28.

Western blotin definisanje, tehnike, izvođenje i detekcija proteina

Western blotting je tehnika kojom se detektuju mikro molekulipeptidne prirode najčešće

proteini. Primenjuje se za POTVRDU DIJAGNOZU (konformacioni test).
Princip izvođenja obuhvata sledeće korake:
1 izdvajanje proteina
2 elektroforetsko razdvajanje proteina na gelu
3 prenos (bloating) proteina sa gela na čvrstu podlogu odnosno membranu
4 specifično vezivanje antitela za odgovarajući antigensku determinantu
5 detekcija antigen-antitela (Ag-At) kompleksa

Izdvojeni i prečišćeni virusni proteini razdvajaju se na osnovu molekulske težine pomoću

POLIAKRILAMID GEL ELEKTROFOREZE. Proteini sa manjom molekulskom težinom
migriraju daleko bolje od proteina sa većom.

Razdvojeni virusni proteini se prenose na NITROCELULOZNI PAPIR, poređani u vidu

traka. Oni predstavljaju čvrstu fazu u WB testu.

Pozitivan ispitivani serum prethodno siniran u Elisa testu nanosi se na nitrocelulozne trake i
inkubira. Ako u serumu postoje specifična antivirusna antitela ona će se vezati za antigen koji
je indukovao njihovu sintezu. Nakon ispiranja dodaje se ANTIHUMANI
IMUNOGLOBULIN obeležen enzimom peroksidaza ili alkalnafosfataza. Posle određene
intubacije i ispiranja dodaje se supstrat. Kao rezultat reakcije enzim-supstrat doći do pojave
boje na trakama (antigenima) gde se formira kompleks ANTIGEN-ANTITELO-HUMANI
IMUNOGLOBULIN OBELEZEN ENZIMOM.

U testu se koristi POZITIVNA I NEGATIVNA KONTROLA. Pozicija obojenih traka se

određuje na osnovu pozitivne kontrole. Rezultat se očitava golim okom, upoređivanjem
obojenih traka sa pozitivnom kontrolom . Test se mora ponoviti ako obojene trake nisu jasno
definisane.

Prednost Western blottinga se ogleda u tome što se u isto vreme detektuje postojanje
formiranog antigen-antitelo kompleksa kao i molekulska masa antigena.