· 418· 临床检验杂志 2019 年 6 月第 37 卷第 6 期 Chin J Clin Lab Sci，June 2019，Vol．37，No．6

DOI： 10．13602 / j．cnki．jcls．2019．06．04 · 临床实验研究 ·

GＲEM1 对胃癌细胞增殖迁移的作用
林雅静，李天捷，王华，邵世和（ 江苏大学医学院，江苏镇江 212013）
摘要： 目的 检测胃癌细胞中 GＲEM1 基因的表达，探讨其对胃癌细胞生物学特性的影响并评估其在胃癌诊断和胃癌患者预
后中的临床价值。方法 运用数据库分析 GＲEM1 基因在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异，评估 GＲEM1 基因表达水平对
胃癌患者预后的相关性。Western blot 检测胃癌细胞系中 GＲEM1 蛋白质表达水平。AGS 细胞中沉默 GＲEM1 基因后，采用平
板克隆、Transwell 和 western blot 检测其对胃癌细胞增殖、迁移、上皮间质转化（ EMT） 发生及 Wnt / β-catenint 通路的影响。结果
Kaplan-Meier 分析表明，GＲEM1 基因高表达患者总体生存率（ OS） 和无进展生存率（ PFS） 均降低。GＲEM1 蛋白在 AGS 细胞
系中的表达水平（ 1．967±0．056） 最高。平板克隆、Transwell 及 western blot 实验显示，沉默 GＲEM1 基因可导致胃癌细胞的增殖
29．60； P 均＜0．01） ； E-cadherin 表达上升（ t = 10．65，P＜0．01） ，ZEB1、MMP2 表达均下降（ t 分别
及迁移能力降低（ t 分别为 22．00，
为 10．74 和13．67，P 均＜0．01） ； Wnt / β-catenin 通路中 β-catenin、CyclinD1、c-myc、p-GSK3β 和 PCNA 的表达水平均降低（ t 分别为
12．65，
16．21， 7．75 和 8．42； P 均＜ 0．01） 。结论
8．74， GＲEM1 通过激活 Wnt / β-catenin 诱导 EMT 发生，促进肿瘤转移和生长。
GＲEM1 可作为新的胃癌分子诊断和预后指标。
关键词： GＲEM1； 胃癌； 增殖； 迁移； 上皮间质转化
中图分类号： Ｒ446； Ｒ735．2 文献标志码： A

Effect of GＲEM1 on the proliferation and metastasis of gastric cancer cells

LIN Yajing，LI Tianjie，WANG Hua，SHAO Shihe （ Jiangsu University School of Medicine，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To detect the expression of GＲEM1 gene in gastric cancer cells，investigate its effects on the biological charac-
teristics of gastric cancer cells and evaluate its application value in the diagnosis and prognosis of gastric cancer． Methods The ex-
pression difference of GＲEM1 in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues was analyzed by the database，and the correlation of
GＲEM1 expression levels with the prognosis of gastric cancer patients was evaluated． The expression levels of GＲEM1 protein in gastric
cancer cell lines were detected by western blot． After GＲEM1 gene in AGS cells was silenced，its effects on the proliferation，migra-
tion，epithelial-mesenchymal transition （ EMT） and Wnt / β-catenin pathway of AGS cells were detected by the colony formation assay，
Transwell and Western blot，respectively． Ｒesults Kaplan-Meier analysis showed that the patients with high expression of GＲEM1
gene had low overall survival （ OS） and progression-free survival （ PFS） ． The expression level of GＲEM1 protein in AGS cells was the
highest in all gastric cancer cell lines （ 1．967 ± 0．056） ． The analysis of colony formation assay，Transwell and Western blot showed
that the silencing of GＲEM1 gene could decrease the proliferation and migration of gastric cancer cells （ t = 22．00； t = 29．60； P＜0．01） ，
increase the expression of E-cadherin （ t = 10．65，P＜0．01） ，and decrease the expressions of ZEB1 and MMP2 （ t = 10．74； t = 13．67；
P＜0．01） and the expressions of β-catenin，Cyclin D1，c-myc，p-GSK3β and PCNA in the Wnt / β-catenin pathway （ t = 12．65； t =
16．21； t = 8．74； t = 7．75； t = 8．42； P＜0．01） ． Conclusion GＲEM1 may induce EMT by activating the Wnt / β-catenin pathway，and
promote the metastasis and growth of tumors，which may be used as a new molecular diagnostic and prognostic marker for gastric cancer．
Key words： GＲEM1； gastric cancer； proliferation； metastasis； epithelial-mesenchymal transition

Gremlin1 （ GＲEM1 ） 是 骨 形 态 发 生 蛋 白 （ bone 能力的影响，旨在探讨 GＲEM1 在胃癌发病机制中

morphogenetic protein，BMP ） 拮抗剂家族中的一员， 的潜在作用。
可与 BMP-2，BMP-4 和 BMP-7 等 BMP 家族结合从
［1］
1 材料和方法
而发挥拮抗作用 。BMP 家族已被证实在多种组
织中与细胞增殖和凋亡存在一定关系。GＲEM1 在 1．1 细胞系、主要试剂及仪器 胃癌细胞系 AGS、
大部分器官和组织中表达为阴性或较弱，但在胃和 SGC-7901、BGC-823、MGC-803 和 HGC 均购自中国
皮肤中具有一定量的表达。GＲEM1 已被验证与结 科学院上海细胞库。细胞蛋白裂解液 ＲIPA、蛋白酶
［2］
直肠癌等 癌症的发生、发展存在相关性。 但在胃 抑制剂 PMSF 及 BCA 蛋白质浓度试剂盒均购自碧
癌中的研究报道甚少。 本研究通过 GＲEM1 基因沉 云天 公 司； ＲPMI 1640 培 养 基、F12 培 养 基 （ 美 国
默技术检测 GＲEM1 敲减后对胃癌细胞增殖和凋亡 Gibco 公司） ； 胎牛血清 （ FBS，加拿大 Wisent 公司 ） ；

作者简介： 林雅静，
1993 年生，女，硕士研究生，研究方向： 微生物检验。
通信作者： 邵世和，教授，博士研究生导师，博士，E-mail： 13951404805@ 163．com。
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胰蛋白酶（ 美国 Sigma 公司） ； ECL 增强化学发光试 抗体，兔抗人 E-cadherin 多克隆抗体，兔抗人 PCNA

剂盒与 Transwell 小室（ 德国 Millipore 公司） ； 靶向敲 多克隆抗体，兔抗人 p-GSKβ 多克隆抗体 （ 1 ∶ 1 000
减 GＲEM1 的 siＲNA 和 对 照 乱 序 ＲNA （ 美 国 Santa 稀释） ，兔抗人 MMP2 多克隆抗体，兔抗人 c-Myc 多
Cruz 公 司 ） ； PVDF 膜 （ 密 理 博 公 司 ） ； 4 × Loading 克隆 抗 体，兔 抗 人 CyclinD1 多 克 隆 抗 体，兔 抗 人
buffer（ 美 国 Bio-Ｒad 公 司 ） ； 蛋 白 质 Marker （ 美 国 ZEB1 多克隆抗体 （ 1 ∶ 200 稀释 ） ，TBS / T 洗膜 3 次，
Thermo 公司） ； 鼠抗人 GＲEM1 多克隆抗体 （ 美国 每次 5 min，
加入 HＲP 标记山羊抗兔 IgG 二抗和 HＲP
Santa Cruz 公司） ； 兔抗人 GAPDH 多克隆抗体，兔抗 标记山羊抗鼠 IgG 二抗（ 1 ∶2 000 稀释） 37 ℃ 温育 l h。
人 β -catenin 多克隆抗体，兔抗人 E-cadherin 多克隆 TBS / T 洗膜 5 次后，曝光并采用 Image J 软件对条带
抗体，兔抗人 PCNA 多克隆抗体，兔抗人 p-GSKβ 多 进行灰度扫描及结果判读，
试验重复 3 次。
克隆抗体（ 美国 Cell Signaling 公司 ） ； 兔抗人 MMP2 1．5 ＲNAi 技术抑制 GＲEM1 基因表达 取对数生
多克 隆 抗 体，兔 抗 人 c-Myc 多 克 隆 抗 体，兔 抗 人 长期的 AGS 细胞，
2．5 g / L 胰蛋白酶消化重悬计数，
CyclinD1多克隆抗体，兔抗人 ZEB1 多克隆抗体 （ 沈 5
接种于 6 孔细胞培养板中，每孔中加入 2 × 10 个细
阳万类公司） ； HＲP 标记山羊抗兔 IgG 二抗和 HＲP 胞。置于 37 ℃ 、
5% CO 2 、饱和湿度的恒温细胞培养
标记山羊 抗 鼠 IgG 二 抗 （ 美 国 福 麦 斯 生 物 公 司 ） ； 箱培养 18 ～ 24 h，至细胞融合度达 30% ～ 50% 时用于
Lipofectamine 3000 转 染 试 剂 （ 美 国 Invitrogen 公 后续实验。转染时设实验组 （ 加入 3．75 μL Lip3000
司） 。细胞培养瓶、6 孔板和 24 孔板 （ 美国 Corning 和 15 μL si-GＲEM1 ） 和 对 照 组 （ 加 入 3． 75 μL
公司） ； 蛋 白 质 电 泳 仪 和 转 膜 仪 （ 美 国 Bio-Ｒad 公 Lip3000 和 15 μL si-control） ，继续培养 48 h 用于后
司） ； 正 置 荧 光 显 微 镜 和 倒 置 荧 光 显 微 镜 （ 日 本 续实验。
Nikon 公司） ； 超净工作台 （ 上海启前公司 ） ； 二氧化 1．6 平板克隆实验 取转染后 48 h 的实验组和对
碳培 养 箱、微 量 移 液 器、台 式 离 心 机、低 温 离 心 机 照组细胞，
2．5 g / L 胰蛋白酶消化计数，接种于 6 孔
（ 德国 Eppendorf 公司 ） ； 蛋白质浓度检测仪 （ 美国 细胞培养板中，每孔中加入 1 000 个细胞。37 ℃ 恒
Thermo 公 司 ） ； 化 学 发 光 凝 胶 成 像 仪 （ ImageQuant 温培养 7 ～ 14 d。 弃去上清液，PBS 洗涤 3 次。4%
LAS4000 mini，日本 GE 公司） ； 多聚甲醛 室 温 固 定 20 min，结 晶 紫 染 液 室 温 染 色
1．2 细胞培养 AGS 细胞培养于 F12 培养基中， 30 min。光学显微镜下观察实验组与对照组形成的
SGC-7901、BGC-823、MGC-803 和 HGC 细胞均培养 细胞集落。
于 ＲPMI 1640 培养基中。 培养时均加入 10% 胎牛 1．7 Transwell 迁移实验 取转染 siＲNA 48 h 后的
血清，并置于 37 ℃ 、饱和湿度、5% CO 2 的细胞温育 AGS 细 胞，2． 5 g / L 胰 蛋 白 酶 消 化，PBS 洗 涤 后 用
箱中常规培养。 200 μL 无血清培养基重悬并计数，以 1 × 10 4 / 孔的细
1．3 细胞蛋白质提取 取上述适量对数生长期的 胞密度接种于 Transwell 小室的上室，下室加入转染
细胞，弃培养基，PBS 洗涤 3 次，用细胞刮刀刮下细 上清液 600 μL。培养 36 ～ 48 h 后，取出 Transwell 小
胞。用移液枪转移细胞至 Ep 管，低温 1 000 ×g 离心 室，
用 4% 多聚甲醛固定 30 min，然后用棉签轻轻擦
5 min，弃上清液，加入 100 μL ＲIPA 和 1 μL PMSF， 去小室膜上表面未迁移的细胞，PBS 洗涤 3 次，4%
冰上裂解 45 min，每 15 min 吹打混匀一次， 13 500 ×g 多聚甲醛固定 30 min，结晶紫染色 30 min，PBS 洗涤
离心 30 min，
蛋白质浓度检测仪测定蛋白质浓度。取 3 次。正置光学显微镜下观察迁移到膜下表面的细
100 μL 上清液， 加入 33．3 μL Loading buffer，
100 ℃ 煮 胞，随机计数低倍镜视野下的细胞。
沸 5 ～ 10 min，置于 － 20 ℃ 保存。 1．8 统计学分析 采用 Graphpad prism 5．0 软件进
1．4 western blot 检测 配制 10% SDS-PAGE 分离 ±s 表示，实验组与对照组
行统计学分析。 数据用 x珋
胶，将上述蛋白质样品按 200 μg 的总蛋白质量进行 间差异比较采用独立样本 t 检验，以 P＜0．05 为有统
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ 积层胶采用 80 V 电压，分离 计学意义。
胶采用 100 V 电压 ） 。 电泳结束后在 350 mA 恒流
2 结果
条件下 2 h 将蛋白质转移至 PVDF 膜上。 转膜结束
后将膜置于 50 g / L 脱脂牛奶中室温封闭 1 h，分别 2．1 数据库数据分析 GＲEM1 的表达量与总体生存
加入鼠抗人 GＲEM1 多克隆抗体 （ 1 ∶ 100 稀释 ） ，兔 率 Kaplan-Meier 分析检测了 644 例 GＲEM1 基因
抗人 GAPDH 多克隆抗体，兔抗人 β -catenin 多克隆 低表达和 322 例 GＲEM1 高表达的胃癌患者，结果发
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现胃癌组织中 GＲEM1 基因高表达胃癌患者的总体 患者组织和对应癌旁组织中 mＲNA 表达量，结果显

生存率（ OS） 下降。对 443 例 GＲEM1 基因低表达和 示 GＲEM1 基因在大部分癌组织和癌旁组织中均表
198 例高表达的胃癌患者分析结果也显示，GＲEM1 达，并且在大部分癌组织中的表达量高于对应癌旁
基因高表达患者无进展生存率 （ PFS） 降低 （ 图 1A、 组织。GＲEM1 在胃癌组织中的表达量也明显高于
B） 。 在 GEPIA 数据库中检索 GＲEM1 在所有癌症 癌旁组织（ 图 1C、D） 。

注： A，GＲEM1 表达量对 OS 的影响； B，GＲEM1 表 达 水 平 对 PFS 的 影响； C，GEPIA 数据库分析癌症组织与癌旁组织

GＲEM1 的表达； D，GEPIA 数据库分析胃癌组织（ n = 408） 和癌旁组织（ n = 211） 的 GＲEM1 表达； * ，P＜0．05。
图1 GＲEM1 在人类癌症组织中的表达及其表达对胃癌患者预后的影响

2．2 各胃癌细胞系中 GＲEM1 表达水平 GＲEM1 最高，而在 BGC-823（ 0．392±0．017） 和 HGC（ 0．357 ±
蛋白 在 5 种 不 同 胃 癌 细 胞 系 （ AGS、SGC-7901、 0．023） 细胞中较低 （ 图 2A 和 2B） 。 选取 AGS 细胞
BGC-823、MGC-803 和 HGC ） 中 均 表 达。 其 中， 进行基因干扰实验，结果见图 2C 和 2D。
GＲEM1 蛋白表达量在 AGS 细胞 （ 1． 967 ± 0． 056） 中

注： A，不同胃癌细胞系中 GＲEM1 表达差异比较； B，胃癌细胞系中 GＲEM1 表达的 western blot 灰度扫描结果； C，western
blot 检测转染 GＲEM1 siＲNA 后 AGS 细胞中的 GＲEM1 表达； D，ＲNAi 技术抑制 GＲEM1 后的灰度扫描结果； ＊＊，P＜0．01。
图2 western blot 验证不同胃癌细胞系中 GＲEM1 的表达差异以及 siＲNA 干扰 AGS 细胞后 GＲEM1 的表达
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2．3 GＲEM1 基因沉默后对 AGS 细胞增殖和迁移的 0．01） ，单 个 细 胞 形 成 的 克 隆 直 径 也 减 小 （ 图 3A，

影响 western blot 结果显示，si-GＲEM1 组 GＲEM1 3B） 。Transwell 结果显示，经过 24 h 细胞迁移后，敲
较对照组表达量下降，证实靶向 siＲNA-GＲEM1 转 减组 AGS 细 胞 迁 移 速 率 较 对 照 组 明 显 减 慢 （ t =
染成功。平板克隆结果显示，si-GＲEM1 组细胞增殖 29．60，P＜0．01） ，见图 3C、D。
形成的克隆数量较对照组明显减少 （ t = 22．00，P ＜

注： A，siＲNA 干扰 GＲEM1 对 AGS 细胞克隆形成能力的影响； B，计数每组大于 50 个细胞的克隆数； C，Transwell 迁移实验

检测敲除 GＲEM1 对细胞迁移能力的影响（ ×100） ，标尺 = 50 μm； D，定量比较各组迁移的细胞数； ＊＊，P＜0．01。
图3 干扰 GＲEM1 表达抑制 AGS 细胞的增殖和迁移能力

2．4 GＲEM1 干扰后细胞增殖和迁移相关蛋白表达 0．01） 。在 Wnt / β -catenin 通路中，β -catenin、c-myc、

western blot 结 果 显 示，si-GＲEM1 组 较 对 照 组 CyclinD1、p-GSK3β 和 PCNA 表达量均降低 （ t 分别
E-cadherin表 达 上 升 （ t = 10． 65，P ＜ 0． 01 ） ，ZEB1、 为 12．65、
16．21、 7．75 和 8．42； P 均 ＜0．01） ，见图
8．74、
MMP2 表达均下降 （ t 分别为 10．74 和 13．67； P 均 ＜ 4A、B。

注： A，western blot 检测干扰 GＲEM1 表达后 AGS 细胞中 EMT 相关蛋白以及 Wnt / β-catenin 通路蛋白的表达； B，western blot
灰度扫描结果； ＊＊，P＜0．01。
图4 敲除 GＲEM1 抑制 AGS 细胞 EMT 相关蛋白、Wnt / β-catenin 蛋白表达

3 讨论 死亡率居高不下。胃癌诊疗靶指标的发现为胃癌的
［3-5］
诊治提供了极大的帮助 。GＲEM1 定位于人类染
胃癌由于缺乏早期特异性症状，难以确诊，因而
色体 15q13．3 上，是 DAN family BMP 拮抗剂中的一
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员。已被证实可以通过与 BMP 家族蛋白结合，从而
起到 拮 抗 作 用。 研 究 表 明，GＲEM1 通 过 激 活
TGF-β1 / smad 通路，调节肿瘤 EMT 的发生，促进细
［6］
胞的增殖和迁移作用，包括食管鳞状细胞癌 、胶
［7］ ［2］
质细胞瘤 、结直肠癌 等。 但其在胃癌中的机制
研究仍未可知。 本研究通过系列功能学实验证实，
GＲEM1 敲减抑制了胃癌细胞的增殖和迁移 。
肿瘤细胞所具备的重要能力之一是细胞运动
性。而 EMT 发生与细胞运动性息息相关。 本实验
检测了 EMT 相关指标，结果显示 si-GＲEM1 组较对
照组 E-cadherin 表达上升，ZEB1、MMP2 表达均下
降。表明沉默 GＲEM1 抑制 EMT 发生，降低胃癌细
胞 的 迁 移 能 力。 进 一 步 检 测 增 殖 细 胞 核 抗 原
（ PCNA） 显示，PCNA 较对照组表达水平下降，该结
果提示 GＲEM1 可影响胃癌细胞的增殖能力。
Wnt / β -catenin 是 肿 瘤 发 生 的 重 要 信 号 通 路。
在经典 Wnt 途径中，已被发现的 β -catenin，糖原合
酶激酶 3β （ GSK3β ） 等均为信号转录因子，而其中
β -catenin 是核心分子。 β -catenin 是一种多 功 能 蛋
［5］
白质，在生理稳态中起到重要作用 。 其异常高表
达 可 导 致 包 括 癌 症 在 内 的 多 种 疾 病。 它 可 与
LEF-1 / TCF4共调节剂结合，以组织特异性方式促
进靶基因如 Jun、c-Myc 和 CyclinD1 （ 其中大多数编
码癌蛋白 ） 的转录。 本研究检测到沉默 GＲEM1 后
β -catenin、c-myc、CyclinD1、p-GSK3β 表达水平相对
于对照组均下降，因而可以推断沉默 GＲEM1 可能
通过影响 β -catenin 表达来调节下游蛋白质的表达，
Chin J Clin Lab Sci，June 2019，Vol．37，No．6
从而影响胃癌细胞的增殖与迁移 。
综上所述，GＲEM1 可促进胃癌细胞的增殖和迁
移能力，这可能与其调节 Wnt / β -catenin 通路，促进
EMT 发生有关。然而，详细机制仍需进一步研究。
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（ 收稿日期： 2019-02-14）
（ 本文编辑： 许晓蒙）