UAS BIOTEKNOLOGI

1. Mengkloning gen
Organisme  Klebsiella pneumoniae
Gen  phyK
Menghasilkan  3-phytase precursor

Sumber (NCBI) :
Penulis : Sajidan,A., Farouk,A., Greiner,R., Jungblut,P., Muller,E.C. and Borriss,R.
Judul : Molecular and physiological characterisation of a 3-phytase from soil bacterium
Klebsiella sp. ASR1
Jurnal : Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 (1), 110-118 (2004)

Translasi "MPARHQGLLRLFIACALPLLALHSAAAADWQLEKVVELSRHGIR
PPTAGNREAIEAATGRPWTEWTTHDGELTGHGYAAVVNKGREEGQHYRQLGLLQAGCP
TAESIYVRASPLQRTRATAQALVDGAFPGCGVAIHYVNGDADPLFQTDKFAATQTDPA
RQLAAVKEKAGDLAQRRQALAPTIQLLKQAVCQADKPCPIFDTPWRVEQSKSGKTTIS
GLSVMANMVETLRLGWSENLPLSQLAWGKIAQASQITALLPLLTENYDLSNDVLYTAQ
KRGSVLLNAMLDGVKPEANPNVRWLLLVAHDTNIAMVRTLMNFSWQLPGYSRGNIPPG
SSLVLERWRDAKSGERYLRVYFQAQGLDDLRRLQTPDAQHPMLRQEWRQPGCRQTDVG
TLCPFQAAITALGQRIDRPSTPAVAMVLP"

1 atgcctgcaa gacatcaggg gctgttacgc ctgtttatcg cctgcgcgct gccgctgctg

61 gcgctgcact cagccgccgc cgcagactgg cagctggaga aagtggtgga gcttagccgc
121 cacggcattc gtccgccgac ggccggcaac cgggaagcca tcgaggccgc caccggacgc
181 ccatggaccg agtggaccac ccatgacggc gagctcaccg gtcatggcta tgccgccgtg
241 gtcaacaaag ggcgtgagga aggccagcac tatcgccagc tcggcctgct gcaggcggga
301 tgcccgacgg cggagtcgat ttacgtgcgc gccagcccgc tgcagcggac gcgggcgacc
361 gcccaggcgc tggtggatgg cgccttcccc ggctgtggcg tcgctatcca ttacgtcaac
421 ggggatgccg atccgctgtt tcagaccgac aagttcgccg ccacgcaaac cgaccccgcc
481 cgccagctgg cggcggtgaa agagaaggcc ggggatctgg cgcagcgtcg gcaggcgctg
541 gcgccgacta tccagctatt gaaacaggcg gtttgccagg ccgataagcc ctgcccgatc
601 tttgataccc catggcgggt cgagcagagc aaaagcggca agaccaccat tagcggactg
661 agcgtgatgg ccaatatggt ggaaacgctg cgtctcggct ggagtgaaaa cctgcctctc
721 agccagctgg cgtggggcaa gatcgcccag gccagtcaga tcacggccct gctgccgctg
781 ttaacggaaa actacgatct gagtaacgac gtgctgtata ccgcgcaaaa acgcgggtcg
841 gtgctgctca acgccatgct cgacggcgtc aaaccagagg cgaatccgaa cgtacgctgg
901 ctgctgctgg tggcgcatga caccaacatc gccatggtgc gcacgctgat gaactttagc
961 tggcagctgc cgggctacag ccgggggaat atcccgccgg gcagtagcct ggtgctggag
1021 cgctggcgcg acgcgaagag cggtgaacgc tatctgcggg tctatttcca ggcgcaaggc
1081 ctcgacgacc tgcgtcgtct gcagacgccg gacgcgcagc acccgatgct gcgtcaggag
1141 tggcgtcagc cgggctgccg tcagaccgac gtcggtacgc tgtgcccctt ccaggcggcc
1201 atcaccgcgt tgggtcagcg tatcgatcgg ccctccaccc cggcggtagc catggtcctg
1261 ccgtag

- Pengkloningan gen menggunakan metode PCR

1) Memotong strain phyK (Klebsiella pneumoniae 3-phytase precursor) dan hanya
diambil beberapa potongan saja.
2) Memilih salah satu primer dari 10 pasang primer yang ada (masing-masing
primer terdiri dari 20-30 nukleotida).
3) Nukleotida bebas akan digabungkan menjadi satu untaian oleh enzim DNA
polymerase.
4) Melakukan proses denaturasi, dengan cara menaikkan suhu menjadi 90-95oC.
Proses denaturasi bertujuan agar bentuk rantai DNA yang tadinya double helix
dapat menjadi untaian DNA yang lurus atau renggang.
5) Melakukan proses annealing, dengan cara menempelkan primer di ujung kiri atas
(forward) dan ujung kanan bawah (reverse).
6) Melakukan proses extention atau pemanjangan primer, dengan cara menurunkan
suhu menjadi 720C
Proses extention dibantu oleh enzim DNA polimerase.
Tujuan dari penurunan suhu adalah agar enzim DNA polimerase dapat bekerja
secara optimal.
7) Selanjutnya, DNA polimerase menempel di bagian ujung (start) untaian dan
menambahkan nukleotida sesuai komplemennya. Ketika sampai ujung (stop) dia
berhenti lalu dia akan menggandakan rantai sehingga membentuk bilangan
geometri 2-4-8-16 hingga ribuan.
- Ekspresi gen
Ekspresi gen hasil kloning dapat dilakukan dengan cara memasukkan gen tersebut ke
dalam tubuh makhluk hidup. Di dalam tubuh makhluk hidup akan terjadi proses
transkripsi dan translasi yang selanjutnya menghasilkan protein. Protein yang
terbentuk bisa berupa protein struktural dan fungsional.
2. Metode untuk mengetahui potongan tubuh yang ditemukan merupakan milik
target