Journal of Indonesian Forensic and Legal Medicine ISSN : 2656-2391

Vol. 1 (1) Pebruari 2019

Amphetamine Detection in Human Blood Plasma With LC_MS/MS

Idha Arfianti Wiraagni1*, Mustafa Ali Mohd2, Rusdi Abdul Rashid3,

Didi Erwandi bin Mohammad Haroon2, Egha Zainur Ramadhani4
1
Department of Forensic, Faculty of Medicine, University Gadjah Mada,Yogyakarta, Indonesia
2
Shimadzu‐UMMC Center for Xenobiotics Studies (SUCXeS), Faculty of Medicine,University of Malaya,
Kuala Lumpur, Malaysia
3
Department of Psychological Medicine, Faculty of Medicine,University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia
4
Department of Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences,University Abdurrab, Riau, Indonesia
*)Corresponding author: E-mail : idha.arfianti@ugm.ac.id

ABSTRAK ABSTRACT

Penggunaan narkotika golongan stimulan sangat
umum di seluruh dunia. Salah satu dari stimulan
yang disalahgunakan secara luas adalah
amfetamin, karena mempunyai efek yang poten
dalam meningkatkan aktivitas tubuh dan sistem
saraf pusat, melalui stimulasi berbagai
neurotransmiter. Penelitian ini berhasil
menemukan prosedur (presipitasi protein) yang
efektif, efisien, dan sederhana yang bisa
mendeteksi amfetamin di dalam plasma darah
manusia dengan (Liquid Chromatography
Tandem Mass Spectrometry / LC-MS/MS).
Metode ini bisa mendapat hasil dalam jangka
waktu cepat, dengan harga yang murah dan
jumlah sampel yang sedikit. Metode ini
jugamempunyai sensitifitas, spesifisitas, dan
recovery yang bagus untuk deteksi amfetamin di
dalam plasma darah manusia, pada konsentrasi
lebih dari 100 ng/mL. Metode ini disarankan
untuk tes konfirmasi, yang diperlukan untuk
memastikan adanya amfetamin di dalam plasma
darah manusia
Kata kunci : amfetamin, plasma darah manusia,
skreening, LC-MS/MS
The use of stimulants as a abused drug are very
common in all over the world. One of the main
stimulant that are widely used are amphetamine,
because it has potent effect in increasing activity
of the body and central nervous system, through
the stimulation ofneurotransmitter.This research
successfully performed aneffective, efficient, and
simple protein precipitation extraction procedure
of amphetamine from human plasma then
analysed by (Liquid Chromatography Tandem
Mass Spectrometry / LC-MS/MS). This method
showed fast running time with minimum cost and
volume of sample.The developed methodhad quite
good sensitivity, specificity, and recovery for
amphetamine detection in human plasma samples
in the concentration more than 100 ng/mL.This
method was suggested for confirmatory screening
test, that are needed to make sure the presence of
amphetamine in human blood plasma.
Key words: amphetamine, human blood plasma,
screening, LC-MS/MS

PENDAHULUAN kalangan pecandu karena harganya yang

Amfetamin merupakan salah satu dari obat
yang sering disalahgunakan di masyarakat. Obat
ini masuk ke dalam golongan Psikotropika grup II
yang bisa membuat peminumnya semakin
bertenaga. Penggunaan amfetamin sangat marak di
terjangkau dan juga digunakan sebagai doping di
bidang olahraga. Harganya yang murah dan lebih
mudah didapat, membuat pecandu beralih dari
golongan opioid ke amfetamin. Bahkan beberapa
kasus pasien pecandu yang berobat rutin di klinik
metadon, dalam beberapa tahun ada yang berubah
mengkonsumsi amfetamin sebagai bentuk
pelampiasan lain dalam kecanduannya (Triswara
dan Carolia, 2017).

1
Journal of Indonesian Forensic and Legal Medicine
Vol. 1 (1) Pebruari 2019
Amfetamin bisa memacu pelepasan
beberapa neurotransmiter di dalam badan, seperti
dopamin, noreprinefrin, dan serotonin.
Peningkatan yang ditimbulkan dari neurotransmiter
tersebut bisa meningkatkan stimulasi energi,
meningkatkan ketahanan fisik, aktifitas motorik,
serta meimbulkan rasa senang. Semua organ di
dalam tubuh bekerja lebih keras, sehingga
pengguna merasa lebih fokus, bertenaga, percaya
diri, dan dapat berpikir dengan cepat (Betzler,
Viohl, Romanczuk-Seiferth, dan Foxe, 2017).
Efek samping yang ditimbulkan dari
penggunaan amfetamin ini adalah timbulnya rasa
sangat lelah setelah efek hilang dalam beberapa
jam. Penggunaan jangka panjang menyebabkan
ketergantungan dan intoleransi sehingga pengguna
akan senantiasa ingin mengkonsumsi obat tersebut
untuk mencegah efek withdrawal (sakau). Untuk
kasus penggunaan dosis yang berlebih akan
menimbulkan kondisi yang bisa mengancam
nyawa(Substance Abuse and Mental Health
Services Administration, 2013a, 2013b). Dalam
beberapa kasus, pecandu meminum beberapa obat
yang dikonsumsi sekaligus atau juga
menambahkan zat aditif, seperti lem, cat, dan
plastik. Kombinasi ini dilakukan dengan maksud
untuk meningkatkan efek kerja obat agar semakin
berkesan, khususnya pada pecandu yang sudah
toleran dengan dosis tunggal amfetamin (Kolbrich
et al., 2008).
Amfetamin adalah obat yang dikonsumsi
secara oral. Tersedia dalam sediaan tablet
konvensional dan kapsul lepas tertunda. Setelah
masuk ke dalam tubuh, dia akan diserap secara
sempurna dari usus dalam jangka waktu 3 sampai 7
jam. Setelah proses penyerapan, efek dari zat ini
akan dirasakan oleh pengguna dalam 3 sampai 12
jam. Dalam hati, amfetamin akan dimetabolisme
oleh CYP2D6, glisin N-aciltransferase, dopamin β-
hidroksilase, butirat-KoA ligase, danflavin-
monooksigenase3 menjadi zat yang lebih larut
dalam air, dan mudah dikeluarkan melalui ginjal.
ISSN : 2656-2391
Mayoritas ekskresi amfetamin melaluiginjal dan
sebanyak 30-40% tetap diekskresikan dalam
bentuk amfetamin. Itulah mengapa amfetamin bisa
dideteksi dari urin (Betzler, Viohl, Romanczuk-
Seiferth, dan Foxe, 2017).
Berdasarkan toksikokinetik di atas,
amfetamin di dalam tubuh bisa dideteksi dari
berbagai cairan biologis pengguna, seperti darah,
cairan mulut, dan urin. Metode penapisan atau
skrining biasa dilakukan dalam berbagai bidang,
seperti olahraga, pendidikan, okupasi, atau
penelitian. Dalam bidang olahraga, tim kedokteran
akan melakukan skrining untuk memastikan atlet
bebas dari penggunaan dopping, sehingga dapat
meningkatkan sportifitas dalam bertanding. Dalam
pendidikan dan okupasi, institusi memerlukan
pelajar dan pekerja yang tidak terlibat dalam
penggunaan narkotika. Dalam penelitian, metode
skrining sangat aplikatif untuk mendeteksi
pengguna narkotika dalam waktu yang singkat di
lapangan (Fernandez et al., 2009).
Metode skrining yang mudah dan relatif
murah di lapangan adalah deteksi dengan
menggunakan rapid test.Rapid test banyak
digunakan dalam aplikasinya, tetapi memiliki
beberapa kelemahan. Kelemahan pertama adalah
isu mengenai kualitas alat rapid, yang tergantung
pada proses pabrikasi dan penyimpanan sebelum
digunakan. Kelemahan lainnya dan sering muncul
di lapangan adalah adanyacross reaction dari alat
uji.Cross reactionbermakna alat uji akan
menunjukkan hasil positif, jika diujikan dalam
beberapa zat yang mempunyai struktur kimia yang
sama atau pada golongan obat yang sama.
Konsekuensi dari Cross reactionmenyebabkan
adanya hasil yang positif palsu. (Vlase, Popa,
Loghin, & Leucuta, 2009).
Kelemahan uji rapid tersebut
membuatperlu adanya pemeriksaan dengan alat
deteksi yang lebih canggih (dengan sensitivitas dan
spesifisitas tinggi), untuk memastikan jenis obat
apa yang dikonsumsi oleh pasien. Proses deteksi
2
Journal of Indonesian Forensic and Legal Medicine ISSN : 2656-2391
Vol. 1 (1) Pebruari 2019

tersebut juga diharapkan lebih mudah dalam

pengerjaannya, dan lebih murah dibandingkan uji HASIL DAN PEMBAHASAN
konfirmasi, tanpa mengurangi validitas dan
keterandalannya. Studi ini mengembangkan Hasil injeksi sampel menunjukkan waktu retensi
metode deteksi baru dengan menggunakan LC- (RT = Retention Time) kromatogram amfetamin
MS/MS untuk mendeteksi adanya amfetamin adalah 3.92 menit, serta rasio massaterhadap
dalam darah sebagai alternatif metode konfirmasi muatan (m/z) sebesar 136.32>90.9 dan
yang sangat diperlukan di masyarakat (Barnes et 136.32>118.9. Hasil optimasi dari parameter
spektrometer yang optimal terdapat dalam Tabel 1.
al., 2009).
Tabel 1. Parameter Spektrometer Amfetamin
METODE PENELITIAN Analit Q1 Q3 DP EP CE C
X
Analisis amfetamin dilakukan dengan P
menggunakan instrumen LC-MS/MS. Instrumen Amfetamin 136.3 90.9 256 10 23 14
118.9 256 10 11 16
LC terdiri dari sistem LC-20AD XR UFLC dengan DP: declustering potential; EP: entrance potential; CEP:
injektor sampel otomatis SIL-HT (Shimadzu, collision cell entrance potential; CE: collision energy; CXP:
Kyoto Japan). Sistem LC-MS/MS dikontrol collision cell exit potential
dengan software Analyst, versi 1.6.3 (Applied
Saat pemeriksaan blanko, tidak terdapat
Biosystems). Kolom analitikal yang digunakan
peak lain yang muncul pada menit ke 3.83. Hal ini
adalah Agilent, Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (150
menunjukkan metode ini spesifik untuk deteksi
mm x 2.1 mm, 5µm ). Suhu kolom 40°C dengan
amfetamin (Gambar 1). Sensitifiti dari prosedur
total waktu analisis 10 menit. Fase gerak yang
ini mencapai 100 ng/mL. Hal ini dapat mendeteksi
digunakan adalah 10 mM ammonium formate
kuantiti yang minimal dari amfetamin di dalam
dalam air (pH 6.6) pada pompa A dan 0.1% FA
tubuh.
(dalam asetonitril) pada B. Kecepatan aliran0.3
mL/menit dengan gradien elusi yang diset sesuai Selain mengembangkan metode deteksi
suhu ruangan. Gradien dimulai dengan 5% B, lalu amfetamin dengan LC-MS/MS, studi ini juga
naik menjadi 40% B saat 3 menit, dan berlangsung menemukan metode ekstraksi amfetamin yang
sampai 4 menit. Selanjutnya gradien naik menjadi sangat efektif dan efisien dari sampel biologis
100% B saat 6 menit, dan berlangsung sampai 8 berupa plasma manusia. Sampel yang dibutuhkan
menit. Gradien kemudian kembali ke5% B saat dalam metode ini sangat sedikit yaitu 100 µl
8.01 menit dan kondisi ini berlaku sampai 10 plasma manusia.
menit.Volum sampel saat injeksi sebanyak 8 µL.
Untuk spektrometer kita menggunakan
Linear Ion Trap Quadrupole LC-MS/MS
Spectrometer, QTRAP 5500, dengan ESI probe.
Instrumen ini dioperasikan dengan model ionisasi
negatif. Beberapa parameter spektometeryang
optimal digunakan untuk deteksi amfetamin adalah
suhu sumber ion 4500C, tegangan ion spray 5500
V, tekanan gas curtainsejumlah 20 psi, tekanan gas
sumber ion 1 sebesar 35 psi, dan tekanan gas
sumber ion 2 sebesar 35.0 psi. Dwell time yang
digunakan untuk amfetamin adalah 40 milisekon.

3
Journal of Indonesian Forensic and Legal Medicine ISSN : 2656-2391
Vol. 1 (1) Pebruari 2019

Sample Name: "Blank Plasma" Sample ID: "" File: "Curve Plasma and Validation day1 26102018.wiff" Sample Name: "Blank Plasma" Sample ID: "" File: "Curve Plasma and Validation day1 26102018.wiff"
Peak Name: "Amphetamine" Mass(es): "136.320/90.900 Da"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index: 2
Sample Type: Unknown 7.57
Peak Name: "D5 Amphetamine(IS)" Mass(es): "141.326/92.800 Da"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index: 2
Sample Type: Unknown 0.79
Gambar kromatogram amfetamin dalam plasma
Concentration: N/A Concentration: 1.00 ng/mL

manusia terdapat dalam Gambar 2. Tes recovery

Calculated Conc: 0.00 ng/mL Calculated Conc: N/A 860
Acq. Date: 10/26/2018 1.15e4 Acq. Date: 10/26/2018
Acq. Time: 1:57:20 PM Acq. Time: 1:57:20 PM
840
Modified: No 1.10e4 Modified: No
820

juga dilakukan dengan membandingkan area

Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III
Noise Percentage: 50
800
Base. Sub. Window: 1.00 min
1.05e4 Peak-Split. Factor: 2
780
Report Largest Peak: Yes

kromatogram amfetamin dalam plasma manusia

Min. Peak Height: 0.00 cps
Min. Peak Width: 0.00 sec 760
1.00e4 Smoothing Width: 0 points
RT Window: 30.0 sec 740
Expected RT: 4.04 min
Use Relative RT: No 720

dengan area kromatogram dalam standard. Hasil

9500.00 2.77
Int. Type: Base To Base 700
Retention Time: 3.94 min
Area: 1.30e+003 counts 680
9000.00 Height: 3.08e+002 cps

perbandingan dalam konsentrasi 100 ng/mL adalah

Start Time: 3.85 min 660
End Time: 3.98 min
640
8500.00 4.70
620

8000.00 600

580 1.15
116% dan hasil perbandingan dalam konsentrasi
1000 ng/mL adalah 105%.
7500.00 560
6.55
540
0.09
7000.00 520
3.40 9.25
500
6500.00
480 1.852.23 3.00 3.62 Sample Name: "QCM" SampleID: "" File: "Curve Plasma and Validation day 1 26102018.wiff" Sample Name: "QCM" Sample ID: "" File: "Curve Plasma and Validation day 1 26102018.wif "
Peak Name: "Amphetamine" Mass(es): "136.320/90.900 Da" Peak Name: "D5 Amphetamine(IS)" Mass(es): "141.326/92.800 Da"
460 Comment: "" Annotation: "" Comment: "" Annotation: ""
0.39 6.82 7.79
6000.00 Sample Index: 86 Sample Index: 86
In

In
te

te
n

440
s

s
it

it
y

y
,c

,c

Sample Type: QC Sample Type: QC

p

3.92 3.90
s

5.926.29 9.18 Concentration: 3000. ng/mL Concentration: 1.00 ng/mL

420 3.9e4
Calculated Conc: 3170. ng/mL Calculated Conc: N/A
5500.00 Acq. Date: 10/29/2018 Acq. Date: 10/29/2018 8.2e4
5.56 7.51
400 Acq. Time: 5:08:12 PM 3.8e4 Acq. Time: 5:08:12 PM
8.0e4
380 5.38 Modified: Yes 3.7e4 Modified: Yes
5000.00
6.99 Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III Proc. Algorithm: Specify Parameters - MQ III 7.8e4
360 Noise Percentage: 50 Noise Percentage: 50
3.94 8.61 3.6e4
Base. Sub. Window: 0.10 min Base. Sub. Window: 1.00 min 7.6e4
4500.00 340 Peak-Split. Factor: 2 Peak-Split. Factor: 2
4.50 3.5e4
Report Largest Peak: Yes Report Largest Peak: Yes 7.4e4
320
Min. Peak Height: 1000.00 cps Min. Peak Height: 0.00 cps
Min. Peak Width: 0.10 sec 3.4e4 Min. Peak Width: 0.00 sec
1.57 8.36 7.2e4
4000.00 300
7.91 Smoothing Width: 5 points Smoothing Width: 0 points
RT Window: 30.0 sec 3.3e4 RT Window: 30.0 sec
280 7.0e4
Expected RT: 4.04 min Expected RT: 4.04 min
3500.00 Use Relative RT: No 3.2e4 Use Relative RT: No
260 6.8e4
Int. Type: Manual 3.1e4 Int. Type: Base To Base
240 6.6e4
9.74 Retention Time: 3.92 min Retention Time: 3.90 min
3000.00 1.53 Area: 2.35e+005 counts Area: 4.42e+005 counts
220 3.0e4
Height: 3.77e+004 cps Height: 8.56e+004 cps 6.4e4
9.59 Start Time: 3.83 min Start Time: 3.78 min
200 2.9e4
8.28 9.27 End Time: 4.05 min End Time: 4.37 min 6.2e4
2500.00
180 2.8e4 6.0e4
160
5.34 2.7e4 5.8e4
2000.00 6.54
6.40 140
2.6e4 5.6e4
5.02
5.59 120
1500.00 4.46 2.5e4 5.4e4
100
2.4e4 5.2e4
4.07 80
1000.00
3.69 2.3e4 5.0e4
2.112.23 3.56 60
3.15
40 2.2e4 4.8e4
500.00
20 2.1e4 4.6e4

0.00 0 2.0e4 4.4e4

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

In

In
te

te
n

n
1 23 45 68 90 112 134 156 179 201 223 245 268 290 312 334 356 379 401 423 1 45 90 134 179 223 268 312 356 401

s
ity

ity
4.2e4

,c

,c
p

p
1.9e4

s
Time, min Time, min
4.0e4
1.8e4 1.55
3.8e4
1.7e4

Gambar 1. Kromatogram pada pemeriksaan blanko 1.6e4

3.6e4

3.4e4
1.5e4
3.2e4
1.4e4
3.0e4
1.3e4

Prosedur yang dilakukan dalam

2.8e4
1.2e4
2.6e4
1.1e4
2.4e4

pengambilan sampel adalah 5 mL darah manusia 1.0e4

9000.0
2.2e4

2.0e4

dimasukkan ke dalam tabung EDTA. Sel-sel darah

8000.0
1.8e4
7000.0
1.6e4
6000.0 7.05

dipisahkan dari plasma dengan cara prosedur

1.4e4

5000.0 1.2e4

4000.0 1.0e4

sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan

7.23 8.44 8.60
3000.0 8000.0
9.47
2000.0 6000.0

2,000 x g. Setelah proses sentrifugasi, plasma

1000.0 4000.0

0.0 2000.0

0.0

dipindahkan ke dalam tabung polypropylene steril

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
1 45 90 134 179 223 268 312 356 401 1 45 90 134 179 223 268 312 356 401
Time, min Time, min

dengan menggunakan pipet Pasteur. Sampel Gambar 2. Kromatogram amfetamin konsentrasi 3000 ng/mL
disimpan di dalam almari es -20ºC sampai saat dengan intensitas : 3.9e4 dalam plasma darah manusia
analisis.
KESIMPULAN
Peparasi sampel dilakukan dengan teknik
ekstraksi presipitasi protein. Sampel plasma yang Studi ini mengembangkan metode
sudah beku dicairkan dalam suhu ruangan. Setelah skreening dan deteksi amfetamin baru dengan
sampel plasma cair, plasma divorteks untuk menggunakan LC-MS/MS. Metode ini mempunyai
memastikan semua kandungan tercampur spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi. Selain itu,
sempurna. Selanjutnya 100 µL plasma ditambah ditemukan juga metode yang sederhana, efektif,
dengan 300 µL asetonitril. Campuran divorteks dan efisien untuk mengekstraksi amfetamin dari
selama 5 detik dan disentrifugasi selama 2 menit plasma manusia dengan protein pesipitasi. Sampel
dengan kecepatan 14800 rpm. Supernatan difilter plasma yang diperlukan dalam kuantitas yang
dengan filter berdiameter 0.2 µm, kemudian minimal, prosedur yang digunakan cepat, mudah,
ditransfer ke dalam vial yang baru. Sebanyak 8 dan murah dalam aplikasinya. Kedua metode ini
mikroliter sampel diinjeksikan ke dalam LC- diarapkan dapat diaplikasikan dengan mudah dan
MS/MS untuk deteksi kandungan amfetamin.

4
Journal of Indonesian Forensic and Legal Medicine ISSN : 2656-2391
Vol. 1 (1) Pebruari 2019

luas, sebagai metode konfirmasi dari pemeriksaan 320–332.

skreening sederhana yang dilakukan di lapangan. doi:10.1097/FTD.0b013e3181684fa0.

UCAPAN TERIMAKASIH 5. Substance Abuse and Mental Health Services

Administration, 2012. National Survey on Drug
Terimakasih untuk LPDP Indonesia Use and Health: Detailed tables. 2013a.
sebagai institusi penyandang dana yang telah Retrievedfrom
membiayai studi ini. Selain itu, terimakasih kami http://www.samhsa.gov/data/NSDUH/2012Sum
tujukan kepada Shimadzu‐UM Center for mNatFindDetTables/DetTabs/NSDUH-
Xenobiotics Studies (SUCXeS)dan Departemen DetTabsTOC2012.htm.
Patologi Univesiti Malaya, yang telah
menyediakan tempat dan fasilitas untuk 6. Triswara, R., Carolia, N., 2017. Gangguan
menyelesaikan studi ini. Fungsi Kognitif Akibat Penyalahgunaan
Amfetamin 5. Majority 7(1).
DAFTAR PUSTAKA
7. Vlase, L., Popa, D.-S., Loghin, F., Leucuta,
1. Barnes, A.J., De Martinis, B.S., Gorelick, D.A., S.E., 2009. High-throughput toxicological
Goodwin, R.S., Kolbrich, E.A., Huestis, M.A., analysis of Methamphetamine, MDA and
2009. Disposition of MDMA and Metabolites in MDMA from human plasma by LC-MS/MS.
Human Sweat Following Controlled MDMA Romanian Journal of Legal Medicine 17, 213–
Administration. Clinical Chemistry 55, 454– 220.
462.
https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.117093.

2. Betzler, F., Viohl, L., Romanczuk-Seiferth,

N.,&Foxe, J., 2017.Decision-making in chronic
ecstasy users: a systematic review. European
Journal of Neuroscience, 45(1), 34–
44.doi:10.1111/ejn.13480.

3. Fernández, M. del M.R., Wille, S.M.R., Samyn,

N., Wood, M., López-Rivadulla, M., De Boeck,
G., 2009. High-Throughput Analysis of
Amphetamines in Blood and Urine with Online
Solid-Phase Extraction-Liquid
Chromatography—Tandem Mass Spectrometry.
Journal of Analytical Toxicology 33, 578–587.
https://doi.org/10.1093/jat/33.9.578.

4. Kolbrich, E.A., Goodwin,R.S., Gorelick, D.A.,

Hayes, R.J., Stein, E.A.,&Huestis, M.A.,
2008.Plasma pharmacokinetics of 3,4-
methylenedioxymethamphetamine after
controlled oral administration to young
adults". Therapeutic Drug Monitoring,30(3),