AISLAMIENTO DE ACIDOS

NUCLEICOS (3ra parte)

Asignatura: Biotecnología-Año 2020

Dra. Mariela Monti

Departamento Química Biológica Ranwel Caputto
CIQUIBIC-CONICET
Facultad de Ciencias Químicas, UNC
AISLAR  AMPLIFICAR
AMPLIFICACION ISOTERMICA
Amplificación isotérmica
Amplificación en cadena de la polimerasa (PCR)

UNICA temperatura

Varias temperaturas

“Although PCR has been widely applied in various fields, it still has
many disadvantages, such as easy contamination, high cost, and
time consuming. What's more, the requirement of a thermal cycler
largely limits the applications of PCR in the resource-limited settings
and point-of-care measurements. Alternatively, isothermal
amplification can effectively avoid the shortcomings of PCR and amplify
the targets in a rapid, simple and efficient way at a constant
temperature”
AMPLIFICACION ISOTERMICA
“Isothermal amplification techniques have been developed since the early 1990s,
based on our improved understanding of nucleic acid replication and corresponding
advances in recombinant technologies”
AMPLIFICACION ISOTERMICA
PCR vs Amplificación isotérmica
AMPLIFICACION ISOTERMICA

The global Isothermal Nucleic

Acid Amplification Technology
(INAAT) market size was valued
at USD 1.3 billion in 2014

Isothermal amplification is
mostly used for the detection of
infectious diseases, blood
screening and in the detection
of cancer-specific molecular
biomarkers

Some of the technologies in the

market include SPIA, SDA,
NASBA, HDA, LAMP, and TMA.
TMA was the first INAAT
introduced in the market. It was
developed by Hologic (Gen
probe)
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

4 cebadores (FIP, BIP, F3 y B3) y ADN polimerasa con capacidad para desplazar ADN
Templado: ADN doble o simple cadena, ARN (previa conversión al ADN copia)

-Iniciación- -Elongación y amplificación-

AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

F: forward-adelante
-Iniciación- (tres regiones F1, F2 y
F3)

B: backward-atrás
(tres regiones B1, B2
y B3)
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

- Elongación y amplificación-
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

-Elongación y amplificación-

https://www.youtube.com/
watch?v=L5zi2P4lggw
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

-Mezcla de productos de diferente tamaño (fragmentos pequeños)

M C- 60 61 62 63 64 65℃

Electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. Tinción agentes intercalantes.

AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

-Diseño de los cebadores es complejo (amplifica <250 pb)

AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

-ADN polimerasa con capacidad

para desplazar ADN

Bst de Bacillus stearothermophilus

-Templados

ADN simple cadena

ARN

ADN doble cadena

A 65oC, el ADN doble cadena se encuentra en un equilibrio

dinámico donde se desnaturaliza/renaturaliza, lo cual permite la
unión del cebador. Posteriormente, la ADN polimerasa cataliza la
desnaturalización y síntesis de ADN
AMPLIFICACION ISOTERMICA DEPENDIENTE DE HELICASA
Helicase-dependent amplification, HDA

2 cebadores, ADN helicasa, proteína de unión a simple cadena y ADN polimerasa con capacidad para
desplazar ADN
Templado: ADN doble o simple cadena, ARN (previa conversión al ADN copia)

similar a una horquilla de replicación….

AMPLIFICACION ISOTERMICA DEPENDIENTE DE HELICASA
Helicase-dependent amplification, HDA

-Un único producto

Electroforesis en geles de
agarosa o poliacrilamida.
Tinción agentes intercalantes

-Templados

ADN simple cadena

ARN

ADN doble cadena

la ADN helicasa cataliza la apertura de la doble cadena
AMPLIFICACION ISOTERMICA DEPENDIENTE DE HELICASA
Helicase-dependent amplification, HDA

IsoAmp® III Universal tHDA Kit

ADN helicasa termoestable: UvrD de Thermoanaerobacter tengcongensis

(Tte) (aumenta especificidad de la amplificación)

Proteína de unión a simple cadena: SSB

ADN polimerasa con capacidad para desplazar ADN: Bst 2.0

Producto 70-150 pb

Nuevo sistema donde se fusionó Tte-

UvrD y Bst 2.0 (helimasa), amplifica
hasta 2300 pb
AMPLIFICACION MEDIADA POR TRANSCRIPCION
transcription mediated amplification, TMA

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)

2 cebadores, transcriptasa reversa (síntesis de ADN utilizando como molde ARN y síntesis de
ADN utilizando como molde ADN) , ARNasa (degrada ARN dentro del duplex ARN:ADN) y ARN
polimerasa dependiente de AND (T7 polimerasa)

Templado: ARN

Producto de amplificación: ARN simple cadena

NASBA: Enzima con actividad ARNasa

vs

TMA: La actividad ARNasa se encuentra en alguna de las

otras enzima como la transcriptasa reversa
Actividades
asociadas a las
transcriptasa
reversa
AMPLIFICACION MEDIADA POR TRANSCRIPCION
Primer 1
Primer 1 has the T7 promoter
sequence

The reaction requires an annealing

temperature (65 °C) for a primer 1 at
the beginning, while the rest of the
reaction is performed at 41 °C

Importantly, enzymes must be added

after the annealing step due to their
thermolabilities

TMA and NASBA are not truly

isothermal

similar a la replicación de retrovirus….

AMPLIFICACION MEDIADA POR TRANSCRIPCION

-Dos productos: ARN (banda inferior) y ARN:ADNc (banda superior)

M Concentración decreciente templado M

Electroforesis en geles de
agarosa o poliacrilamida.
Tinción agentes intercalantes

This enzyme cocktail is a mixture, consisting of :

-Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transcriptase

-RNase H

-T7 RNA Polymerase

Producto <150 pb
AMPLIFICACION MEDIADA POR RECOMBINASA
Recombinase polymerase amplification, RPA

2 cebadores, recombinasa, proteína de unión a simple cadena y ADN polimerasa con capacidad para
desplazar ADN
Templado: ADN doble o simple cadena, ARN (previa síntesis del ADN copia)

similar a la recombinación homóloga….

AMPLIFICACION MEDIADA POR RECOMBINASA
Recombinase polymerase amplification, RPA

-Un único producto (<1000 pb)

Electroforesis en geles de
agarosa o poliacrilamida.
Tinción agentes intercalantes

-Templados

ARN

ADN simple cadena

ADN doble cadena

la apertura de la doble cadena se realiza por la acción de la
recombinasa y ADN polimerasa
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

DETECCIÓN MOLECULAR SIMPLIFICADA

DEL VIRUS SARS-COV-2, AGENTE
ETIOLÓGICO DE LA NEUMONÍA ATÍPICA
O SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO
(SARS)

SARS-CoV-2 is an enveloped
virus with a positive-sense,
single-stranded RNA genome
of ~30 kb
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP
“RT-qPCR assay is considered the gold-standard method to detect viruses such
as SARS-CoV and MERS-CoV”

Cebadores utilizados en RT-qPCR listados en la Organización Mundial de la Salud

The Xpert Xpress SARS-CoV-2 test is a rapid, real-

time RT-PCR test intended for the qualitative
detection of nucleic acid from the SARS-CoV-2 in
upper respiratory specimens
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

ORF1a ORF1b E N

Retrotranscripción del genoma del

SARS-CoV-2 (ARN) seguida de una
amplificación molecular específica
(LAMP) de cuatro fragmentos del
ADN resultante
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

ORF1a ORF1b E N

INCLUSIVIDAD
Diseño de cebadores: secuencias de SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) proveniente de Wuhan, China y otras 10
secuencias del virus que corresponden a China, Japón y USA, que incluyen las secuencias de los virus circulantes en
Argentina.

EXCLUSIVIDAD (falsos positivos)

Análisis in silico de comparación de secuencias, donde se incluyeron otros coronavirus (SARS y MERS), virus de
diferentes géneros y virus de concomitancia regional (Dengue, Zika, Chikungunya, Influenza H1N1). Además de genomas
de potenciales contaminantes de la muestra, como levaduras, bacterias y humano.
Asimismo, se realizaron ensayos de especificidad in vitro con múltiples genomas, incluyendo humano, de levaduras,
bacterias y virus regionalmente concomitantes (Influenza, Dengue, Zika y Chikungunya), confirmando que el kit es
específico para SARS-CoV-2.

PRECISIÓN Y SENSIBILIDAD ANALÍTICA

Sensibilidad analítica del 100% partiendo de muestra que contenga apenas 12.5 copias de genoma viral.
La sensibilidad clínica evaluada contra muestras clínicas diagnosticadas en centros de referencia es del 98%.
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

ARN aislado de la muestra

clínica (hisopado
nasofaríngeo /
orofaríngeo, saliva o
esputo)

La síntesis de un
ADNc
(retrotranscripció
n) seguida de la
amplificación
específica LAMP
ocurren a
temperatura
constante (64°C),
en un único paso
operativo
AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR BUCLE
Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP

Detección colorimétrica con HNB hydroxynaphthol blue (HNB)

dNTPs + Mg+2 PPi + Mg+2  PPi- Mg+2 (precipitado)

Detección por electroforesis Mg+2 libre Mg+2 depletado
en geles de agarosa
CUESTIONARIO ORIENTATIVO:

1. Cuál es la diferencia entre las técnicas de amplificación isotérmicas y las técnicas de PCR?

2. Indique las principales ventajas de las técnicas de amplificación isotérmicas comparado a

las técnicas de PCR.

3. Realiza un cuadro comparativo de las cuatro técnicas de amplificación isotérmica

incluyendo la siguiente información:
a.Técnica
b.Templado (tipo de ácido nucleico)
c.Cebadores (número y complejidad)
d.Producto de amplificación (tipo de ácido nucleico, tamaño, complejidad)
e.Forma de separar la doble cadena de ADN
f.Enzimas utilizadas en la reacción
g.Se nececita dNTPs y/o NTPs

4. El método para detectar la amplificación del ARN viral utilizado en el Neokit, basado en el
cambio de color del compuesto HNB, se puede utilizar para las amplificaciones por PCR y los
otros tipos de amplificaciones isotérmicas aparte del LAMP?