BỘ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

KHOA DINH DƯỠNG ẨM THỰC
----------

TIỂU LUẬN MÔN

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI
ĐỊNH LƯỢNG BACILLUSCEREUS
GVHD: HOÀNG XUÂN THẾ
Nhóm 7:
Danh sách thành viên:
Nguyễn Như Quỳnh 2005191240
Hồ An Ni 2005191517
Hoàng Hải Quỳnh 2005190550
Nguyễn Thị Yến Nhi 2005190431
Nguyễn Hoàng Phương 2005191506

Năm 2021

1
P

MỤC LỤC
1. Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus.......................................................3
1.1. Các ổ chứa và lối sống của Bacillus cereus...................................3
1.2. Bacillus cereus có thể chuyển từ đất sang thực phẩm...................4
2. Đặc điểm sinh học:...............................................................................6
3. CƠ SỞ PHÂN TÍCH............................................................................7
3.1. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007
WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH VẬT TRONG THỰC
PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ
HƯỚNG DẪN KIỂM TRA VI SINH VẬT............................................7
3.2. TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO
7932:2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN
CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS
CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN ĐĨA THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM
KHUẨN LẠC Ở 30oC............................................................................8
4. Quy trình phân tích.............................................................................12
5. Dụng cụ, môi trường, thiết bị.............................................................14
6. Các bước tiến hành.............................................................................16
7. An toàn phân tích...............................................................................17
KẾT LUẬN..............................................................................................19
LỜI CẢM ƠN..........................................................................................20
NHẬN XÉT CỦA THẦY........................................................................21
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................22

2
P

1. Tình hình ô nhiễm Bacillus cereus

1.1. Các ổ chứa và lối sống của Bacillus cereus

Bacillus cereus có mặt khắp nơi trong tự nhiên và có thể được tìm thấy
trong nhiều loại đất, trầm tích, bụi và thực vật. Bào tử có thể lây lan một cách
thụ động và do đó cũng được tìm thấy bên ngoài môi trường sống tự nhiên.
Người ta tin rằng B. cereus sensu lato tồn tại trong đất dưới dạng bào tử, nảy
mầm và phát triển khi tiếp xúc với chất hữu cơ hoặc vật chủ là côn trùng hoặc
động vật. Sự quan tâm đến hệ sinh thái của vi khuẩn này đã thúc đẩy một
nghiên cứu chỉ ra rằng B. cereus có thể nảy mầm, phát triển và tạo bào tử trong
đất, do đó thể hiện vòng đời hoại sinh. Hơn nữa, một kiểu hình đa bào với
phương thức sinh trưởng dạng sợi đã được quan sát và đề xuất là một phương
tiện chuyển vị qua đất. Một phương thức phát triển đa bào, hình sợi cũng đã
được quan sát thấy trong ruột của côn trùng. Ruột của côn trùng được gợi ý
làm môi trường sống cho B. cereus khi vi khuẩn tạo bào tử, sau này được xác
định là B. cereus, được phân lập từ ruột của các loài chân đốt sống trong đất
khác nhau, nơi vi khuẩn dường như tồn tại cộng sinh với vật chủ là động vật
không xương sống của chúng (Margulis và cộng sự, 1998). Vai trò của các
cộng đồng vi sinh vật đường ruột côn trùng như một vị trí thích hợp tự nhiên
cho một phần của vòng đời B. cereus là xa hơn, và người ta cũng gợi ý rằng sự
tồn tại của các chế độ hình thái khác nhau được B. cereus sử dụng, chẳng hạn
như chế độ dạng sợi, có thể là sự thích nghi với các chu kỳ sống khác nhau như
chu kỳ sống 'bình thường' như một loài cộng sinh hoặc không thường xuyên
hơn vòng đời gây bệnh với tốc độ phát triển nhanh chóng.

Bacillus cereus đã được báo cáo là có trong phân của người khỏe mạnh ở
các mức độ khác nhau. Sự hiện diện ở mức độ thấp phổ biến của nó trong môi
trường, thức ăn và thực phẩm sẽ đảm bảo B. cereus hiện diện thoáng qua trong
ruột động vật có vú. Tuy nhiên, dữ liệu gen từ chủng loại B. cereus ATCC
14579 và từ B. anthracis cho thấy rằng khả năng trao đổi chất của chúng thích
nghi hơn với việc sử dụng protein làm nguồn dinh dưỡng hơn là carbohydrate,
và hơn nữa các gen để thành lập trong vật chủ là được bảo tồn. Thêm một sắc
thái khác vào bức tranh, một so sánh gần đây về kiểu gen và kiểu hình giữa các
chủng B. cereus ATCC 14579 và ATCC 10987 cho thấy rằng chủng ATCC
14579 thực sự có khả năng chuyển hóa một số lượng lớn cacbohydrat hơn so
với những gì được tin tưởng ban đầu chỉ dựa trên phân tích bộ gen. Những dữ
liệu này cho thấy rằng ngoài vòng đời đầy đủ trong đất, nơi nó hiện diện phong
phú, B. cereus cũng thích nghi với lối sống trong vật chủ, như một mầm bệnh

3
P

hoặc có thể là một phần của hệ thực vật đường ruột, cũng như để phát triển
trong các loại thực phẩm. Khả năng thích nghi của B. cereus với môi trường
ruột động vật có thể là cơ sở cho tác dụng lợi khuẩn được đề xuất của chúng.
Việc sử dụng như vậy không thể được coi là an toàn đối với con người vì tất cả
các chủng B. cereus đều có thể tạo ra ít nhất một trong các độc tố liên quan đến
bệnh tiêu chảy. Tuy nhiên, một số chủng tạo ra một lượng độc tố không đáng
kể ở 37 C đã được Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) cho phép sử
dụng chế phẩm sinh học.

Có mặt trong nhiều môi trường như vậy, người ta cho rằng B. cereus cũng
nên được tìm thấy trong nước; tuy nhiên, không có nhiều dữ liệu về sự hiện
diện của B. cereus trong nguồn nước và các phương pháp tiêu chuẩn để phát
hiện từ nước không có sẵn. Các vùng nước bề mặt của Na Uy đã được điều tra
về sự hiện diện của các bào tử B. cereus và các chủng gây độc tế bào được
phân lập từ một số con sông. Điều này cho thấy khả năng nguồn cung cấp
nước có thể là một phương tiện để B. cereus xâm nhập vào dây chuyền chế
biến thực phẩm.

1.2. Bacillus cereus có thể chuyển từ đất sang thực phẩm

Bacillus cereus có thể được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và thành phần
thực phẩm khác nhau, bao gồm gạo, các sản phẩm từ sữa, gia vị, thực phẩm
khô và rau. Sự lây nhiễm chéo có thể phân phối bào tử hoặc tế bào sang các
thực phẩm khác, chẳng hạn như các sản phẩm thịt. Khi thu hoạch, tế bào hoặc
bào tử B. cereus có thể đi cùng nguyên liệu thực vật vào các khu vực sản xuất
thực phẩm và hình thành trên thiết bị chế biến thực phẩm. Bacillus cereus là
chất gây ô nhiễm phổ biến trong sữa, và nó có thể gây ra một khuyết tật được
gọi là sữa đông ngọt trong các sản phẩm sữa. Bào tử hoặc tế bào của B. cereus
có thể gây ô nhiễm bầu vú của bò trong quá trình chăn thả, hoặc xâm nhập vào
trang trại bò sữa qua vật liệu lót chuồng hoặc thức ăn. Trong một nghiên cứu
gần đây, số lượng lớn B. cereus đã được tìm thấy trong các lớp trên của chăn ga
gối đệm trang trại bò sữa.
Bào tử Bacillus cereus đại diện cho một lợi thế to lớn đối với sinh vật, cho
phép gắn kết, cũng như tồn tại khi xử lý nhiệt hoặc các quy trình khác để loại
bỏ các loài vi khuẩn sinh dưỡng có thể phát triển mạnh hơn B. cereus. Sự khác
biệt về sức căng trong các đặc điểm của bào tử, chẳng hạn như tính kỵ nước,
ngăn chứa và các phần phụ, đã được chứng minh là ảnh hưởng đáng kể đến khả
năng bám của bào tử vào các bề mặt như dây chuyền chế biến thực phẩm. Bào
tử Bacillus cereus không nhất thiết phải bị loại bỏ bằng cách làm sạch bề mặt
thường xuyên. Khả năng B. cereus xâm nhập vào một lối sống khác khi hình
thành màng sinh học rất có thể có tầm quan trọng đối với sự tồn tại của nó
4
P

trong các thiết bị công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn như đường ống dẫn sữa.
Màng sinh học bảo vệ bào tử và tế bào sinh dưỡng chống lại sự bất hoạt bởi
chất khử trùng.
Công nghệ sản xuất thực phẩm hiện đại, quy mô lớn, với việc sử dụng rộng
rãi việc làm lạnh như một phương tiện bảo tồn, đã tạo ra một ngách lạnh rất
thích hợp cho các vi khuẩn không có khả năng cạnh tranh cao, nhưng có thể tồn
tại qua xử lý nhiệt và cũng phát triển ở nhiệt độ thấp. Ví dụ, B. weihenste-
phanensis cũng như B. cereus và các loài Bacillus khác thường được phân lập
từ các sản phẩm sữa và môi trường sử dụng rộng rãi việc làm mát như một
phương tiện kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật. Ngoài các sản phẩm từ
sữa, các loại thực phẩm được xử lý nhiệt nhẹ với thời gian bảo quản lâu hơn
cũng là một môi trường mới và thuận lợi cho các loài thuộc nhóm B. cereus.
Xét đến sự hiện diện phổ biến của B. cereus, các bào tử có khả năng phục
hồi của nó và bản chất không khó tính của vi sinh vật này, không loại thực
phẩm nào có độ pH> 4,8 có thể bị loại trừ như một phương tiện có thể xảy ra
hoặc là một nguy cơ hư hỏng thực phẩm hoặc bệnh do thực phẩm. Người tiêu
dùng không tuân thủ các quy tắc chuẩn bị thực phẩm cơ bản, tức là làm lạnh
chậm hoặc không đủ, bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung quanh hoặc giữ
nhiệt kéo dài ở <60 C, có thể cho phép B. cereus phát triển và thường là một
phần của câu chuyện trong các trường hợp nhiễm vào thực phẩm dịch bệnh.

5
P

2. Đặc điểm sinh học:

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, nội bào tử, có kích thước 0,5-1,5
x 2-4 μ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động.
 Đăch điểm nuôi cấy:
- Hiếu khí và khị khí tùy ý.
- Nhiệt độ 5-50℃ , tối ưu 35-40℃ .
- pH 4,5-9,3 thích hợp 7-7,2
- Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo nhóm lớn, nhăn nheo,
xù xì
- Trên môi trường MYP: khóm hồng xung quanh có vòng sáng.
- Trên môi trường Mossel: khóm to hồng chung quanh có vòng sáng.
- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
 Tính chất sinh hóa:
- Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và
khị khí, không lên men mannitol.
- Khử nitrat bằng nitrit
- Phản ứng khử VP (+)
- Phân giải Tyroxin
- Catalase (+), Citrate (+)
- Mọc trên NB + 0,001% lyzozym
 Đặc điểm gây bệnh - độc tố - triệu chứng:
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại
thức ăn qua đêm hoặc trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Độc tố: vi khuẩn sản sinh ra 2 loại độc tố:
 Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc
tố trên thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây phân hủy
hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính
mạng.

6
P

 Độc tố gây nôn mữa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo,
cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định
cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một loại protein gây độc
mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể bị trung hòa bởi cholesterol
trong huyết thanh nhưng nó có thể góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
Bacillus Cereus có thể gây nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm
trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.
Triệu chứng gây độc:
- Thực ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây
độc
- Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn, nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm
nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ.
- Biện pháp phòng ngừa: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn
luôn hâm nóng trên 80℃ trước khi ăn.

7
P

3. CƠ SỞ PHÂN TÍCH

3.1. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO

7218:2007 WITH AMENDMENT 1:2013): VI SINH
VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN
NUÔI - YÊU CẦU CHUNG VÀ HƯỚNG DẪN KIỂM
TRA VI SINH VẬT.

Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu chung và các hướng dẫn/lựa chọn cho ba
mục đích sử dụng chính sau đây:
- Áp dụng các tiêu chuẩn của các Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia có
liên quan để phát hiện hoặc định lượng vi sinh vật.
- Thực hành phòng thử nghiệm tốt đối với các phòng thử nghiệm vi
sinh vật trong thực phẩm.
- Hướng dẫn công nhận các phòng thử nghiệm vi sinh trong thực
phẩm (tiêu chuẩn này mô tả các yêu cầu kỹ thuật theo Phụ lục B của
TCVN ISO/IEC 17025 về công nhận phòng thử nghiệm vi sinh bởi
các tổ chức quốc gia).
- Các hướng dẫn bổ sung trong lĩnh vực kiểm tra sinh học phân tử được quy
định trong TCVN 11134 (ISO 22174).
- Tiêu chuẩn này bao gồm việc kiểm tra vi khuẩn, nấm men và nấm mốc và có
thể được sử dụng nếu được bổ sung hướng dẫn cụ thể về prion (các phần tử
lây nhiễm có protein), ký sinh trùng và virut. Tiêu chuẩn này không bao gồm
việc kiểm tra các độc tố hoặc các chất chuyển hóa khác (ví dụ: các amin) từ
vi sinh vật.
- Tiêu chuẩn này áp dụng cho vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi
và môi trường sản xuất thực phẩm và môi trường sản xuất ban đầu.
- Mục đích của tiêu chuẩn này là giúp đảm bảo tính hợp thức của công việc
kiểm tra nhằm xác định tính đồng nhất của các kỹ thuật chung sử dụng trong
kiểm tra ở tất cả các phòng thử nghiệm, giúp đạt được các kết quả đồng nhất
tại các phòng thử nghiệm khác nhau và bảo vệ sức khỏe của nhân viên phòng
thử nghiệm bằng cách ngăn ngừa các nguy cơ truyền nhiễm.

3.2. TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO

7932:2004): VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ

8
P

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH

LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH TRÊN ĐĨA
THẠCH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30oC

Phạm vi áp dụng:
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định có
khả năng mọc được trên đĩa thạch bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30oC. Tiêu
chuẩn này có thể áp dụng cho:
- Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi.
- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
Thuật ngữ và định nghĩa
Bacillus cereus giả định (presumptive Bacillus cereus)
Để cho phương pháp thử mang tính thực tiễn thì giai đoạn khẳng định đã giới
hạn về thử điển hình trên thạch MYP và thử hồng cầu. Do đó, thuật ngữ "giả
định" đã được đưa vào để công nhận thực tế là giai đoạn khẳng định không thể
phân biệt được B.cereus với các loài Bacillus khác có liên quan mật thiết,
nhưng thường ít gặp phải như: B.anthracis, B.thuringiensis,
B.weithenstepanensis, B.mycoides. Một phép thử tính di động bổ sung có thể
giúp để phân biệt B.cereus với B.anthracis khi nghi ngờ có mặt B.anthracis.
Vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc điển hình trên bề mặt môi trường cấy chọn
lọc và cho phản ứng khẳng định dương tính dưới các điều kiện được qui định
trong tiêu chuẩn này.
Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một
lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt
môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri.
Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha
loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
Ủ trong các điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC từ 18 h đến 48 h.
Tính số lượng B.cereus trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số lượng
khuẩn lạc khẳng định thu được trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho
kết quả có ý nghĩa và được khẳng định theo phép thử qui định.
Phép thử

Phép thử Thực hiện Kết quả khẳng định

9
P

Bacillus cereus giả định

Từ mỗi đĩa đã chọn, lấy năm khuẩn lạc
giả định. Nếu trên đĩa có ít hơn năm
khuẩn lạc, thì lấy tất cả các khuẩn lạc
giả định có mặt.
Hình thành khuẩn lạc màu
Thạch Nếu trên các đĩa, khuẩn lạc mọc quá dày hồng được bao quanh bởi
MYP và không thể chọn các khuẩn lạc phân một vùng kết tủa.
lập tốt, thì cấy ria năm khuẩn lạc giả
định lên các đĩa đựng môi trường hoàn
chỉnh. Để từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm
ở 30oC
Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các
Thử hồng khuẩn lạc đã chọn lên mặt thạch huyết
Phản ứng dương tính, độ
cầu trên cừu theo cách sao cho thể hiện được tốt
rộng của vùng hồng cầu
thạch huyết phản ứng hồng cầu.
có thể thay đổi
cừu Ủ ở 30oC trong 24 h ± 2 h và giải thích
phản ứng hồng cầu.
Các khuẩn lạc giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng (cho thấy không lên
men mannitol) và thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho thấy hình
thành lexitinase)
Nếu các đĩa chứa nhiều vi sinh vật lên men mannitol dẫn đến sinh axit, thì màu
hồng đặc trưng của khuẩn lạc B.cereus có thể bị nhạt đi hoặc biến mất hoàn
toàn.
Một số chủng B.cereus chỉ sinh ít hoặc không sinh lexitinase. Các khuẩn lạc
thuộc các chủng này sẽ không có vùng kết tủa bao quanh. Các khuẩn lạc này
cũng cần được thử khẳng định.

GIỚI HẠN CHO PHÉP B.CEREUS

Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định
giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm”.
GIỚI HẠN B. cereus
Sản phẩm
(Trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)
Sữa dạng bột 102
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai 102

10
P

củ, đậu đỗ: bột, miến, mỳ sợi (có xử lý

nhiệt trước khi sử dụng)
Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai
củ, đậu, đỗ: bánh, bột (dùng trực tiếp,
10
không qua xử lý nhiệt trước khi sử
dụng)
Rau quả muối, rau quả khô 102
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng
cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc
102
biệt (phải xử lý nhiệt trước khi sử
dụng)
Thức ăn khô và thức ăn dinh dưỡng
cho trẻ em, thức ăn thay thế đặc
10
biệt (dùng trực tiếp, không qua xử lý
nhiệt trước khi sử dụng)

Theo QCVN 8-3: 2012/BYT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI
VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
Giới hạn cho phép B. cereus giả định (CFU/ml
Sản phẩm hoặc CFU/g)
m M
Sản phẩm dinh dưỡng
công thức dạng bột cho 5x101 5x102
trẻ đến12 tháng tuổi
Sản phẩm dinh dưỡng
công thức với các mục
5x101 5x102
đích y tế đặc biệt cho trẻ
đến 12 tháng tuổi

11
P

4. Quy trình phân tích

Cân 10g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml đối với mẫu lỏng + 90ml
Saline Peptone Water
Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60 giây
Pha loãng
−1
Dịch mẫu [10 ] Dịch mẫu [10−2]

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

MYP MYP MYP MYP

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho
đến khi khô bề mặt thạch. Ủ 30°C/24 giờ

Đếm khuẩn lạc

Khẳng định B.cereus giả định trên môi trường thạch máu cừu bằng phản ứng
Haemolysin. Ủ 30°C/24 giờ

Tính và biểu thị kết quả

Quy trình định lượng B.cereus giả định

12
P

13
P
5. Dụng cụ, môi trường, thiết bị
Bảng dụng cụ
STT Dụng cụ
1 Bình tam giác
2 Pipet
3 Đĩa petri
4 Que cấy trải
5 Quy trải
Bảng môi trường và hóa chất
Môi trường và hóa chất
SPW (Saline Peptone Water)
MYP agar base (Mannitol -
Egg Yolk - Polymixin)
Polymixin B
Egg Yolk
Blood agar base
Sheep blood
HCl và NaOH 10%
Mục đích
Chứa dung dịch hóa chất, chứa mẫu
Vận chuyển một lượng thể tích (huyền phù
hoặc dung dịch pha loãng) xác định
Nuôi cấy vi sinh vật
Trải đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa
Trải mẫu vật, làm mịn bề mặt thạch
Mục đích
Pha loãng mẫu
Nuôi cấy B.cereus
Khẳng định B.cereus giả định
Được bổ sung vào môi trường nhằm tăng khả năng
phát triển cho các loài vi sinh vật khó mọc
Điều chỉnh pH
14
P

Bảng thiết bị
STT Thiết bị Mục đích
Cân

1 Cân lượng mẫu rắn

Máy lắc vortex

2 Trộn mẫu

Máy dập Stomacher

3 Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng

Máy đếm khuẩn lạc

Nhìn thấy độ khuếch đại của khuẩn lạc để

4
dễ dàng đếm

Nồi hấp tiệt trùng

Tiệt trùng vi khuẩn cho các thiết bị, dụng

5
cụ và hóa chất

15
P

6. Các bước tiến hành

Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml đối với
mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi
nhựa vô trùng (bình tam giác). Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho
phép ± 5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu. Đồng nhất mẫu
và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam
giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Để vi sinh vật không bị tổn
thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt
quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng. Do các bào tử lắng
xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi
được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích
hợp. Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để
tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.
Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn
kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2
(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là
10-1 ). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-
4, 10-5,... cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1ml huyền phù
ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui trình
với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. Sử dụng 2 nồng độ
pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Dùng que cấy trải trải đều dịch
mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một que trải vô trùng cho mỗi đĩa. Để
các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để chất cấy bám vào thạch. Lật úp đĩa
và ủ ở 30oC trong 24 giờ.
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc B. cereus
giả định là các khuẩn lạc lớn, màu hồng, được bao quanh bởi một vòng kết tủa.
Đếm các khuẩn lạc B. cereus giả định trên những đĩa có số đếm phù hợp. Lấy 5
khuẩn lạc giả định, nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn
lạc giả định có mặt. Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn lên
mặt thạch máu cừu, ủ ở 30oC trong 24 giờ. Đọc kết quả.
*Kết quả

16
P

B. cereus giả định trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức:
(C 1× R 1 ) + ( C 2 × R 2 ) + ( C 3 × R 3 )+(C 4 × R 4 )
X= (CFU/g hay CFU/ml)
V ×(n 1+ 0.1× n2) ×d

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc B. cereus giả định đếm được tương ứng trên 4 đĩa của
hai độ
pha loãng liên tiếp được giữ lại.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính tương ứng trong 4 đĩa petri được giữ lại ở
hai
độ pha loãng liên tiếp
*Biểu thị kết quả
 Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1.0 và 9.9 nhân với 10n (n là số
mũ thích hợp của 10)
 Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của đậm
độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
 Nếu 4 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu
có ít hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả là trung bình cộng của các khuẩn lạc
đếm được ở cả 4 đĩa tính ra cho 1g hoặc 1ml sản phẩm.
 Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau:
 Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1ml sản phẩm.
 Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1g sản phẩm.
7 An toàn phân tích.
 Các yêu cầu đối với phòng vi sinh
 Hạn chế tiếp cận khu vực phòng thí nghiệm Vi sinh:
 Có biển cảnh báo hạn chế tiếp cận “Không phận sự, không được phép
vào khu vực này” đối với người không phận sự, trước khi vào khu vực
phòng thí nghiệm Vi sinh.
 Những nhân viên không có phận sự, không được phép tiếp cận khu vực
phòng thí nghiệm vi sinh.
 Khách tham quan, người liên hệ công tác, hoặc các nhân viên cần tiếp
cận, phải được sự đồng ý của Phụ trách phòng và có nhân viên bộ phận
hướng dẫn khi đi lại trong khu vực phòng thí nghiệm.

17
P

 Các bề mă ̣t bàn làm viê ̣c trong phòng thí nghiệm phải được vê ̣ sinh kỹ
bằng cồn 70 % trước và sau khi làm viê ̣c.
 Các thao tác với chủng vi sinh vâ ̣t chuẩn phải được thực hiê ̣n trong tủ an
toàn sinh học cấp 2.
 Khi chuẩn bị hóa chất môi trường có cảnh báo nguy hiểm, cần đọc kỹ và
tuân theo hướng dẫn pha chế và MSDS của hóa chất và môi trường.
 Khi vâ ̣n hành các thiết bị có liên quan đến tính an toàn (nồi hấp, đèn
Bunsen), cần đọc kỹ và tuân thủ hướng dẫn sử dụng thiết bị.
 Yêu cầu đối với Rác thải hoặc mẫu đã kiểm nghiệm xong của phòng vi
sinh
 Rác thải vi sinh phải được phân loại và xử lý:
 Rác thủy tinh vỡ và vâ ̣t dụng sắc nhọn (kim tiêm): gom vào thùng dày,
có nắp đâ ̣y kín.
 Rác thải nhiễm và mẫu thực phẩm nhiễm vi sinh phải được hấp tiê ̣t
trùng 1210C, 30 phút trước khi cho vào thùng có nắp kín, và chuyển cho
dịch vụ thu gom rác cuối ngày làm viêc.̣
 Rác thải nhiễm vi sinh bao gồm các loại sau:
 Mẫu thực phẩm, môi trường nuôi cấy và vâ ̣t dụng chứa (túi mẫu, đĩa
petri, ống nghiê ̣m) sau khi cấy và nuôi ủ;
 Đầu tip, khay đựng mẫu, cốc đựng típ, que cấy, que trang, giá ống
nghiê ̣m và các vâ ̣t dụng tiếp xúc trực tiếp với mẫu nhiễm hoă ̣c có nguy
cơ bị mẫu nhiễm rơi đổ;
 Găng tay, khẩu trang, bông gòn vê ̣ sinh mă ̣t bàn thao tác với mẫu nhiễm;

7. KẾT LUẬN

Trong môi trường chọn lọc, B.Cereus tạo khuẩn lạc rất to, mọc lăn, rìa
nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, hỗn
hợp gia vị, sản phẩm khô…). Hình thành 2 loại độc tố chính là diarrhoeal toxin
gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa.
B.Cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trường thạch chọn lọc
Mannitol – Egg Yolk – Polymein (MYP) hoặc Cereus Selective Agar
(MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA).
Khuẩn lạc này có thể tiếp tục khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với
các đặc điểm như lên men đường glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử
nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP(+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được
trong 0,001 % lysozyme. Ngoài B.cereus cũng được định lượng bằng phương
pháp MPN.

18
P

LỜI CẢM ƠN

Nhóm em xin cảm ơn thầy Hoàng Xuân Thế đã dày công truyền đạt kiến
thức, hướng dẫn và chỉ bảo nhóm chúng em trong quá trình giảng dạy và trong
quá trình làm bài để nhóm chúng em có thể hoàn thành bài tiểu luận một cách
tốt nhất.
Tuy còn hạn chế và không có nhiều kiến thức thực nghiệm nên còn
nhiều khiếm khuyết trong bài làm, nhóm chúng em rất mong thầy có thể góp ý
và giúp chúng em có thể hoàn thiện hơn.
Một lần nữa xin cảm ơn thầy đã dành thời gian để đọc bài của nhóm
chúng em. Trong tình hình dịch bệnh căng thẳng và phức tạp, nhóm chúng em
xin chúc thầy cô một năm giảng dạy đầy hiệu quả và gặt hái được nhiều thành
công.

19
P

NHẬN XÉT CỦA THẦY

Nhóm chúng em mong nhận được thầy nhận xét để hoàn thiện hơn và sửa
chữa sai sót ạ.

…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………..

20
P

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4992 : 2005 (ISO 7932 : 2004)
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 WITH
AMENDMENT 1:2013)
Quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định giới
hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm”.
QCVN 8-3: 2012/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh
vật trong thực phẩm
Lotte Arnesen, From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins,
2008

21