phản ứng đông huyết tương
những dòng thuần từ những khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.
Môi trường nuôi cấy
- Môi trường tăng sinh chọn lọc: Mannitol Salt Broth (MSB) chỉ dùng trong
trường hợp kiểm tra định tính.
- Môi trường phân lập: Tellurite Glycerin Agar (TGA) hoặc Baird Parker.
- Môi trường phục hồi: Brain Heart Infusion (BHI)
Kiểm tra định tính
- Cấy 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8 ml môi trường MSB. Trộn đều
dịch mẫu và môi trường, ủ ở 370C, 24 giờ.
- Sau 24 giờ cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển màu từ đỏ
sang vàng ) lên môi trường phân lập và ủ ở 370C, 24 giờ.
- Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn,
lồi, đường kính từ 1-1,5 mm được bao quanh bởi một quầng sáng. Các khuẩn
lạc không đặc trưng có kích thước và màu sắc tương tự nhưng không có quầng
sáng.
- Chọn một số khuẩn lạc đặc trưng cấy chúng vào một ống nghiệm chứa môi
trường BHI, ủ ở 370C, 24 giờ.

13
 - Sau 24 giờ cấy vi sinh vật từ môi trường BHI vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng
0,3 ml huyết tương và ủ ở 370C, 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Phản ứng
được coi là dương tính khi có bất kỳ sự đông kết nào xuất hiện trong ống huyết
tương chứa vi sinh vật thử và đồng thời ống đối chứng không đông.
Kết luận mẫu có chứa Staphylococcus aureus khi có phản ứng đông huyết tương
dương tính.

Hình 3.2 Staphylococcus aureus trên môi trường

nuôi cấy (Staphylococcus aureus lên men mannitol)

d. Đếm nấm mốc và nấm men tổng số

Tiêu chuẩn này dùng để đếm nấm men và nấm mốc trong thực phẩm bằng kỹ
thuật đểm khuẩn lạc ở 25oC.
- Nguyên tắc: nấm men và nấm mốc là những vi sinh vật tạo ra những khuẩn
lạc ở 25oC trong môi trường chọn lọc phù hợp. Nuôi cấy hiếu khí các đĩa ở 25 oC trong
3-5 ngày. Đếm số khuẩn lạc xác định được trên đĩa ở nồng độ pha loãng đã chọn.
- Môi trường nuôi cấy: Sabouraud có nồng độ Cloramphenicol 0,1g/l hoặc
các môi trường dinh dưỡng phù hợp.
- Tiến hành:
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2
lần pha loãng liên tiếp. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường thạch dinh dưỡng.
Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng
ngang cho đông tự nhiên. Khi môi trường đông, đặt đĩa ở 25oC ( nhiệt độ phòng)
trong thời gian 3-5 ngày.
- Đọc kết quả:
Nhận diện các khuẩn ty của nấm mốc và các tế bào nấm men có trên đĩa petri

14
IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM
- Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian
- Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên các mẫu đã phân tích.

15
 BÀI 4. KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT
TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM LỎNG

I. MỤC ĐÍCH
Giúp cho sinh viên làm quen, nắm được các thao tác cũng như áp dụng lý thuyết đã
học vào trong quá trình kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh có trong nước và
thực phẩm lỏng.
Nội dung bài thực tập giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường, mẫu,
cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong nước và các sản phẩm
thực phẩm lỏng. Từ đó xác định mức độ nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm này.
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu:
- Nước rau má
- Sữa tươi
- Cồn
- Bông gòn
- Nước cất vô trùng
- Muối tinh khiết
2.2 Hóa chất
- Môi trưòng Nutrient Agar
- Môi trường EMB
- Môi trường Fluid Lastose Medium
- Nước pepton đệm (Buffered Pepton Water)
- Canh Tetrathionate (Muller –Kauffmann)
- Desoxycholate Agar (XLD)
2.3 Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri - Đèn cồn. - Que cấy
- Bình cầu 200ml - Kính hiển vi - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu.
- Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm.
2.4 Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy, tủ ủ
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Cân các môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác
định trong bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình cầu.

16
 - Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong nước.
- Pha loãng dung dịch nước muối 0,85%. Dùng ống đong đong 90ml nuớc muối
đã pha loãng cho vào bình cầu. Bịt kín miệng bình cầu bằng bông gòn.
- Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm, pipette. Dùng giấy bịt kín (chuẩn bị thanh trùng)
- Thanh trùng các môi trường, dụng cụ thủy tinh, bình chứa mẫu pha loãng.
3.2 Chuẩn bị mẫu
Tiến hành cân 10g mẫu từ các nguồn nguyên liệu. Cho mẫu đã cân vào bình cầu
đựng 90ml nước muối 0,85% (Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1/10).
3.3 Tiến hành thí nghiệm
a. Tổng số vi sinh vật
Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật. Thường sử
dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để xác định chỉ tiêu này.
- Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một
lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất.
- Môi trường nuôi cấy: Nutrient Agar
- Tiến hành
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi
đĩa khoãng 15ml thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi
chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên.
Khi môi trường đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở chế độ nhiệt 37 0C trong thời
gian 24-48h.
- Đọc kết quả
Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng
và qui ra lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu.
b. Escherichia coli
Là một dạng coliform có nguồn gốc từ phân phát triển được ở 44+/-0.50C. Sinh
indol, sinh nhiều acid, không sinh aceton và không dùng citrate làm nguồn carbon duy nhất.
E. coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 44+/-0.50C
- Môi trường nuôi cấy:
Môi trường tăng sinh: Fluid Lactose Medium.
Môi trường phân lập: EMB (Eosine Methylene Blue Agar)
- Tiến hành:
Tăng sinh: Cấy 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng
sinh. Dùng 2 ống nghiệm cho mỗi mẫu.
Phân lập: Sau 24h dùng que cấy cấy dịch mẫu từ ống có phản ứng dương tính
(có sinh hơi, làm đục môi trường màu vàng ) lên môi trường phân lập, ủ ở 370C trong 24h.
Nhận dạng khuẩn lạc E.coli:

17
Trên môi trường EMB khuẩn lạc có màu đỏ tía, thường có ánh kim, tròn, bờ đều,
đường kính khoảng 0,5mm.
c. Salmonella
Định nghĩa: Salmonella là trực trùng gam âm kích thước khoảng o,6 X 2m,
hiếu khí, có khả năng di động, không tạo bào tử, không sinh indol hoặc acetoin, không
có khả năng lên men sucrose, lactose, hoặc phân giải urea, không có khả năng tách
amine từ triptophan.
Nguyên tắc: Salmonella được phát hiện bằng những phản ứng sinh hoá phù hợp.
Môi trường nuôi cấy
- Môi trường tiền tăng sinh: Nước pepton đệm (Buffered Pepton Water)
- Môi trường tăng sinh: canh Tetrathionate (Muller –Kauffmann), canh
Selenite hoặc canh Rappaport-Vassiliadis (RV)
- Môi trường phân lập: Brilliant Green Agar (BGA), Xylose-Lysine-
Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Sulfite Agar (BSA)
Tiến hành:
a. Lấy mẫu: Đối với Salmonella tuỳ theo loại nguyên liệu mà ta có phương pháp
lấy mẫu khác nhau.
Ví dụ:
+ Đối với thịt đông, thuỷ sản đông lấy mẫu trên vùng bề mặt càng rộng càng
tốt.
+ Đối với bột khô hoặc ngũ cốc nên lấy từ nhiều bao gói khác nhau và chú ý
khối lượng mẫu.
b. Tiền tăng sinh: về nguyên tắc là trộn một phần mẫu với 9 phần nước pepton
đệm, sau đó ủ ở 370C, 24 giờ (ví dụ: nếu dùng 25 g mẫu thì hoà đều mẫu đó với 225
ml nước pepton đệm).
c. Tăng sinh: lắc kỹ canh tiền tăng sinh trước khi cấy chuyển 0,1 ml canh đó vào
10 ml môi trường tăng sinh và ủ ở 370C, 24 giờ
d. Phân lập: dùng khuyên cấy chuyển khuẩn dịch (canh tăng sinh) lên bề mặt môi
trường phân lập sao cho có thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở
370C, 24 giờ.
- Trên môi trường XLD, khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do
sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, đôi khi có tâm đen. Bao giờ cũng có thể
nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ quanh khuẩn lạc.
- Trên môi trường BGA Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ và cũng có
vùng môi trường đỏ quanh khuẩn lạc.
- Trên môi trường BSA khuẩn lạc Salmonella dẹt, khô, đen nhánh, có vùng môi
trường nâu đen bao quanh và thường tạo ánh kim bạc phớt trên bề mặt môi trường.
e. Thử phản ứng sinh hoá: có thể kết luận mẫu Salmonella khi có chứa
những trực khuẩn gam âm tạo khuẩn lạc đặc trưng trên những môi trường phân lập và
cho những kết quả sinh hoá sau: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urea (-), Indol (-),
VP (-), TDA (-), Mannitol (+).
18
IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM.
- Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian
- Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên các mẫu đã phân tích.

19
 BÀI 5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT
VI SINH VẬT BẰNG NHIỆT

I. MỤC ĐÍCH
Trong chế biến thực phẩm, nhiệt là một trong những phương pháp phổ biến nhất
được sử dụng để ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật, đặc biệt là những loại vi sinh vật
gây hư hỏng sản phẩm. Hai yếu tố quan trọng là nhiệt độ và thời gian xử lý. Mục đích
của bài thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đến khả
năng tiêu diệt vi sinh vật.
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu
- Cồn
- Bông gòn
- Nước cất vô trùng
- Muối tinh khiết
2.2 Hóa chất
- Môi trường Fluid Lastose Medium
- Môi trường TSB, pH = 7 (Tryptic soy broth)
- Môi trường VRBL (Crystal Violet Neutral Red Bile Lactose Agar)
2.3 Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri - Đèn cồn.
- Bình cầu 200ml - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu.
- Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm.
- Que cấy - Viết không xoá
- Nhãn dán mẫu
2.4 Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy
- Tủ ủ
- Water bath
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Sử dụng các môi trường và dụng cụ đã được chuẩn bị trong bài 1
3.2 Chuẩn bị mẫu
Chọn và phân lập các khuẩn lạc coliforms trong bài thí nghiệm 3 (hoặc 4), sau
đó cấy tăng sinh trong môi trường Fluid Lastose Medium, ủ ở 370C, 24 giờ.

20
3.3 Tiến hành thí nghiệm
1. Chia nhóm thực tập thành 4 nhóm nhỏ, mỗi nhóm sẽ thực hiện ở một nhiệt độ (54,
58, 62 và 700C)
2. Ghi nhãn trên tất cả các đĩa petri đã tiệt trùng, ghi rõ nồng độ pha loãng, nhiệt độ xử
lý, thời gian xử lý.(theo bảng 5.1 và hình 5.1)
3. Cho 10ml huyền phù coliforms (đã cấy tăng sinh qua đêm) vào 90 ml môi trường
TSB pH = 7, và trộn đều bằng vortex. (thường khi ủ qua đêm mật số coliforms trong
huyền phù khoảng 3x109 cfu/ml, vì thế nồng độ của coliforms trong môi trường TSB
khoảng 3x108 cfu/ml)
4. Dùng viết không xoá ghi lên các ống nghiệm đã được tiệt trùng nhiệt độ và thời gian
xử lý nhiệt (0,10, 20, 30, 40, 50 và 60 phút)
5. Cho vào mỗi ống nghiệm 5ml mẫu được chuẩn bị ở bước 3, nồng độ này được xem
như là 100 cho tất cả các mẫu.
6. Cho các ống nghiệm vào bễ điều nhiệt đã được nâng nhiệt sẵn theo nhiệt độ của
từng nhóm. Bắt đầu tính thời gian cho các ống nghiệm theo thời gian đã ghi sẵn trên
ống nghiệm. Khi đủ thời gian xử lý nhiệt cho các ống nghiệm vào trong nước đá hoặc
ice water bath để làm nguội. Sau đó trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm, tiến
hành pha loãng và đổ đĩa với 2 lần lặp lại cho 1 nồng độ pha loãng như hình 5.1
7. Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng lấy 1 ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Sử
dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Đổ vào mỗi đĩa khoảng
15 ml môi trường VRBL ở 450,50C. Lắc tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim đồng hồ,
mỗi chiều 5 lần. Sau khi môi trường đông hoàn toàn đổ thêm khoảng 4ml môi trường
VRBL tráng kín bề mặt đĩa và để đông đặc như trên.
8.Lật úp đĩa và ủ ở 370C, 24 giờ.
9. Đọc và tính kết quả: Trên môi trường VRBL các khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ tía,
đường kính khoảng 0,5 mm, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa. Đếm
khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên những đĩa có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung
bình từ các độ pha loãng để qui về số coliforms trong 1 ml mẫu.

21
Hình 5.1: Sơ đồ hướng dẫn nồng độ pha loãng được kiểm tra ở các nhiệt độ và thời
gian xử lý khác nhau
IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM
1. Tính kết quả và ghi vào bảng kết quả
2. Vẽ đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa mật số vi sinh vật (semi –log) (cfu/ml) và
thời gian xử lý nhiệt
3. Tính toán giá trị D và giá trị z ở các nhiệt độ xử lý khác nhau
4. Bước thí nghiệm nào có thể gây sai số trong thí nghiệm này? Nêu biện pháp
hạn chế sai số xảy ra.
5. Đường cong chết nhiệt có phải là đường thẳng không? Giả sử nếu không phải là
đường thẳng, theo bạn nguyên nhân gây ra sự biến đổi này là gì?
6. Nếu bạn muốn lặp lại thí nghiệm để kiểm tra số lượng tế bào bị tổn thương, bạn
sẽ thực hiện bằng cách nào? Bạn có cần kiểm tra ở tất cả các nồng độ pha loãng
hay không?
7. Nếu pH của môi trường nuôi cấy bằng 4, theo bạn giá trị D và z có thay đổi gì
không? Tại sao?

22
 BÀI 6 KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VÀ HƯ HỎNG BỞI
VI SINH VẬT TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓ ĐỘ ACID
THẤP (LOW- ACID PRODUCTS)

I. MỤC ĐÍCH
Giúp cho sinh viên làm quen, nắm được các thao tác cũng như áp dụng lý
thuyết đã học vào trong quá trình kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh có trong
thực phẩm.
Nội dung bài thực tập giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường,
mẫu, cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong các sản phẩm
thực phẩm. Từ đó xác định mức độ nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm.
II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
2.1 Nguyên vật liệu
- Đồ hộp thịt
- Đồ hộp cá
- Đồ hộp bắp non
- Cồn
- Bông gòn
- Nước cất vô trùng
- Muối tinh khiết
2.2 Hóa chất
- Môi trường Nutrient Agar
- Môi trường Iron Sulphite Agar
2.3 Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri - Đèn cồn. - Que cấy
- Bình cầu 200ml - Kính hiển vi - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu.
- Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm.
2.4 Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy
- Tủ ủ
III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Chuẩn bị môi trường
- Cân các môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác
định trong bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình cầu.
- Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong
nước.

23
 - Pha loãng dung dịch nước muối 0,85%. Dùng ống đong đong 90ml nuớc muối
đã pha loãng cho vào bình cầu. Bịt kín miệng bình cầu bằng bông gòn.
- Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm, pipette. Dùng giấy bịt kín (chuẩn bị thanh
trùng)
- Thanh trùng các môi trường, dụng cụ thủy tinh, bình chứa mẫu pha loãng.
3.2 Chuẩn bị mẫu
Tiến hành gây nhiễm trên 3 loại đồ hộp thịt, cá và bắp non với 4 mốc thời gian
khác nhau 0 ngày (mẫu đối chứng), 1 ngày, 2 ngày và 3 ngày.
3.3 Tiến hành thí nghiệm
a. Tổng số vi sinh vật
Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật. Thường sử
dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để xác định chỉ tiêu này.
- Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một
lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất.
- Môi trường nuôi cấy: Nutrient Agar
- Tiến hành:
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi
đĩa khoãng 15ml thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi
chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên.
Khi môi trường đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở chế độ nhiệt 370C trong thời
gian 24-48h.
- Đọc kết quả:
Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng
và qui ra lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu.
b. Clostridium khử sulfite
Định nghĩa: Giống Clostridium là những trực khuẩn kị khí gam dương có khả
năng tạo bào tử và khử sulphite, phần lớn có khả năng di động.
Khử sulphite là đặc tính tiêu biểu nhất của Clostridium có ý nghĩa đặc biệt
trong vấn đề vệ sinh thực phẩm.
Nguyên tắc: Dựa trên đặc tính của bào tử Clostridium chịu được nhiệt độ 750C,
10 phút. Số lượng Clostridium khử sulphite xác định bằng cách cấy một dịch mẫu xác
định vào ống thạch đứng cao chứa môi trường thích hợp có bổ sung ferric citrate và
sodium sulphite, đun cách thuỷ 800C, 10 phút, đếm các khuẩn lạc đen đặc trưng sau
khi ủ ở 370C, từ 1 đến 4 ngày.
Môi trường nuôi cấy: Iron Sulphite Agar. Trước khi cấy bổ sung 1 ml dịch ferric
citrate 5% và 1 ml dung dịch sodium sulphite 5% vào mỗi 100 ml môi trường cơ bản ở
45-500C.

24
 Tiến hành
Đun cách thuỷ các ống đã cấy ở 800C 10 phút để loại trừ tế bào sinh dưỡng của
Clostridium cũng như các vi sinh vật không tạo bào tử khác, đồng thời loại bớt lượng
oxy hoà tan có sẵn trong môi trường. Khi thạch đã đông rót thêm 2-3 ml môi trường
lỏng hoặc paraffin lỏng. Ủ các ống đã cấy ở 370C.
Đọc kết quả sau 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc hình cầu màu đen, đường kính
khoảng 1 mm trở lên.

IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM

- Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian
- Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên các mẫu đã phân tích.
- Tại sao các thực phẩm có độ acid thấp (low-acid products) lại thường sử dụng
chế độ tiệt trùng mà không phải là thanh trùng.
- Tại sao trong các sản phẩm này lại có sự hiện diện của các vi sinh vật kỵ khí ưa
ấm như Clostridium. spp. Khi thay đổi loại thực phẩm sử dụng trong thí nghiệm như
đổi từ đồ hộp thịt sang đồ hộp cá hoặc đồ hộp bắp … kết quả thí nghiệm có thay đổi gì
không? Tại sao?

25
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thuỷ sản (SEAQIP). 2004. Sổ tay kiểm nghiệm vi
sinh thực phẩm thuỷ sản. Bộ Nông nghiệp.
Bùi Thị Quỳnh Hoa, Nguyễn Bảo Lộc. 2007. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm.
ĐHCT
Horwitz, William. 2000. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL.
Volume I, chapter 17. AOAC International publishing.
Nguyễn Đức Lượng. 2001. Thực Tập Vi Sinh Vật Học Thực Phẩm. Trường Đại học Kỹ
Thuật Thành phố Hồ Chí Minh
Lynne McLansborough. 2005. Food microbiology laboratory. CRC PRESS
Một Số Vấn Đề về Quản Lý Chất Lượng Thủy Sản. 1996. Tài liệu tập huấn . Bộ Thủy
Sản.
Kiều Hữu Ánh. 2006. Giáo trình vi sinh vật học- Lý thuyết và bài tập. Nhà xuất bản khoa
học và kỹ thuật.
Trần Thanh Thủy. 1999. Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục

26