Chương 3

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI SINH VẬT

1
 3.1. Nhu cầu dinh dưỡng của VSV

- VSV cần các nguyên tố đa lượng (C,N,H,O,P, S, Ca, Fe) và các

nguyên tố vi lượng (Mn, B, Mo, Zn, Cu, Ni, Cl, Si…) cho sự sinh
trưởng, vitamin và các chất kích thích sinh trưởng.
- Được cung cấp qua:
+ Nước
+ Nguồn cacbon: glucose, các loại đường, mật rỉ, tinh bột,
cellulose….
+ Nguồn nito: nito vô cơ (amoniac, muối amon) hoặc nito hữu cơ
(cao ngô, dịch thủy phân nấm men, cao thịt pepton..)
+ Các muối vô cơ
+ Vitamin và các chất kích thích sinh trưởng.

2
 Cách tính thành phần môi trường

- Trong sinh khối khô, tỉ lệ C 50% và tỉ lệ N 10%

- Aiba (1965),
Nếu muốn sản xuất 40g/l tế bào khô của vi khuẩn hiếu khí chứa
cacbon bằng 50% khối lượng của nó và có thể biến đổi được 50%
cacbon có trong cơ chất thì cơ chất đó phải chứa:
(40*50)/100 * 100/50 = 40 g cacbon.
Nếu lượng cacbon đó được cung cấp dưới dạng glucose thì trong
công thức của mỗi môi trường cần có:
40 * 180/72 = 100g glucose/l

3
 Tối ưu hoá thành phần môi trường

- Cách 1: khảo sát đơn biến

- Cách 2: qui hoạch thực nghiệm
+ xác định mức ý nghĩa của các yếu tố
+ tối ưu hoá, tìm mối tương quan tối ưu cho các yếu tố

4
 3.2. Nguyên liệu trong sản xuất CNSV
3.2.1. Nước
a. Chất lượng nước được xem xét ở ba chỉ tiêu:
- Độ cứng của nước (số mg đương lượng của Mg2+ và Ca2+ trong 1 lit
nước) yêu cầu trong lên men không vượt quá 7mg.
- Độ oxy hóa của nước (mức độ nhiễm bẩn chất hữu cơ) biểu hiện
bằng mgO2/ lit
- Chỉ số VSV (mức độ nhiễm bẩn sinh học): tổng vsv hiếu khí <1000
tế bào/lit; chỉ số coli không quá 3CFU/lit.
b. Phương pháp xử lý nước dùng trong CNVS
- Chưng cất (phòng thí nghiệm)
- Lọc qua cát, sỏi, hấp thụ qua hạt nhựa trao đổi ion (công nghiệp)

5
 3.2.2. Nguồn Cacbon
• Rỉ đường
• Malt trích ly
• Tinh bột và dextrin
• Cellulose
• Dầu thực vật
• Methanol
• Hydrocacbon

6
a. Rỉ đường
- Phế liệu của công nghiệp sản xuất đường,
chiếm 3-5% so với mía nguyên liệu
- pH=6.8-7.2
- Độ kiềm: 0.5-20 (10 tương đương 1ml H2so4 1N
trung hòa hết 100g mật rỉ)
- Độ đệm: 14-45 (thể tích dung dịch H2so4 1N để
điều chỉnh 100g mật rỉ và 100g nước đến pH 4.5)
- Rỉ đường mía và rỉ đường củ cải

7
• Rỉ đường mía:
- 15-20% nước
- 80-85% chất khô hòa tan bao gồm:
+ Đường 60% (saccharose 35-40%, đường khử
15-20%)
+ Chất khô khác < 40% (30-32% chất hữu cơ như
a.a., các acid hữu cơ… và 8-10% chất vô cơ)
+Vitamin (Thiamin 8,3; Riboflavin 2,5; a.nicotinic
21,4; a.folic 0,038; pyridoxine 6,5; biotin 12g/g
rỉ đường)

8
• Rỉ đường củ cải:
Thành phần rỉ đường củ cải (%)
- Sacharose: 48
- Rafinose: 1
- Đường chuyển hóa khác: 1
- Các acid hữu cơ: 2
- Biotin thấp (0,13 g/g rỉ đường)

9
* Xử lý rỉ đường
• Mục đích:
- Loại bỏ màu của rỉ đường
- Phá vỡ hệ keo của rỉ đường cản trở oxy hòa tan trong môi trường
- Pha loãng hàm lượng đường để phù hợp lên men.
• Phương pháp:
- Cách thứ nhất : Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy
đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm dịch trong .
- Cách thứ hai : Khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun
toàn bộ lên 85oC và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch
trong.
- Cách thứ ba : Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4,
người ta đun nóng đến 120 – 125oC trong một phút để các chất vô cơ
kết tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong

10
* Xử lý rỉ đường
- Rỉ đường thường có màu sẫm. Màu này khó bị phá huỷ
trong quá trình lên men. Sau lên men chúng sẽ bám vào
sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu
ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất
khó khăn.
- Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40
– 50%). Lượng đường này chủ yếu là saccharose nên khi
tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp.
- Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là
hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hoà tan
oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của oxy càng
kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ
là phải phá hệ keo này.

11
 b. Nguyên liệu chứa tinh bột
• Sắn, khoai, bắp, gạo nhưng rẻ tiền nhất là sắn
• Thành phần

- Ngoài ra còn có một số vitamin nhóm B nhưng thường bị mất đi khi chế
biến nguyên liệu
- Độc tố trong sắn có tên chung là Phazeolitunatin, chủ yếu ở vỏ và cùi;
có nhiều trong sắn đắng. Bình thường nó không độc nhưng khi bị thủy phân
sẽ giải phóng HCN
- HCN dễ bay hơi và hòa tan trong nước nên có thể loại bỏ
- Sắn cắt lát hoặc phơi khô giảm đáng kể HCN
12
Thành phần hóa học của các nguyên liệu khác

13
Thành phần hóa học của các nguyên liệu khác

14
 Xử lý nguyên liệu chứa tinh bột
• Nguyên liệu – Xử lý – Dịch hóa – Đường hóa– Dịch đường
a) Xử lý:
- Làm sạch: rửa, loại tạp chất
- Làm nhỏ: Nghiền (máy nghiền búa), băm
Trong quá trình nghiền những hạt nhỏ
sẽ được quạt hút và đẩy qua rây ra ngoài

15
 Xử lý nguyên liệu chứa tinh bột
b) Dịch hóa (nấu): phá vỡ cấu trúc của hạt nguyên liệu, phá vỡ màng của
hạt tinh bột cho phép enzyme sẽ dễ tiếp xúc với tinh bột, đồng thời giúp tinh
bột hòa tan trong dung dịch thành dạng cháo hoặc hồ
• Có thể nấu liên tục, gián đoạn hoặc bán liên tục
- Nấu gián đoạn: toàn bộ quá trình trong 1 nồi, thao tác đơn giản nhưng tốn
năng lượng
- Nấu bán liên tục: ba giai đoạn nấu khác nhau trong 3 nồi, tiết kiệm thời
gian nấu ở áp suất cao, nhiệt độ cao, nên tiết kiệm 15-30% lượng hơi nhưng
sẽ tốn nhiều thiết bị
- Nấu liên tục: có thể nấu ở nhiệt độ thấp, dễ cơ khí, tự động hóa, ít tốn thiết
bị nhưng nguyên liệu phải nghiền rất nhỏ và điện, nước, hơi phải ổn định
16
Nấu gián đoạn
Nấu bán liên tục
Phương pháp nấu liên tục
 Xử lý nguyên liệu chứa tinh bột
c) Đường hóa dịch cháo (Thủy phân):
• Mục đích: Chuyển toàn bộ tinh bột thành đường
• Thực hiện:
- Dùng Malt (Phương pháp maltaza) rượu có hương vị ngon nhưng do hệ
enzyme amylase trong malt không ổn định nên hiệu suất đường hóa có thể
thấp, không kinh tế. Chỉ sử dụng trong sản xuất rượu đặc sản
- Dùng acid vô cơ mạnh: (HCl, H2SO4) thủy phân tốt cả tinh bột và
cellulose trong nguyên liệu nhưng cho nhiều sản phẩm phụ (đường pentose);
phá hủy các acid amin thành chất độc cho vi sinh vật, ăn mòn thiết bị, độc
hại, bã rượu khó sử dụng
- Dùng enzyme amylase (từ vi sinh vật hoặc chế phẩm enzym): an toàn,
không bị ăn mòn, không cần thiết bị đắt tiền 24
Cấu trúc của tinh bột Quá trình đường hóa
 Amylase

• α amylase cắt liên kết 1-4 glucozide ở vị trí bất kỳ nhưng tập trung vào
giữa mạch amylose và amylopectin; chuyển tinh bột thành dextrin,
maltose và 1 ít glucose làm giảm độ nhớt của tinh bột (enzym dịch hóa)
• β amylase cắt liên kết 1-4 glucozide theo 2 gốc glucose 1 tạo sản phẩm
chủ yếu là maltose (enzyme đường hóa)
• Glucoamylase có khả năng cắt nối 1-4 và 1-6 từ các vị trí bất kỳ
• Dextrinase cắt liên kết 1-6 glucozide

26
 Đường hóa liên tục 2 lần

- Cháo từ nồi nấu chín thêm được đưa vào thùng đường hóa lần 1
- Dịch amylase từ thùng qua bộ phận phân phối, khoảng 30% vào
thùng đường hóa lần 1, phối hợp với dịch cháo có nhiệt độ 600C
- Thời gian đường hóa kéo dài 15-20 phút
- Dịch sẽ được bơm qua thiết bị đường hóa lần 2, bổ sung 70%
enzym còn lại, tiếp tục đường hóa 15-20 phút
- Đường hóa xong 10% đưa vào phân xưởng gây men, 90% được làm
nguội và đưa vào thiết bị lên men chính

33
c. Dung dịch kiềm sulfit
Nước thải từ các nhà máy giấy cellulose theo phương
pháp sulfit là nguồn nguyên liệu rất tốt để nuôi nấm
men
d. Cellulose
Phế thải (rơm rạ, giấy thải, vỏ quả, mùn cưa…) qua
xử lý hóa học hoặc enzyme cellulase rồi mới sử dụng

34
e. Dầu thực vật (dầu lạc, hướng dương, đậu
nành…)
Nguồn cacbon và là chất phá bọt.
Chia thành từng đợt bổ sung 0,5%
f. Malt trích ly
- Rất thích hợp để nuôi cấy nấm men, nấm mốc
và xạ khuẩn
- Chứa 90-92% chất khô với nhiều đường đơn
19%, maltose 52%, saccharose 1,8%, dextrin
15%, protein, peptit, a.amin, vitamin…
35
 3.2.3. Nguồn Nito
Trong PTN:
• Nito vô cơ (NO3-, NH4+) hữu cơ (pepton, axit amin)
Trong công nghiệp:
• Nước chiết ngô và cao ngô
• Nước chiết nấm men và cao men
• Bột đậu nành
• Khô lạc hay bánh đậu phộng
• Nước mắm, nước tương

36
a. Nước chiết ngô và cao ngô: Sản phẩm phụ của
quá trình chế biến tinh bột từ ngô
- Nước chiết ngô: ngô được ngâm với dung dịch natri
sulfit. Trong khi ngâm các a.a và vitamin được chiết
ra và hòa tan vào dung dịch thành nước chiết ngô.
Trong quá trình ngâm có xảy ra lên men lactic.
- Cao ngô: nước chiết ngô cô đặc trong điều kiện chân
không thành dạng sệt chứa 50% chất khô
Trong cao ngô có 6,4 – 8% N tổng, với ½ là a.a
(alanin, arginin, a.glutamic, isoleucin, treonin,
phenylalanin, methionin, xystein…); a.lactic và các
hydratcacbon, 15 – 20% tro ( P, K, Mg…), Vitamin H
và vitamin B1.

37
b. Nước chiết nấm men và cao men
- Nước chiết nấm men: sinh khối men bia hoặc
men rượu được rửa sạch và cho tự phân ở 48-
520C (có bổ sung enzym) hoặc tiêu nguyên
sinh chất bằng muối ăn ở nồng độ cao trong 2-
3 ngày, lọc bỏ bã, thu dịch thủy phân gọi là
nước chiết nấm men.
- Cao men: nước chiết nấm men cô đặc chân
không thành dạng sệt 40-50% chất khô gọi là
cao men.

38
Thành phần (%) PP tự phân Tiêu NSC bằng NaCl
Chất khô 70 80
N tổng số 8,8 7,4
Protein 55 46
NaCl <1g 18
Các axit amin
Các vitamin (mg/kg)
Thiamin 20-30 10-15
Riboflavin 50-70 50-70
Piridoxin 25-35 20-30
Niacinamid 600 100
A.Pantotenic 200 350
Thành phần dịch thủy phân nấm men bằng các pp khác nhau
39
 3.2.4.Nguồn muối vô cơ
Cung cấp P, S, Mg, K, Fe…
• (NH4)2SO4
• (NH4)2HPO4
• H3PO4
• KH2PO4
• KCl
• MgSO4
• FeSO4…

40
 Các nguyên tố khoáng
• Phospho (bột đậu, bột bắp, bã rượu hay các
dạng muối vô cơ của K, Na, NH4)
• Các chất khoáng Mg, Na, Fe… từ muối vô cơ
hay nước pha môi trường (nước máy)
• Các nguyên tố vi lượng như Mn, Mo, Co… có
trong nguyên liệu ban đầu như dịch nước trái
cây, nước chiết thóc malt…
Hạn chế Fe bằng cách dùng nồi lên men từ
thép Cacbon bên trong nồi còn có quét lớp keo
bảo vệ

41
3.2.5. Vitamin và các nhân tố sinh trưởng
Thông qua việc bổ sung các nguyên liệu giàu
vitamin như cao ngô, rỉ đường

42
 3.3. Khử trùng môi trường
3.3.1. Khử trùng môi trường rắn cho nuôi cấy bề mặt
3.3.2. Khử trùng môi trường lỏng cho lên men bề sâu
3.3.3. Khử trùng dầu mỡ phá bọt

43
 3.3.1. Khử trùng môi trường rắn
- Tiệt trùng khay chứa môi trường bằng các dịch sát khuẩn
(cồn, javel…) hoặc sấy khô ở nhiệt độ cao 120-1600C
- Môi trường sau khi phối trộn được khử trùng bằng hơi
nóng trong thiết bị có áp suất để đạt nhiệt độ thích hợp ( ví
dụ 1400C, 2atm, 20-30 phút; 105-1100C với áp suất 0,05-
0,1 Mpa (1Mpa ~ 9,869 Atm, 1,5-2h)
- Thỉnh thoảng (15 phút) đảo khối môi trường
- Có thể khử trùng tại khay (nếu không cần vô trùng quá
nghiêm ngặt) hoặc khử trùng trong thiết bị chuyên dùng,
làm nguội rồi chuyển đến khay cấy.

44
 3.3.2. Khử trùng môi trường lỏng
- Phương pháp gián đoạn (mẻ lên men nhỏ): khử trùng nồi
lên men, hệ thống đường ống dẫn, cho môi trường vào nồi,
gia nhiệt và làm nguội ngay trong thiết bị lên men bằng
cách cho nước vào vỏ hoặc ống xoắn trao đổi nhiệt hoạt
động cùng hệ thống khuấy. Áp suất 0,05-0,1 Mpa, 110-
1200C trong 1- 1,5h.
- Phương pháp liên tục (1400C, 5-15 phút) ngay trong thiết
bị với 3 bộ phận: khử khuẩn, bình lưu môi trường và làm
nguội

45
 3.3.3. Khử trùng dầu mỡ phá bọt
- Tiến hành trong 1 thiết bị riêng
- Khử trùng gián đoạn với áp suất cao 0,2- 0,25 Mpa, nhiệt
độ 120-1250C, 1-1,5h.
- Làm nguội và dùng khí nén vô trùng để đẩy qua đường
ống vào nồi lên men

46
3.3.4. Kiểm tra độ vô trùng sau khi khử trùng
- Lấy mẫu và cấy vào các hộp petri có môi trường thạch-
thịt- pepton hoặc thạch- malt. Sau đó gói hộp bằng giấy
sạch và để vào tủ ấm 30 - 37o C trong 24 giờ.
- Xem kết quả

47